KR101710639B1 - 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 조직 증강을 필요로하는 부위에 주입함으로써 주입 부위의 부피가 증가하고, 새로운 조직들이 생성되어 뛰어난 조직 증강 효과를 나타냈다.

Description

핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법 {Filler composition comprising nucleic acid, chitosan and hyaluronic acid for tissue augmentation and process for producing the same}
본 발명은 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
안티-에이징(anti-aging)이란 노화를 의학적으로 관리하고 젊음을 유지하기 위한 여러 가지 치료를 뜻한다. 최근 고령화, 외모 중시 경향 심화, 소득증가, 여성의 사회진출 확대로 인해 안티-에이징 수요가 급증하고 있으며 여기에 삶의 질 개선을 중시하는 정부 정책과 바이오, 의료 기술 혁신이 더해지면서 안티-에이징 제품 및 서비스의 품질도 발전을 거듭하고 있다(김수범, 2014; 김철영, 2015). 안티-에이징 산업이 미래 성장산업으로 부상되는 가운데, 보톡스, 필러 시술, 레이저치료, 박피술 등이 포함되어 있는 안면미용(facial aesthetics) 관련 시장이 주목받고 있다.
필러(filler)란 단어 뜻대로 '채워주다, 피부 속을 채워주는 물질' 이라는 뜻으로 피부조직을 보충할 수 있는 물질을 말한다. 성형용 필러는 얼굴의 탱탱함 복원이나 윤곽 개선, 얼굴 주름 완화를 위하여 주입되어 채우는 것을 목적으로 하며 약리적 작용 없이 스스로 부피를 유지하는 역할을 하는 제품을 말하는 것으로 피부 절개나 수술 없이 사용되는 비수술적 요법의 안전한 시술이다(김철영, 2015; Kang I.G., 2015). 이러한 성형용 필러는 주입형 안면 임플란트(injectable facial implant), 피부 필러(dermal filler), 주름개선 필러(wrinkle filler), 안면부 연조직 필러(facial soft tissue filler) 또는 이외의 다양한 명칭으로 불리고 있다.
필러는 제품의 특성(주성분, 점도 등), 시술 상의 차이(주입량, 주입기술) 및 환자 개개인의 특성에 따라 효과의 유지 기간에 차이가 있을 수 있다. 필러의 특성에 따라서 이상성(biphasic) 필러와 일상성(monophasic) 필러로 나눌 수 있다. 일상성 필러의 경우 가교제가 많이 섞여 있어 끈적끈적한 상태로 존재하며 주형이 쉬워 표면을 매끄럽게 만들 수 있지만 지속성이 다소 떨어진다. 이상성 필러는 탄성이 뛰어나서 변형이 적은 반면 표면이 울퉁불퉁해질 수 있다(홍기웅, 2013).
성형용 필러는 주된 성분에 따라 분해성과 비분해성으로 나뉠 수 있다. 분해성은 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 칼슘-히드록시아파타이트(calcium hydroxyapatite)와 같은 천연고분자를 주성분으로 함유하는 것으로, 해당 성분을 분해하는 효소를 이용하여 제거가 비교적 용이하다는 장점을 가지고 있다. 비분해성 필러는 흡수되지 않고 체내에 남아 있음으로써 지속효과가 장기간 유지된다는 장점이 있으나, 시술 후 제거가 어렵다는 단점을 지니고 있는 것으로, 폴리메틸메타그릴레이트(poly(methylmethacrylate, PMMA)와 가교 폴리아미드 유도체(crosslinked polyamide derivatives) 등이 주성분으로 사용된다. 일부 성형용 필러는 시술시 발생하는 통증의 감소를 위해 마취제를 미량 포함하고 있다(의료기기정보기술지원센터, 2015; 조양하, et al., 2015).
필러 주입의 부작용으로는 부종, 통증, 압통, 저림, 멍, 혈종, 발적, 홍반, 색소 침착, 알러지 반응, 가려움, 소양증(pruritus), 비대칭, 부정형, 눈에 띄는 덩어리나 결절(nodule), 감염, 육아종(granuloma), 혈관혈류이상(vascular compromise) 및 틴들 현상(Tyndall effect) 등이 있다.
이에, 본 발명자는 핵산 및 키토산을 포함하는 하이드로겔 조성물에 대해 연구를 진행하던 중, 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 온도감응성 하이드로겔 조성물을 피부의 진피층에 주입하여 형성된 겔이, 피부의 지속적인 조직 증강 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 유럽공개특허 제0696210호에는 히알루론산과 폴리데옥시리보뉴클레오티드 기반 하이드로겔을 이용한 충전제가 개시되어 있어 본 발명과 유사하나 본 발명의 키토산은 기재되어 있지 않다. 또한, 한국등록특허 제1476381호에는 어류 정액 또는 알로부터 분리된 DNA 중합체를 포함하는 주름개선용 얼굴 또는 피부 충진제가 개시되어 있으나 키토산 및 하이드로겔이 전혀 언급되어 있지 않다.
유럽공개특허 제0696210호, Use of hyaluronic acid and/or polydeoxyribonucleotide based hydrogels as materials for filling prostheses and prostheses obtained, 1997. 10. 22. 공개. 한국등록특허 제1476381호, 어류 정액 또는 알로부터 분리된 DNA 중합체 단편혼합체를 포함하는 세포활성 강화용 조성물, 및 얼굴 또는 피부 충진제, 2014. 12. 18. 등록.
김수범, 글로벌 항노화산업 시장동향-안면미용 시장(Facial Aesthetics Market), 보건산업브리프, 144, 1~8, 2014. 김철영, 안티에이징(Anti-Aging)-1-젊음, 아름다움에 투자를 아끼지 않은 시대, Market Issue, 2015. 의료기기정보기술지원센터, 성형용 필러, 의료기기 안정성정보지, 6, 1~3, 2015. 조양하, et al., 성형용 필러 안전사용을 위한 안내서, 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 의료기기심사부, 2015. 홍기웅, 히알루론산 필러에 대한 최신지견, 제31차 대한미용성형외과학회, 2013. Kang I.G., Recent Knowledge of Facial Plastic and Reconstructive Surgery, Korean J. Otorhinolaryngol-Head Neck Surg., 58(6), 378-388, 2015.
본 발명의 목적은 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 핵산, 키토산 및 히알루론산이 10 내지 1000 : 1 : 10 내지 1000 중량비율로 혼합된 조성물 일 수 있다.
상기 조성물은 핵산, 키토산 및 히알루론산이 25 내지 100 : 1 : 25 내지 100 중량비율로 혼합된 조성물 일 수 있다.
상기 조성물은 핵산 및 히알루론산이 1 : 5 내지 5 : 1 중량비율로 혼합된 조성물일 수 있다.
상기 핵산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%일 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 핵산은 분자량이 1kDa 내지 100,000kDa일 수 있다.
상기 핵산은 분자량이 10kDa 내지 10,000kDa일 수 있다.
상기 핵산은 분자량이 50kDa 내지 3,500kDa일 수 있다.
상기 키토산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.00001중량% 내지 0.3중량%일 수 있다.
상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa일 수 있다.
상기 히알루론산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%일 수 있다.
상기 히알루론산은 분자량이 20kDa 내지 3000kDa일 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 핵산 저장용액(stock solution)을 제조하는 단계; ii) 키토산 저장용액을 제조하는 단계; iii) 상기 i) 단계의 핵산 저장용액 및 상기 ii)단계의 키토산 저장용액을 혼합하여 교반하는 단계; iv) 상기 iii) 단계의 핵산 및 키토산 혼합액에 히알루론산 원료를 넣고 혼합하여 핵산, 키토산 및 히알루론산의 중량비율이 10 내지 1000 : 1 : 10 내지 1000이 되도록 혼합하여 교반하는 단계; 및 v) 상기 iv) 단계의 핵산, 키토산 및 히알루론산 혼합액을 교반하면서 상온으로 낮추는 단계; 로 이루어진 조직 증강용 충전 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은, i) 핵산을 완충용액(buffer)에 넣고 70℃ 내지 80℃에서 교반하면서 1시간 내지 3시간 동안 용해시켜 핵산 저장용액을 제조하는 단계; ii) 키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 단계; iii) 상기 i) 단계의 핵산 저장용액 및 상기 ii) 단계의 키토산 저장용액을 혼합하여 60℃ 내지 80℃에서 20분 내지 1시간 동안 교반하는 단계; iv) 상기 iii) 단계의 핵산 및 키토산 혼합액에 히알루론산 원료를 첨가하여 핵산, 키토산 및 히알루론산 혼합액의 중량비율이 10 내지 1000 : 1 : 10 내지 1000이 되도록 혼합하여 55℃ 내지 65℃에서 1시간 내지 2시간 동안 교반하는 단계; 및 v) 상기 iv) 단계의 핵산, 키토산 및 히알루론산 혼합액을 2시간 내지 4시간 동안 교반하면서 온도를 상온으로 낮추는 단계;로 이루어질 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
상기 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물은 핵산, 키토산 및 히알루론산의 중량비율이 10 내지 1000 : 1 : 10 내지 1000의 범위인 것이 바람직하며, 핵산, 키토산 및 히알루론산의 중량비율이 25 내지 100 : 1 : 25 내지 100인 것이 보다 바람직하다.
상기 조성물은 핵산 및 히알루론산이 1 : 5 내지 5 : 1 중량비율로 혼합된 조성물일 수 있다.
상기 핵산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%일 수 있다.
상기 핵산은 분자량이 1kDa 내지 100,000kDa의 핵산일 수 있다. 바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa이고, 가장 바람직하게는 50kDa 내지 3,500kDa일 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 디옥시리보핵산일 수 있다.
또한, 상기 디옥시리보핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonuclotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide)일 수 있다.
상기 키토산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.00001중량% 내지 0.3중량%일 수 있다.
상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 히알루론산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%일 수 있다.
상기 히알루론산은 분자량이 20kDa 내지 3000kDa일 수 있다.
상기 조직 증강용 충전 조성물의 제조방법은, i) 핵산을 완충용액(buffer)에 넣고 70℃ 내지 80℃에서 교반하면서 1시간 내지 3시간 동안 용해시켜 핵산 저장용액을 제조하는 단계; ii) 키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 단계; iii) 상기 i) 단계의 핵산 저장용액 및 상기 ii) 단계의 키토산 저장용액을 혼합하여 60℃ 내지 80℃에서 20분 내지 1시간 동안 교반하는 단계; iv) 상기 iii) 단계의 핵산 및 키토산 혼합액에 히알루론산 원료를 첨가하여 핵산, 키토산 및 히알루론산 혼합액의 중량비율이 10 내지 1000 : 1 : 10 내지 1000이 되도록 혼합하여 55℃ 내지 65℃에서 1시간 내지 2시간 동안 교반하는 단계; 및 v) 상기 iv) 단계의 핵산, 키토산 및 히알루론산 혼합액을 2시간 내지 4시간 동안 교반하면서 온도를 상온으로 낮추는 단계;를 포함하는 제조방법일 수 있다.
상기 핵산 저장용액 제조 시 이용할 수 있는 완충용액으로는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨(sodium chloride), 염화마그네슘(magnesium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 인산 완충 식염수(phosphate buffer sline) 또는 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid) 완충용액이 있으며, 바람직하게는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate)를 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 키토산 저장용액 제조 시 이용할 수 있는 산성 완충용액으로는 아세트산(acetic acid), 염산(hydrochloric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 젖산(lactic acid), 질산(nitric acid)이 있으며, 바람직하게는 아세트산(acetic acid)을 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물은 온도 감응성 하이드로겔일 수 있다. 온도감응성 하이드로겔이라는 것은 온도에 따라 졸(sol) 겔(gel)로 또는 겔이 졸로 상전이(phase transition)가 일어나는 하이드로겔을 일컫는다.
상기 조직 증강용 충전 조성물은 주입에 의한 조직 증강 효과를 나타낼 뿐 만 아니라, 주입 부위의 주변에 섬유아세포(fibroblast)의 증식에 의한 신규 혈관과 콜라겐 생성이 나타나 새로운 조직으로 진피층, 피하조직 또는 육상층, 근막을 채워 기존의 조직 증강용 충전 조성물보다 지속적인 조직 증강 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 조직 증강용 충전 조성물을 피부의 피내 또는 피하 부위에 주입하면, 조직 증강용 충전 조성물이 겔화 되어 주입 부위의 부피가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 주입 부위의 조직학적 변화를 관찰한 결과, 주입 부위에 새로운 조직들이 생성되는 것을 알 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물을 조직 증강을 필요로 하는 부위에 처리함으로써 뛰어난 조직 증강 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 피부 조직 및 조직 증강용 충전 조성물의 탄성(A), 점성(B) 및 점탄성(C)을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 피부 조직의 구조 및 조직 증강용 충전 조성물의 투여 부위를 보여주고 있다.
도 3은 조직 증강용 충전 조성물의 투입에 따른 투입 부위의 조직학적 변화(A) 및 조직 충전 효과(B)를 관찰한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 조직 증강용 충전 조성물의 투입 후 육상층에서의 조성물 잔존 여부(A)와 표피 및 진피층에서의 조성물 잔존 여부(B)를 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물의 제조>
본 발명의 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물을 제조하기 위해 핵산 및 키토산 저장용액(stock solution)을 제조하였다.
핵산 저장용액의 경우 핵산을 130mM 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate) 완충용액에 넣고 75℃의 열교반기를 이용하여 2시간 이상 용해하여 제조하였다.
키토산 저장용액은 90mM 아세트산(acetic acid)을 이용하여 제조하였다.
제조한 핵산 및 키토산 저장용액을 혼합하여 70℃의 열교반기에서 30분간 교반하였다. 핵산 및 키토산 혼합 용액에 히알루론산 원료를 추가 혼합하여 60℃의 열교반기에서 1시간 교반 후, 3시간 동안 상온에서 교반하여 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직증강용 충전 조성물을 제조하였다. 이때, 핵산, 키토산 및 히알루론산의 농도가 하기 표 1의 농도가 되도록 혼합하였다.
구성 최종 농도(중량%) 혼합비율 (중량비율)
핵산 키토산 히알루론산 핵산 키토산 히알루론산
실시예 1-1 0.01 0.001 0.01 10 1 10
실시예 1-2 0.1 0.01 0.1 10 1 10
실시예 1-3 1 0.1 1 10 1 10
실시예 1-4 3 0.3 3 10 1 10
실시예 1-5 1.5 0.03 1.5 50 1 50
실시예 1-6 1.5 0.015 1.5 100 1 100
실시예 1-7 0.01 0.00001 0.01 1000 1 1000
실시예 1-8 0.1 0.0001 0.1 1000 1 1000
실시예 1-9 1 0.001 1 1000 1 1000
실시예 1-10 3 0.003 3 1000 1 1000
실시예 1-11 0.5 0.05 2.5 10 1 50
실시예 1-12 2.5 0.05 0.5 50 1 10
< 비교예 1. 비교 대상의 조직 증강용 충전 조성물의 제조>
하기 표 2의 비교예에 해당되는 농도가 되도록 비교 대상의 조직 증강용 충전 조성물을 제조하였다. 제조 방법은 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 진행하였다.
구성 최종 농도(중량%) 혼합비율 (중량비율)
핵산 키토산 히알루론산 핵산 키토산 히알루론산
비교예 1-1 1.5 0 0 1 0 0
비교예 1-2 1.5 0 1.5 1 0 1
비교예 1-3 1.5 0.015 0 100 1 0
비교예 1-4 0.001 0.0001 0.001 10 1 10
비교예 1-5 0.001 0.000001 0.001 1000 1 1000
비교예 1-6 1.5 0.3 1.5 5 1 5
비교예 1-7 1.5 0.00075 1.5 2000 1 2000
< 실험예 1. 조직 증강용 충전 조성물의 점탄성 측정>
본 발명의 조직 증강용 충전 조성물의 지속시간(duration), 부피(volume)와 관련성이 있는 특성인 점탄성을 확인하기 위해서 레오미터(rheometer)를 이용하였다. 이때 사용한 측정 조건은 PU20, 간격(Gap) 1㎜, 1Hz, 1% 응력-변형률(stress strain)로 25℃부터 40℃까지 1분간 1℃씩 올려주면서 G'(Pa)(탄성계수), G"(Pa)(점성계수) 및 G*(Pa)(점탄성계수)를 측정하였다.
점탄성 측정은 실시예 1 중에서 발명자의 육안검사와 주사기 충전을 통한 주입테스트를 실시하여 사용감이 가장 우수했던 실시예 1-5와 혼합 조성물 간의 비교를 위하여 비교예 1-1, 비교예 1-2 및 비교예 1-3을 선택하였으며, 측정한 결과를 도 1에 나타내었고, 이 중 36℃에서 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구성 G' (탄성) G'' (점성) G* (점탄성계수)
단위 (Pa)
실시예 1-5 270.5 208.3 341.7
비교예 1-1 44.5 3 44.67
비교예 1-2 108.1 118.9 160.7
비교예 1-3 75.28 4 75.34
도 1 및 상기 표 3에서 보여주듯이, 핵산, 키토산 및 히알루론산을 혼합한 실시예 1-5는 핵산만 있는 비교예１-1, 핵산 및 히알루론산을 혼합한 비교예 1-2 및 핵산 및 키토산을 혼합한 비교예 1-3의 조성물 보다 탄성(도 1A), 점성(도 1B), 점탄성(도 1C) 모두에서 우수한 수치를 보였으며, 실시예 1-5의 조성물이 조직 증강용 충전 조성물로 사용하기에 가장 좋은 조합임을 확인하였다. 또한, 핵산 및 히알루론산으로 이루어진 조성물에 키토산을 추가하여 혼합할 경우 조성물의 물성에 변화가 있다는 것을 알 수 있었다.
<실험예 2. 실험 동물의 준비>
동물실험은 10주령의 Sprague-Dawley계 수컷 쥐(Rat)를 영바이오(성남시, 대한민국)로부터 구입하였고, 쥐는 각 실험군마다 2마리씩 이용하였다. 스테인리스 철망 사육 상자(W×D×H가 260㎜×305㎜×210㎜)에 검역, 순화기간 동안에는 2마리씩, 관찰기간 동안에는 1마리씩 사육하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Harlan laboratories, Inc., USA)를 사용하였고 급이기에 고형사료를 넣어 자유섭취 시켰다. 음수는 수돗물을 필터유수살균기로 여과한 후 자외선을 조사하였고, 자동급수장치로 자유섭취 시켰다. 실험동물 사육실의 환경은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전 8시 점등~오후 8시 소등) 및 조도 150~300Lux로 유지하였다.
<실험예 3. 조직 증강용 충전 조성물 주입>
실험예 2에서 사육한 쥐를 이소플루란(Isoflurane)을 이용하여 호흡마취 시켰다. 마취 한 쥐의 등 부위의 털을 깎고, 베타딘 솜으로 주사부위를 소독하고 1cc의 일회용 멸균주사기와 30게이지(gage)의 바늘을 이용하여 조직 증강용 충전 조성물 0.5cc를 도 2에 표기된 것처럼 피내(intradermal, ID) 또는 피하(subcutaneous, SC) 주사하였다. 조성물 주입 후 사육 상자에서 1주일 동안 사육하면서 조직 증강용 충전 조성물의 효과, 생체 적합성, 조직 증강 등을 관찰하였다.
<실험예 4. 조직병리학적 관찰>
본 발명의 조직 증강용 충전 조성물을 피하에 주입하고 7일 후 쥐를 CO2 가스로 희생시킨 후 조성물을 주입한 등 쪽 피하부위 조직을 채취하였다. 채취된 조직은 10% 중성 완충포르말린(neutral buffered formalin)으로 24시간 이상 고정한 후 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 탈수시킨 다음 파라핀으로 침습시켰다. 침습이 끝난 조직은 5㎛ 두께로 조직 절편 하였다. 제작한 조직 절편을 Mayer's hematoxyline(Sigma, USA) 용액에 1초간 반응시킨 후, 흐르는 물에서 10분간 세척하였다. 이후 eosin(Sigma, USA) 용액에 3초간 반응시켰다. 염색이 완료된 조직은 탈수과정을 거쳐 Permount®(Fischer scientific, USA)로 봉입하였다. H&E 염색한 조직 절편을 현미경을 이용하여 조직병리학적 변화의 유무를 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보여주듯이, (A)는 본 발명의 조직 증강용 충전 조성물을 피하 주사하고 7일 경과 후에 각 조성물의 주입에 따른 조직 증강 효과를 보여주고 있다. 비교예 1-1의 조성물을 처리한 경우는 무처리군에 비하여 육상층의 아래 부위에 조직 증강이나 충전 효과가 나타남이 확인되지만, 그 효과가 크지 않았다. 반면, 비교예 1-2 및 비교예 1-3의 조성물을 주입한 경우에는 무처리한 경우에 비해 조직 층이 좀 더 두꺼워진 것으로 나타나지만, 두 군 간에는 큰 차이가 나타나지 않았다. 실시예 1-5의 조성물을 처리한 경우에는 무처리 및 비교예의 조성물을 처리한 경우에 비해 육상층의 아래 부위가 더 두꺼워지고, 조성물이 있던 자리에 새로운 조직들이 생성되어 채워지는 것처럼 나타났다. (B)의 경우에는 실시예 1-5의 조직 증강용 충전 조성물을 주입한 후 조직 충전 효과를 보여주고 있다. 즉, 조직 증강용 충전 조성물이 있던 부위에 세포들이 채워지면서 층이 생성되어 조직의 치밀도가 높아지는 것을 보여주고 있다. 이는 본원발명의 조직 증강용 충전 조성물이 단순히 겔화 되어 조직 증강 효과를 나타내는 것이 아니라, 조직 생성을 통한 조직 증강 효과를 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.
이를 통해, 본 발명의 조직 증강용 충전 조성물의 조직 증강 효과가 조성물의 겔화로 인한 조직의 볼륨 증가 뿐 만 아니라 조성물 주입 부위에 혈관 및 콜라겐과 같은 새로운 조직들이 생성되어 조직의 치밀도를 증가시킴으로써 조직 증강 효과를 더욱 높일 수 있다는 것을 알 수 있다.
<실험예 5. 조직 증강용 충전 조성물 주입에 따른 부피 변화 관찰>
상기 실험예 3의 방법대로 본 발명의 조직 증강용 충전 조성물을 피하 조직에 주입하고, 주입 후 3일 또는 7일차에 주사 부위를 절개하여 표피 및 진피층 또는 육상층에 남아 있는 조성물의 잔존 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보여주듯이, (A)에서는 조직 증강용 충전 조성물 주입 부위를 절개하여 표피 및 진피층 또는 육상층을 분리하고, 분리한 육상층은 포르말린으로 고정한 뒤 조직의 단면을 관찰하기 위해 반으로 잘랐다. 육상층 관찰의 경우 조직 증강용 충전 조성물을 주입하고 3일 경과 후에 실시예 1-5의 조직 증강용 충전 조성물을 주입한 마우스에서만 육상층의 부피가 증가한 것을 확인하였고, 육상층의 단면을 확인한 결과, 조직 증강용 충전 조성물에 겔 형태의 조성물이 남아 있는 것을 확인하였다. (B)에서는 조직 증강용 충전 조성물을 주입하고 7일 경과 후에 표피 및 진피층에 남아 있는 겔 형태의 조성물의 잔존 여부를 관찰하였다. 그 결과 비교예 1-1, 비교예 1-2 및 비교예 1-3의 조직 증강용 충전 조성물을 주입한 경우에는 표피 및 진피층에 남아 있는 조성물이 관찰되지 않았다. 반면에 실시예 1-5의 조직 증강용 충전 조성물을 투여한 경우에는 투명한 겔 형태의 물질이 표피 및 진피층에 남아 있는 것을 확인하였고, 이를 통해, 본 발명의 조직 증강용 충전 조성물에 의한 조직 증강 효과가 오랜 시간 동안 유지될 수 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하며,
    상기 핵산, 키토산 및 히알루론산이 25 내지 100 : 1 : 25 내지 100 중량비율인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 핵산 및 히알루론산이 1 : 5 내지 5 : 1 중량비율인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 분자량이 1kDa 내지 100,000kDa인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 핵산은 분자량이 10kDa 내지 10,000kDa인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 핵산은 분자량이 50kDa 내지 3,500kDa인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 키토산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.00001중량% 내지 0.3중량%인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa인 것 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산은 분자량이 20kDa 내지 3000kDa인 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물.
  14. 제1항에 기재된 조직 증강용 충전 조성물의 제조방법으로서,
    i) 핵산을 완충용액(buffer)에 넣고 70℃ 내지 80℃에서 교반하면서 1시간 내지 3시간 동안 용해시켜 핵산 저장용액을 제조하는 단계;
    ii) 키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 단계;
    iii) 상기 i) 단계의 핵산 저장용액 및 상기 ii) 단계의 키토산 저장용액을 혼합하여 60℃ 내지 80℃에서 20분 내지 1시간 동안 교반하는 단계;
    iv) 상기 iii) 단계의 핵산 및 키토산 혼합액에 히알루론산 원료를 첨가하여 핵산, 키토산 및 히알루론산 혼합액의 중량비율이 25 내지 100 : 1 : 25 내지 100이 되도록 혼합하여 55℃ 내지 65℃에서 1시간 내지 2시간 동안 교반하는 단계; 및
    v) 상기 iv) 단계의 핵산, 키토산 및 히알루론산 혼합액을 2시간 내지 4시간동안 교반하면서 온도를 상온으로 낮추는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 증강용 충전 조성물의 제조 방법.
  15. 삭제
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