JP4347062B2 - Polynucleotide, polypeptide and method for producing polypeptide - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、新規なプロテアーゼの遺伝子機能を有するポリヌクレオチド、かかるプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、及びかかるプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。
背景技術
従来、ペプチド中の塩基性アミノ酸残基に作用し、そのペプチド結合を加水分解するプロテアーゼには、アルギニン残基、リジン残基の双方に作用する動物由来のトリプシンが知られており、そのプロテアーゼとしての作用が食品分野での蛋白質分解物の製造、工業分野での皮革製造、生絹の処理等に利用されている他、その血液凝固、血圧低下、抗炎症作用は医療分野で利用されている。またアルギニン残基、リジン残基の双方に作用する微生物由来のトリプシン様のプロテアーゼも知られている（特開２０００−１１６３７７号）。
しかし、上記のアルギニン残基、リジン残基の双方に作用するプロテアーゼでは基質特異性が広く、蛋白質に作用させると該蛋白質の低分子化を生じ、蛋白質が本来有している乳化性、保水性等の機能性が消失すると言う問題があった。かかる事情から、食品業界においては、ハム、ソーセージや水産練り製品、低アレルゲン性の卵製品や豆腐等の製造用途に供される大豆蛋白、小麦蛋白、卵蛋白等の分解物の乳化性、保水性、溶解性、分散性等の機能性を選択的に調節し、当該機能性の多様化を図ることができるプロテアーゼ、即ち蛋白質を極めて限定的に分解して蛋白質の機能性の改善ができる基質特異性の狭いプロテアーゼの開発が要望されている。
一方、例えばアルギニン残基に特異的に作用するプロテアーゼとして、人、猿、ハムスター等の動物細胞中に存在するプロテアーゼ（プロプロテイン・コンバターゼ）が知られているが（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８，ｐ３４９−３６８）、動物由来のプロテアーゼには、動物臓器の供給量に制限があると共に狂牛病等のプリオン病の懸念もあるため、量産性のある微生物に由来する新規なプロテアーゼの開発が強く要望されている。

発明の開示
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、プロテアーゼとしての基質特異性が狭く、量産性のある微生物に由来する新規なポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供することを課題とする。そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来の菌株が新規なプロテアーゼを生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、第１に、配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。又、配列番号１に示す塩基配列又はこれと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、プロテアーゼ遺伝子、好ましくはセリンプロテアーゼ遺伝子もしくはシステインプロテアーゼ遺伝子として機能するポリヌクレオチドをも提供する。
上記において「ポリヌクレオチド」とは１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを言う。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、公知の適宜なハイブリダイゼーション法において、以下の条件下で一方のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）又は該ポリヌクレオチドの断片に対して他方のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）がハイブリダイズできることを言う。即ち、フィルターに固定化された一方のポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの断片に対し、０．７〜１ＭのＮａＣｌの存在下、所定温度（Ｘ°Ｃ）下で他方のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用いてＸ°Ｃの条件下でフィルターを洗浄した場合に、他方のポリヌクレオチドを同定できることを言う。そして「Ｘ°Ｃ」とは、少なくとも５０°Ｃ以上であり、より好ましくは６０°Ｃ以上であり、更に好ましくは６５°Ｃ以上である。
本発明は、第２に、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。又、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて５個以下の任意のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、プロテアーゼ活性を示すポリペプチドをも提供する。更に、上記各種のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをも提供する。
本発明は、第３に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌株を栄養培地に培養し、培地中に上記各種のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを生成蓄積させ、これを精製採取するポリペプチドの製造方法を提供する。前記菌株としてはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）種に属する菌株が特に好ましく、アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９株がとりわけ好ましい。

発明の実施形態
先ず、本発明のポリペプチド（プロテアーゼ）の製造法について説明する。本発明のポリペプチド（以下「本酵素」ともいう。）は、アスペルギルス属に属する菌株を栄養培地で培養し、培地中に本酵素を生成蓄積させ、これを精製採取して得ることができる。アスペルギルス属に属する菌株としては、本酵素生産能を有するものであればいかなる菌株でも使用することができ、これらの菌株の変異株も使用することができる。好ましい菌株としては、アスペルギルス・オリゼー種に属する菌株及びこれらの菌株の変異株が挙げられる。本酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えば、アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９１３として２００２年２月２５日に経済産業省・工業技術院・生命工学工業技術研究所・特許微生物寄託センターへ国際寄託）菌株が挙げられる。本菌株の菌学的性質は次の通りである。
１．
形態
分生子頭：放射状。
分生子柄：粗面、１３００〜２０００×５〜１０μｍ。
頂のう：フラスコ形、直径１１〜２２μｍ、上部１／２〜３／４よりフィアライドあるいはメトレを形成。
フィアライド：アンプル形、９〜１８×４〜５μｍ。
メトレ：形成する場合メトレ先端にフィアライドを形成、６〜１２×４〜６μｍ。
分生子：球状〜亜球状、滑面〜不規則な粗面（光学顕微鏡下）、裂片状〜編目状（走査型電子顕微鏡下）、４〜８×４〜６μｍ。
２．
生育状態
マルトエキス寒天平板培地：黄色がかった灰色〜灰緑色の表面色調である。裏面は黄色がかった灰色である。
ツァペックイーストエキス寒天平板培地：黄色がかった灰色〜白色の表面色調である。裏面は黄色がかった灰色である。
本菌株は、その集落の色調及び組織、分生子形状構造、分生子の形状及び表面構造等から、アスペルギルス・オリゼー種に分類され、アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９菌株として、東京大学分子細胞生物学研究所ＩＡＭカルチャーコレクションにおいて分譲可能なように保存され、何人も容易に入手することができる。
次に、アスペルギルス属菌の培養法しては、液体培養法、固体培養法のいずれも使用することができる。固体培養法の場合、培地としては、通常は小麦ふすま培地が用いられ、水を小麦ふすま１００重量部に対して４０〜２００重量部、好ましくは６０〜１２０重量部の割合で添加する。必要ならば、その際の培地添加物として黄粉、大豆粉等の有機窒素源或いは硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源を添加することができる。培養条件としては、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃で、２４〜１２０時間培養を行い、培養後得られたふすま麹より水又はｐＨ５〜８の緩衝液を用いて抽出し、遠心分離、ろ過等により、本酵素（プロテアーゼ）を含む抽出液（以下「粗酵素液」ともいう。）を得る。
液体培養法の場合、培地としては、当該菌株が良好に生育し、本酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩類、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地があげられる。例えば、炭素源としては、澱粉またはその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげられる。
窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー又は大豆もしくは大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
そして、無機塩類としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
培養は振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で培地をｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜８に調製し、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃で、２４〜９６時間培養する。培養後菌体を遠心分離、ろ過等により除去し、粗酵素液を得る。
次に、上記の固体培養法及び液体培養法により得られた粗酵素液からの本酵素の精製には、酵素の精製に用いられる通常の方法、即ち、硫安塩析法、アルコール分画法、各種クロマトグラフィー（イオン交換樹脂、疎水クロマト用樹脂、アフィニティクロマト用樹脂、ゲルろ過用樹脂等によるクロマトグラフィー）等による精製法を適宜組み合わせて用いることができ、該精製法により高純度の本酵素を得ることができる。
更に、本酵素は、該酵素を夾雑物として含む市販の酵素製剤から上記精製法により得ることができる。市販の酵素剤としては、アスペルギルス・オリゼー種の微生物から製造されたプロテアーゼ「アマノ」Ａ（天野エンザイム株式会社製）、プロテアーゼ「アマノ」Ｍ（天野エンザイム株式会社製）等を用いることができる。該市販の酵素製剤からの本酵素の精製は、該市販の酵素製剤をｐＨ４〜ｐＨ７の緩衝液に溶解後、酵素の精製に用いられる通常の方法、即ち、硫安塩析法、アルコール分画法、各種クロマトグラフィー（イオン交換樹脂、疎水クロマト用樹脂、アフィニティクロマト用樹脂、ゲル濾過用樹脂等によるクロマトグラフィー）による精製法等を適宜組み合わせることにより行うことができ、これにより高純度の本酵素を得ることができる。
実施例
〔実施例１：アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９による本酵素の培養〕
ポテトデキストロース寒天培地（極東製薬製）に３０℃、５日間培養したアスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９を、滅菌した８ｇの小麦ふすま懸濁液１００ｍＬ（ｐＨ５．６）を入れた培養フラスコに接種し、３０℃、４０時間、１４０ｒｐｍの条件下振盪培養し、種培養とした。
これを小麦ふすま１０００ｇに９００ｍＬ（９００ｇ）の水を散水し、殺菌した培地に全量接種し、３０℃にて６８時間、静置培養して本酵素を産生させた。培養後、水４２００ｍＬを加え、産生した酵素を抽出し、粗酵素液３０００ｍＬを得た。
〔実施例２（実施例１の粗酵素液からの本酵素の精製〕
実施例１で得た粗酵素液を分画分子量６０００の限外ろ過膜で３００ｍＬまで濃縮し、冷エタノール１２００ｍＬを添加し粗酵素沈殿物を得た。該粗酵素沈殿物を遠心分離により分取後真空乾燥し、６０ｇの粗酵素粉末を得た。この粗酵素粉末の本酵素活性はキログラム当たり１９．１ｎｋａｔであった。得られた粗酵素粉末６０ｇを緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）２００ｍＬに溶解後、硫酸アンモニウム分画（５０％飽和）を行った。沈殿物を４℃、６０００×ｇの条件で３０分間遠心分離を行い、上清をフェニールトヨパール６５０ＭＭ（東ソー株式会社製）に添加し、吸着した蛋白を硫酸アンモニウム濃度１．４モル〜０モルのリニアグラジエントで溶出した。溶出した酵素活性画分を回収し、アルギニン−セファロース４Ｂ（アマジャム・ファルマシア社製）に添加し、０．１モル〜０．３モルの食塩濃度でリニアグラジエント溶出を行い、酵素活性画分を回収した。この酵素溶液をＵＦ膜（ミリポア社製）で濃縮を行い、次いでスーパーロース６（アマジャム・ファルマシアバイオテク社製）に添加し、活性画分を回収し精製酵素液（以下「本酵素液」ともいう。）を得た。精製酵素の活性は２８．８（ｍｋａｔ／ｋｇ 蛋白質）であった。収率は０．９％であり、純度は５１０倍に増加した。
酵素活性測定法（Ｚ−アルギニル−アルギニンＭＣＡ法）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度のクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）０．９４５ｍＬに０．０５ｍＬの酵素液を加え、３０℃で１０分間加温する。これに１０ｍｍｏｌ／ｌ濃度のＺ−アルギニル−アルギニンＭＣＡ（Ｚ−アルギニル−アルギニンと７−アミノ−４−メチルクマリンとの脱水縮合体）溶液を０．００５ｍＬ添加し酵素反応を開始する。蛍光光度計を用いて、本酵素による加水分解により遊離される７−アミノ−４−メチルクマリン（以下、「ＡＭＣ」という。）量を励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで蛍光強度の増加を経時的に測定する。上記反応条件下、１秒間あたり１モルのＡＭＣを遊離させる本酵素量を１ｋａｔａｌ（ｋａｔ）とした。
〔実施例３：市販酵素剤からの本酵素の精製〕
市販酵素剤のプロテアーゼＭ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製）２０ｇを緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）２００ｍＬに溶解後、硫酸アンモニウム分画（５０％飽和）を行った。沈殿物を４℃、６０００×ｇの条件で３０分間遠心分離を行い、上清をフェニールトヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）に添加し、吸着した蛋白を硫酸アンモニウム濃度１．４モル〜０モルのリニアグラジエントで溶出した。溶出した酵素活性画分を回収し、アルギニン−セファロース４Ｂ（アマジャム・ファルマシア社製）に添加し、０．１モル〜０．３モルの食塩濃度でリニアグラジエント溶出を行い、酵素活性画分を回収した。この酵素溶液をＵＦ膜（ミリポア社製）で濃縮を行い、次いでスーパーロース６（アマジャム・ファルマシア社製）に添加し、活性画分を回収し本酵素液を得た。本酵素の活性は２９．８（ｍｋａｔ／ｋｇ蛋白質）であった。収率は０．４％であり、純度は１０６倍に増加した。本酵素は糖鎖が結合した糖蛋白質であるので、糖鎖をＮ−グリカナーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）で分解した後に、蛋白質部分のみをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図１の（３）のように、単一なバンドであり、分子量は６１３００であった。
〔実施例４：本酵素の理化学的性質〕
（１）作用・基質特異性
表１に示したペプチド研究所製の各合成基質を用いて、実施例３で得られた本酵素の基質特異性を測定した。即ち、５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ４．０、クエン酸緩衝液）０．９４５ｍＬと本酵素液０．０５ｍＬを混合後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の各合成基質液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．０、クエン酸緩衝液）を０．００５ｍＬ添加し、酵素反応を開始する。蛍光光度計を用いて、本酵素による加水分解により遊離されるＡＭＣ量を励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで蛍光強度の増加を経時的に測定し活性を算出した。Ｚ−アルギニル−アルギニンＭＣＡに対する活性を１００％として、相対値で表した。その結果、表１に示すように、本酵素はＭＣＡに隣接するアミノ酸残基（以下「Ｐ１アミノ酸残基」という。）のうちで、ペプチド結合を１個有するペプチドであるＡｒｇ−ＭＣＡ、Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｌｅｕ−ＭＣＡ、Ｐｈｅ−ＭＣＡ、Ａｌａ−ＭＣＡ、Ｍｅｔ−ＭＣＡ、Ｐｙｒ−ＭＣＡの各Ｐ１エアミノ酸残基には作用しなかった。
また、ペプチド結合を２個以上有するペプチドのうち、Ｐ１アミノ酸残基が酸性アミノ酸のアスパラギン酸残基であるＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＭＣＡ、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＭＣＡ、グルタミン酸残基であるＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＭＣＡ、Ｐ１アミノ酸残基が中性アミノ酸のグリシン残基であるＺ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＭＣＡ、チロシン残基であるＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ、ロイシン残基であるＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＭＣＡ、フェニールアラニン残基であるＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、アラニン残基であるＳｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＭＣＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡにも本酵素は作用しなかった。
さらに、ペプチド結合を２個以上有するペプチドのうち、Ｐ１アミノ酸残基が塩基性アミノ酸のプロリン残基であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ、Ｓｕｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ、トリプトファン残基であるＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−ＭＣＡに本酵素は作用を示さなかった。また、塩基性アミノ酸残基がリジン残基であるＢｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡについては、本酵素は、僅かな相対活性で作用を示したものの、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡについては、作用を示さなかった。
一方、ペプチド結合を２個以上有するペプチドのうち、Ｐ１アミノ酸残基が塩基性アミノ酸のアルギニン残基であるＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡについては、本酵素は幅広い相対活性で作用し、該アルギニン残基のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解した。
以上のように、本酵素は、ペプチド結合を２個以上有するペプチドであってＰ１アミノ酸残基が塩基性アミノ酸のアルギニン残基であるペプチドに対し作用し、ペプチド結合を１個有するペプチドには作用せず、またペプチド結合を２個以上有するペプチドであってＰ１アミノ酸残基が中性、酸性及びアルギニン以外の塩基性アミノ酸残基であるペプチドに対しては、リジン残基に対して僅かに作用したことを除き、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、チロシン、アラニン、プロリン、ロイシン、フェニールアラニン、トリプトファンの各アミノ酸残基を切断しないことから、アルギニンに対して極めて高い加水分解特異性を有していることが明らかになった。
【表１】
表１中の用語について、以下に説明する。
ＭＣＡ ：４−メチルクマリンアミド（４−メチル−７−アミノクマリンとの脱水縮合体）
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチロキシカルボニル
Ｚ
：ベンジルオキシカルボニル
Ｐｙｒ ：ピログルタミル
ＯＢｚｌ：ベンジルオキシ
Ａｃ ：アセチル
Ｓｕｃ ：サクシニル
（２）至適ｐＨ
ｐＨ２〜４の５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液、ｐＨ５の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８の５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ９〜１０の５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液のそれぞれ０．９４５ｍＬに本酵素液の０．０５ｍＬを混合後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の各合成基質液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．０、クエン酸緩衝液）を０．００５ｍＬ添加し、酵素反応を開始する。蛍光光度計を用いて、本酵素による加水分解により遊離されるＡＭＣ量を励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで蛍光強度の増加を経時的に測定し活性を算出した。最も活性の高い所を１００％として、各ｐＨで相対活性を算出し至適ｐＨを求めた。図２に示すように、至適ｐＨはｐＨ４を中心に存在していることから、該至適ｐＨを約４とした。
（３）ｐＨ安定性
ｐＨ２〜４の１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液、ｐＨ５の１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ９の１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液に溶解した本酵素液を３０℃に３０分間放置後、ｐＨを４．０にし酵素活性を測定した。その結果、図３に示すようにｐＨ３〜６の範囲で元の活性の９０％以上を維持していた。従って、本酵素は少なくともｐＨ３〜６の範囲で安定である。
（４）温度安定性
ｐＨ４の５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液に溶解した本酵素液を１０〜７０℃に１０分間放置した後、酵素活性を測定した。その結果、図４に示すように、４０℃以下の温度において元の活性の７０％以上を維持していた。従って、本酵素は４０℃以下で安定である。
（５）阻害剤
阻害剤として、シグマアルドリッチジャパン株式会社製のセリンプロテアーゼ阻害剤であるフェニールメタンスルホニルフルオライド、ｏ−フェナンスロリン、ロイペプチン、アンチパイン、システインプロテアーゼ阻害剤であるｐ−クロロマーキュリー安息香酸、Ｎ−エチルマレイミド、ロイペプチン、アンチパイン及び金属プロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸を用いて検討を行った。なお、阻害剤の濃度は表２に示した各濃度の条件下で行った。３０℃で３０分間放置後に酵素活性を測定した。その結果、表２に示すように、ロイペプチン及びアンチパインにより、酵素活性が阻害されたことから、本酵素はセリンプロテアーゼ又はシステインプロテアーゼと示唆された。
【表２】
（６）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行った。標準蛋白質（括弧内に分子量を示す。）としては、ニューイングランドバイオラボ社製のマルトースバインディングプロテインヒュースドベーターガラクトシダーゼ（１５８０００）、ベーターガラクトシダーゼ（１１６０００）、ホスフォリラーゼｂ（９７２００）、牛血清アルブミン（６６４００）、グルタミン酸脱水素酵素（５５６００）、マルトースバインディングプロテイン（４２７００）、乳酸脱水素酵素（３６５００）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（２６６００）を使用し、ゲル染色は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０（ファルマシアＬＫＢ製）を用いたＣＢＢ染色で行った。電気泳動図を図１に示した。その結果、本酵素は図１の（２）に示したように、約７００００から１０００００の広い分子量を示していた。本酵素は糖鎖が結合した糖蛋白質であるので、糖鎖をＮ−グリカナーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で分解した後に蛋白質部分のみを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図１の（３）に示したように、単一なバンドであり、分子量は６１３００であった。
〔実施例５：本酵素のゲノムＤＮＡ取得〕
１）部分アミノ酸配列決定
アミノ酸配列の決定は島津製作所（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）のプロテインシークエンサーＰＰＳＱ−２３を用いた。本酵素のＮ末端配列はＧＬＮ（Ｔ）ＶＴＮＴＤＱＬＩＴＰＥＸＩＲＡＬＹＫＩＰＳＡＸＡＡＰであった。内部配列はピリジルエチル化した本酵素をリジルエンドペプチダーゼ処理により断片化した後、本酵素のペプチド断片をＨＰＬＣにより分離し、配列を決めた。内部配列はＸＨＮＰＰＹＰＹＹＸＧＡＸＮＬであった。Ｘは特定されなかったアミノ酸を示す。
２）プローブ作製
Ｎ末端配列の中ＮＴＤＱＬＩＴＰの配列をベースにセンスプライマーａｏ−Ｎ（５’−ＡＡＹＡＣＩＧＡＹＣＡＲＹＴＩＡＴＨＡＣＮＣＣ−３’）を作製した。また、内部配列ＮＰＰＹＰＹＹをベースにアンチセンスプライマーａｏ−Ｃ１（５’−ＲＴＡＲＴＡＩＧＧＲＴＡＩＧＧＮＧＧＲＴＴ−３’）を作製した。（ここでＹはＴかＣ，Ｉはイノシン酸、ＲはＡかＧ、ＨはＴかＣかＡ，ＮはＡかＣかＴかＧを示す）。プライマーａｏ−Ｎ及びａｏ−Ｃ１を用い、アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応はＴＯＹＯＢＯのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用い、９５℃で３分間ＤＮＡを変性した後、９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、６８℃で２分間を２５サイクル行った。その結果、１．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅したので、このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＥｃｏ ＲＶ部位へサブクローニングし塩基配列を決定した。塩基配列から予想されるアミノ酸配列はａｏ−Ｎプライマー配列の後に続いてＮ末端アミノ酸配列ＥＣＩＲＡＬＹＫＩＰＳＡＲＡＡＰをコードしていたので、このＤＮＡ断片は目的のものと判断し、ＤＮＡクローニングの際にプローブとして用いた。
３）ライブラリー作製
アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９のゲノムＤＮＡをＳａｕ ３ＡＩで部分分解し、約１５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ベクターとしてはＴＯＹＯＢＯのλＤＡＳＨ ＩＩを用いＢａｍ ＨＩ部位へＤＮＡ断片をライゲーションした。このライゲートをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔによりパッケージングし、宿主大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）を用いて１回増幅した。
４）クローニング
プラークハイブリダイゼーションにより陽性クローンを得た。プローブのラベルはロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製のＤＩＧ ｌａｂｅｌ ｓｙｓｔｅｍを用いた。組換えファージＤＮＡから目的のＤＮＡ断片を含む４ｋｂ Ｘｂａ Ｉ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−へサブクローニングし塩基配列の決定に用いた。
５）塩基配列決定の決定には、日立製作所（ＨＩＴＡＣＨＩ）のＳＱ−５５００ ＤＮＡシークエンサーを用いた。
〔実施例６：本酵素のｃＤＮＡ取得等〕
１）
本鎖ｃＤＮＡの作製
アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６０９の培養菌体から全ＲＮＡを精製した（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ使用）。次にアンカーＴプライマー（５’−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）と、ＡＭＶ逆転写酵素を用い、全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
２）２本鎖ｃＤＮＡの作製
ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡの増幅を行った。鋳型としては１本鎖ｃＤＮＡ、プライマーはＡｐａ−Ｓｐｅ２（５’−ＡＡＴＣＴＣＧＣＡＴＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＴＧ−３’）とアンカー（５’−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応はＴＯＹＯＢＯ社製のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用い、９５℃で３分間ＤＮＡを変性した後、９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、６８℃で２分間を２５サイクル行った。その結果、２．２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅したので、このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＳｐｅ Ｉ，Ｃｌａ Ｉ部位へサブクローニングし塩基配列を決定した。
３）遺伝子配列の解析
ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの配列を比較することにより、プロモーター配列及びイントロンを決定した。この遺伝子は８個のイントロンを含んでいた。
４）全アミノ酸配列の決定
ｃＤＮＡの塩基配列から本酵素の全アミノ酸配列を推定した。この遺伝子は６５２アミノ酸残基をコードしており、成熟タンパク質は４３７アミノ酸からなっていた。
〔実施例７：プラスミノーゲンの活性化〕
１）
プラスミノーゲンの精製
市販プラスミノーゲン（ＲＯＣＨＥ）は安定化のため多量のＢＳＡが入っているので精製を試みた。５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４に調整された１ｍｇ／ｍｌプラスミノーゲン２００μｌを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＬｙｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（１．０×１０ｃｍ）に供し、同緩衝液でよく洗浄する。０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）でさらによく洗浄し、０．２Ｍ ε−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｃａｐｒｏｎｉｃ ａｃｉｄにて溶出した。溶出画分を１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．４）で透析し、ε−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｃａｐｒｏｎｉｃ ａｃｉｄを除いた。この画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一性を確認した。
２）
プラスミノーゲンの活性化
精製したプラスミノーゲン４５０μｌに本酵素希釈液５０μｌを加え混合し、３７℃で各時間反応させた後、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５００μｌを加えることにより本酵素の酵素反応を停止した。これに１０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ基質５μｌを加え活性化されたプラスミンの酵素反応を開始した。基質から遊離されるＡＭＣの量を島津製作所製のＲＦ５０００型分光蛍光光度計を用いて、励起波長３６０ｎｍと蛍光波長４４０ｎｍで測定した。プラスミンの活性は３７℃、ｐＨ７．５で測定した。その結果、本酵素は１０分間反応でプラスミンノーゲンの活性化を最大にした。その以上の反応ではプラスミンの活性が徐々に下がっていたことから、活性化されたプラスミンを分解して行くものと考えられた。
産業上の利用分野
本発明の新規ポリペプチドは、蛋白質中のアルギニン残基のカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ活性を示すことから、蛋白質を極めて限定分解して、蛋白質の機能性の改善ができる。具体的には、水に対して溶解性が低い小麦や大豆の蛋白質を分解して、蛋白質の有する乳化性、保水性等の機能性を保持したまま、溶解性を向上させることが挙げられ、ハム、ソーセージや水産練り製品等の増量剤として食品用途で利用され得る。
また、アルギニン残基を活性中心に有する蛋白質を、そのアルギニン残基部位で加水分解することにより、蛋白質を不活性化することができる。具体的には、大豆中の大豆トリプシンインヒビターを分解して不活性化ができ、消化性の良い大豆蛋白質を製造させうる。
さらに、アルギニン残基をアレルゲン性の活性中心とする蛋白質を加水分解してアレルゲン性を低減させ、低アレルゲン性の卵製品、豆腐等の食品製造の用途に利用され得る。このように本発明の新規プロテアーゼは、広く食品用に利用され得る。
また、遺伝子組替えによる蛋白質の機能性の発現にも利用されうる。機能性の蛋白質は、機能性を有しないプロ蛋白質として生産されるが、この蛋白質のアルギニン残基を分解することにより、機能性を有する蛋白質に変換することができる。例えば、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化することを例示できる。
（配列表）

【図面の簡単な説明】
第１図は本発明に係るプロテアーゼのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。第２図は本発明に係るプロテアーゼのｐＨ特性を示す図である。第３図は本発明に係るプロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。第４図は本発明に係るプロテアーゼの温度安定性を示す図である。Technical field
The present invention relates to a polynucleotide having a novel protease gene function, a polypeptide having such a protease activity, and a method for producing a polypeptide having such a protease activity.
Background art
Conventionally, animal-derived trypsin that acts on both arginine and lysine residues has been known as a protease that acts on basic amino acid residues in peptides and hydrolyzes the peptide bonds. Are used for the production of protein degradation products in the food field, the production of leather in the industrial field, the treatment of raw silk, and the like, and its blood coagulation, blood pressure lowering and anti-inflammatory effects are used in the medical field. A trypsin-like protease derived from a microorganism that acts on both arginine residues and lysine residues is also known (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-116377).
However, proteases that act on both the arginine and lysine residues described above have wide substrate specificity. When they act on a protein, the protein is reduced in molecular weight, and the inherent emulsifiability and water retention properties of the protein. There has been a problem that the functionality such as the above disappears. For this reason, in the food industry, the emulsifiability and water retention of decomposed products such as ham, sausage, fish paste products, low allergenic egg products and tofu, etc. Protease that can selectively adjust functionality such as solubility and dispersibility, and diversify the functionality, ie, substrate-specific that can improve protein functionality by degrading protein very limitedly There is a demand for the development of proteases with narrow properties.
On the other hand, for example, a protease (proprotein convertase) present in animal cells such as humans, monkeys, and hamsters is known as a protease that specifically acts on arginine residues (Handbook of Proteolytic Enzyme, Academic Press, 1998, pp. 349-368), animal-derived proteases are limited in the amount of animal organs supplied, and there are concerns about prion diseases such as mad cow disease, so the development of novel proteases derived from mass-producing microorganisms Is strongly demanded.

Disclosure of the invention
The present invention has been made to solve the above-described problems, and has a novel substrate derived from a microorganism having a narrow substrate specificity as a protease and mass production, a polynucleotide encoding the polypeptide, and It is an object of the present invention to provide a method for producing a polypeptide having protease activity. Thus, as a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a strain derived from the genus Aspergillus produces a novel protease, and have completed the present invention.
The present invention first provides a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, it has a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary base sequence, and functions as a protease gene, preferably a serine protease gene or a cysteine protease gene A polynucleotide is also provided.
In the above, “polynucleotide” refers to single-stranded or double-stranded DNA and / or RNA. “Hybridize under stringent conditions” means that, in a known appropriate hybridization method, one polynucleotide (DNA) or the other polynucleotide (DNA) with respect to a fragment of the polynucleotide under the following conditions: ) Can hybridize. That is, one polynucleotide or a fragment of the polynucleotide immobilized on the filter is hybridized with the other polynucleotide at a predetermined temperature (X ° C) in the presence of 0.7 to 1 M NaCl. After that, when the filter is washed under an X ° C condition using an SSC solution of about 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution of 1 time concentration is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). In addition, it means that the other polynucleotide can be identified. “X ° C.” is at least 50 ° C. or more, more preferably 60 ° C. or more, and further preferably 65 ° C. or more.
Second, the present invention provides a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, a polypeptide having an amino acid sequence in which 5 or less arbitrary amino acid residues are substituted, deleted, or added in the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and exhibiting protease activity is also provided. Furthermore, polypeptides encoded by the various polynucleotides are also provided.
Thirdly, the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising culturing a strain belonging to the genus Aspergillus in a nutrient medium, generating and accumulating the polypeptides having the various protease activities in the medium, and purifying and collecting the polypeptides. I will provide a. As the strain, a strain belonging to the species Aspergillus oryzae is particularly preferable, and an Aspergillus oryzae IAM2609 strain is particularly preferable.

Embodiment of the Invention
First, a method for producing the polypeptide (protease) of the present invention will be described. The polypeptide of the present invention (hereinafter also referred to as “the present enzyme”) can be obtained by culturing a strain belonging to the genus Aspergillus in a nutrient medium, producing and accumulating the enzyme in the medium, and purifying and collecting the enzyme. As the strain belonging to the genus Aspergillus, any strain can be used as long as it has the ability to produce this enzyme, and mutant strains of these strains can also be used. Preferred strains include strains belonging to Aspergillus oryzae species and mutant strains of these strains. Specific examples of strains capable of producing this enzyme include, for example, Aspergillus oryzae IAM2609 (deposit number FERM BP-7913 on February 25, 2002, Ministry of Economy, Trade and Industry, Institute of Industrial Technology, Biotechnology Institute of Technology, Patent (International deposits at the Microbial Deposit Center). The bacteriological properties of this strain are as follows.
1.
Form
Conidia head: Radial.
Conidial pattern: rough surface, 1300 to 2000 × 5 to 10 μm.
Summit: Flask shape, diameter of 11-22 μm, phialide or metre is formed from upper part 1 / 2-3 / 4.
Fear ride: Ampoule type, 9-18 × 4-5 μm.
Metre: When forming, a phialide is formed at the tip of the metre, 6-12 × 4-6 μm.
Conidia: spherical to subspherical, smooth to irregular rough surface (under an optical microscope), shards to stitches (under a scanning electron microscope), 4 to 8 × 4 to 6 μm.
2.
Growth state
Malt extract agar plate medium: surface color tone of yellowish gray to grayish green. The back side is yellowish gray.
Czapek yeast extract agar plate medium: yellowish gray to white surface tone. The back side is yellowish gray.
This strain is classified into the Aspergillus oryzae species based on the color and structure of the colony, the conidia shape structure, the conidia shape and the surface structure, etc., and the Aspergillus oryzae IAM2609 strain is referred to as the Institute for Molecular Cell Biology IAM. It is stored so that it can be sold in the culture collection and can be easily obtained by anyone.
Next, as a culture method for Aspergillus, either liquid culture method or solid culture method can be used. In the case of the solid culture method, a wheat bran medium is usually used as a medium, and water is added in a proportion of 40 to 200 parts by weight, preferably 60 to 120 parts by weight, based on 100 parts by weight of wheat bran. If necessary, an organic nitrogen source such as yellow powder or soybean powder or an inorganic nitrogen source such as ammonium sulfate or ammonium nitrate can be added as a medium additive at that time. Culture conditions are 20 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C., for 24 to 120 hours, extracted from the bran obtained after the culture using water or a buffer of pH 5 to 8, and centrifuged. By filtration, an extract containing the present enzyme (protease) (hereinafter also referred to as “crude enzyme solution”) is obtained.
In the case of the liquid culture method, the medium may be a synthetic medium or a natural medium containing the carbon source, nitrogen source, inorganic salts, necessary nutrient sources, etc. necessary for the strain to grow well and produce the enzyme smoothly. Medium. For example, as the carbon source, carbohydrates such as starch or a composition fraction thereof, roasted dextrin, modified starch, starch derivative, physically-processed starch and α-starch can be used. Specific examples include soluble starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, dextrin, amylopectin, and amylose.
Nitrogen sources include polypeptone, casein, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, organic nitrogen source materials such as extracts such as soybean or soybean meal, inorganic salt nitrogen compounds such as ammonium sulfate and ammonium phosphate, amino acids such as glutamic acid Kind.
As inorganic salts, phosphates such as monopotassium phosphate and dipotassium phosphate, magnesium salts such as magnesium sulfate, calcium salts such as calcium chloride, sodium salts such as sodium carbonate, and the like are used.
The culture is carried out under aerobic conditions such as shaking culture and aeration and agitation culture, and the medium is adjusted to pH 4 to 10, preferably pH 5 to 8, and cultured at 20 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C. for 24 to 96 hours. . After culturing, the cells are removed by centrifugation, filtration or the like to obtain a crude enzyme solution.
Next, for purification of this enzyme from the crude enzyme solution obtained by the above solid culture method and liquid culture method, the usual methods used for enzyme purification, namely, ammonium sulfate salting out method, alcohol fractionation method, Various purification methods (chromatography using ion exchange resin, hydrophobic chromatography resin, affinity chromatography resin, gel filtration resin, etc.) can be used in combination as appropriate. Obtainable.
Furthermore, this enzyme can be obtained by the above purification method from a commercially available enzyme preparation containing the enzyme as a contaminant. As commercially available enzyme agents, protease “Amano” A (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.), protease “Amano” M (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) and the like produced from Aspergillus oryzae species microorganisms can be used. Purification of the enzyme from the commercially available enzyme preparation is performed by dissolving the commercially available enzyme preparation in a buffer solution having a pH of 4 to 7, followed by the usual methods used for enzyme purification, ie, ammonium sulfate salting-out method, alcohol fractionation method. Can be performed by appropriately combining purification methods such as chromatography using ion exchange resins, hydrophobic chromatography resins, affinity chromatography resins, gel filtration resins, etc. Obtainable.
Example
[Example 1: Cultivation of this enzyme by Aspergillus oryzae IAM2609]
Aspergillus oryzae IAM2609 cultured on potato dextrose agar medium (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) at 30 ° C. for 5 days was inoculated into a culture flask containing 100 mL of sterile 8 g wheat bran suspension (pH 5.6). The culture was performed under shaking at 140 rpm for 40 hours to prepare a seed culture.
900 g (900 g) of water was sprinkled with 1000 g of wheat bran, the whole amount was inoculated into a sterilized medium, and statically cultured at 30 ° C. for 68 hours to produce this enzyme. After cultivation, 4200 mL of water was added, and the produced enzyme was extracted to obtain 3000 mL of a crude enzyme solution.
Example 2 (Purification of the enzyme from the crude enzyme solution of Example 1)
The crude enzyme solution obtained in Example 1 was concentrated to 300 mL with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 6000, and 1200 mL of cold ethanol was added to obtain a crude enzyme precipitate. The crude enzyme precipitate was separated by centrifugation and then vacuum dried to obtain 60 g of crude enzyme powder. The enzyme activity of this crude enzyme powder was 19.1 nkat per kilogram. 60 g of the obtained crude enzyme powder was dissolved in 200 mL of a buffer solution (10 mmol / L citrate buffer solution, pH 5.0), and then ammonium sulfate fractionation (50% saturation) was performed. The precipitate is centrifuged at 6000 × g for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant is added to Phenoltoyopal 650MM (manufactured by Tosoh Corporation), and the adsorbed protein has an ammonium sulfate concentration of 1.4 to 0 mol. Elute with a linear gradient. The eluted enzyme active fraction is collected, added to arginine-Sepharose 4B (Ajamam Pharmacia), and linear gradient elution is performed at a salt concentration of 0.1 to 0.3 mol to collect the enzyme active fraction. did. This enzyme solution is concentrated with a UF membrane (Millipore), then added to Superose 6 (Amajam Pharmacia Biotech), and the active fraction is recovered and purified enzyme solution (hereinafter also referred to as “this enzyme solution”). .) The activity of the purified enzyme was 28.8 (mkat / kg protein). The yield was 0.9% and the purity increased 510 times.
Enzyme activity measurement method (Z-arginyl-arginine MCA method)
Add 0.05 mL of the enzyme solution to 0.945 mL of 50 mmol / L citrate buffer (pH 4.0), and warm at 30 ° C. for 10 minutes. To this, 0.005 mL of a 10 mmol / l Z-arginyl-arginine MCA (dehydrated condensate of Z-arginyl-arginine and 7-amino-4-methylcoumarin) solution is added to start the enzyme reaction. Using a fluorometer, the amount of 7-amino-4-methylcoumarin (hereinafter referred to as “AMC”) released by hydrolysis with the present enzyme was measured at an excitation wavelength of 360 nm and a fluorescence wavelength of 440 nm. To measure. Under the above reaction conditions, the amount of this enzyme that liberates 1 mol of AMC per second was defined as 1 katal (kat).
[Example 3: Purification of this enzyme from a commercially available enzyme agent]
20 g of commercially available enzyme agent Protease M “Amano” (manufactured by Amano Enzyme Inc.) was dissolved in 200 mL of a buffer solution (10 mmol / l citrate buffer, pH 5.0), and then ammonium sulfate fractionation (50% saturation) was performed. . The precipitate is centrifuged at 6000 × g for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant is added to Phenoltoyopal 650M (manufactured by Tosoh Corporation), and the adsorbed protein has an ammonium sulfate concentration of 1.4 to 0 mol. Elute with a linear gradient. The eluted enzyme active fraction is collected, added to arginine-Sepharose 4B (Ajamam Pharmacia), and linear gradient elution is performed at a salt concentration of 0.1 to 0.3 mol to collect the enzyme active fraction. did. The enzyme solution was concentrated with a UF membrane (Millipore) and then added to Superose 6 (Amajam Pharmacia) to collect the active fraction to obtain the enzyme solution. The activity of this enzyme was 29.8 (mkat / kg protein). The yield was 0.4% and the purity increased 106 times. Since this enzyme is a glycoprotein with a sugar chain bound thereto, as a result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of only the protein portion after degrading the sugar chain with N-glycanase (Roche Diagnostics). As shown in FIG. 1 (3), it was a single band and the molecular weight was 61300.
[Example 4: Physicochemical properties of the enzyme]
(1) Action / Substrate specificity
The substrate specificity of this enzyme obtained in Example 3 was measured using each synthetic substrate manufactured by Peptide Institute shown in Table 1. That is, after mixing 0.945 mL of 50 mmol / L (pH 4.0, citrate buffer) and 0.05 mL of the present enzyme solution, each synthetic substrate solution (50 mmol / L, pH 4.0, citrate buffer) having a concentration of 10 mmol / L. 0.005 mL of liquid) is added to start the enzyme reaction. Using a fluorometer, the amount of AMC released by hydrolysis with this enzyme was measured over time at an excitation wavelength of 360 nm and a fluorescence wavelength of 440 nm, and the activity was calculated. The activity against Z-arginyl-arginine MCA was expressed as a relative value with the activity being 100%. As a result, as shown in Table 1, this enzyme is a peptide having one peptide bond among amino acid residues adjacent to MCA (hereinafter referred to as “P1 amino acid residue”), Arg-MCA, Lys- It did not act on each P1 amino acid residue of MCA, Leu-MCA, Phe-MCA, Ala-MCA, Met-MCA, and Pyr-MCA.
In addition, among peptides having two or more peptide bonds, Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-MCA and Ac-Asp-Glu-Val-Asp-MCA in which the P1 amino acid residue is an acidic amino acid aspartic acid residue Z-Leu-Leu-Glu-MCA which is a glutamic acid residue, Z-Leu-Arg-Gly-Gly-MCA whose P1 amino acid residue is a neutral amino acid glycine residue, and Suc-Leu which is a tyrosine residue -Leu-Val-Tyr-MCA, leucine residue Z-Leu-Leu-Leu-MCA, phenylalanine residue Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA, alanine residue Suc-Ala -This enzyme does not act on Pro-Ala-MCA or Suc-Ala-Ala-Ala-MCA .
Furthermore, among peptides having two or more peptide bonds, Gly-Pro-MCA, Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA, wherein the P1 amino acid residue is a basic amino acid proline residue, tryptophan residue This enzyme had no effect on Suc-Ile-Ile-Trp-MCA. In addition, for Boc-Glu-Lys-Lys-MCA, in which the basic amino acid residue is a lysine residue, although this enzyme showed an effect with a slight relative activity, Boc-Val-Leu-Lys-MCA Had no effect.
On the other hand, among peptides having two or more peptide bonds, the P1 amino acid residue is a basic amino acid arginine residue, Boc-Leu-Arg-Arg-MCA, Z-Arg-Arg-MCA, Boc-Gly-Arg. -Arg-MCA, Boc-Gln-Arg-Arg-MCA, Pyr-Gly-Arg-MCA, Boc-Gly-Lys-Arg-MCA, Boc-Leu-Lys-Arg-MCA, Boc-Gln-Gly-Arg -MCA, Boc-Leu-Gly-Arg-MCA, Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-MCA, Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA, Boc-Leu-Thr-Arg-MCA, Z-Phe -Arg-MCA, Boc-Ala-Gly-Pro-Arg-MCA, Boc-V For 1-Pro-Arg-MCA, Boc-Asp (OBzl) -Pro-Arg-MCA, Boc-Phe-Ser-Arg-MCA, Boc-Glu- (OBzl) -Ala-Arg-MCA, this enzyme is It acted with a wide range of relative activities and hydrolyzed the peptide bond on the carboxyl group side of the arginine residue.
As described above, this enzyme acts on a peptide having two or more peptide bonds, and the P1 amino acid residue is a basic amino acid arginine residue, and acts on a peptide having one peptide bond. In addition, it has a slight effect on lysine residues for peptides that have two or more peptide bonds and whose P1 amino acid residues are neutral, acidic, and basic amino acid residues other than arginine. Aspartic acid, glutamic acid, glycine, tyrosine, alanine, proline, leucine, phenylalanine, and tryptophan amino acid residues are not cleaved. It became clear.
[Table 1]
The terms in Table 1 are described below.
MCA: 4-methylcoumarin amide (dehydrated condensate with 4-methyl-7-aminocoumarin)
Boc: t-Butyloxycarbonyl
Z
: Benzyloxycarbonyl
Pyr: pyroglutamyl
OBzl: benzyloxy
Ac: Acetyl
Suc: Succinyl
(2) Optimum pH
50 mmol / L citrate buffer at pH 2-4, 50 mmol / L acetate buffer at pH 5, 50 mmol / L phosphate buffer at pH 6-8, 50 mmol / L Tris buffer at pH 9-10 each in 0.945 mL After mixing 0.05 mL of the enzyme solution, 0.005 mL of each synthetic substrate solution (50 mmol / L, pH 4.0, citrate buffer) with a concentration of 10 mmol / L is added to start the enzyme reaction. Using a fluorometer, the amount of AMC released by hydrolysis with this enzyme was measured over time at an excitation wavelength of 360 nm and a fluorescence wavelength of 440 nm, and the activity was calculated. The relative activity was calculated at each pH with the highest activity as 100%, and the optimum pH was determined. As shown in FIG. 2, since the optimum pH exists around pH 4, the optimum pH was set to about 4.
(3) pH stability
The enzyme solution dissolved in 10 mmol / L citrate buffer at pH 2-4, 10 mmol / L acetate buffer at pH 5, 10 mmol / L phosphate buffer at pH 6-8, 10 mmol / L Tris buffer at pH 9 After standing for 30 minutes, the pH was adjusted to 4.0 and the enzyme activity was measured. As a result, as shown in FIG. 3, 90% or more of the original activity was maintained in the pH range of 3-6. Therefore, this enzyme is stable at least in the range of pH 3-6.
(4) Temperature stability
The enzyme solution dissolved in 50 mmol / L citrate buffer at pH 4 was allowed to stand at 10 to 70 ° C. for 10 minutes, and then the enzyme activity was measured. As a result, as shown in FIG. 4, 70% or more of the original activity was maintained at a temperature of 40 ° C. or lower. Therefore, this enzyme is stable at 40 ° C. or lower.
(5) Inhibitor
As inhibitors, phenylmethanesulfonyl fluoride, serine protease inhibitor produced by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd., o-phenanthroline, leupeptin, antipine, p-chloromercury benzoic acid, cysteine protease inhibitor, N-ethyl The study was conducted using maleimide, leupeptin, antipain and ethylenediaminetetraacetic acid, which is a metalloprotease inhibitor. In addition, the concentration of the inhibitor was performed under the conditions of each concentration shown in Table 2. The enzyme activity was measured after standing at 30 ° C. for 30 minutes. As a result, as shown in Table 2, since the enzyme activity was inhibited by leupeptin and antipain, this enzyme was suggested to be a serine protease or cysteine protease.
[Table 2]
(6) Molecular weight
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed according to the Laemmli method. As standard proteins (molecular weights are shown in parentheses), maltose binding protein fused beta-galactosidase (158000), beta-galactosidase (116000), phosphorylase b (97200), bovine serum albumin (66400) manufactured by New England Biolabs. ), Glutamate dehydrogenase (55600), maltose binding protein (42700), lactate dehydrogenase (36500), triose phosphate isomerase (26600), and gel staining, Coomassie Brilliant Blue This was performed by CBB staining using R-250 (Pharmacia LKB). The electropherogram is shown in FIG. As a result, the enzyme showed a wide molecular weight of about 70,000 to 100,000 as shown in (2) of FIG. Since this enzyme is a glycoprotein with a sugar chain bound thereto, the result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of only the protein portion after the sugar chain was decomposed with N-glycanase (Roche Diagnostics). As shown in FIG. 1 (3), it was a single band and the molecular weight was 61300.
[Example 5: Acquisition of genomic DNA of this enzyme]
1) Partial amino acid sequencing
The amino acid sequence was determined using a protein sequencer PPSQ-23 manufactured by Shimadzu Corporation. The N-terminal sequence of this enzyme was GLN (T) VTNTDQLITPEXIRARYKIPSAXAP. The internal sequence was fragmented by pyridylethylated enzyme by lysyl endopeptidase treatment, and then the peptide fragment of the enzyme was separated by HPLC to determine the sequence. The internal sequence was XHNPPYPYYXGAXNL. X represents an unspecified amino acid.
2) Probe production
A sense primer ao-N (5′-AAYACIGAYCARYTIATACNCC-3 ′) was prepared based on the NTDQLITP sequence in the N-terminal sequence. In addition, an antisense primer ao-C1 (5′-RTARTIGGRTAIGGNGRTT-3 ′) was prepared based on the internal sequence NPPYPYY. (here Y is T or C , I is inosinic acid, R is A or G, H is T or C or A, and N is A, C, T or G). PCR was performed using primers ao-N and ao-C1 and Aspergillus oryzae IAM2609 genomic DNA as a template. The PCR reaction was performed using TOYOBO KOD DNA polymerase, and the DNA was denatured at 95 ° C for 3 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C for 0.5 minutes, 55 ° C for 0.5 minutes, and 68 ° C for 2 minutes. As a result, a 1.1-kb DNA fragment was amplified, and this DNA fragment was subcloned into the Eco RV site of pBluescript II KS- to determine the nucleotide sequence. Since the amino acid sequence predicted from the base sequence encoded the N-terminal amino acid sequence ECIRARYKIPSARAP following the ao-N primer sequence, this DNA fragment was judged to be the target and used as a probe during DNA cloning. .
3) Library preparation
Aspergillus oryzae IAM2609 genomic DNA was partially digested with Sau 3AI to obtain a DNA fragment of about 15 kb. The DNA fragment was ligated to the Bam HI site using λDASH II of TOYOBO as a vector. The ligation was packaged with Gigapack III Gold in vitro packaging Kit and amplified once using host E. coli XL1-Blue MRA (P2).
4) Cloning
Positive clones were obtained by plaque hybridization. The probe label was a DIG label system manufactured by Roche. A 4 kb Xba I fragment containing the DNA fragment of interest from the recombinant phage DNA was subcloned into pBluescript II KS- and used to determine the base sequence.
5) The SQ-5500 DNA sequencer of Hitachi, Ltd. (HITACHI) was used for the determination of the base sequence determination.
[Example 6: cDNA acquisition of this enzyme, etc.]
1)
Preparation of single-stranded cDNA
Total RNA was purified from cultured cells of Aspergillus oryzae IAM2609 (using RNeasy Mini Kit manufactured by QIAGEN). Next, single-stranded cDNA was synthesized from total RNA using an anchor T primer (5′-GACCACCGCGTATCGATGTCGAACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ′) and AMV reverse transcriptase.
2) Preparation of double-stranded cDNA
CDNA was amplified by PCR reaction. Single-stranded cDNA was used as a template, and Apa-Spe2 (5′-AATCTGCATACTAGTTCCACACAATG-3 ′) and an anchor (5′-GACCACCGGTATCGGATGTCAC-3 ′) were used as primers. The PCR reaction was performed using TOYOBO KOD DNA polymerase, which was denatured at 95 ° C. for 3 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C. for 0.5 minutes, 55 ° C. for 0.5 minutes, and 68 ° C. for 2 minutes. . As a result, a 2.2-kb DNA fragment was amplified. This DNA fragment was subcloned into the Spe I and Cla I sites of pBluescript II KS-, and the nucleotide sequence was determined.
3) Analysis of gene sequence
Promoter sequences and introns were determined by comparing genomic DNA and cDNA sequences. This gene contained 8 introns.
4) Determination of all amino acid sequences
The entire amino acid sequence of this enzyme was deduced from the base sequence of the cDNA. The gene encoded 652 amino acid residues and the mature protein consisted of 437 amino acids.
[Example 7: Activation of plasminogen]
1)
Purification of plasminogen
Since commercial plasminogen (ROCHE) contains a large amount of BSA for stabilization, purification was attempted. 200 μl of 1 mg / ml plasminogen adjusted to 5 mM phosphate buffer pH 7.4 was subjected to Lys-Sepharose 4B (1.0 × 10 cm) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 7.5). Wash well with buffer. The plate was further washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.5 M NaCl, and eluted with 0.2 M ε-amino-n-capronic acid. The eluted fraction was dialyzed against 10 mM MES buffer (pH 5.4) to remove ε-amino-n-capronic acid. Uniformity was confirmed for this fraction by SDS-PAGE.
2)
Activation of plasminogen
After adding 50 μl of the diluted enzyme solution to 450 μl of purified plasminogen and reacting at 37 ° C. for each time, the enzyme reaction of the enzyme was stopped by adding 500 μl of 200 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). did. To this, 5 μl of 10 mM Boc-Val-Leu-Lys-MCA substrate was added to initiate the enzyme reaction of activated plasmin. The amount of AMC released from the substrate was measured at an excitation wavelength of 360 nm and a fluorescence wavelength of 440 nm using an RF5000 spectrofluorometer manufactured by Shimadzu Corporation. The activity of plasmin was measured at 37 ° C. and pH 7.5. As a result, this enzyme maximized the activation of plasminogen after 10 minutes of reaction. In the further reaction, the activity of plasmin was gradually lowered, so it was considered that the activated plasmin was degraded.
Industrial application fields
Since the novel polypeptide of the present invention exhibits protease activity that specifically hydrolyzes the peptide bond on the carboxyl group side of the arginine residue in the protein, the protein is extremely limited to improve the functionality of the protein. it can. Specifically, the protein of wheat or soybean having low solubility in water is decomposed, and the solubility is improved while retaining the functionality such as emulsifiability and water retention of the protein, It can be used in food applications as a bulking agent for ham, sausage, marine products and the like.
In addition, a protein having an arginine residue at the active center can be inactivated by hydrolyzing the protein at the arginine residue site. Specifically, soybean trypsin inhibitor in soybean can be decomposed and inactivated, and a digestible soybean protein can be produced.
Furthermore, it can hydrolyze a protein having an arginine residue as an allergenic active center to reduce the allergenicity, and can be used for food production such as low allergenic egg products and tofu. Thus, the novel protease of the present invention can be widely used for foods.
It can also be used for expression of protein functionality by gene recombination. Functional proteins are produced as non-functional proproteins, but can be converted to functional proteins by decomposing arginine residues of these proteins. For example, activating plasminogen to plasmin can be exemplified.
(Sequence Listing)

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis diagram of the protease according to the present invention. FIG. 2 shows the pH characteristics of the protease according to the present invention. FIG. 3 shows the pH stability of the protease according to the present invention. FIG. 4 shows the temperature stability of the protease according to the present invention.

Claims (7)

配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド。  A polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. 配列番号１に示す塩基配列又はこれと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、プロテアーゼ遺伝子として機能するポリヌクレオチド。  A polynucleotide having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary thereto, and functions as a protease gene. 配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。  A polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. 配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて５個以下の任意のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、プロテアーゼ活性を有するポリペプチド。  A polypeptide having an amino acid sequence in which 5 or less arbitrary amino acid residues are substituted, deleted or added in the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having protease activity. 請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。  A polypeptide encoded by the polynucleotide of claim 2. アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）種に属し、請求項３〜５のいずれかに記載のポリペプチドを生産する能力を持つ菌株を栄養培地に培養し、培地中に請求項３〜５のいずれかに記載のポリペプチドを生成蓄積させ、これを精製採取するポリペプチドの製造方法。 A strain belonging to the species Aspergillus oryzae and capable of producing the polypeptide according to any one of claims 3 to 5 is cultured in a nutrient medium, and the medium according to any one of claims 3 to 5 is contained in the medium. A method for producing a polypeptide, wherein the described polypeptide is produced and accumulated and purified. 前記菌株がアスペルギルス・オリゼー IAM2609 株である請求項６に記載のポリペプチドの製造方法。The method for producing a polypeptide according to claim 6 , wherein the strain is Aspergillus oryzae IAM2609 strain.