JP2673761B2 - Alkaline protease K-16N - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、アルカリ性において作
用するアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎに関し、更に詳
細には、界面活性剤全般に対して極めて優れた安定性を
有し、洗浄力の向上に寄与することのできるアルカリプ
ロテアーゼＫ−１６Ｎに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an alkaline protease K-16N which acts in alkaline condition, and more specifically, it has extremely excellent stability to all surfactants and contributes to improvement of detergency. It relates to an alkaline protease K-16N capable of

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来、洗浄剤配合用のアルカリプロテア
ーゼは、種々報告され、すでに種々の洗剤に配合され、
上市されている。2. Description of the Related Art Conventionally, various alkaline proteases for blending detergents have been reported and have already been blended in various detergents.
Has been launched.

【０００３】しかしながら、プロテアーゼが洗剤中に有
効に配合されるためには、単にアルカリ性条件下におい
て作用するというだけでは不十分であり、洗剤に配合さ
れる界面活性剤中で安定であること、および衣類の汚れ
を分解しうる能力、すなわち洗浄力を有することが要求
される。However, in order for the protease to be effectively incorporated into the detergent, it is not sufficient that it acts under alkaline conditions, and that it is stable in the detergent incorporated into the detergent, and It is required to have the ability to decompose dirt on clothes, that is, the cleaning power.

【０００４】このような、洗剤に配合されるプロテアー
ゼに要求される両特性を同時に満足させるアルカリプロ
テアーゼは未だ提示されていないのが実情である。[0004] The fact is that no alkaline protease that simultaneously satisfies both of the properties required for the protease incorporated in the detergent has been presented.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】上記実情に鑑み、本発
明者らは先に、新たなアルカリプロテアーゼ生産菌を取
得すべく、日本全国の土壌を採取し探索した。 その結
果、栃木県芳賀郡の土壌より分離されたバチルス属の一
菌株が、洗浄剤配合系において優れた洗浄力を有し、し
かも界面活性剤中で極めて高い安定性を有するアルカリ
プロテアーゼを生産することを見出し、特許出願を行っ
た（特願平３-３３１１６号及び特願平３-３３１１７
号）。In view of the above-mentioned circumstances, the present inventors previously conducted a search by collecting soil from all over Japan in order to obtain a new alkaline protease-producing bacterium. As a result, a Bacillus strain isolated from the soil in Haga-gun, Tochigi Prefecture produces an alkaline protease having excellent detergency in a detergent-containing system and having extremely high stability in a surfactant. Therefore, we applied for a patent (Japanese Patent Application No. 3-33116 and Japanese Patent Application No. 3-33117).
issue).

【０００６】上記微生物の産生するアルカリプロテアー
ゼ Ｋ−１６は、実際の使用に十分な安定性と洗浄力を
有する優れたものであるが、更に、より優れた界面活性
剤中での安定性と、より優れた洗浄剤配合酵素としての
機能を有するアルカリプロテアーゼを探求することは極
めて意義のあることである。Alkaline protease K-16 produced by the above-mentioned microorganism is an excellent one having stability and detergency sufficient for practical use, and further, further excellent stability in a surfactant, It is extremely significant to search for an alkaline protease having a function as a better detergent-mixed enzyme.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記アル
カリプロテアーゼ Ｋ−１６について種々研究を行なっ
た結果、当該酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、アルカリプロテアーゼ活性を有する少なくと
も３成分から構成されていることを見出した。これら成
分を分離、精製すべく、検討を重ねた結果、種々のカラ
ムクロマトグラフィーを用いることにより、電気泳動的
に均一な成分としてアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎを
取得することに成功し、本発明を完成するに至った。As a result of various studies on the above-mentioned alkaline protease K-16, the present inventors have found that the enzyme is selected from at least three components having alkaline protease activity by polyacrylamide gel electrophoresis. Found that it is composed. As a result of repeated studies to separate and purify these components, various column chromatography was used to successfully obtain alkaline protease K-16N as an electrophoretically uniform component, thus completing the present invention. Came to do.

【０００８】すなわち、本発明は新規なアルカリプロテ
アーゼ Ｋ１６−Ｎを提供するものである。That is, the present invention provides a novel alkaline protease K16-N.

【０００９】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎ
は、例えばバチルス属に属するバチルス・エスピー ＫＳ
Ｍ−Ｋ１６（Bacillus ｓｐ. ＫＳＭ−Ｋ１６； 微工研
条寄第３３７６号）を適当な培地に接種し、常法に従っ
て培養を行った後、その培養上清液を適当な分離、精製
処理を施すことにより得ることができる。 なお、この
バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６の菌学的性質および
その取得方法は、特願平３−３３１１６号、同 ３−３
３１１７号等に記載されている。Alkaline protease K-16N of the present invention
Is, for example, Bacillus sp. KS belonging to the genus Bacillus
M-K16 (Bacillus sp. KSM-K16; Mikori Kenjo No. 3376) was inoculated into an appropriate medium and cultivated according to a conventional method, and then the culture supernatant was appropriately separated and purified. It can be obtained by applying. The mycological properties of Bacillus sp. KSM-K16 and the method for obtaining the same are described in Japanese Patent Application Nos. 3-33116 and 3-3.
3117 and the like.

【００１０】培養に使用される培地としては、通常の微
生物の培養に用いられ、本菌株に利用可能なものであれ
ば何れをも使用することができるが、該培地中には資化
しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくこと
が好ましい。As the medium used for the culture, any medium can be used as long as it is used for the culture of ordinary microorganisms and can be used for this strain. It is preferable to include an appropriate amount of the nitrogen source and the nitrogen source.

【００１１】培地中に含有せしめる炭素源及び窒素源に
ついては特に制限はないが、窒素源の好ましい例として
は、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イ
ワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿
実油粕、カルチベーター、アミフレックス及びアジプロ
ン、ゼスト等が挙げられる。The carbon source and the nitrogen source contained in the medium are not particularly limited, but preferable examples of the nitrogen source include corn gluten meal, soybean powder, corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, pharmamedia and sardines. Meal, meat extract, peptone, high pro, adipower, cornmeal, soybean meal, coffee meal, cottonseed meal meal, cultivator, amiflex and adipron, zest and the like can be mentioned.

【００１２】また、炭素源としては、資化しうる炭素
源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗糖、麦芽
糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトー
ル、グリセリン、可溶性澱粉や廃糖蜜、転化糖、また資
化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。更に、そ
の他、リン酸、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｚｎ
^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋等の無機塩や、必要であ
れば無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。As the carbon source, assimilable carbon sources such as arabinose, xylose , glucose, mannose, fructose, galactose, sucrose, maltose, lactose, sorbitol, mannitol, inositol, glycerin, soluble starch and molasses, inversion. Examples thereof include sugars and organic acids that can be assimilated, such as acetic acid. In addition, phosphoric acid, Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Mn ²⁺ , Zn
Inorganic salts such as ²⁺ , Co ²⁺ , Na ⁺ , and K ⁺ , and if necessary, inorganic and organic micronutrient sources can be appropriately added to the medium.

【００１３】斯して得られた培養物中からの目的物質で
あるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの採取及び精製
は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うこと
ができる。Collection and purification of the objective substance, alkaline protease K-16N, from the thus obtained culture can be carried out in accordance with general enzyme collection and purification means.

【００１４】すなわち、培養物を遠心分離または瀘過等
することによって菌体を分離し、その培養瀘液から通常
の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱
法（メタノール、エタノール、インプロピルアルコー
ル、アセトン等） によって蛋白質を沈澱させたり、ま
た、限外瀘過（例えばダイアフローメンブレンフィルタ
ー；アミコン社製）により濃縮させたり、あるいは、セ
ファデックスＧ−２５、ポリビニルピロリドン等により
濃縮して、粗酵素としてアルカリプロテアーゼＫ−１６
を得ることができる。That is, cells are separated by centrifuging or filtering the culture, and the culture filtrate is separated by a conventional means such as salting out method, isoelectric focusing method, solvent precipitation method (methanol). , Ethanol, inpropyl alcohol, acetone, etc.) to precipitate the protein, or ultrafiltration (for example, Diaflow membrane filter; manufactured by Amicon) to concentrate, or Sephadex G-25, polyvinylpyrrolidone, etc. Alkaline protease K-16 as a crude enzyme
Can be obtained.

【００１５】上記分離手段のうち、塩析法では例えば硫
安（３０-７０％飽和画分）中で、溶媒沈澱法では、例
えば７５％エタノール中でアルカリプロテアーゼＫ−１
６を沈澱させた後、瀘過あるいは遠心分離、脱塩するこ
とによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能であ
る。ここで採用しうる脱塩の方法としては、透析また
は、セファデックスＧ−２５等を用いるゲル瀘過法等の
一般的方法が用いられる。Among the above-mentioned separating means, for example, ammonium sulfate (30-70% saturated fraction) is used in the salting-out method, and alkaline protease K-1 is used in the solvent precipitation method in, for example, 75% ethanol.
It is also possible to prepare a lyophilized powder by precipitating 6, followed by filtration, centrifugation or desalting. As a desalting method which can be adopted here, a general method such as dialysis or a gel filtration method using Sephadex G-25 is used.

【００１６】さらに、上記取得物中からアルカリプロテ
アーゼＫ−１６Ｎを精製、採取するには、例えば、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー等の吸着クロマト
グラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セ
ルロースやＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグ
ラフィー及びセファデックスやパイオゲルのような分子
篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製
すればよい。望ましくは、ＤＥＡＥ−バイオゲル、ＣＭ
−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びハ
イドロキシアパタイト等の吸着のクロマトグラフィーの
組合せであり、これらの組合せにより精製を行うと良好
な結果を得ることができる。Further, in order to purify and collect the alkaline protease K-16N from the above-obtained material, for example, adsorption chromatography such as hydroxyapatite chromatography, ions such as DEAE-Sephadex, DEAE-cellulose and CM-biogel are used. Exchange chromatography and molecules like Sephadex and Piogel
The fractional purification may be performed by appropriately combining sieve gel chromatography . Desirably DEAE-Biogel, CM
-A combination of ion exchange chromatography of biogel and the like and adsorption chromatography of hydroxyapatite and the like, and good results can be obtained by performing purification with these combinations.

【００１７】斯して得られた本発明のアルカリプロテア
ーゼＫ−１６Ｎは、以下に示すような酵素学的性質を有
する。 尚、以下において、酵素活性の測定は次の如く
して行った。The alkaline protease K-16N of the present invention thus obtained has the following enzymatic properties. In the following, the measurement of enzyme activity was performed as follows.

【００１８】（ 酵素活性測定法 ）カゼイン（HAMMARST
EN；メルク社製）１％（w/v）を含む５０ｍＭ ホウ酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.０）１ｍｌを４０
℃で５分間保温した後、酵素液 ０.１ｍｌと混合し、４
０℃で１０分間反応させた。 次いで、この反応液に反
応停止液（０.１２３Ｍ トリクロロ酢酸−０.２４６Ｍ
酢酸ナトリウム−０.３６９Ｍ 酢酸）２ｍｌを加え、室
温にて約２０分間放置した。 生成した酸不溶性蛋白質
を瀘過（瀘紙Ｎｏ.２；ワットマン社製）により除去し
た後、瀘液中の酸可溶性蛋白分解物をフォーリン・ロー
リー法により比色定量した。尚、酵素１単位（Ｕ）は、
上記反応条件下において、１分間に１μmolのチロシン
に相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量とし
た。(Enzyme activity measurement method) Casein (HAMMARST
EN; manufactured by Merck) 50 mM boric acid containing 1% (w / v)
40 ml of 1 ml of sodium hydroxide buffer solution (pH 10.0)
After incubating for 5 minutes at ℃, mix with 0.1 ml of enzyme solution and mix.
The reaction was carried out at 0 ° C for 10 minutes. Then, a reaction stop solution (0.123M trichloroacetic acid-0.2246M) was added to this reaction solution.
2 ml of sodium acetate-0.369M acetic acid) was added, and the mixture was left at room temperature for about 20 minutes. After removing the produced acid-insoluble protein by filtration (filter paper No. 2; manufactured by Whatman), the acid-soluble protein hydrolyzate in the filtrate was colorimetrically determined by the Foreign Lowry method. In addition, 1 unit of enzyme (U) is
Under the above-mentioned reaction conditions, it was defined as the amount of enzyme that liberates an acid-soluble proteolytic product corresponding to 1 μmol of tyrosine per minute.

【００１９】（１）作 用 単純蛋白質および複合蛋白質を加水分解し、オリゴペプ
チド又はアミノ酸を生成する。(1) Operation The simple protein and the complex protein are hydrolyzed to produce oligopeptides or amino acids.

【００２０】（２）基質特異性 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの各種基質に対する特
異性を、他の市販酵素と比較した。 基質には、ガゼイ
ン、ヘモグロビン、獣毛ケラチン、ヒト由来α−ケラチ
ンおよびエラスチンを用いた。 ５０ｍＭ ホウ酸−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）に各基質を１％（α−ケラ
チンは０.２５％）加え、各酵素液０.０４０−０.０４
３Ｕ（エラスチンの場合は、０.２００−０.２１５Ｕ）
を添加し、４０℃で１０分間反応を行い、これらの基質
に対する分解活性を測定した。 各酵素のカゼインに対
する活性を１００％とし、各種基質に対する活性を表１
に示した。(2) Substrate specificity The specificity of alkaline protease K-16N for various substrates was compared with other commercially available enzymes. As the substrate, casein, hemoglobin, animal hair keratin, human-derived α-keratin and elastin were used. 50 mM boric acid-Na
1% of each substrate (0.25% for α-keratin) was added to an OH buffer (pH 10.0), and each enzyme solution was added to 0.040-0.04.
3U (0.200-0.215U for elastin)
Was added and reacted at 40 ° C. for 10 minutes, and the decomposition activity for these substrates was measured. The activity of each enzyme against casein is defined as 100%, and the activity against various substrates is shown in Table 1.
It was shown to.

【００２１】 [0021]

【００２２】この結果から明らかなように、アルカリプ
ロテアーゼＫ−１６Ｎはバチルス属微生物が産生する他
の市販のアルカリプロテアーゼと比較して、不溶性蛋白
質である獣毛ケラチン、α−ケラチンおよびエラスチン
に対して優れた分解作用を示した。As is clear from these results, the alkaline protease K-16N is more effective than the other commercially available alkaline proteases produced by Bacillus microorganisms against the insoluble proteins animal hair keratin , α-keratin and elastin. It showed an excellent decomposition action.

【００２３】（３）至適ｐＨ 下記に示した５０ｍＭの各種ｐＨ緩衝液１ｍｌに、カゼ
インを１％（w/v）となるように溶解後、アルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｎを０.０１７Ｕ添加し、酵素活性を
測定した。 至適ｐＨでの活性を１００％とした各ｐＨ
での相対活性を図１に示した。この結果、アルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｎの至適ｐＨは、１０.０−１１.５で
あった。(3) Optimum pH Casein was dissolved in 1 ml of various 50 mM pH buffer solutions shown below so that the concentration was 1% (w / v), and 0.017 U of alkaline protease K-16N was added, Enzyme activity was measured. Each pH with 100% activity at the optimum pH
Relative activity in is shown in FIG. As a result, the optimum pH of alkaline protease K-16N was 10.0-11.5.

【００２４】（ 使用した各種ｐＨ緩衝液およびｐＨ範
囲 ） 酢酸緩衝液： ｐＨ ４.１８−６.１０ リン酸緩衝液： ｐＨ ６.２１−８.４２ 炭酸緩衝液： ｐＨ ８.９８−１０.９ リン酸−ＮａＯＨ緩衝液： ｐＨ １０.９−１２.３ ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液： ｐＨ １２.０−１３.３(Various pH buffers and pH ranges used) Acetate buffer: pH 4.18-6.10 Phosphate buffer: pH 6.21-8.42 Carbonate buffer: pH 8.98-10. 9 Phosphate-NaOH buffer: pH 10.9-12.3 KCl-NaOH buffer: pH 12.0-13.3

【００２５】（４）ｐＨ安定性 （３）で用いた各種ｐＨ緩衝液（２０ｍＭ）について、
２ｍＭ ＣａＣｌ₂添加系および無添加系を調製し、そこ
にアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎを０.１７Ｕ添加
し、５５℃で１０分間放置した。 この処理液を氷冷
後、５０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）
で１０倍に希釈し、酵素活性を測定した。処理前の酵素
活性を１００％とした各ｐＨでの相対活性を図２に示し
た。この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎは、２
ｍＭ ＣａＣｌ₂添加系において、ｐＨ５.０−１２.０の
範囲で極めて安定であった。 また、ＣａＣｌ₂無添加系
においてもｐＨ５.０−１２.０の範囲で比較的安定であ
った。(4) pH stability Regarding the various pH buffer solutions (20 mM) used in (3),
A 2 mM CaCl ₂ addition system and a non-addition system were prepared, 0.17 U of alkaline protease K-16N was added thereto, and the mixture was left at 55 ° C. for 10 minutes. After cooling this treatment solution on ice, 50 mM boric acid-NaOH buffer solution (pH 10.0)
The enzyme activity was measured by diluting with 10 times. The relative activity at each pH when the enzyme activity before treatment was 100% is shown in FIG. As a result, alkaline protease K-16N
In the mM CaCl ₂ addition system, it was extremely stable in the pH range of 5.0 to 12.0. Further, even in the CaCl ₂ -free system, it was relatively stable in the pH range of 5.0-12.0.

【００２６】（５）至適温度 ３０℃−８０℃の各温度で、アルカリプロテアーゼＫ−
１６Ｎを０.０１２Ｕ用い、５ｍＭのＣａＣｌ₂添加系お
よび無添加系において、温度以外は標準反応条件と同様
にして酵素活性を測定した。 標準反応条件における活
性を１００％とした各温度での相対活性を図３に示し
た。 この結果アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの至適
温度は、ＣａＣｌ₂無添加系では６０℃、５ｍＭのＣａ
Ｃｌ₂添加系においても６０℃であり、他の一般的なプ
ロテアーゼで認められる様な、Ｃａ²⁺イオンによる高温
域への至適温度の極端なシフトは、認められなかった。(5) Optimum temperature At each temperature of 30 ° C to 80 ° C, alkaline protease K-
The enzyme activity was measured in the same manner as the standard reaction conditions except that the temperature was adjusted using 0.012 U of 16N in a system containing 5 mM CaCl ₂ and a system containing no CaCl ₂ . The relative activity at each temperature is shown in FIG. 3, where the activity under the standard reaction conditions is 100%. As a result, the optimum temperature of alkaline protease K-16N was 60 ° C. and 5 mM Ca in the system without CaCl ₂ addition.
The temperature was 60 ° C. even in the Cl ₂ -added system, and the extreme shift of the optimum temperature to the high temperature region due to Ca ²⁺ ions, which was observed with other general proteases, was not observed.

【００２７】（６）耐 熱 性 ３０℃−７０℃の各温度において、２０ｍＭ ホウ酸−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.０）の５ｍＭ ＣａＣｌ₂添加
系および無添加系の溶液を５分間保温した後、アルカリ
プロテアーゼＫ−１６Ｎを０.２４Ｕ添加し、１０分間
各温度で熱処理を行った。 水冷後、５０ｍＭ ホウ酸−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で２倍希釈し、残存活
性を測定した。３０℃で処理した酵素活性を１００％と
した各処理温度での相対活性を図４に示した。(6) Heat resistance 20 mM boric acid-at each temperature of 30 ° C to 70 ° C
A 5 mM CaCl ₂ addition system solution and a non-addition system solution of NaOH buffer (pH 9.0) were kept warm for 5 minutes, 0.24 U of alkaline protease K-16N was added, and heat treatment was performed at each temperature for 10 minutes. After cooling with water, 50 mM boric acid-
The residual activity was measured by diluting 2-fold with NaOH buffer solution (pH 10.0). The relative activity at each treatment temperature was shown in FIG. 4, where the enzyme activity treated at 30 ° C. was 100%.

【００２８】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎは、Ｃａ
Ｃｌ_２ 無添加系で５０℃まで、５ｍＭＣａＣｌ_２添加系
では５５℃まで、９０％以上の活性が保持された。 こ
の結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎは、Ｃａ^２＋
イオンの存在により熱に対する安定性が増大することが
判った。Alkaline protease K-16N is Ca
90% or more of the activity was retained up to 50 ° C. in the system without addition of Cl ₂ and up to 55 ° C. in the system with addition of 5 mM CaCl ₂ . As a result, alkaline protease K-16N is Ca ²⁺
It has been found that the presence of ions increases the thermal stability.

【００２９】（７）分 子 量 （ａ）アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの分子量を、ゲ
ル瀘過法を用いて測定した。 すなわち、酵素液を５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０、２００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む）で平衡化したセファ
デックスＧ−５０カラム（１.５cm×１７０cm、ファル
マシア社製）にかけ、同緩衝液で溶出した。 分子量マ
ーカーには、ゲルフィルトレイション・キャリブレイシ
ョンキット［ブルーデキストラン（分子量２,０００,０
００）、オボアルブミン（分子量４３,０００）、キモ
トリプシノーゲンＡ（分子量２５,０００）、リボヌク
レアーゼＡ（分子量１３,７００）；ファルマシア社
製］およびチトクロームＣ （分子量 １２,５００）；
シグマ社製］を用いた。この結果、本酵素の分子量は、
１５,０００と決定された。(7) Molecular weight (a) The molecular weight of alkaline protease K-16N was measured by the gel filtration method. That is, 50 parts of enzyme solution
mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, 200 mM Na
It was applied to a Sephadex G-50 column (1.5 cm × 170 cm, manufactured by Pharmacia) equilibrated with Cl and containing 5 mM CaCl ₂ , and eluted with the same buffer. For the molecular weight marker, gel filtration gel calibration kit [blue dextran (molecular weight 2,000,0
00), ovalbumin (molecular weight 43,000), chymotrypsinogen A (molecular weight 25,000), ribonuclease A (molecular weight 13,700); Pharmacia] and cytochrome C (molecular weight 12,500);
Manufactured by Sigma] was used. As a result, the molecular weight of this enzyme is
It was decided to be 15,000.

【００３０】（ｂ）また、アルカリプロテアーゼＫ−１
６Ｎの分子量を、１５％のアクリルアミドを用いたドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により測定した。分子量マー
カーには、エレクトロフォレシス・キャリブレイション
キット［ホスホリラーゼＢ（分子量９４，０００）、牛
血清アルブミン（分子量６７，０００）、卵白アルブミ
ン（分子量、４３，０００）、カルボニックアンヒドラ
ーゼ（分子量３０，０００）、大豆トリプシンインヒビ
ター（分子量２０，１００）、α−ララクトアルブミン
（分子量１４，４００）；ファルマシア社製］を用い
た。その結果、本酵素は、分子量１４，５００±５００
と１２，０００±５００の２成分からなることが判明し
た。(B) In addition, alkaline protease K-1
The molecular weight of 6N was measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method using 15% acrylamide. The molecular weight markers include an electrophoretic calibration kit [phosphorylase B (molecular weight 94,000), bovine serum albumin (molecular weight 67,000), ovalbumin (molecular weight 43,000), carbonic anhydrase (molecular weight 30,000). ), Soybean trypsin inhibitor (molecular weight 20,100), α-lactalbumin (molecular weight 14,400); Pharmacia] were used. As a result, the enzyme has a molecular weight of 14,500 ± 500.
And 12,000 ± 500.

【００３１】（ｃ）さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料
調製の際に、アルカリセリンプロテアーゼの阻害剤であ
るフェニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ、
１ｍＭ）あるいは中性プロテアーゼの阻害剤であるエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、５ｍＭ）を添加し、同
様の方法で分子量を測定した。その結果、本酵素はいず
れの阻害剤の影響を受けず上記２成分から成ることが明
らかになった。(C) Further, in preparing a sample for SDS-PAGE, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF, which is an inhibitor of alkaline serine protease).
1 mM) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 5 mM) which is an inhibitor of neutral protease was added, and the molecular weight was measured by the same method. As a result, it was revealed that this enzyme was composed of the above-mentioned two components without being affected by any inhibitor.

【００３２】（８）金属イオンの影響 各種金属イオンが、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎに
及ぼす影響を調べた。すなわち、２０ｍＭ ホウ酸−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.０）に各種金属塩を１ｍＭとな
るように加え、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎを１.
２Ｕ添加した。 ３０℃で２０分間放置した後、５０ｍ
Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１０倍希
釈して、酵素活性を測定した。金属塩無添加系で同様に
処理した場合の酵素活性を１００％とした各種金属塩添
加系における相対活性を表２に示した。(8) Effects of Metal Ions The effects of various metal ions on the alkaline protease K-16N were investigated. That is, 20 mM boric acid-N
Various metal salts were added to an aOH buffer solution (pH 9.0) to a concentration of 1 mM, and alkaline protease K-16N was added to 1.
2 U was added. 50m after leaving at 30 ℃ for 20 minutes
The enzyme activity was measured by diluting 10 times with M boric acid-NaOH buffer (pH 10.0). Table 2 shows the relative activity in various metal salt-added systems, where the enzyme activity when treated in the same manner with the metal salt-free system was 100%.

【００３３】 [0033]

【００３４】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｎは、各種金属イオンに対して極めて安定であることが
判った。As a result, alkaline protease K-16
It has been found that N is extremely stable against various metal ions.

【００３５】（９）各種阻害剤の影響 各種阻害剤がアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎに及ぼす
影響を調べた。まず、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、アルカ
リプロテアーゼＫ−１６Ｎを１.２Ｕ添加し３０℃で２
０分間放置した。 その後、各処理液を５０ｍＭホウ酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１０倍希釈し、酵
素活性を測定した。 阻害剤無添加系で同様に処理した
場合の活性を１００％とした各阻害剤添加系での相対活
性を表３に示した。(9) Effects of various inhibitors The effects of various inhibitors on the alkaline protease K-16N were investigated. First, 20 mM phosphate buffer (pH 7.
Various inhibitors were added to 0) to a predetermined concentration, 1.2 U of alkaline protease K-16N was added, and the mixture was added at 30 ° C. for 2 hours.
It was left for 0 minutes. Then, each treatment solution was diluted 10 times with 50 mM boric acid-NaOH buffer solution (pH 10.0), and the enzyme activity was measured. Table 3 shows the relative activity in each inhibitor-added system, where the activity when treated in the same manner with the inhibitor-free system was 100%.

【００３６】 [0036]

【００３７】 ＊ 阻害剤略号 ＥＤＴＡ： エチレンジアミン四酢酸 ＤＴＴ； ジチオスレイトール ＮＥＭ； Ｎ−エチルマレイミド ＨＮＢ： ２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド ＤＮＴＢ： ５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸 ＰＣＭＢ： ｐ−クロロマーキュリー安息香酸 ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルホニルフルオリド* Inhibitor abbreviation EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid DTT; dithiothreitol NEM; N-ethylmaleimide HNB: 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide DNTB: 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid PCMB: p-Chlor Mercury Benzoic Acid PMSF: Phenylmethanesulfonyl Fluoride

【００３８】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎは、セリ
ンプロテアーゼの特異的阻害剤であるフェニルメタンス
ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモスタチンにより
阻害されることから、本酵素の活性発現の際には、セリ
ン残基を必要とするアルカリセリンプロテアーゼである
ことが判った。また、他の阻害剤に対しては極めて安定
であった。Alkaline protease K-16N is a specific inhibitor of serine protease, phenylmethane
Since it is inhibited by lufonyl fluoride (PMSF) and chymostatin, it was revealed that this is an alkaline serine protease that requires a serine residue when the activity of this enzyme is expressed. Further, it was extremely stable against other inhibitors.

【００３９】（１０）界面活性剤の影響 各種界面活性剤が、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎに
及ぼす影響を調べた。５％（w/v）の各種界面活性剤、
および１０％（v/v）エタノールを含む ０.１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）にアルカリプロテアーゼＫ
−１６Ｎを３.０Ｕ添加し、４０℃で４時間放置した
後、５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）
で１０倍希釈して、酵素活性を測定した。 各種界面活
性剤中での処理時間０分の活性を１００ ％とした残存
活性を相対値により表４に示した。(10) Effects of surfactants The effects of various surfactants on the alkaline protease K-16N were investigated. 5% (w / v) various surfactants,
Alkaline protease K in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) containing 10% (v / v) ethanol.
After adding -16N (3.0 U) and allowing it to stand at 40 ° C for 4 hours, 50 mM boric acid-NaOH buffer (pH 10.0)
The enzyme activity was measured after 10-fold dilution with. The residual activity is shown in Table 4 as a relative value, with the activity at 0 minute treatment time in various surfactants taken as 100%.

【００４０】 [0040]

【００４１】なお、具体的な界面活性剤は次の通りであ
る。Specific surfactants are as follows.

【化１】 Embedded image

【００４２】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｎは、高濃度（５％）の界面活性剤中においても優れた
安定性を示すことが明らかになった。また、市販の洗剤
用アルカリプロテアーゼ２種類と比較してもアルカリプ
ロテアーゼＫ−１６Ｎは、各種界面活性剤中で極めて安
定であった。As a result, alkaline protease K-16
It was revealed that N shows excellent stability even in a high concentration (5%) of a surfactant. In addition, alkaline protease K-16N was extremely stable in various surfactants as compared with two commercially available alkaline proteases for detergents.

【００４３】[0043]

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

【００４４】実 施 例 １ 菌 株 の 培 養 ：アルカリプロテアーゼＫ−１６を生
産するバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６（微工研条
寄第３３７６号）株を、培地Ａに１白金耳接種し、３０
℃で２４時間好気的に振盪培養を行った。得られた種培
養液を、培地Ｂへ２％（v/v）接種し、３０℃で４８時
間好気的に振盪培養を行い、アルカリプロテアーゼＫ−
１６を含む培養液１ｌを得た。Example 1 Cultivation of strain: Bacillus sp. KSM-K16 (Mikaku Kenjoyori No. 3376) strain producing alkaline protease K-16 was inoculated into medium A at 1 platinum loop, 30
Shaking culture was performed aerobically at 24 ° C. for 24 hours. 2% (v / v) of the resulting seed culture was inoculated into the medium B, and aerobically shake-cultured at 30 ° C. for 48 hours to obtain alkaline protease K-
1 liter of culture medium containing 16 was obtained.

【００４５】培 地 Ａ： グ ル コ ー ス ２.０ ％（w/v） ポリペプトンＳ １.０ 〃 酵 母 エ キ ス ０.０５ 〃 リン酸一カリウム ０.１ 〃 硫酸マグネシウム・７水塩 ０.０２ 〃 炭酸ナトリウム（別滅菌） １.０ 〃 （ ｐＨ無調整 ）Culture A: Glucose 2.0% (w / v) Polypeptone S 1.0 〃 Fermentation mother Exex 0.05 〃 Monopotassium phosphate 0.1 〃 Magnesium sulfate heptahydrate 0.02 〃 Sodium carbonate (separate sterilization) 1.0 〃 (no pH adjustment)

【００４６】培 地 Ｂ： グ ル コ ー ス ２.０ ％（w/v） 魚 肉 エ キ ス １.０ 〃 大 豆 粉 １.０ 〃 リン酸一カリウム ０.１ 〃 硫酸マグネシウム・７水塩 ０.０２ 〃 （ ｐＨ １０.０ ）Cultivation B: Glucose 2.0% (w / v) Fish Meat EX 1.0 〃 Soybean flour 1.0 〃 Monopotassium phosphate 0.1 〃 Magnesium sulfate, 7 water Salt 0.02〃 (pH 10.0)

【００４７】実 施 例 ２ アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの精製： （１） 実施例１で得られた培養液１ｌを遠心分離（１
０,０００rpm、５分間）して、菌体を除去し、その上清
液を限外瀘過膜（分画分子量：５,０００）を用いて濃
縮した後、凍結乾燥した。 この凍結乾燥粉末１.５ｇを
イオン交換水１５ｍｌに溶解した後、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８.０；２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む）に
対して一昼夜透析した。Example 2 Purification of alkaline protease K-16N: (1) Centrifuge 1 liter of the culture broth obtained in Example 1 (1
The cells were removed at 5,000 rpm for 5 minutes), and the supernatant was concentrated using an ultrafiltration membrane (molecular weight cutoff: 5,000) and then freeze-dried. After dissolving 1.5 g of this freeze-dried powder in 15 ml of ion-exchanged water, 10 mM Tris-
It was dialyzed overnight against a hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0; containing ₂ mM CaCl ₂ ).

【００４８】次に、透析内液を１０ｍＭ トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８.０； ２ｍＭＣａＣｌ₂を含む）で平衡
化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａカラム（２.５×１
６cm； バイオラッド社製）にかけ、同緩衝液で洗浄溶
出し、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎを含んだ画分を
得た。 この画分を集め（１５０ｍｌ）限外瀘過（ＹＭ
−５メンブレン；アミコン社製）により濃縮し、得られ
た濃縮液を１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０；
２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む）で平衡化したＣＭ Ｂｉｏ
−Ｇｅｌ Ａカラム（２.５×１６cm； バイオラッド社
製）にかけた後、同緩衝液２５０ｍｌで洗浄溶出を行っ
た。Next, the dialysis inner solution was equilibrated with 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0; containing ₂ mM CaCl ₂ ), a DEAE Bio-Gel A column (2.5 × 1).
6 cm; manufactured by Bio-Rad) and washed and eluted with the same buffer to obtain a fraction containing alkaline protease K-16N. Collect these fractions (150 ml) and ultrafilter (YM
-5 membrane; manufactured by Amicon Co., Ltd., and the obtained concentrated solution is 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0;
CM Bio equilibrated with 2 mM CaCl ₂ )
-After applying to a Gel A column (2.5 x 16 cm; manufactured by Bio-Rad), washing and elution was performed with 250 ml of the same buffer.

【００４９】（２） 次に１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８.０； ２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む）を用いた、０
から３０ｍＭの塩化カリウム濃度勾配溶出（２２５ｍｌ
ずつ）を行った後、続けて同様に３０ｍＭから１００ｍ
Ｍ の塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（２２５ ｍｌ
ずつ）。(2) Next, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0; containing ₂ mM CaCl ₂ ) was used to
To 30 mM potassium chloride gradient elution (225 ml
Each time) and then continue from 30 mM to 100 m
Gradient elution of M 2 with potassium chloride was performed (225 ml
Each).

【００５０】０から３０ｍＭの塩化カリウムの濃度勾配
溶出により得られたアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎを
含む画分を集め（１３５ｍｌ）、限外瀘過 （ＹＭ−５
メンブレン；アミコン社製）により濃縮を行った。 こ
の濃縮液（４.３ｍｌ）を、５０ｍＭリン酸緩衝液 （ｐ
Ｈ７.０ 、０.２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む）で平衡化した
ヒドロキシアパタイトカラム（１.６ ×１０cm）にか
け、同緩衝液５０ｍｌで洗浄後、５０ｍＭから２００ｍ
Ｍ のリン酸緩衝液（ｐＨ７.０ 、０.２ｍＭ ＣａＣｌ₂
を含む）濃度勾配溶出（５０ｍｌずつ）を行った。Fractions containing alkaline protease K-16N obtained by elution with a gradient of 0 to 30 mM potassium chloride were collected (135 ml) and subjected to ultrafiltration (YM-5).
Membrane; manufactured by Amicon) was used for concentration. This concentrated solution (4.3 ml) was added to a 50 mM phosphate buffer solution (p
It is applied to a hydroxyapatite column (1.6 × 10 cm) equilibrated with H7.0 and 0.2 mM CaCl ₂ ), washed with 50 ml of the same buffer, and then 50 mM to 200 m.
M phosphate buffer (pH 7.0, 0.2 mM CaCl ₂
Gradient elution (each containing 50 ml) was performed.

【００５１】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎを含む１
８０ｍＭリン酸濃度以上で溶出される画分を集め（１８
ｍｌ）、限外瀘過（ＹＭ−５メンブレン；アミコン社
製）により濃縮し（１.８ｍｌ）、２０％（v/v）となる
ようにグリセロールを添加して、使用時まで−２０℃で
保存した。1 containing alkaline protease K-16N
Fractions eluted above 80 mM phosphate concentration were collected (18
ml), concentrated by ultrafiltration (YM-5 membrane; manufactured by Amicon) (1.8 ml), added glycerol to 20% (v / v), and kept at -20 ° C until use. saved.

【００５２】（３） 以上述べた精製法により、アルカ
リプロテアーゼＫ−１６の粗酵素粉末１.５ｇ（総活
性：７９,５６０Ｕ；総蛋白量、９１８mg；比活性、８
６.７Ｕ／mg）から、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎ
の精製標品（総活性、２９.９Ｕ；総蛋白量、７.９mg；
比活性、３.８Ｕ／mg）を得ることができた。また、ア
ルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの凍結乾燥標品より求め
たＥ^1% ₂₈₀は９.０４であった。(3) By the purification method described above, 1.5 g of crude enzyme powder of alkaline protease K-16 (total activity: 79,560 U; total protein amount, 918 mg; specific activity, 8
6.7 U / mg) to alkaline protease K-16N
Purified product (total activity, 29.9 U; total protein amount, 7.9 mg;
The specific activity was 3.8 U / mg). Further, E ^1% ₂₈₀ determined from a freeze-dried preparation of alkaline protease K-16N was 9.04.

【００５３】[0053]

【発明の効果】以上のように、種々のカラムの組み合わ
せにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に均一な
成分にまで精製された本発明のアルカリプロテアーゼＫ
−１６Ｎは、各種の界面活性剤中で安定である。従っ
て、本発明酵素は洗浄剤配合用酵素として極めて優れた
ものであり、洗剤等に有利に利用することができるもの
である。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the alkaline protease K of the present invention purified to a polyacrylamide gel electrophoretic uniform component by combining various columns.
-16N is stable in various surfactants. Therefore, the enzyme of the present invention is extremely excellent as an enzyme for blending detergents and can be advantageously used in detergents and the like.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの至適ｐＨ
を示す図面。FIG. 1 Optimum pH of alkaline protease K-16N
Drawing.

【図２】 アルカリプロテアーゼＫ−１６ＮのｐＨ安定
性試験の結果を示す図面。FIG. 2 is a drawing showing the results of a pH stability test of alkaline protease K-16N.

【図３】 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの至適温度
を示す図面。FIG. 3 is a drawing showing the optimum temperature of alkaline protease K-16N.

【図４】 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎの熱安定性
試験の結果を示す図面。FIG. 4 is a drawing showing the results of a thermal stability test of alkaline protease K-16N.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川合 修次 栃木県河内郡河内町立伏471−199 (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (56)参考文献 特開 昭62−158483（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−280278（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−134990（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−16186（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−281782（ＪＰ，Ａ) ─────────────────────────────────────────────────── --- Continuation of the front page (72) Inventor Shuji Kawai 471-199, Tachibushi, Kawachi-cho, Kawachi-gun, Tochigi Prefecture (72) Inventor Susumu Ito 3441-64, Higashimine-cho, Utsunomiya-shi, Tochigi (56) Reference JP 62 -158483 (JP, A) JP 61-280278 (JP, A) JP 58-134990 (JP, A) JP 4-16186 (JP, A) JP 4-281782 (JP, A) )

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するアルカリプ
ロテアーゼＫ−１６Ｎ （１） 作 用 単純蛋白質および複合蛋白質を加水分解し、オリゴペプ
チド又はアミノ酸を生成する。 （２） 基質特異性 カゼイン、ヘモグロビン等の水溶性蛋白質ならびにケラ
チン、エラスチン等の水不溶性蛋白質に対して良好な分
解活性を有する。 （３） 至適ｐＨ カゼインを基質とし、種々の緩衝液中で４０℃、１０分
間反応させた場合、至適ｐＨは１０.０−１１.５であ
る。 （４） ｐＨ安定性 種々の緩衝液中にＣａ²⁺イオンを添加し、５５℃で１０
分間処理した場合、ｐＨ５.０−１２.０の範囲で極めて
安定である。 （５） 至適温度 カゼインを基質としてｐＨ１０.０で反応させた場合、
至適温度は６０℃である。 （６） 耐熱性 ｐＨ９.０、５０℃にて１０分間熱処理した場合、また
はＣａ²⁺イオンを添加し５５℃にて１０分間熱処理した
場合、９０％以上活性が残存する。 （７） 分子量 ゲル瀘過法（セファデックスＧ−５０）による見かけの
分子量は１５,０００である。 また、ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
よる分子量は１４,５００±５００と１２,０００±５０
０であり、２成分から構成される。 （８） 金属イオンの影響 Ｃａ²⁺イオンの添加により熱安定性およびｐＨ安定性が
増大する。 （９） 阻害剤の影響 アンチパイン、エチレンジアミン四酢酸およびｐ−クロ
ロマーキュリー安息香酸では活性は阻害されない。 キ
モスタチン、フェニルメタンスルホニルフルオリドによ
り活性が阻害される。 （１０）界面活性剤の影響 ｐＨ９.０に調整した、高濃度の直鎖アルキルベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル硫
酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、α−オレフィ
ンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウ
ムおよびα−スルホ脂肪酸エステル等の界面活性剤中で
４０℃、４時間処理した場合、いずれも７０％以上活性
が残存する。1. An alkaline protease K-16N (1) having the following physicochemical properties (1) Working Simple proteins and complex proteins are hydrolyzed to produce oligopeptides or amino acids. (2) Substrate specificity It has a good activity for degrading water-soluble proteins such as casein and hemoglobin and water-insoluble proteins such as keratin and elastin. (3) Optimum pH When using casein as a substrate and reacting in various buffers at 40 ° C. for 10 minutes, the optimum pH is 10.0-11.5. (4) pH stability Ca ²⁺ ions were added to various buffers and the pH was adjusted to 10 at 55 ° C.
When treated for a minute, it is extremely stable in the pH range of 5.0-12.0. (5) Optimum temperature When casein is used as a substrate and reacted at pH 10.0,
The optimum temperature is 60 ° C. (6) Heat resistance When heat-treated at 50 ° C for 10 minutes at pH 9.0, or when heat-treated at 55 ° C for 10 minutes by adding Ca ²⁺ ions, 90% or more of the activity remains. (7) Molecular weight The apparent molecular weight by the gel filtration method (Sephadex G-50) is 15,000. The molecular weights by sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis were 14,500 ± 500 and 12,000 ± 50.
It is 0 and is composed of two components. (8) Effect of metal ions Addition of Ca ²⁺ ions increases thermal stability and pH stability. (9) Effect of inhibitor The activity is not inhibited by antipain, ethylenediaminetetraacetic acid and p-chloromercurybenzoic acid. The activity is inhibited by chymostatin and phenylmethanesulfonyl fluoride. (10) Effect of Surfactant High-concentration sodium linear alkylbenzene sulfonate adjusted to pH 9.0, sodium polyoxyethylene alkyl sulfate, sodium dodecyl sulfate, sodium α-olefin sulfonate, sodium alkane sulfonate and α- When treated at 40 ° C. for 4 hours in a surfactant such as sulfo fatty acid ester, 70% or more of the activity remains. 【請求項２】 バチルス属に属する微生物により産生さ
れるものである請求項第１項記載のアルカリプロテアー
ゼＫ−１６Ｎ。2. The alkaline protease K-16N according to claim 1, which is produced by a microorganism belonging to the genus Bacillus. 【請求項３】 バチルス属に属する微生物が、バチルス
・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ１６である請求
項第２項記載のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｎ。3. The alkaline protease K-16N according to claim 2, wherein the microorganism belonging to the genus Bacillus is Bacillus sp. KSM-K16.