JP4334012B2 - 核酸精製の方法および装置 - Google Patents

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Description

本発明は試料由来の核酸の単離および精製の方法、ならびにそのための適切な装置に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の導入、およびその後の核酸の選択的増幅系は、診断試験の標本としての遺伝物質の使用を可能にしてきた。結果として、現在新規の分析方法が、特に病状の早期診断が可能な遺伝的疾患、ある疾患についての疾病素質および感染性の疾患の診断について特に利用可能となっている。
遺伝物質を酵素による増幅のための適切な形態へと変換するために、生物試料物質から遊離することが必要である。さらに、核酸を、生物物質または環境由来のヌクレアーゼによる分解、および化学反応条件による分解から保護しなければならない。最もストリンジェントな要件は、生物試料およびそこから単離した核酸がコンタミネーションしていないということに関する。核酸は増幅のために、緩衝されて、水溶性で、実質的に無塩である溶液中に存在するべきである。
通常PCRには非常に少量の解析物を用いるが（pg〜ng範囲）、特別な課題のために、より多量な試料を加工する必要がある。例えば、正常細胞のバックグラウンドに対して一つの腫瘍細胞の感度で循環している腫瘍細胞標を同定するためには、10〜20mlの血液試料から核酸を単離する必要がある。試料の破砕後、次いで腫瘍関連遺伝子の発現について、単離したRNAの部分標本を検査し得る。
酵素的、機械的または化学的な試料物質の溶解、続いてフェノールおよびフェノール/CHCl3のタンパク質および脂質の抽出ならびにエタノールまたはi-プロパノールによる水相の核酸の沈殿、による核酸単離の古典的な方法（Sambrook, Jら, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第2版9.16-9.23；Ausubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987, 2.1.1-2.4.5）に加えて、カオトロピック塩条件下で、核酸がガラス表面に結合するという70年代の終わりから公知であった特性を利用した、特にPCR試料の調製用の、いくつかの市販のキットがここ数年で開発されている（Vogelstein, B. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1979)615-619）。タンパク質、脂質または塩等の生物物質の他の構成成分は、結合せず分離される。バッチプロセスを可能にするような、ガラスフリースインレーまたはシリカゲル懸濁液を有する遠心分離用の容器は公知である。また、直下に接するバキュームチャンバーの補助および遠心分離により作動し得る、基板のくぼみに設けられた、ガラスフリースを有するストリップおよび96ウェルマイクロタイタープレート形式において複数の装置が公知である。これらの方法において、試料の体積はしばしば制限される。また、ガラスフリースから核酸を有効に溶出するために大量の緩衝液が必要となり、これにより単離された分子の希釈溶液が得られ、確実な応用のためにさらなる調製工程が必要となる。
変更された方法（Millerら, Nucl. Acids Res. 16: 1215）には濃縮した塩溶液が用いられ、試料物質の溶解後にタンパク質および他の付随の物質を沈殿させる。上清中の核酸を、次いでエタノールにより沈殿させ、遠心分離により回収する。核酸を溶解した後に、増幅に用い得る。
WO 93/11221に、陰イオン交換体および無機質担体物質を使用する核酸の単離および精製のための方法および装置が開示される。US 5,104,533に、圧力補正を有した濾過単位が開示される。US 4,270,921に、マイクロカラムおよび遠心分離チューブの組み合わせが開示される。WO 98/32877に、核酸を結合する物質を含有する閉鎖要素により連結された二つの容器よりなる、核酸の単離のための装置が開示される。US 4,956,298に、遠心分離容器およびレシーブ体（receiving body）よりなる分離または反応カラムが開示され、レシーブ体はカラム物質を含有し、遠心分離のための容器がレシーブ体の流出物を回収する。DE 19512361に、生物物質を単離する方法が開示され、これは生物物質を結合させるための圧縮性多孔マトリックスを用い、生物物質に圧力をかけて物質を溶出する。EP 588564に、ピペットの先端に位置する捕捉用の膜を含む親和性分離のための装置が記載される。WO 96/41810には、空洞状の膜フィルターおよびイオン交換の工程の補助による細胞懸濁液からのDNAの除去が開示される。核酸を結合する物質を含有する装置の製造法は、EP 738733より公知である。WO 02/053256には、カラム挿入部を有する試料保持体を含む、精製のための装置および方法が開示されているが、カラムモジュールは前記カラム挿入部に固定されている。US 6,177,009およびドイツ国実用新案DE 298 03 712 U1およびDE 202 18 503 U1に、分離装置および流れ出た液体の回収容器を有する分離カラムを含む、生物分子の処理のための装置が記載されている。
（発明の概要）
本発明の目的は、より大きな試料体積から核酸を精製または単離する新規の装置および新規の方法を提供することであった。
目的は本発明に従って個々の構成要素が図1に示される装置により達成される。さらに、本発明にかかる装置が用いられ、また個々の段階が図１に例として模式的に示されるような方法が記載される。本発明にかかる装置が使用される、本発明にかかる方法により、核酸の、より多量の収量が保証される。
本発明のある主題は、試料の入口開口部101および出口開口部102を有する第一の中空体100ならびに入口開口部201および出口開口部202を有する第二の中空体200からなる核酸の精製または単離のための装置であり、第二の中空体の入口開口部201は、第一の中空体の出口開口部102に機能的に連結しており、第一および第二の中空体は互いに分離し得、核酸結合物質203は第二の中空体の出口開口部202の前面に位置し、第二の中空体200は第一の中空体100と比較してより小さな容積を有し、第一の中空体100は5mlより大きい容積を有する。
本発明の別の側面は、本発明にかかる装置を含む、閉口可能容器400に関する。
本発明はまた、
a) 本発明にかかる装置を提供する工程、
b) 第一の中空体の入口開口部を介して、試料を装置に移す工程、
c) 核酸結合物質を介して、第二の中空体から、試料を容器へと通過させ、その間に核酸が核酸結合物質に結合する工程、
d) 核酸結合物質に結合した核酸を任意に洗浄する工程、
e) 第一の中空体から第二の中空体を離し、第二の中空体を受け取り容器900に移す工程、
f) 核酸結合物質に結合した核酸を洗浄する工程、
g) 核酸結合物質に結合した核酸を溶出し、これにより核酸を第二の受け取り容器13に回収し、これにより精製または単離する工程、
を含む、試料から核酸を精製または単離する方法に関する。
本発明はまた、本発明にかかる装置または本発明にかかる容器、および核酸を核酸結合物質に結合させるカオトロピック試薬からなる、試料から核酸を精製または単離するキットに関する。
本発明の別の主題は、試料から核酸を精製または単離するための、本発明にかかる装置または本発明にかかる容器の使用である。
核酸結合物質は、核酸がある条件下で非共有結合するが、試料中の他の物質はこの条件下で結合しない物質として理解されている。この核酸の結合は、可逆的であるので、条件を変えることにより、核酸は続いて該物質から再び溶出され得る。
本発明の範囲内で、マトリックスは、核酸結合物質の粒子または繊維が埋め込まれた物質として理解される。試料がマトリックスを通過できるように、マトリックスの素材は液体透化性であり、核酸は核酸結合物質に接触し得、試料の他の構成物はマトリックスを通過し得る。小さな直径を有する固形物質は、当業者により粒子と呼ばれる。好ましくは、これらの粒子は本質的に球形の表面を有する。核酸結合物質から作られたラメラ状で、フィラメント状の粒子は、繊維と呼ばれる。
本発明の範囲において、中空体は、試料が中空体内に入ることができる入口開口部、および試料が中空体から再び出ることができる出口開口部を有する空洞状の構造である。対照的に、容器は、試料が容器中に入ることができる入口開口部一つのみを有する空洞状の構造である。従って、それは試料の回収のために用いられ得る。
本発明の範囲において、中空体の機能的な連結は、本発明にかかる方法を実行することができるような様式で、二つの中空体が連結されることを意味することが理解されよう。この目的のために、必要に応じて連結を分離することが可能であるべきであり、液体不透過性であるべきで、ならびにある応用のために、外部との空気の交換を妨げるべきでもある。さらに、第一の中空体から第二の中空体へ、試料が消失することなく通過することが保証されるべきである。
カオトロピック試薬は、タンパク質または核酸の二次、三次および／または四次構造を変化させるが、少なくともその一次構造には影響しない物質として理解されている。例としては、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムヒドロクロライド、NaI、KI、ナトリウムチオシアネートまたはこれら物質の組み合わせがある。本発明の範囲において、カオトロピック試薬は液体水（liquid water）の整然とした構造を乱し、従って、DNAまたはRNAを水溶液からガラス表面へ結合させる、全ての化学物質として理解されている。NaCl、KClまたはCaCl2等の他の物質は、イオン強度を変化させるために溶液中に存在し得る。ガラス表面への結合は可逆的であるので、カオトロピック条件下でDNAまたはRNAがガラス表面へ結合する特性は、他の生物物質を含有する水溶液からそれらを単離するために利用され得る。例えば、カオトロピック試薬の濃度が減少するか、またはカオトロピック試薬が完全に除去される場合、DNAまたはRNAは再び溶出され得る。
（発明の詳細な説明）
本発明のある主題は、試料の入口開口部101および出口開口部102を有する第一の中空体100ならびに入口開口部201および出口開口部202を有する第二の中空体200からなる核酸の精製または単離のための装置であり、第二の中空体の入口開口部201は、第一の中空体の出口開口部102に機能的に連結しており、第一および第二の中空体は互いに分離し得、核酸結合物質203は第二の中空体の出口開口部202の前面に位置し、第二の中空体200は第一の中空体100と比較してより小さな容積を有し、第一の中空体100は5mlより大きい容積を有する。
核酸を結合させる物質は、当業者に公知である。該物質は粒状および繊維状であり得る。物質が粒子から成る場合、例えば、薄膜間に粒子を固定するような小さい孔を有する、セルロースまたはプラスチック等の繊維状物質からなるファブリックまたはフリース等の液体透過性薄膜間に、これらの粒子を組み込むことで粒子を固定することが有利であると証明されている。好ましくは、核酸結合物質は主に、二酸化ケイ素で構成されるか、または繊維状もしくは粒状で二酸化ケイ素を含有する。特に好ましくは、核酸結合物質はガラスフリースもしくはシリカゲルであるか、またはゼオライトからなる。核酸結合物質はまた、好ましくは繊維状もしくは粒状で、酸化金属または酸化合金からなる。特に好ましくは、核酸結合物質は、酸化アルミニウム、酸化ハフニウムもしくは酸化ジルコニウムからなるか、または繊維状もしくは粒状で酸化アルミニウム、酸化ハフニウムもしくは酸化ジルコニウムを含有する。
核酸結合物質は、好ましくは繊維状物質、例えばファブリックまたはフリースの形状である。適切な物質は、例えば遠心分離チューブ（EP 738733）もしくはストリップ形式の複数の装置（EP 616638）の補助を伴う核酸の単離方法より公知である。核酸結合物質には、いかなる付加的な力の作用も伴わないか、または例えば圧力もしくは不足圧（underpressure）をかけることによる力を利用することによって、試料液体が該物質を通過し得る特性が必要である。しかしながら本方法において、核酸の試料からの濾過によってではなく、核酸の表面への親和性を利用する方法によって核酸は結合するので、比較的目の粗い多孔性物質を用いることが可能である。このことは、比較的粘性のある試料液体であっても流れを促進する。
液体透過性の核酸結合物質は、核酸に結合し得るが、周囲の液体、およびそこに溶解しているタンパク質等の他の構成物の通過を可能にする。第一の変形において、物質の表面に結合している捕捉用プローブにより、核酸は配列特異的に結合し得る。捕捉用プローブは、ハイブリダイズ条件下で、単離される核酸中の相補的な塩基配列に結合し得る塩基配列を有する。配列特異的な物質の使用により、特定の配列の核酸の選択的な単離が可能となる。固体の表面で、核酸をペプチド性核酸に結合させる方法は、例えばWO 95/14708に記載されている。
酸化ジルコニウム、酸化ハフニウムもしくは酸化アルミニウム（EP 897978）、また酸化チタニウムは、例えば核酸結合物質として適している。これら物質の水和表面は、十分に正に帯電しており、負に帯電している核酸と結合する。酸化物の表面は塩基性溶液中で水和され得る。核酸は次いで、低分子アルコールまたは他の低pHの洗浄溶液を用いた洗浄により溶出され得る。
好ましい態様において、液体透過性の核酸結合物質は、ガラスを含有した表面を有する。粒状および繊維状の形態において核酸に結合するガラスの特性は、長らく公知であった。ガラス表面への可逆的な結合には、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムヒドロクロライド、NaI、KI、ナトリウムチオシアネート等のカオトロピック試薬またはこれら物質の組み合わせが必要である（US 5,234,809）。DE-A-19512369には、核酸の単離のためのガラスフリースの使用が記載されている。試料をカオトロピックグアニジニウム塩およびシリカ粒子の混合物と混合する、EP-B-0389063に方法が提示される。これらの条件下で、核酸は配列と無関係に、シリカ表面に結合する。他の試料構成物を洗い流すことができ、続いて水性緩衝液に核酸を溶出し得る。
本発明の意味において、核酸は、例えばウィロイド性、ウィルス性、細菌性または細胞性起源の核酸等、任意の起源の核酸として理解される。核酸が試料から容易に入手できない場合、好ましくは適切な試薬によって入手可能となる。これには、pHの変化（アルカリ性）、熱、繰り返しの温度の極端な変化（凍結／融解）、生理的生育条件の変化（浸透圧）、界面活性剤、カオトロピック塩または酵素（例えばプロテアーゼおよびリパーゼ）の作用、が挙げられる。この様式で核酸を遊離し得るような試料物質は、具体的には細胞含有メディウム、細胞スメア（cell smear）および組織切片である。核酸はRNAおよびDNAであり得る。
本発明にかかる装置は、機能的連結3で連結され、各々が試料の入口開口部101/201および出口開口部102/202を有する、二つの中空体100/200からなる。好ましくは、本発明にかかるこの装置は、少なくとも一部で容器400に収まるように形作られる。この文脈において、機能的に連結されることは二つの中空体が本発明にかかる方法を行うことが可能であるように連結されることを意味する。この目的のために、必要に応じて連結を分離することが可能であるべきであり、液体不透過性であるべきであり、およびある応用のためには、周囲との空気の交換を妨げるべきでもある。さらに、第一の中空体から第二の中空体へ、試料が消失することなく通過することが保証されるべきであろう。好ましくは、これら中空体は本質的に円筒状である。好ましくは、開口部は本質的に円形である。入口開口部の円筒状部分に加えて、特に好ましくは、第一の中空体はまた、その出口開口部に向かって円錐状に狭くなる部分も有する。好ましくは、第一の中空体は5mlより大きい容積を有する。一旦試料5が中空体100の出口開口部102を通過すると、機能的連結3により、好ましくは円形の入口開口部201を通って、消失することなく第二の中空体200に入る。
液体透過性の核酸結合物質203は、第二の中空体中に配置される。核酸結合物質は、出てくる試料液体5が核酸結合物質を通過しなければならないような様式で、中空体の好ましくは円形の出口開口部202に位置する。この過程において、核酸は核酸結合物質に結合する。
第二の中空体は、その設計および材質に関して、第一の中空体と同様であり得る。特に、中空体は、少なくとも試料液体5の体積を収容可能であるべきである。好ましくは、第二の中空体は、第一の中空体と比較してより小さな容積を有する。好ましくは、この中空体は、少なくとも部分的に受け取り容器900に収まるような形状である。さらに、第二の中空体は、一分あたり14,000回転までの高速の遠心分離に適するような、材料からなり、大きさを有する。
両中空体は、それらが互いに機能的におよび可逆的に連結可能となるような手段を有する。第一および第二の中空体の機能的連結3は、好ましくはネジ式連結、すなわち、例えば外部または内部のネジ山（screw thread）である。第一の中空体が、例えばネジ山（thread）を有する場合、第二の中空体の手段は対になるネジ山である。本発明の別の好ましい態様において、第一および第二の中空体は、圧力、例えばプラグコネクションによって互いに連結する。
好ましくは、二つの中空体はともに、両中空体が全試料および、例えば核酸結合物質への核酸の結合を促進するための他の試薬を収容可能となる容積を有する。容積は500μlより大きく、好ましくは、1〜1000mlの間であり、特に好ましくは1〜100mlの間、および最も好ましくは5〜50mlまたは10〜30mlの間である。10、20または30mlの容積が特に好ましい。第一の中空体は、好ましくは1〜100mlの間、特に好ましくは5〜50mlの間、最も好ましくは10〜30mlの間の容積を有する。第二の中空体は、好ましくは2ml未満、特に好ましくは1〜2mlの容積を有する。
本発明にかかる装置の好ましい変形は、二つの中空体が、共に5〜50mlの間の容積を有することを特徴とする、装置である。
さらに、第一の中空体は、好ましくは、その位置が固定されるように、その入口開口部101に近接して、中空体の保持103のために容器400中に手段を有する。この容器は、好ましくは円形である入口開口部401を有する。好ましくは、該容器は、入口開口部401に円筒状部分、およびその端に円錐状領域を有する。核酸結合物質203を通過した後に、第二の中空体200から出てくる液体8を受け取るために容器は用いられる。好ましくは、容器は閉じられ得る。
特に好ましくは、容器400は、機能的に連結された中空体100/200の両方を完全に受け入れ得るように、形作られ、閉鎖手段6を供与され、容器400は閉鎖要素7により閉口し得る。好ましくは、閉鎖要素はプラスチック製のスクリューキャップである。円形フランジは、容器400中の第一の中空体を保持103するための手段として好ましく、中空体が容器上にとどまり、さらに容器中へと貫通しないように、容器の縁をはみ出す。好ましくは、この円形フランジは、閉鎖要素7により容器に繋がれ、シールとして機能するような形状である。この場合、閉鎖要素は、好ましくは、上部から配置されたスクリューキャップであり、このとき容器は対のネジ山（counter thread）を有する。
あるいは、第一の中空体が付加的な保持するための手段がなくても、規定の位置で容器中へとさらに突き抜けることができないように、容器はその入口開口部401で、円錐状に狭くなる部分を有し得る。この場合、容器はまた、閉鎖要素により閉口し得る。機能的に連結された二つの中空体が、部分的にのみ容器に収まることも考えられ、この場合少なくとも第二の中空体の出口開口部が、完全に容器中に延在する必要がある。
図２に示された、本発明にかかる装置のさらに好ましい変形において、容器400には圧力差をかける手段が設けられる。この圧力差により、核酸結合物質を介した試料の通過をなし得るか、または補助し得る。この目的のために、容器に過剰圧または不足圧をかけるための連結部品16を備え、閉鎖要素7に圧力均等化連結部17を備える。該装置のこれらの変形において、そうでなければ核酸結合物質を隔てて圧力差が生じ得ないので、二つの中空体の連結部もガス不透過性であることが必要である。
好ましくは、第二の中空体200は、受け取り容器900に少なくとも部分的に収まるような形状である。好ましくは、この受け取り容器は本質的に円形の入口開口部901を有する。好ましくは、受け取り容器900は閉鎖可能であり、入口開口部で円筒状部分、および端で円錐状部分からなる。特に好ましくは、支持装置204を備えた第二の中空体200が受け取り容器に収まり、閉鎖要素10により容器が閉口し得るように受け取り容器は設計される。第一の中空体100のように、好ましくは第二の中空体もまた、受け取り容器の縁を越えて延在する保持手段204として円形フランジを有する。ネジ山11を有するスクリューキャップ10を用いる場合、円形フランジは受け取り容器によりはさまれ、シールとして機能する。また、この場合、中空体が完全にまたは部分的に受け取り容器中に貫通する規定の位置で、第二の中空体を保持するために、受け取り容器は円錐状の形状を有し得る。
本発明のさらなる変形において、好ましくは、受け取り容器に、圧力差をかける手段が備えられる。この圧力差により、フリースからの残液の除去、および該物質からの核酸の溶出がなされ得るか、または補助され得る。この目的のために、受け取り容器に過剰圧または不足圧かけるための連結部品が備えられ、閉鎖要素に圧力均等化連結部が備えられる。
本発明にかかる装置の第一もしくは第二の中空体、容器または受け取り容器は、核酸に結合しない物質で作られている。好ましくは、本発明にかかる装置の第一もしくは第二の中空体、容器または受け取り容器は、プラスチック製、金属製または混成物質製である。ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンまたはLuran（登録商標）が特に好ましい。これらには、プラスチックは複合注入プロセスにおいて容易に製造することができ、本発明にかかる単離方法の条件下で高い機械的な安定性を有し得るという利点がある。
第二の中空体の製造時に、プラスチックは核酸結合性を有する液体透過性物質の移入がすでに可能であるため、中空体の材料としては射出成形され得るプラスチックが特に好ましい。特にガラス繊維フリースの場合には、射出成形プロセス時に該物質を閉鎖要素に恒久的に注入し得る。しかしながら、例えば接着もしくは溶接によるか、またはクランプリングによる固定による射出成形プロセスでの第二の中空体の製造後、該物質を付着するだけのこともまた可能である。核酸結合物質を含む中空体の製造過程は特許出願書類 EP 0 738 733に記載されている。核酸結合物質を含むかかる分離カラムも市販されている（High PureTMカラム、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim製）。
また、本発明は、本発明にかかる装置を含む閉鎖可能容器にも関する。本発明の二つの中空体連結部全体を受容可能であり、閉鎖要素により閉鎖され得るように、閉鎖可能容器は好ましい形状である。閉鎖可能な容器は、特に好ましくは、50mlの容積で、スクリューキャップにより閉鎖可能な、プラスチックチューブ（Falconチューブ）等の市販の遠心容器である。
本発明の別の側面は、
a) 本発明にかかる装置を提供する工程、
b) 第一の中空体の入口開口部を介して、試料を装置に移す工程、
c) 核酸結合物質を介して、第二の中空体から、試料を容器へと通過させ、その間に核酸が核酸結合物質に結合する工程、
d) 核酸結合物質に結合した核酸を任意に洗浄する工程、
e) 第一の中空体から第二の中空体を離し、第二の中空体を受け取り容器900に移す工程、
f) 核酸結合物質に結合した核酸を洗浄する工程、
g) 核酸結合物質に結合した核酸を溶出し、それによって核酸を第二の受け取り容器13に回収し、これにより精製または単離する工程、
を含む、試料から核酸を精製または単離する方法に関する。
本発明の方法の好ましい変形は、核酸結合物質を有する本発明にかかる装置、および試料を使用し、核酸結合物質は主に二酸化ケイ素で構成されるか、または粒状もしくは繊維状の二酸化ケイ素を含むか、または特に好ましくはガラスフリースもしくはシリカゲルであるか、またはゼオライト、および試料を装置に移す前に、第一の中空体の入口開口部から、カオトロピック試薬の濃度が1M〜8Mになるように、すでにカオトロピック試薬を添加した試料からなる。
本発明にかかる装置に基づいた、本発明にかかる方法の好ましい態様を以下に記載する。まず、5〜30mlの全血、血清、血漿または他の体液の細胞を溶解し、粉砕し、例えばカオトロピック塩または／およびプロテアーゼ等の付加的に必要な試薬を試料液体に加える。さらに、本発明にかかる装置を、核酸を含まない液体の回収用の容器内に配置する（図１の工程IおよびII参照）。第一の中空体の入口開口部を介して、試料5を装置へ移した後、容器は、好ましくは、キャップできつく閉じられる（図１の工程III）。
次の工程において、試料液体を核酸結合物質に通す（図１の工程IV）。重力によるか、または好ましくは装置の遠心分離によるかのいずれかで、試料は通過し得る。また好ましくは、圧力差をかけて、試料を核酸結合物質に通し得る。本発明のこの態様において（図２参照）、装置に、例えば圧力をかけるための二つの連結部品16/17等の手段をさらに備える。過剰圧力または不足圧をかけるための、一つの連結部品を容器上に配置し、圧力均等化連結部として用いるために、第二の連結部品を容器の閉鎖要素上に配置する。
試料液体が核酸結合物質を通過する間に、他の試料成分は液体８とともに容器へ通過するが、試料中に存在する核酸は核酸結合物質に結合する。ここで、単離された核酸は、必要に応じて第一の中空体から分離され得、かつ任意の所望の様式でさらに加工され得る、第二の中空体の核酸結合物質中にある。
混入物を含む一定量の液体は、遠心分離後であっても、液体透過性物質に通常接着したままなので、装置を容器から取り外して中空体の機能的な連結を分離する前に、特に純粋な核酸を単離するために、任意の洗浄工程によって、接着したままの物質を除去することができる。この目的のために、容器を通り、次いで容器に集められる間に核酸が結合する物質を洗い流す洗浄液を、例えば第一の中空体の入口開口部を通して加え得る。洗浄工程は、好ましくは、圧力差をかけることによって、または装置を遠心分離機にかけることによって行われ得る。
核酸を再び液体透過性核酸結合物質から分離するために、第二の中空体を装置から取り外し得る（図１の工程V）。この目的のために、第二の中空体は、まずフリース中に存在する残液12を除去するために第一の中空体から分離した後に、好ましくは受け取り容器900に連結される（図１の工程VI）。大きさが小さいために、受け取り容器に連結された第二の中空体が非常に高い遠心力に供され得るので、この洗浄は、好ましくは装置の遠心分離によって行われる。続いて、第二の中空体は、溶出液を集める第二の受け取り容器13に連結される（図１の工程VII）。溶出液14は、核酸結合物質への核酸の結合をなくすように構成される。核酸が分離し得る条件は、ここでも用いられる物質に依存し、この過程は、ここでも圧力差をかけること、または遠心分離によって支持され得る（図１の工程VIII）。
溶出は、核酸が非常に少量の溶出液に溶解できるようになり、また核酸結合物質に残る核酸の量を減らせることから、好ましくは、遠心分離によって行われる。溶出および洗浄のための遠心分離は、好ましくは、試料の通過および任意の洗浄のための遠心分離よりも大きい遠心力によって行われる。溶出および洗浄のための遠心分離は、好ましくは、5000 gを超えて行われ、試料の通過および任意の洗浄のための遠心分離は、好ましくは5000 g未満で行われる。第二の中空体および受け取り容器は、特に好ましくは、例えば、ともにエッペンドルフ遠心分離機（Eppendorf, Hamburg, Germany）中で10,000 gを超えて遠心分離され得るように形作られる。これは、かなり低い遠心力（例えば、Beckman卓上遠心分離機（Beckman Coulter, Inc., USA）で約3000 g）に供され得るだけで、そのためより多くの溶出液を必要とする第一の容器より、受け取り容器がかなり小さい容積を有しさえすればよいために可能である。そのため、本発明の装置は、核酸の単離だけでなく、核酸を、より大きい体積5からより小さい体積15に変えるのに適している。
核酸を精製または単離するための装置の容積は、本発明の重要な特徴である。一方で、装置の容積は、希釈された、体積の大きい試料を適用するために大きくなければならず、また一方で、装置の大きさは、少量の溶解バッファーでの溶解手順を実現するために、小さくなければならない。核酸の効率的な溶出に必要な溶解バッファーの量は、中でも、核酸結合物質の大きさ、および溶解手順の支持力に依存する。大きい第一の中空体と、核酸結合物質を含む小さい第二の中空体との可逆的カップリングは、上記の両方の要件を解決する。第一に、両方の中空体の全体の容積は、結合過程の間の、希釈された、体積の大きい試料の適用性を提供する。第二に、結合過程の後、小さい第二の中空体は装置から取り外され得、核酸は、同じ開始試料体積に適用可能な最先端の装置で可能なものよりも、かなり高い遠心力によって溶出され得る。
本発明の別の側面は、本発明の装置または本発明の容器、および核酸を核酸結合物質に結合するためのカオトロピック試薬から構成される、試料から核酸を精製または単離するためのキットである。キットはさらに、マイクロタイタープレート、またはエッペンドルフ反応容器（Eppendorf, Hamburg, Germany）等の単純な反応容器等の、本発明の方法を行うのに必要な、他のプラスチック部分を含み得る。また、キットは、本発明の方法に必要なさらなる試薬、例えば、カオトロピック剤、界面活性剤、アルコール、もしくは細胞を溶解するこれらの物質の混合物を含む、溶解バッファー、核酸が結合した核酸結合物質を洗浄する、カオトロピック試薬、および／もしくはアルコール、もしくは酸性pHのバッファーを含む、洗浄バッファー、または核酸が核酸結合物質から分離できるようにする溶出バッファーを含み得る。本発明によると、キットのこれらの化合物は、個々に、または保存容器中で提供され得る。試薬は、通常、すぐに使えるように提供されるが、使用前に希釈される必要のあるストック溶液の形態でも販売され得る。
本発明はまた、試料から核酸を精製または単離するための、本発明の装置または本発明の容器の使用にも関する。
具体的には、本発明は、以下の側面を包含する：
1. 試料のための入口開口部101および出口開口部102を有する第一の中空体100ならびに入口開口部201および出口開口部202を有する第二の中空体200からなる、核酸を精製または単離するための装置であって、ここで第二の中空体の入口開口部201が第一の中空体の出口開口部102に機能的に連結され、第一および第二の中空体が互いに分離し得、核酸結合物質203が第二の中空体の出口開口部202の前に位置する、装置。
2. 第二の中空体が、第一の中空体と比較して小さい容積を有する、1の装置。
3. 少なくとも部分的に容器400に適合するように形作られた、1または2いずれかの装置。
4. 第二の中空体が、少なくとも部分的に受け取り容器900に適合するように形作られた、1〜3いずれかの装置。
5. 第一および第二の中空体が、ねじ込み継手によって連結された、1〜4いずれかの装置。
6. 第一および第二の中空体が、押圧によって連結された、1〜4いずれかの装置。
7. 第一および／または第二の中空体が本質的に円筒である、1〜6いずれかの装置。
8. 第一の中空体が、入口開口部の円筒形部分に加えて、出口開口部に向かって円錐形に狭くなる部分を有する、7の装置。
9. 第一および／または第二の中空体の開口部が本質的に円形である、1〜8いずれかの装置。
10. 第一の中空体が5 mlより大きい容積を有することを特徴とする、1〜9いずれかの装置。
11. 容器が閉鎖可能である、3〜10いずれかの装置。
12. 容器が、入口開口部の円筒形部分および端の円錐形部分からなる、3〜11いずれかの装置。
13. 容器が、圧力差をかけるための手段を有する、3〜12いずれかの装置。
14. 受け取り容器が閉鎖可能である、4〜13いずれかの装置。
15. 受け取り容器が閉鎖可能であり、かつ入口開口部401の円筒形部分および端の円錐形部分からなる、4〜14いずれかの装置。
16. 受け取り容器が、圧力差をかける手段を有する、4〜15いずれかの装置。
17. 容器の入口開口部401および／または受け取り容器の入口開口部901が本質的に円形である、4〜16いずれかの装置。
18. 核酸結合物質が、主に二酸化ケイ素から構成されるか、または繊維もしくは粒子の形で二酸化ケイ素を含むことを特徴とする、1〜17いずれかの装置。
19. 核酸結合物質がガラスフリースまたはシルカゲルであるか、またゼオライトから構成されることを特徴とする、1〜18いずれかの装置。
20. 核酸結合物質が、金属酸化物もしくは混合金属酸化物から構成されるか、または繊維または粒子の形で金属酸化物もしくは混合金属酸化物を含むことを特徴とする、1〜19いずれかの装置。
21. 核酸結合物質が酸化アルミニウム、酸化ハフニウムもしくは酸化ジルコニウム、または繊維もしくは粒子の形の酸化アルミニウム、酸化ハフニウムもしくは酸化ジルコニウムから構成されることを特徴とする、1〜20いずれかの装置。
22. 第一もしくは第二の中空体、容器または受け取り容器が、核酸に結合しない物質で作られることを特徴とする、1〜21いずれかの装置。
23. 第一もしくは第二の中空体、容器または受け取り容器が、プラスチック、金属または混成物質から構成されることを特徴とする、1〜22いずれかの装置。
24. 第二の中空体がポリプロピレンで作られることを特徴とする、23の装置。
25. 1〜24いずれかの装置を含む、閉鎖可能な容器400。
26.ａ）1〜25いずれかの装置を提供する工程、
ｂ）第一の中空体の入口開口部を介して試料を装置へ移す工程、
ｃ）試料を第二の中空体から核酸結合物質を介して容器へ通過させ、核酸を核酸結合物質に結合させる工程、
ｄ）核酸結合物質に結合した核酸を任意に洗浄する工程、
ｅ）第一の中空体から第二の中空体を分離し、第二の中空体を受け取り容器900に移す工程、
ｆ）核酸結合物質に結合した核酸を洗浄する工程
ｇ）核酸結合物質に結合した核酸を溶出し、それによって核酸が第二の受け取り容器13に集められ、精製または単離される工程
によって、試料から核酸を精製または単離する方法。
27. 18または19いずれかに主張される装置が用いられること、およびカオトロピック試薬の濃度が1 M〜8 Mの間になるように、装置に移す前にカオトロピック試薬が第一の中空体の入口開口部を介してさらに試料に加えられることを特徴とする、26の方法。
28. 工程ｃ）における試料の通過、工程ｄ）における任意の洗浄、工程ｆ）における洗浄または工程ｇ）における溶出が圧力差をかけることによって行われることを特徴とする、26の方法。
29. 工程ｃ）における試料の通過、工程ｄ）における任意の洗浄、工程ｆ）における洗浄または工程ｇ）における溶出が遠心分離によって行われることを特徴とする、26の方法。
30. 工程ｆ）およびｇ）における遠心分離が、工程ｃ）およびｄ）における遠心分離と比較して、より大きい遠心力で行われることを特徴とする、29の方法。
31. 工程ｃ）およびｄ）における遠心分離が5000 g未満の遠心力で行われることを特徴とする、29の方法。
32. 工程ｆ）およびｇ）における遠心分離が5000 gを超える遠心力で行われることを特徴とする、29の方法。
33.ａ）1〜24いずれかの装置または25の容器、
ｂ）核酸を核酸結合物質に結合させるためのカオトロピック試薬
から構成される、試料から核酸を精製または単離するためのキット。
34. 試料から核酸を精製または単離するための、1〜24いずれかの装置または25の容器の使用。
本発明は、以下の実施例、刊行物および図面によってさらに明らかになり、その保護範囲は特許請求の範囲に由来する。記載される方法は、変形後の発明も記載する例として理解されたい。
（実施例）
実施例：１
5 mlの血清からのDNA単離の以下の例は、本発明をさらに明らかにすることを意図する。いわゆる「UpScale HighPure」法は、市販の「HighPureTMカラム」（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）、はめ込み可能な体積付加物（pluggable volume attachment）、および「MagNA Pure（登録商標） LC Total Nucleic Acid Isolation Kit-Large Volume」（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）の試薬と同一な試薬から構成される、いわゆる「UpScale HighPure」キットを利用する。体積付加物（ポリプロピレン製）は、この実施例においては、約25 mlの充填容積を有し、円形の入口開口部、およびHighPureカラム（容積 約1.5 ml）が取り付けられ得る出口開口部を有する円筒形の形状を有する（内径2.5 cm、長さ 5 cm）。エッペンドルフ遠心分離機（Eppendorf, Hamburg, Germany）、50 mlのファルコンチューブを用いるベックマン遠心分離機（Beckman Coulter, Inc., USA）、市販のボルテックスおよびエッペンドルフ反応容器（Eppendorf, Hamburg, Germany）もまた、「UpScale HighPure」法を用いたDNA単離に用いられる。
DNA単離の手順
250μlの40 mg/mlプロテイナーゼK溶液を、50 mlファルコンチューブに入れる。5 mlの試料（血清または血漿）を加え、ボルテックスにかけ、次いで室温で10分インキュベートする。次の工程において、6.25 mlの溶解／結合バッファーを加え、ボルテックスにかけ、溶液を65℃で10分インキュベートする。その次に、1900 gで遠心分離する（泡の除去）。次の工程において、3.125 mlのイソプロパノールを加え、混合し、1900 gで1分遠心分離し、次いで混合物を室温で10分放置する。次の工程において、混合物の一部（約15 ml）を装置の体積付加物に適用し、残った残液もまた、ピペッティングによってカラムに適用する。これをまず1900 gで2分（加速を含む）、続いて3300 gで1分遠心分離する。次の工程において、溶出液を廃棄する。
これに、様々な洗浄工程が続く（用いられる洗浄バッファーは、市販の「MagNA Pure（登録商標） LC Total Nucleic Acid Isolation Kit-Large Volume」、カタログ番号3264793、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germanyである）：まず、装置を新しい50 mlファルコンチューブに入れ、2 mlの洗浄バッファー１を加えて3300 gで2分遠心分離する。その後、2 mlの洗浄バッファー２を加え、3300 gで2分遠心分離する。次の洗浄工程において、2 mlの洗浄バッファー３を加え、3300 gで2分遠心分離する（該3つの洗浄工程は、ファルコンチューブを変えずに行われ得る）。体積付加物を、ここでHigh Pureカラムから除去し、High Pureカラムをエッペンドルフカップに入れ、蓋を閉め、エッペンドルフ遠心分離機で、20,000 gで1分遠心分離する。これによって残液をフリースから除去する。
次の工程は、DNAの溶出を含む。50〜100μlの溶出バッファーをフリースに適用し、High Pureカラムの蓋を閉める。その後、室温で3分インキュベートし、次いで20,000 gで1分、エッペンドルフ遠心分離機で遠心分離する。エッペンドルフ反応容器は溶出液を含み、HighPureTMカラムは廃棄され得る。
実施例２：
以下の実施例は、本発明の方法のDNA単離と、最先端技術の単離の比較を示す。血清試料を、実施例１に類似して調製し、体積付加物を有する2つのHighPureTMカラムに均等に分ける。両方のカラムの実験手順は、残液を除去する工程までは同一である。カラムの一方において、体積付加物はそれ以降HighPureカラムから分離され、フリース中の残液はエッペンドルフ遠心分離機（約15μl）を採用した遠心分離によって除去され、結合した核酸は、次いでエッペンドルフ遠心分離機を採用して50μl中に溶出される。
これに対し、第二のカラムにおいては、HighPureカラムと体積付加物との間の連結が保持され、装置全体がファルコンチューブに挿入され、フリースから前もって残液を除去することなく、ベックマン遠心分離機中で（2分 3300 g）50μlの溶液を用いて溶出が行われる。
結果から、装置を分離せず、エッペンドルフ遠心分離機を用いない10回より多い実験で、平均して、DNA収率は約30％低かったことが示される。
実施例３：
以下の実施例は、本発明の方法のDNA単離と最先端技術の単離との、他の比較を示す。血清試料は実施例１と類似して調製し、体積付加物を有するHighPureTMカラムと、Macherey & Nagel, Dueren, Germanyの「NucleoSpin（登録商標） Funnel」カラム（カタログ番号740959）との間で均一に分ける。両方のカラムについての実験手順は、残液を除去する工程までは同一である。HighPureTMカラムの場合、体積付加物はそれ以降HighPureカラムから分離され、フリース中の残液は、エッペンドルフ遠心分離機を採用した遠心分離（約15μl）によって除去され、結合した核酸は、次いでエッペンドルフ遠心分離機を採用して、60μl中に溶出される。
これに対し、Macherey & Nagelのカラムはファルコンチューブに挿入され、フリースから残液を前もって除去することなく、ベックマン遠心分離機（2分 3300 g）中で60μlの溶液を用いて溶出が行われる。
結果から、5つの異なる血清プローブと比較して（1つのプローブにつき3回測定）、平均して、体積付加物を有するHighPureTMカラムを用いたDNA収率は、Macherey & Nagelのカラムを用いた場合と比較して、約3〜4倍良好であったことが示される。
実施例４：
実施例３で用いた5つの血清プローブを用いて、本発明の装置の性能を、2つの市販のDNAの単離または精製のための沈降キットである、Invitek GmbH, Berlin, Germanyの「RTP（登録商標） DNA/RNA Virus Supersense」キット（カタログ番号10404002、ロットOC030036）およびQiagen GmbH, Hilden, Germanyの「QIAmp（登録商標） UltraSensTM」キット（カタログ番号53704、ロット11862713）の性能との比較もした。両方のキットを、製造業者のプロトコールに従って用い（Invitek: Vers. TH11/03.2 March 2003; Qiagen: 01/2003）、Qiagenキットの場合は、プロトコールは1 mlから5 ml容量に適合させた。
大きい容量に適合させたHighPureTMカラムと比較して、Qiagenキットは、約9倍減少した平均量のDNAを単離し、Invitekキットは、約80倍も減少した平均量のDNAを単離した。
図１は、本発明にかかる装置を用いた例を示すとして示された、本発明にかかる方法の模式的な表示である。 図２は、圧力差を生じ得、試料が核酸結合物質を通過することを確実にするように手段が備えられた、本発明にかかる装置の代替的な態様である。

Claims (33)

  1. 試料用の入口開口部（101）および出口開口部（102）を有する第一の中空体（100）ならびに入口開口部（201）および出口開口部（202）を有する第二の中空体（200）からなる、核酸を精製または単離するための装置であって、ここで第二の中空体の入口開口部（201）は第一の中空体の出口開口部（102）に機能的に連結されており、第一および第二の中空体は互いに分離し得、核酸結合物質（203）が第二の中空体の出口開口部（202）の前に位置し、第二の中空体（200）が第一の中空体（100）に比べて小さい容積を有し、第一の中空体（100）が5 mlより大きい容積を有する、装置。
  2. 該装置が、少なくとも部分的に容器（400）に適合するように形作られた、請求項１記載の装置。
  3. 第二の中空体が、少なくとも部分的に受け取り容器（900）に適合するように形作られた、請求項１または２記載の装置。
  4. 第一および第二の中空体が、ねじ込み継手によって連結された、請求項１〜３いずれか記載の装置。
  5. 第一および第二の中空体が押圧によって連結されている、請求項１〜３いずれか記載の装置。
  6. 第一および／または第二の中空体が本質的に円筒である、請求項１〜５いずれか記載の装置。
  7. 第一の中空体が、入口開口部の円筒形部分に加えて、出口開口部に向かって円錐形に狭くなる部分を有する、請求項６記載の装置。
  8. 第一および／または第二の中空体の開口部が本質的に円形である、請求項１〜７いずれか記載の装置。
  9. 容器（４００）が閉鎖可能である、請求項２〜８いずれか記載の装置。
  10. 容器（４００）が、入口開口部の円筒形部分および端の円錐形部分からなる、請求項２〜９いずれか記載の装置。
  11. 容器（４００）が、圧力差をかけるための手段を有する、請求項２〜１０いずれか記載の装置。
  12. 受け取り容器（９００）が閉鎖可能である、請求項３〜１１いずれか記載の装置。
  13. 受け取り容器（９００）が閉鎖可能であり、かつ入口開口部（401）の円筒形部分および端の円錐形部分からなる、請求項３〜１２いずれか記載の装置。
  14. 受け取り容器（９００）が、圧力差をかける手段を有する、請求項３〜１３いずれか記載の装置。
  15. 容器の入口開口部（401）および／または受け取り容器の入口開口部（901）が本質的に円形である、請求項３〜１４いずれか記載の装置。
  16. 核酸結合物質が、主に二酸化ケイ素で構成されるか、または繊維または粒子の形で二酸化ケイ素を含むことを特徴とする、請求項１〜１５いずれか記載の装置。
  17. 核酸結合物質がガラスフリースまたはシルカゲルであるか、またゼオライトから構成されることを特徴とする、請求項１〜１５いずれか記載の装置。
  18. 核酸結合物質が、金属酸化物もしくは混合金属酸化物から構成されるか、または繊維または粒子の形で金属酸化物もしくは混合金属酸化物を含むことを特徴とする、請求項１〜１５いずれか記載の装置。
  19. 核酸結合物質が酸化アルミニウム、酸化ハフニウムもしくは酸化ジルコニウム、または繊維もしくは粒子の形の酸化アルミニウム、酸化ハフニウムもしくは酸化ジルコニウムから構成されることを特徴とする、請求項１〜１５いずれか記載の装置。
  20. 第一もしくは第二の中空体、容器または受け取り容器が、核酸に結合しない物質で作られることを特徴とする、請求項１〜１９いずれか記載の装置。
  21. 第一もしくは第二の中空体、容器または受け取り容器が、プラスチック、金属または混成物質から構成されることを特徴とする、請求項１〜２０いずれか記載の装置。
  22. 第二の中空体がポリプロピレンで作られることを特徴とする、請求項２１記載の装置。
  23. 2つの中空体がともに5〜50 mlの容積を有することを特徴とする、請求項１〜２２いずれか記載の装置。
  24. 請求項１〜２３いずれか記載の装置を含む、閉鎖可能な容器（400）。
  25. ａ）請求項１〜２４いずれか記載の装置を提供する工程、
    ｂ）第一の中空体の入口開口部を介して、試料を装置へ移す工程、
    ｃ）第二の中空体から核酸結合物質を介して容器へ試料を通過させ、その間に核酸が核酸結合物質に結合する工程、
    ｄ）任意に、核酸結合物質に結合した核酸を洗浄する工程、
    ｅ）第二の中空体を第一の中空体から分離し、第二の中空体を受け取り容器（900）に移す工程、
    ｆ）核酸結合物質に結合した核酸を洗浄する工程、
    ｇ）核酸結合物質に結合した核酸を溶出し、それによって第二の受け取り容器（13）に核酸が集められ、精製または単離される工程
    によって、試料から核酸を精製または単離する方法。
  26. 請求項１６または１７記載の装置を使用すること、および装置へ移す前に、カオトロピック試薬の濃度が1 M〜8 Mの間になるようにカオトロピック試薬が第一の中空体の入口開口部を介して試料へさらに加えられることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
  27. 工程ｃ）における試料の通過、工程ｄ）における任意の洗浄、工程ｆ）における洗浄または工程ｇ）における溶出が圧力差をかけることによって行われることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
  28. 工程ｃ）における試料の通過、工程ｄ）における任意の洗浄、工程ｆ）における洗浄または工程ｇ）における溶出が遠心分離によって行われることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
  29. 工程ｆ）およびｇ）における遠心分離が、工程ｃ）およびｄ）における遠心分離と比較して、より大きい遠心力で行われることを特徴とする、請求項２８記載の方法。
  30. 工程ｃ）およびｄ）における遠心分離が5000 g未満の遠心力で行われることを特徴とする、請求項２８記載の方法。
  31. 工程ｆ）およびｇ）における遠心分離が5000 gを超える遠心力で行われることを特徴とする、請求項２８記載の方法。
  32. ａ）請求項１〜２３いずれか記載の装置または請求項２４記載の容器（４００）、
    ｂ）核酸結合物質への核酸の結合のための、カオトロピック試薬
    で構成される、試料から核酸を精製または単離するためのキット。
  33. 試料から核酸を精製または単離するための、請求項１〜２３いずれか記載の装置または請求項２４記載の容器（４００）の使用。
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