ES2286800T3 - Metodo y dispositivo para la purificacion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo para la purificación o aislamiento de ácidos nucleicos, el cual consiste en un primer cuerpo hueco (100) con una abertura de entrada (101) para una muestra y una abertura de salida (102) y un segundo cuerpo hueco (200) con una abertura de entrada (201) y una abertura de salida (202) en donde la abertura de entrada del segundo cuerpo hueco (201) está funcionalmente conectado a la abertura de salida del primer cuerpo hueco (102), pudiendo el primero y segundo cuerpo hueco separarse uno de otro, y un material para la unión con ácidos nucleicos (203) está situado frente a la abertura de salida del segundo cuerpo hueco (202), el segundo cuerpo hueco (200) tiene un volumen menor comparado con el primer cuerpo hueco (100), y el primer cuerpo hueco (100) tiene un volumen mayor de 5 ml.
Description
Método y dispositivo para la purificación de
ácidos nucleicos.
La invención se refiere a un método para el
aislamiento y purificación de ácidos nucleicos a partir de una
muestra, y un dispositivo adecuado para ello.
La introducción de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y subsiguientes sistemas alternativos de
amplificación para los ácidos nucleicos ha permitido el empleo de
este material genético como un método para los ensayos de
diagnóstico. Como consecuencia, se dispone ahora de nuevos métodos
analíticos especialmente para el diagnóstico de enfermedades
hereditarias, de la predisposición para ciertas enfermedades y
enfermedades infecciosas, los cuales entre otras cosas, permiten un
diagnóstico temprano de la condición.
Con el fin de convertir el material genético en
una forma adecuada para la amplificación enzimática, es necesario
liberarlo del material de la muestra biológica. Además el ácido
nucleico debe protegerse de la degradación por las nucleasas del
material biológico o del medio ambiente, y de la degradación por las
condiciones de la reacción química. Los requisitos más exigentes
son los que se refieren a la ausencia de contaminación de la
muestra biológica y del ácido nucleico aislado de la misma. Para la
amplificación, el ácido nucleico debe estar presente en una
solución tamponada, acuosa, substancialmente exenta de sales.
Mientras la PCR emplea normalmente muy pocas
cantidades de analito (del orden de los pg-ng), hay
problemas especiales que requieren a veces el procesado de una
cantidad mayor de muestra. Por ejemplo, con el fin de identificar
células tumorales en circulación con una sensibilidad de una célula
tumoral frente a un fondo de células normales, el ácido nucleico
debe aislarse de 10-20 ml de una muestra de sangre.
Después de la homogeneización de la muestra, un alícuota del ARN
aislado puede ser examinado a continuación para detectar la
expresión de un gen asociado al tumor.
Además de los métodos clásicos de aislamiento
del ácido nucleico por medio de la lisis enzimática, mecánica o
química del material de la muestra, la subsiguiente extracción de
las proteínas y lípidos de fenol y fenol/CHCl_{3} y la
precipitación del ácido nucleico a partir de la fase acuosa mediante
etanol ó i-propanol (Sambrook, J. et al.,
Molecular Cloning ("Clonado molecular"), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 2ª edición, 9.16-9.23;
Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, 1987, 2.1.1-2.4.5),
han sido desarrollados en los últimos años varios kits comerciales
especialmente para la preparación de muestras para PCR, los cuales
utilizan la propiedad de los ácidos nucleicos de unirse a
superficies de vidrio en condiciones caotrópicas de sal, lo cual ya
es conocido desde el final de los años setenta (Vogelstein, B.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 75 (1979)
615-619). Otros constituyentes del material
biológico, tales como proteínas, lípidos o sales, no se unen y por
lo tanto se separan. Se conocen recipientes de centrifugación con
incrustaciones de lana de vidrio o suspensiones de silica gel, los
cuales permiten un proceso por lotes. Además se conocen múltiples
dispositivos en un formato desnudo y con una placa de
microtitulación de 96 pocillos, con la lana de vidrio retirada
hacia la base, la cual puede ser operada con ayuda de una cámara de
vacío unida por la parte inferior así como por centrifugación. En
estos métodos el volumen de las muestras está a menudo limitado.
Además, son necesarias grandes cantidades de tampón para eluir
eficazmente los ácidos nucleicos a partir de la lana de vidrio lo
cual da por resultado una solución diluida de moléculas aisladas y
requiere unos pasos adicionales de preparación para ciertas
aplicaciones.
Un método modificado (Miller et al.,
Nucl. Acids Res. 16: 1215) emplea una solución concentrada de sal
para precipitar las proteínas y otras substancias acompañantes
después de la lisis del material de muestra. Los ácidos nucleicos
del sobrenadante se precipitan a continuación con etanol y se
recogen por centrifugación. Una vez los ácidos nucleicos han sido
disueltos, pueden emplearse para la amplificación.
La patente WO 93/11221 describe un método y un
dispositivo para aislar y purificar ácidos nucleicos, el cual
emplea intercambios aniónicos y substancias minerales portadoras. La
patente US 5.104.533 describe una unidad de filtración con
compensación de la presión. La patente US 4.270.921 describe la
combinación de una microcolumna y un tubo de centrífuga. La patente
WO 98/32877 describe un dispositivo para el aislamiento de ácidos
nucleicos el cual está compuesto de dos recipientes conectados por
un elemento de cierre que contiene un material para la unión de
ácidos nucleicos. La patente US 4.956.298 describe una columna de
separación o reacción, que consta de un recipiente de
centrifugación y un cuerpo receptor en donde el cuerpo receptor
contiene un material de columna y el recipiente de centrifugación
recoge el efluente del cuerpo receptor. La patente DE 19512361
describe un método para el aislamiento de un material biológico el
cual emplea una matriz porosa comprimible para unir el material
biológico y comprime el material con el fin de eluir el material. La
patente EP 588564 describe un dispositivo para la separación por
afinidad que comprende una membrana de captura situada en la punta
de una pipeta. La patente WO 96/41810 describe la eliminación del
ADN de una suspensión de células con ayuda de un filtro de membrana
hueco y un paso de intercambio iónico. La fabricación de un
dispositivo que contiene un material para unir ácidos nucleicos es
conocido a partir de la patente EP 738733. La patente WO 02/053256
describe un dispositivo y un método para la purificación, que
comprende un soporte para la muestra con una parte de inserción a
la columna, mientras que un módulo de columna se fija en dicha parte
de inserción de la columna. La patente US 6.177.009 y los modelos
de utilidad alemanes DE 298 03 712 U1 y DE 202 18 503 U1 describen
un dispositivo para el tratamiento de biomoléculas que comprende una
columna de separación que tiene un dispositivo de separación y un
recipiente de recogida del líquido que fluye fuera.
El objeto de la presente invención es el de
proporcionar un nuevo dispositivo y un nuevo método para la
purificación o aislamiento de ácidos nucleicos a partir de grandes
volúmenes de muestra.
El objetivo se logra de acuerdo con la invención
mediante un dispositivo cuyos componentes individuales están
mostrados en la figura 1. Además se describe un método en el cual se
emplea el dispositivo de acuerdo con la invención, y cuyas fases
individuales se muestran también esquemáticamente y como un ejemplo
en la figura 1. El método de acuerdo con la invención en el cual se
emplea el dispositivo de acuerdo con la invención, asegura un mayor
rendimiento en ácidos nucleicos.
Un objeto de la presente invención es un
dispositivo para la purificación o aislamiento de ácidos nucleicos
y consta de un primer cuerpo hueco 100 con una abertura de entrada
101 para una muestra y una abertura de salida 102, y un segundo
cuerpo hueco 200 con una abertura de entrada 201 y una abertura de
salida 202, en donde la abertura de entrada del segundo cuerpo
hueco 201 está funcionalmente conectada a la abertura de salida del
primer cuerpo hueco 102, estando el primero y segundo cuerpo hueco
separados entre sí, un material de unión con ácidos nucleicos 203
está situado frente a la abertura de salida del segundo cuerpo hueco
202, el segundo cuerpo hueco 200 tiene un volumen más pequeño
comparado con el primer cuerpo hueco 100 y el primer cuerpo hueco
100 tiene un volumen mayor de
5 ml.
5 ml.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
recipiente que puede cerrarse 400, el cual contiene un dispositivo
de acuerdo con la invención.
La invención se refiere también a un método para
la purificación o aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una
muestra, el cual método comprende los pasos:
- a)
- provisión del dispositivo de acuerdo con la invención,
- b)
- transferencia de la muestra dentro del dispositivo a través de la abertura de entrada en el primer cuerpo hueco,
- c)
- paso de la muestra del segundo cuerpo hueco a través del material de unión con ácidos nucleicos dentro de un recipiente durante lo cual los ácidos nucleicos se unen al material de unión con los ácidos nucleicos,
- d)
- opcionalmente, lavado de los ácidos nucleicos unidos al material de unión con los ácidos nucleicos,
- e)
- separación del segundo cuerpo hueco del primer cuerpo hueco y transferencia del segundo cuerpo hueco dentro de un recipiente de recepción 900,
- f)
- lavado de los ácido nucleicos unidos al material de unión con los ácidos nucleicos,
- g)
- elución de los ácidos nucleicos unidos al material de unión con los ácidos nucleicos, recogiendo los ácidos nucleicos en un segundo recipiente de recepción 13 y así son purificados o aislados.
La invención se refiere también a un kit para la
purificación o aislamiento de ácidos nucleicos de una muestra,
compuesto dicho kit de un dispositivo de acuerdo con la invención o
un recipiente de acuerdo con la invención y reactivos caotrópicos
para la unión de los ácidos nucleicos al material de unión de
ácidos nucleicos.
Otro asunto objetivo de la invención es el
empleo de un dispositivo de acuerdo con la invención o de un
recipiente de acuerdo con la invención para purificar o aislar
ácidos nucleicos a partir de una muestra.
Se entiende como material para la unión de los
ácidos nucleicos, un material al cual los ácidos nucleicos se unen
no covalentemente bajo ciertas condiciones, mientras que otras
substancias de la muestra no se unen bajo estas condiciones. Esta
unión con el ácido nucleico es reversible, y por lo tanto los ácidos
nucleicos pueden ser subsiguientemente eluídos de nuevo del
material mediante un cambio en las condiciones.
Dentro del ámbito de esta invención se entiende
por matriz un material en el cual se incrustan partículas o fibras
del material de unión con ácidos nucleicos. Este material de la
matriz es permeable a los líquidos de forma que la muestra puede
pasar a través de la matriz, los ácidos nucleicos pueden hacer
contacto con el material de unión con ácidos nucleicos y otros
componentes de la muestra pueden abandonar la matriz. Los
materiales sólidos que tienen un diámetro pequeño son designadas
como partículas por los expertos en la técnica. Estas partículas
tienen de preferencia una superficie esencialmente esférica. Las
partículas en forma de laminillas y filamentosas, constituidas por
un material que se une a los ácidos nucleicos, reciben el nombre de
fibras.
\newpage
Dentro del ámbito de esta invención se entiende
por cuerpo hueco una estructura hueca con una abertura de entrada a
través de la cual puede entrar una muestra en el cuerpo hueco y una
abertura de salida a través de la cual una muestra puede abandonar
de nuevo el cuerpo hueco. En cambio, un recipiente es una estructura
hueca con solamente una abertura de entrada a través de la cual
puede entrar una muestra en el recipiente. Por lo tanto, puede
emplearse para recoger una muestra.
Dentro del ámbito de esta invención se entiende
por conexión funcional de los cuerpos huecos, que los dos cuerpos
huecos están conectados de tal manera que es posible efectuar el
método de acuerdo con la presente invención. Para esta finalidad
debe ser posible separar la conexión cuando sea necesario, debe ser
impermeable a los líquidos y para ciertas aplicaciones, debe
impedir también el intercambio de aire con el medio ambiente.
Además, debe asegurar un paso de la muestra desde el primer cuerpo
hueco al interior del segundo cuerpo hueco sin ninguna pérdida.
Se entiende por reactivos caotrópicos aquellas
substancias que cambian la estructura secundaria, terciaria y/o
cuaternaria de las proteína o ácidos nucleicos pero no afectan por
lo menos a su estructura primaria. Ejemplos son el tiocianato de
guanidina, hidrocloruro de guanidinio, NaI, KI, tiocianato de sodio
o combinación de estas substancias. Dentro del ámbito de esta
invención, se entiende por reactivos caotrópicos todas aquellas
substancias químicas que alteran la ordenada estructura del agua
líquida y ocasionan así que el ADN ó el ARN se unan desde esta
solución acuosa a la superficie de vidrio. Otras substancias tales
como NaCl, KCl ó CaCl_{2} pueden estar presentes en la solución
con el fin de modificar la fuerza iónica. La propiedad del ADN ó ARN
de unirse en condiciones caotrópicas a las superficies de vidrio,
puede ser utilizada para aislarlas a partir de una solución que
contiene otros materiales biológicos, puesto que la unión a la
superficie de vidrio es reversible. Si por ejemplo, la
concentración de los reactivos caotrópicos se reduce o los reactivos
caotrópicos se eliminan completamente, el ADN ó ARN pueden ser
eluídos de nuevo.
Figura 1: Representación esquemática del método
de acuerdo con la invención mostrada como ejemplo empleando el
dispositivo de acuerdo con la invención.
Figura 2: Versión alternativa del dispositivo de
acuerdo con la invención en la cual figuran unos medios que
permiten que se genere una diferencia de presiones y así se asegura
el paso de la muestra a través del material que se une al ácido
nucleico.
Un objetivo de la presente invención es un
dispositivo para la purificación o aislamiento de ácidos nucleicos,
que consta de un primer cuerpo hueco 100 con una abertura de entrada
101 para una muestra y una abertura de salida 102 y un segundo
cuerpo hueco 200 con una abertura de entrada 201 y una abertura de
salida 202, en donde la abertura de entrada del segundo cuerpo
hueco 201 está funcionalmente conectada a la abertura de salida del
primer cuerpo hueco 102, el primer y segundo cuerpo hueco pueden
separarse entre sí, un material de unión a los ácidos nucleicos 203
está situado frente a la abertura de salida del segundo cuerpo hueco
202, el segundo cuerpo hueco 200 tiene un volumen más pequeño
comparado con el primer cuerpo hueco 100 y el primer cuerpo hueco
100 tiene un volumen mayor de 5 ml.
Los materiales que unen a los ácidos nucleicos
son ya conocidos por los expertos en la técnica. El material puede
estar en forma de partículas así como en fibras. Si el material está
compuesto de partículas se ha demostrado que es ventajoso
inmovilizar estas partículas por ejemplo mediante la incorporación
de las mismas entre laminillas permeables a los líquidos, p. ej.,
tejidos o lana en rama hechos de material fibroso tal como celulosa
o plásticos que tienen poros tan estrechos que las partículas se
apoyan entre las laminillas. El material de unión con los ácidos
nucleicos está de preferencia compuesto principalmente de dióxido de
silicio o contiene dióxido de silicio en forma de fibras o
partículas. El material de unión a los ácidos nucleicos es con
particular preferencia lana de vidrio o un gel de sílice o está
compuesto de zeolita. El material de unión para ácidos nucleicos
está también compuesto de preferencia de óxidos metálicos u óxidos
metálicos mezclados en forma de fibras o partículas. El material de
unión para ácidos está de preferencia compuesto particularmente de
óxido de aluminio, óxido de hafnio u óxido de zirconio o contiene
óxido de aluminio, óxido de hafnio u óxido de zirconio en forma de
fibras o partículas.
El material de unión para ácidos nucleicos es de
preferencia un material fibroso p. ej., en forma de tejido o lana
en rama. Materiales adecuados son por ejemplo los ya conocidos a
partir de métodos para el aislamiento de ácidos nucleicos con ayuda
de tubos de centrifugación (EP 738733) ó dispositivos múltiples en
un formato de cinta (EP 616638). El material de unión para ácidos
nucleicos debe tener la propiedad de que el líquido de muestra
puede pasar a través del material sin ninguna acción adicional de
fuerza o por aplicación de una fuerza, p. ej., aplicando presión o
depresión. Sin embargo, dado que los ácidos nucleicos no están
unidos en el presente método por filtración de los ácidos nucleicos
a partir de la muestra, pero si mediante un método el cual utiliza
la afinidad de los ácidos nucleicos a las superficies, es posible
emplear un material poroso relativamente basto. Esto facilita el
flujo incluso de muestras líquidas relativamente viscosas.
El material para la unión de ácidos nucleicos,
permeable por los líquidos, es capaz de unir a los ácidos nucleicos
pero deja pasar el líquido que los envuelve y otros componentes
disueltos en el mismo tales como proteínas, etc. En una primera
variante los ácidos nucleicos pueden estar específicamente unidos
por una secuencia mediante sondas de captura fijadas a la
superficie del material. Las sondas de captura tienen una secuencia
de bases que puede unirse a una secuencia de bases complementaria
en los ácidos nucleicos para ser aislados en condiciones de
hibridación. El empleo de materiales con secuencias específicas
permite el aislamiento selectivo de los ácidos nucleicos de una
secuencia particular. Un método para la unión de ácidos nucleicos a
ácidos nucleicos peptídicos sobre la superficie de sólidos se
describe por ejemplo en la patente WO 95/14708.
El óxido de zirconio, óxido de hafnio u óxido de
aluminio (patente EP 897978) y también el óxido de titanio son por
ejemplo adecuados como material para la unión con ácidos nucleicos.
Las superficies hidratadas de estos materiales tienen suficiente
cargas positivas para unirse con los ácidos nucleicos cargados
negativamente. La superficie de los óxidos puede ser hidratada en
soluciones básicas. Los ácidos nucleicos pueden entonces ser
eluídos subsiguientemente mediante lavado con alcoholes de bajo peso
molecular u otras soluciones de lavado que tengan un pH bajo.
En una versión preferida, el material para la
unión de ácidos nucleicos, permeable a los líquidos, tiene una
superficie que contiene vidrio. La propiedad del vidrio de unir a
los ácidos nucleicos en forma de partículas y fibras, es conocida
desde hace mucho tiempo. Los reactivos caotrópicos tales como el
tiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, NaI, KI,
tiocianato de sodio o combinaciones de estas substancias, son
necesarios para la unión reversible a las superficies de vidrio
(patente US 5.234.809). La patente
DE-A-19512369 describe el empleo de
lana de vidrio para aislar ácidos nucleicos. En la patente
EP-B-0389 063 se propone un método
en el cual la muestra se mezcla con una mezcla de sal caotrópica de
guanidinio y partículas de sílice. Bajo estas condiciones los
ácidos nucleicos se unen independientemente de las secuencias, a la
superficie de sílice. Los otros componentes de la muestra pueden
eliminarse por lavado y los ácidos nucleicos pueden ser
subsiguientemente eluídos en un tampón acuoso.
Los ácidos nucleicos dentro del sentido de la
invención deben comprenderse como ácidos nucleicos de cualquier
origen, p. ej., ácidos nucleicos de viroides, víricos, bacterianos o
de origen celular. Si los ácidos nucleicos no son fácilmente
accesibles en la muestra, se convierten de preferencia en accesibles
mediante reactivos apropiados. Esto incluye el cambio de pH
(alcalino), calor, cambios extremos de temperatura repetidos
(congelación/descongelación), cambio de las condiciones
fisiológicas de crecimiento (presión osmótica), acción de
detergentes, sales o enzimas caotrópicas (p. ej., proteasas y
lipasas). Materiales de muestra a partir de los cuales los ácidos
nucleicos pueden liberarse de esta manera, son en particular medios
que contienen células, frotis celulares y secciones de tejidos. Los
ácidos nucleicos pueden ser ARN como también ADN.
El dispositivo de acuerdo con la invención
consta de dos cuerpos huecos 100/200 los cuales están conectados
mediante una conexión funcional 3 y cada uno de los cuales tiene una
abertura de entrada 101/201 y un abertura de salida 102/202 para
una muestra. Este dispositivo de acuerdo con la invención tiene de
preferencia una forma que se acopla por lo menos parcialmente
dentro de un recipiente 400. En este contexto, "funcionalmente
conectado" significa que los dos cuerpos huecos están conectados
de tal manera que es posible efectuar el método de acuerdo con la
presente invención. Para esta finalidad debe ser posible separar la
conexión cuando es necesario, debe ser impermeable a los líquidos y
para ciertas aplicaciones, debe impedir también el intercambio de
aire con el medio ambiente. Además, debe asegurar un paso de la
muestra desde el primer cuerpo hueco dentro del segundo cuerpo
hueco sin pérdida alguna. Estos cuerpos huecos son de preferencia
esencialmente cilíndricos. Las aberturas son de preferencia
esencialmente redondas. Además de la parte cilíndrica de la abertura
de entrada, el primer cuerpo hueco tiene particularmente de
preferencia una sección que se estrecha cónicamente hacia la
abertura de salida. El primer cuerpo hueco tiene de preferencia un
volumen mayor de 5 ml. Una vez la muestra 5 ha pasado a través de
la abertura de salida 102 del cuerpo hueco 100, entra en el segundo
cuerpo hueco 200 sin ninguna pérdida a través de la abertura de
entrada 201, de preferencia redonda, mediante la conexión funcional
3.
El material para la unión de ácidos nucleicos,
permeable a los líquidos 203, está situada en el segundo cuerpo
vacío. El material para la unión con ácidos nucleicos está dispuesto
en la abertura de salida, de preferencia redonda 202, del cuerpo
hueco de tal manera que el líquido de muestra de partida 5 tiene que
pasar a través del material para la unión con ácidos nucleicos. En
este proceso, los ácidos nucleicos se unen al material para la
unión con ácidos nucleicos.
El segundo cuerpo hueco puede ser similar al
primer cuerpo hueco en lo que se refiere al diseño así como también
al material. En particular, los cuerpos huecos deben ser capaces de
recibir por lo menos el volumen del líquido de muestra 5. El
segundo cuerpo vacío tiene de preferencia un volumen más pequeño
comparado con el primer cuerpo hueco. Este cuerpo hueco está de
preferencia formado de manera que por lo menos ajusta en un
recipiente de recepción 900. Además, el segundo cuerpo hueco consta
de un material y tiene un tamaño de manera que es adecuado para la
centrifugación a altas velocidades de hasta 14.000 revoluciones por
minuto.
Los dos cuerpos huecos tienen medios que les
permiten estar funcional y reversiblemente conectados entre sí. La
conexión funcional 3 del primero y segundo cuerpo hueco es de
preferencia una conexión en forma de rosca es decir, por ejemplo,
una rosca de tornillo exterior o interior. Si el primer cuerpo hueco
tiene por ejemplo una rosca, el medio del segundo cuerpo hueco es
una contra rosca adaptada. En otra versión preferida de la presente
invención el primer y segundo cuerpo hueco están conectados entre sí
mediante fuerzas de presión p. ej., mediante una conexión de
clavija.
Los dos cuerpos vacíos de preferencia unidos,
tienen un volumen que les permite recibir la muestra entera y otros
reactivos p. ej., para facilitar la unión de los ácidos nucleicos al
material para la unión con ácidos nucleicos. El volumen es mayor de
500 microlitros, de preferencia entre 1 y 1000 ml, en particular de
preferencia entre 1 y 100 ml y con mayor preferencia, entre 5 y 50
ml ó 10 y 30 ml. Un volumen de 10, 20, ó 30 ml es particularmente
preferido. El primer cuerpo vacío tiene un volumen preferido entre 1
y 100 ml; con particular preferencia, entre 5 y 50 ml, con la mayor
preferencia, entre 10 y 30 ml. El segundo cuerpo hueco tiene de
preferencia un volumen por debajo de 2 ml, con particular
preferencia entre 1 y 2 ml.
Una variante preferida del dispositivo de
acuerdo con la presente invención es un dispositivo caracterizado
porque los dos cuerpos huecos tienen juntamente un volumen entre 5 y
50 ml.
Además, el primer cuerpo vacío tiene de
preferencia medios cerca de su abertura en la entrada 101 como
soporte 103 del cuerpo hueco, en un recipiente 400 de manera que su
posición está fija. Este recipiente tiene una abertura en la
entrada 401 la cual es de preferencia redonda. El recipiente tiene
de preferencia una parte cilíndrica en la abertura de entrada 401 y
una región cónica en su extremo final. El recipiente se emplea para
recibir el líquido 8 el cual abandona el segundo cuerpo hueco 200
después de haber pasado a través del material para la unión con
ácidos nucleicos 203. El recipiente puede estar de preferencia,
cerrado.
El recipiente 400 tiene de preferencia una forma
y esta provisto con unos medios de cierre 6 tales que puede recibir
completamente los dos cuerpos 100/200 funcionalmente conectados, y
el recipiente 400 puede cerrarse con un elemento de cierre 7. El
elemento de cierre es de preferencia una tapa roscada hecha de
plástico. Se prefiere una brida circular 103 como medio para
sostener el primer cuerpo hueco en el recipiente 400 el cual
penetra más allá del borde del recipiente de manera que el cuerpo
hueco permanece sobre el mismo y no puede penetrar más dentro del
recipiente. Esta brida circular tiene de preferencia una forma tal
que está sujeta con una abrazadera al recipiente mediante el
elemento de cierre 7 y así actúa como un sellado. En este caso, el
elemento de cierre es de preferencia un tapón de rosca que está
colocado desde arriba y el recipiente tiene entonces la
correspondiente contrarrosca.
Alternativamente, el recipiente puede tener una
sección que se estrecha cónicamente en su abertura de entrada 401
de tal forma que el primer cuerpo hueco no puede penetrar más dentro
del recipiente en una posición definida, incluso sin medios
adicionales para sostenerlo. En este caso, el recipiente puede estar
también cerrado con un elemento de cierre. También es posible que
los dos cuerpos huecos funcionalmente conectados ajusten sólo
parcialmente dentro de los recipientes en cuyo caso por lo menos la
abertura de salida del segundo cuerpo hueco debe extenderse
completamente dentro del recipiente.
En otra versión preferida del dispositivo de
acuerdo con la invención, la cual se muestra en la figura 2, el
recipiente 400 está provisto de medios para aplicar una diferencia
de presión. Esta diferencia de presión puede provocar o soportar el
paso de la muestra a través del material para la unión con ácidos
nucleicos. Para esta finalidad, el recipiente está provisto de una
pieza de conexión 16 para aplicar una sobrepresión o una depresión
y el elemento de cierre 7 está provisto de una conexión para
compensar las presiones 17. En esta variante del dispositivo es
necesario que el lugar que conecta los dos cuerpos huecos sea
también impermeable a los gases dado que de otra manera no puede
generarse una diferencia de presiones a través del material para la
unión con ácidos nucleicos.
El segundo cuerpo hueco 200 tiene de preferencia
una forma tal que por lo menos ajusta parcialmente en un recipiente
de recepción 900. Este recipiente de recepción tiene de preferencia
una abertura de entrada 901 esencialmente redonda. El recipiente de
recepción 900 puede de preferencia cerrarse y consta de una parte
cilíndrica en la abertura de entrada y una parte cónica en su
extremo final. El recipiente de recepción está de preferencia
especialmente diseñado de tal forma que el segundo cuerpo hueco 200
provisto de medios de sujeción 204 ajusta en el mismo, y que el
recipiente puede cerrarse con un elemento de cierre 10. Al igual que
el primer cuerpo hueco 100, el segundo cuerpo hueco tiene también
de preferencia una brida circular como los medios de sujeción 204
la cual se extiende encima del borde del recipiente de recepción.
Cuando se emplea un tapón roscado 10 con una rosca 11 la brida
circular se aprieta contra el recipiente de recepción y actúa como
un sellado. También en este caso, el recipiente de recepción puede
tener también una forma cónica con el fin de sujetar el segundo
cuerpo hueco en una posición definida en la cual el cuerpo hueco
penetra completa o parcialmente en el recipiente receptor.
En otra variante de la presente invención el
recipiente de recepción está de preferencia provisto con unos
medios para aplicar una diferencia de presiones. Esta diferencia de
presiones puede provocar o soportar la eliminación de líquido
residual de la lana en rama y la elución de los ácidos nucleicos del
material. Para esta finalidad el recipiente de recepción está
provisto de una pieza de conexión para la aplicación de una
sobrepresión o de una depresión y el elemento de cierre está
provisto de una conexión para compensar las presiones.
El primer o segundo cuerpo hueco, el recipiente
o el recipiente de recepción del dispositivo de acuerdo con la
invención, están hechos de materiales que no se unen a los ácidos
nucleicos. El primer o segundo cuerpo hueco, el recipiente o
recipiente de recepción del dispositivo de acuerdo con la invención,
están hechos de preferencia de plástico, metal o un material
compuesto. Los plásticos tales como el polipropileno, poliestireno,
polietileno o Luran® son particularmente preferidos. Estos tienen la
ventaja de que pueden fabricarse fácilmente en un procedimiento de
inyección múltiple y tienen una alta estabilidad mecánica en las
condiciones del método de aislamiento de acuerdo con la
invención.
Los plásticos que pueden moldearse por inyección
son particularmente preferidos como materiales para el cuerpo hueco
debido a que permiten la introducción del material para la unión con
ácidos nucleicos, permeable a los líquidos, durante la fabricación
del segundo cuerpo hueco. Especialmente en el caso de la lana de
fibra de vidrio el material puede ser ya permanentemente vertido en
el elemento de cierre ya durante el proceso de moldeado por
inyección. Sin embargo, es también posible unirse solamente al
material después de la fabricación del segundo cuerpo hueco en el
proceso de moldeo por inyección, p. ej., mediante encolado,
soldadura o mediante fijación con un anillo de brida. En la patente
EP 0 738 733 se describen procesos para la fabricación de un cuerpo
hueco conteniendo el material para la unión con ácidos nucleicos.
Estas columnas de separación conteniendo material para la unión con
ácidos nucleicos están también comercialmente disponibles (columna
High Pure^{TM} de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).
La invención se refiere también a un recipiente,
que puede cerrarse, que contiene un dispositivo de acuerdo con la
invención. El recipiente, que puede cerrarse, tiene de preferencia
una forma tal que es capaz de recibir toda la conexión de la
invención de los dos cuerpos huecos y puede cerrarse mediante un
elemento de cierre. El recipiente, que puede cerrarse, es con
particular preferencia un recipiente comercial de centrifugación
tal como un tubo de plástico (tubo Falcón) el cual tiene un volumen
de llenado de 50 ml y puede cerrarse mediante una tapa roscada.
Otro aspecto de la presente invención es un
método para la purificación o aislamiento de ácidos nucleicos a
partir de una muestra, el cual método comprende los pasos:
- a)
- provisión del dispositivo de acuerdo con la invención,
- b)
- transferencia de la muestra dentro del dispositivo a través de la abertura de entrada en el primer cuerpo hueco,
- c)
- paso de la muestra desde el segundo cuerpo hueco, a través del material para la unión con ácidos nucleicos, a un recipiente durante el cual los ácidos nucleicos se unen al material para la unión con ácidos nucleicos,
- d)
- opcionalmente, lavado de los ácidos nucleicos unidos al material para la unión con ácidos nucleicos,
- e)
- separación del segundo cuerpo hueco del primer cuerpo hueco y transferencia del segundo cuerpo hueco en un recipiente de recepción 900,
- f)
- lavado de los ácidos nucleicos unidos al material para la unión con ácidos nucleicos,
- g)
- elución de los ácidos nucleicos unidos al material para la unión con ácidos nucleicos, en donde los ácidos nucleicos se recogen en un segundo recipiente de recepción 13 y así se purifican o aislan.
Una variante preferida del método de la presente
invención emplea un dispositivo de acuerdo con la invención con un
material para la unión con ácidos nucleicos, el cual está compuesto
principalmente de dióxido de silicio o contiene dióxido de silicio
en forma de partículas o fibras, o es con particular preferencia
lana de vidrio o silica gel o consta de zeolita, y una muestra a la
cual ya se han añadido reactivos caotrópicos a través de la
abertura de entrada del primer cuerpo hueco antes de transferir en
el dispositivo, de manera que la concentración de los reactivos
caotrópicos está entre 1 M y 8 M.
A continuación, se describe una versión
preferida del método de acuerdo con la invención, basada en el
dispositivo de acuerdo con la invención. En primer lugar, las
células de 5 a 30 ml de sangre entera, suero, plasma u otros
fluidos corporales, se lisan, se rompen, y se añaden al líquido de
muestra los reactivos que adicionalmente se necesitan, p. ej., una
sal caotrópica o/y proteasa. Además, el dispositivo de acuerdo con
la invención se coloca en un recipiente para la recogida de un
líquido exento de ácido nucleico (ver paso I y II en la figura 1).
Después de que la muestra 5 ha sido transferida al dispositivo a
través de la abertura de entrada del primer cuerpo hueco, el
recipiente se cierra de preferencia herméticamente, con una tapa
(paso III en la figura 1).
En el próximo paso el líquido de muestra se pasa
a través del material para la unión con ácidos nucleicos (paso IV
en la figura 1). La muestra puede pasarse a través del, o bien por
medio de la fuerza gravitatoria, o también de preferencia, por
centrifugación del dispositivo. La muestra puede también de
preferencia pasarse a través del material para la unión con ácidos
nucleicos mediante la aplicación de una diferencia de presiones. En
esta versión de la invención (ver figura 2) el dispositivo está
provisto adicionalmente con unos medios p. ej., dos piezas de
conexión 16/17 para la aplicación de la presión. Una pieza de
conexión para la aplicación de la sobrepresión o depresión se
coloca de preferencia sobre el propio recipiente y la segunda pieza
de conexión se coloca en el elemento de cierre del recipiente para
servir como conexión para la compensación de presiones.
Durante el paso del líquido de muestra a través
del material para la unión con ácidos nucleicos, los ácidos
nucleicos presentes en la muestra se unen al material para la unión
con ácidos nucleicos, mientras otros componentes de la muestra
juntamente con el líquido 8 pasan al interior del recipiente. Los
ácidos nucleicos aislados se encuentran ahora en el material para
la unión con ácidos nucleicos del segundo cuerpo hueco, los cuales
si se desea, pueden separarse del primer cuerpo hueco y además
procesarse de la manera que se desee.
Puesto que ciertas cantidades de líquidos que
contienen contaminantes se adhieren todavía normalmente al material
permeable a los líquidos incluso después de la centrifugación, es
posible eliminar substancias que todavía están adheridas, mediante
un paso opcional de lavado con el fin de aislar los ácidos nucleicos
particularmente puros antes de que el dispositivo sea eliminado del
recipiente y la conexión funcional de los cuerpos huecos sea
separada. Para esta finalidad el fluido de lavado puede por ejemplo
añadirse a través de la abertura de entrada del primer cuerpo hueco
de forma que lave el material al cual los ácidos nucleicos están
unidos, mientras pasa a través y a continuación es recogido en el
recipiente. El paso de lavado puede efectuarse de preferencia
aplicando una diferencia de presiones o por centrifugación del
dispositivo.
Con el fin de separar de nuevo los ácidos
nucleicos del material para la unión con ácidos nucleicos, permeable
a los líquidos, el segundo cuerpo hueco puede eliminarse del
dispositivo (paso V en la figura 1). Para esta finalidad el segundo
cuerpo hueco se conecta de preferencia a un recipiente de recepción
900 después de haberse separado del primer cuerpo hueco con el fin
de eliminar en primer lugar el líquido residual 12 presente en la
lana en rama (paso VI en la figura 1). Este lavado se efectúa de
preferencia por centrifugación del dispositivo dado que el segundo
cuerpo hueco conectado al recipiente de recepción puede ser sometido
a fuerzas centrífugas muy altas debido a sus pequeñas dimensiones.
A continuación, el segundo cuerpo hueco se conecta a un segundo
recipiente de recepción 13 el cual debe recoger el eluato (paso VII
en la figura 1). El líquido de elución 14 tiene una composición tal
que suprime la unión de los ácidos nucleicos al material para la
unión con ácidos nucleicos. Las condiciones bajo las cuales los
ácidos nucleicos pueden separarse de nuevo, dependen del material
empleado y el procedimiento puede de nuevo efectuarse aplicando una
diferencia de presiones o por centrifugación (paso VIII en la
figura 1).
La elución se efectúa de preferencia por
centrifugación puesto que permite que los ácidos nucleicos se
disuelvan en muy pequeños volúmenes de líquido de elución y también
permite reducir la cantidad de ácidos nucleicos que quedan en el
material para la unión con ácidos nucleicos. La centrifugación para
la elución y lavado se efectúa de preferencia empleando fuerzas
centrífugas mayores que en la centrifugación para el paso de la
muestra y el lavado opcional. La centrifugación para la elución y
lavado se efectúa de preferencia a menos de 5000 g y la
centrifugación para el paso de la muestra y lavado opcional, se
efectúa de preferencia a menos de 5000 g. El segundo cuerpo hueco y
el recipiente de recepción tienen particularmente de preferencia una
forma tal que pueden centrifugarse juntamente p. ej., en una
centrífuga Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a más de
10.000 g. Esto es posible debido a que el recipiente de recepción
tiene un volumen considerablemente más pequeño que el del primer
recipiente el cual solamente está sometido a una fuerza centrífuga
considerablemente menor (p. ej., en una centrífuga de mesa Beckman
(Beckman Coulter, Inc., USA) a aproximadamente 3000 g) y requiere
así menos líquido de elución. Por lo tanto el dispositivo de acuerdo
con la invención no es solamente adecuado para el aislamiento de
ácidos nucleicos sinó también para la transferencia de ácidos
nucleicos desde un volumen mayor 5 a un volumen menor 15.
El volumen del dispositivo para la purificación
o aislamiento de ácidos nucleicos es una importante característica
de la presente invención. Por una parte, el volumen del dispositivo
debe ser grande con el fin de aplicar muestras diluidas,
voluminosas y por otra parte, el tamaño del dispositivo debe ser
pequeño con el fin de realizar un procedimiento de lisis con
pequeñas cantidades de tampón de lisis. La cantidad necesaria de
tampón de lisis para la eficiente elución del ácido nucleico es,
entre otras cosas, dependiente del tamaño del material para la
unión con ácidos nucleicos y de la fuerza de apoyo del procedimiento
de lisis. El acoplamiento reversible de un primer gran cuerpo hueco
con un pequeño segundo cuerpo hueco, que comprende el material para
la unión con ácidos nucleicos, soluciona los dos requisitos
mencionados. Primeramente el volumen total de ambos cuerpos huecos
proporciona la aplicabilidad de las voluminosas muestras diluidas,
durante el proceso de unión. En segundo lugar, después del proceso
de unión, el pequeño segundo cuerpo hueco puede eliminarse del
dispositivo y el ácido nucleico puede ser eluído con una fuerza de
centrifugación mucho mayor que la que es posible aplicar con el
dispositivo del estado actual de la técnica, con el mismo volumen de
muestra inicial.
Otro aspecto de la invención es un kit para la
purificación o aislamiento de ácidos nucleicos el cual está
compuesto de un dispositivo de acuerdo con la invención o un
recipiente de acuerdo con la invención, y reactivos caotrópicos
para la unión de los ácidos nucleicos al material para la unión con
ácidos nucleicos. El kit puede adicionalmente contener otras partes
de plástico que se necesitan para efectuar el método de acuerdo con
la invención tales como placas de microtitulación o simples
recipientes de reacción tales como los recipientes de reacción
Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Además, el kit puede
contener otros reactivos que son necesarios para el método de
acuerdo con la invención, p. ej., tampón de lisis conteniendo
reactivos caotrópicos, detergente, alcohol o mezclas de estas
substancias que lisan células, tampón de lavado que contiene
reactivos caotrópicos y/o alcohol o tampón con pH ácido para lavar
el material para la unión con ácidos nucleicos al cual los ácidos
nucleicos están unidos, o tampón de elución el cual permite que los
ácidos nucleicos sean separados del material para la unión con
ácidos nucleicos. De acuerdo con la invención estos componentes del
kit pueden proporcionarse individualmente o en recipientes de
almacenamiento. Los reactivos se ofrecen normalmente
listos-para-usar pero también pueden
venderse en forma de soluciones en stock que tienen que diluirse
antes de ser empleadas.
La invención se refiere también al empleo de un
dispositivo de acuerdo con la invención o a un recipiente de
acuerdo con la invención para purificar o aislar los ácidos
nucleicos de una muestra.
Específicamente, la invención abarca los
siguientes aspectos:
1. Dispositivo para la purificación o
aislamiento de ácidos nucleicos, el cual consiste en un primer
cuerpo hueco 100 con una abertura de entrada 101 para una muestra y
una abertura de salida 102 y un segundo cuerpo hueco 200 con una
abertura de entrada 201 y una abertura de salida 202 en donde la
abertura de entrada del segundo cuerpo hueco 201 está
funcionalmente conectada a la abertura de salida del primer cuerpo
hueco 102, pudiendo el primero y segundo cuerpos huecos separarse
uno de otro, y un material para la unión con ácidos nucleicos 203
está situado frente a la abertura de salida del segundo cuerpo hueco
202.
2. Dispositivo de acuerdo con el item 1, en
donde el segundo cuerpo hueco tiene un volumen más pequeño comparado
con el primer cuerpo hueco.
3. Dispositivo de acuerdo con uno de los items 1
ó 2, en donde el dispositivo tiene una forma tal que ajusta por lo
menos parcialmente con un recipiente 400.
4. Dispositivo de acuerdo con uno de los items 1
a 3, en donde el segundo cuerpo hueco tiene una forma tal que
ajusta por lo menos parcialmente con un recipiente receptor 900.
5. Dispositivo de acuerdo con uno de los items 1
a 4, en donde el primero y segundo cuerpos huecos están conectados
entre sí mediante una junta roscada.
6. Dispositivo de acuerdo con uno de los items 1
a 4, en donde el primero y segundo cuerpos huecos están conectados
entre sí mediante fuerzas de presión.
7. Dispositivo de acuerdo con uno de los items 1
a 6, en donde el primero y/o segundo cuerpo hueco son esencialmente
cilíndricos.
8. Dispositivo de acuerdo con el item 7, en
donde el primer cuerpo hueco además de su sección cilíndrica de la
abertura de entrada, tiene una sección que se vuelve cónicamente más
estrecha hacia su abertura de salida.
9. Dispositivo de acuerdo con uno de los items 1
a 8, en donde las aberturas del primero y/o segundo cuerpos huecos
son esencialmente redondas.
10. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
1 a 9, caracterizado porque el primer cuerpo hueco tiene un volumen
de mas de 5 ml.
11. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
3 a 10, en donde el recipiente puede cerrarse.
12. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
3 a 11, en donde el recipiente consta de una sección cilíndrica en
la abertura de entrada y de una sección cónica en su extremo.
13. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
3 a 12, en donde el recipiente tiene unos medios para la aplicación
de una diferencia de presión.
14. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
4 a 13, en donde el recipiente de recepción puede cerrarse.
15. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
4 a 14, en donde el recipiente de recepción puede cerrarse, y
consta de una sección cilíndrica en la abertura de entrada 401 y una
sección cónica en su extremo final.
16. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
4 a 15, en donde el recipiente de recepción tiene unos medios para
la aplicación de una diferencia de presión.
17. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
4 a 16, en donde las aberturas de entrada del recipiente 401 y/o
del recipiente de recepción 901 son esencialmente redondas.
18. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
1 a 17, caracterizado porque el material para la unión con ácidos
nucleicos está compuesto principalmente de dióxido de silicio o
contiene dióxido de silicio en forma de fibras o partículas.
19. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
1 a 17, caracterizado porque el material para la unión con ácidos
nucleicos es lana de vidrio o silica gel o está compuesto de
zeolita.
20. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
1 a 19, caracterizado porque el material para la unión con ácidos
nucleicos está compuesto de óxidos metálicos u óxidos metálicos
mezclados o contiene óxidos metálicos u óxidos metálicos mezclados
en forma de fibras o partículas.
21. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
1 a 20, caracterizado porque el material para la unión con ácidos
nucleicos está compuesto de óxido de aluminio, óxido de hafnio u
óxido de zirconio, u óxido de aluminio, óxido de hafnio u óxido de
zirconio en forma de fibras o partículas.
22. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
1 a 21, caracterizado porque el primero o el segundo cuerpo hueco,
el recipiente o el recipiente de recepción están hechos de un
material que no se une a los ácido nucleicos.
23. Dispositivo de acuerdo con uno de los items
1 a 22, caracterizado porque el primero o el segundo cuerpo hueco,
el recipiente o el recipiente de recepción están compuestos de
plástico, metal o un material compuesto.
\newpage
24. Dispositivo de acuerdo con el item 23,
caracterizado porque el segundo cuerpo hueco está hecho de
polipropileno.
25. Recipiente 400, que puede cerrarse, el cual
contiene un dispositivo de acuerdo con uno de los items 1 a 24.
26. Método para la purificación o aislamiento de
ácidos nucleicos a partir de una muestra, mediante
- a)
- provisión del dispositivo de acuerdo con uno de los items 1 a 25,
- b)
- transferencia de la muestra dentro del dispositivo a través de la abertura de entrada en el primer cuerpo hueco,
- c)
- paso de la muestra del segundo cuerpo hueco a través del material de unión con ácidos nucleicos dentro de un recipiente durante lo cual los ácidos nucleicos se unen al material de unión con los ácidos nucleicos,
- d)
- opcionalmente, lavando los ácidos nucleicos unidos al material de unión con los ácidos nucleicos,
- e)
- separando el segundo cuerpo hueco del primer cuerpo hueco y transfiriendo el segundo cuerpo hueco dentro de un recipiente de recepción 900,
- f)
- lavado de los ácido nucleicos unidos al material de unión con los ácidos nucleicos,
- g)
- elución de los ácidos nucleicos unidos al material de unión con los ácidos nucleicos, recogiendo los ácidos nucleicos en un segundo recipiente de recepción 13 y así son purificados o aislados.
27. Método de acuerdo con el item 26,
caracterizado porque se emplea un dispositivo como se reivindica en
uno de los items 18 ó 19, y porque se añaden reactivos caotrópicos
adicionalmente a la muestra a través de la abertura de entrada en el
primer cuerpo hueco antes de la transferencia dentro del
dispositivo, de manera que la concentración de los reactivos
caotrópicos está entre 1 M y 8 M.
28. Método de acuerdo con el item 26,
caracterizado porque el paso de la muestra en el paso d), el lavado
opcional en el paso e), el lavado en el paso g) ó la elución en el
paso h), se efectúan aplicando una diferencia de presión.
29. Método de acuerdo con el item 26,
caracterizado porque el paso de la muestra en el paso d), el lavado
opcional en el paso e), el lavado en el paso g) ó la elución en el
paso h), se efectúan mediante centrifugación.
30. Método de acuerdo con el item 29,
caracterizado porque la centrifugación en los pasos g) y h) se
efectúa con una fuerza centrífuga mayor, comparada con los pasos de
centrifugación d) y e).
31. Método de acuerdo con el item 29,
caracterizado porque la centrifugación en los pasos d) y e) se
efectúa con una fuerza centrífuga menor de 5000 g.
32. Método de acuerdo con el item 29,
caracterizado porque la centrifugación en los pasos g) y h) se
efectúa con una fuerza centrífuga mayor de 5000 g.
33. Kit para la purificación o aislamiento de
ácidos nucleicos a partir de una muestra, compuesto de
a) un dispositivo de acuerdo con uno de los
items 1 a 24 ó un recipiente de acuerdo con el item 25,
b) reactivos caotrópicos para la unión de ácidos
nucleicos al material para la unión con ácidos nucleicos.
34. Empleo de un dispositivo de acuerdo con uno
de los items 1 a 24 ó un recipiente de acuerdo con el item 25 para
purificar o aislar ácidos nucleicos a partir de una muestra.
La invención se aclara mediante los siguientes
ejemplos, publicaciones y figuras, la finalidad protectora de los
cuales deriva de las reivindicaciones de la patente. Los métodos
descritos deben entenderse como ejemplos que todavía describen la
invención incluso después de modificaciones.
Ejemplo
1
El ejemplo siguiente de aislamiento de ADN a
partir de 5 ml de suero se pretende que aclare más la presente
invención. El método llamado "UpScale HighPure" ("alto grado
de pureza") utiliza el kit llamado "UpScale HighPure", el
cual se compone de una columna "HighPure^{TM} Column"
comercialmente disponible (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania), un accesorio de volumen con tapa, y unos reactivos
idénticos a los reactivos del kit "MagNA Pure® LC Total Nucleic
Acids Isolation - Large Volume" (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania). El accesorio de volumen (hecho de
polipropileno) tiene una forma cilíndrica en este ejemplo (diámetro
interior 2,5 cm, longitud 5 cm) con un volumen de llenado de
aproximadamente 25 ml, una abertura de entrada redonda y una
abertura de salida en la cual puede fijarse una columna HighPure
(volumen aproximadamente 1,5 ml). Una centrífuga Eppendorf
(Eppendorf, Hamburg, Alemania), una centrífuga Beckman (Beckman
Coulter, Inc., USA) con tubos Falcon de 50 ml, un agitador
comercial vortex y recipientes Eppendorf de reacción (Eppendorf,
Hamburg, Alemania) se emplean también para el aislamiento del ADN
mediante el método "UpScale HighPure".
250 \mul de un solución 40 mg/ml de proteinasa
K, se colocan en un tubo Falcon de 50 ml. Se añaden 5 ml de muestra
(suero o plasma), se agitan en el vortex y a continuación se incuban
durante 10 minutos a temperatura ambiente. En el paso siguiente, se
añaden 6,25 ml de tampón de lisis/unión, se agitan en el vortex y la
solución se incuba durante 10 minutos a 65ºC. A esto sigue una
centrifugación a 1900 g (eliminación de la espuma). En el paso
siguiente, se añaden 3,125 ml de isopropanol, se mezclan y
centrifugan durante 1 minuto a 1900 g, a continuación la mezcla se
deja en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente. En el paso
siguiente la mezcla se aplica a una parte (aproximadamente 15 ml)
del accesorio de volumen del dispositivo, el líquido residual que
queda se aplica también a la columna con una pipeta. Se centrífuga
primeramente durante 2 minutos a 1900 g (incluyendo la aceleración)
y a continuación, durante 1 minuto a 3300 g. En el paso siguiente,
el eluato se desecha.
A esto siguen varios pasos de lavado (los
tampones de lavado empleados pueden adquirirse comercialmente en
"MagNA Pure® LC Total Nucleic Acid Isolation Kit - Large
Volume", artículo del catálogo nº 3264793, Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Alemania): Primeramente se coloca el dispositivo en
un nuevo tubo Falcon de 50 ml, se añaden 2 ml de tampón de lavado 1
y se centrífuga durante 2 minutos a 3300 g. A continuación se añaden
2 ml de tampón de lavado 2 y se centrífuga durante 2 minutos a 3300
g. En el próximo paso de lavado se añaden 2 ml de tampón de lavado
3, y se centrífuga durante 2 minutos a 3300 g (los 3 pasos de lavado
pueden efectuarse sin cambiar el tubo Falcon). El accesorio de
volumen se retira ahora de la columna High Pure y la columna High
Pure se coloca en una copa Eppendorf, se cierra con una tapa y se
centrífuga en una centrífuga Eppendorf durante 1 minuto a
20.000 g. Esto elimina el líquido residual de la lana en rama.
20.000 g. Esto elimina el líquido residual de la lana en rama.
El próximo paso comprende la elución del ADN. Se
aplican 50 - 100 \mul de tampón de elución a la lana en rama y la
columna High Pure se cierra con una tapa. A continuación, se incuba
durante 3 minutos a temperatura ambiente y seguidamente se
centrifuga durante 1 minuto a 20.000 g en la centrífuga Eppendorf.
El recipiente de reacción Eppendorf contiene el eluato y la columna
High Pure^{TM} puede desecharse.
Ejemplo
2
El ejemplo siguiente muestra la comparación
entre un aislamiento de ADN de acuerdo con el método de la invención
y un aislamiento de acuerdo con el estado actual de la técnica. Se
prepara una muestra de suero análogamente al ejemplo 1 y se divide
en dos partes iguales entre 2 columnas High Pure^{TM} con un
accesorio de volumen. El procedimiento experimental para ambas
columnas es idéntico hasta el paso de retirada del líquido residual.
En una de las columnas se separa el accesorio de volumen de la
columna High Pure en el siguiente, el líquido residual de la lana
en rama se elimina por centrifugación con ayuda de una centrífuga
Eppendorf (aproximadamente 15 \mul) y el ácido nucleico unido se
eluye a continuación en 50 \mul con ayuda de una centrífuga
Eppendorf.
Por el contrario, en la segunda columna de
conexión entre la columna High Pure y el accesorio de volumen, es
retenido, todo el dispositivo se inserta en un tubo Falcon y la
elución se efectúa con 50 \mul de solución en una centrífuga
Beckman (2 minutos a 3300 g), sin que se elimine previamente el
líquido residual de la lana en rama.
Los resultados muestran que como promedio, el
rendimiento en ADN fue aproximadamente un 30% inferior sobre 10
experimentos, sin la separación del dispositivo y sin la centrífuga
Eppendorf.
Ejemplo
3
El siguiente ejemplo muestra otra comparación
del aislamiento del ADN de acuerdo con el método de la invención y
un aislamiento de acuerdo con el estado actual de la técnica. Se
prepara una muestra de suero análogamente al ejemplo 1 y se divide
en dos partes iguales entre una columna High Pure^{TM} con un
accesorio de volumen, y una columna "NucleoSpin® Funnel" de
Macherey & Nagel, Düren, Alemania (artículo del catálogo nº
740959). El procedimiento experimental para ambas columnas es
idéntico hasta el paso de retirada del líquido residual. En el caso
de la columna High Pure^{TM} se separa el accesorio de volumen de
la columna High Pure en el siguiente paso, el líquido residual de
la lana en rama se elimina por centrifugación con ayuda de una
centrífuga Eppendorf (aproximadamente 15 \mul) y el ácido
nucleico unido se eluye a continuación en 60 \mul con ayuda de la
centrífuga
Eppendorf.
Eppendorf.
Por el contrario, la columna de Macherey &
Ángel, se inserta en un tubo Falcon, y la elución se efectúa con 60
\mul de solución en una centrífuga Beckman (2 minutos a 3300 g),
sin que previamente se elimine el líquido residual de la lana en
rama.
\newpage
Los resultados muestran que como promedio, el
rendimiento en ADN empleando una columna High Pure^{TM} con
accesorio de volumen fue aproximadamente un factor de 3 a 4 mejor
sobre 5 diferentes pruebas de suero (3 determinaciones por prueba),
que en el caso de emplear una columna Macherey & Nagel.
Ejemplo
4
Las 5 muestras de suero empleadas en el ejemplo
3 se emplearon también para comparar el rendimiento del dispositivo
de la invención empleando dos kits comerciales de precipitación para
el aislamiento o purificación de ADN, el kit "RTP® DNA/RNA Virus
Supersense" de Invitek GmbH, Berlin, Alemania (artículo de
catálogo nº 10404002, lote OC030036) y el kit "QIAmp®
UltraSens^{TM}" de Qiagen GmbH, Hilden, Alemania (artículo de
catálogo nº 53704, lote 11862713). Ambos kits se emplearon de
acuerdo con los protocolos de los fabricantes (Invitek: Vers.
TH11/03.2 Marzo 2003; Qiagen: 01/2003), mientras que en el caso del
kit Qiagen el protocolo se adaptó desde 1 ml hasta 5 ml de
volumen.
En comparación con la columna High Pure^{TM}
adaptada para volúmenes grandes, el kit Qiagen aisló una cantidad
promedio de ADN que se redujo por un factor de aproximadamente 9,
mientras que el kit Invitek aisló una cantidad promedio de ADN que
se redujo incluso por un factor de aproximadamente 80.
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Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987,
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Claims (33)
1. Dispositivo para la purificación o
aislamiento de ácidos nucleicos, el cual consiste en un primer
cuerpo hueco (100) con una abertura de entrada (101) para una
muestra y una abertura de salida (102) y un segundo cuerpo hueco
(200) con una abertura de entrada (201) y una abertura de salida
(202) en donde la abertura de entrada del segundo cuerpo hueco
(201) está funcionalmente conectado a la abertura de salida del
primer cuerpo hueco (102), pudiendo el primero y segundo cuerpo
hueco separarse uno de otro, y un material para la unión con ácidos
nucleicos (203) está situado frente a la abertura de salida del
segundo cuerpo hueco (202), el segundo cuerpo hueco (200) tiene un
volumen menor comparado con el primer cuerpo hueco (100), y el
primer cuerpo hueco (100) tiene un volumen mayor de 5 ml.
2. Dispositivo como se ha reivindicado en la
reivindicación 1, en donde el dispositivo tiene una forma tal que
ajusta por lo menos parcialmente dentro de un recipiente (400).
3. Dispositivo de acuerdo con uno de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde el segundo cuerpo hueco tiene una
forma tal que ajusta por lo menos parcialmente dentro de un
recipiente receptor (900).
4. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el primero y segundo cuerpo hueco
están conectados entre sí mediante una junta roscada.
5. Dispositivo como se ha reivindicado en una de
las reivindicaciones 1 a 3, en donde el primero y segundo cuerpo
hueco están conectados entre sí mediante fuerzas de presión.
6. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el primero y segundo cuerpo hueco
son esencialmente cilíndricos.
7. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación
6, en donde el primer cuerpo hueco además de su sección cilíndrica
en la abertura de entrada, tiene una sección que se vuelve
cónicamente más estrecha hacia su abertura de salida.
8. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde las aberturas del primero y/o
segundo cuerpo hueco son esencialmente redondas.
9. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 8, en donde el recipiente (400) puede
cerrarse.
10. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 9, en donde el recipiente (400) consta de una
sección cilíndrica en la abertura de entrada y de una sección cónica
en su extremo final.
11. Dispositivo de acuerdo con uno de las
reivindicaciones 2 a 10, en donde el recipiente (400) tiene unos
medios para la aplicación de una diferencia de presiones.
12. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 3 a 11, en donde el recipiente de recepción (900)
puede cerrarse.
13. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 3 a 12, en donde el recipiente de recepción (900)
puede cerrarse, y consta de una sección cilíndrica en la abertura de
entrada (401) y de una sección cónica en su extremo final.
14. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 3 a 13, en donde el recipiente de recepción (900)
tiene unos medios para la aplicación de una diferencia de
presión.
15. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 3 a 14, en donde las aberturas de entrada del
recipiente (401) y/o del recipiente de recepción (901) son
esencialmente redondas.
16. Dispositivo como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el
material para la unión con ácidos nucleicos está compuesto
principalmente de dióxido de silicio o contiene dióxido de silicio
en forma de fibras o partículas.
17. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el material
para la unión con ácidos nucleicos es lana de vidrio o silica gel o
está compuesto de zeolita.
18. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el material
para la unión con ácidos nucleicos está compuesto de óxidos
metálicos u óxidos metálicos mezclados o contiene óxidos metálicos
u óxidos metálicos mezclados en forma de fibras o partículas.
19. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el material
para la unión con ácidos nucleicos está compuesto de óxido de
aluminio, óxido de hafnio u óxido de zirconio, u óxido de aluminio,
óxido de hafnio u óxido de zirconio en forma de fibras o
partículas.
\newpage
20. Dispositivo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el primero o el
segundo cuerpo hueco, el recipiente o el recipiente de recepción
están hechos de un material que no se une a los ácidos
nucleicos.
21. Dispositivo de acuerdo con uno de las
reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el primero o el
segundo cuerpo hueco, el recipiente o el recipiente de recepción
está compuesto de plástico, metal o un material compuesto.
22. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación
21, caracterizado porque el segundo cuerpo hueco está hecho
de polipropileno.
23. Dispositivo como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque los dos
cuerpos huecos juntos tienen un volumen entre 5 y 50 ml.
24. Recipiente (400), que puede cerrarse, el
cual contiene un dispositivo como se ha reivindicado en una de las
reivindicaciones 1 a 23.
25. Método para la purificación o aislamiento de
ácidos nucleicos a partir de una muestra, mediante
a) provisión de un dispositivo de acuerdo como
se ha reivindicado en una de las reivindicaciones 1 a 24,
b) transferencia de la muestra dentro del
dispositivo a través de la abertura de entrada en el primer cuerpo
hueco,
c) paso de la muestra desde el segundo cuerpo
hueco a través del material de unión con ácidos nucleicos dentro de
un recipiente durante lo cual los ácidos nucleicos se unen al
material de unión con los ácidos nucleicos,
d) opcionalmente, lavado de los ácidos nucleicos
unidos al material de unión con los ácidos nucleicos,
e) separación del segundo cuerpo hueco del
primer cuerpo hueco y transferencia del segundo cuerpo hueco dentro
de un recipiente de recepción (900),
f) lavado de los ácidos nucleicos unidos al
material de unión con los ácidos nucleicos,
g) elución de los ácidos nucleicos unidos al
material de unión con los ácidos nucleicos, recogiendo los ácidos
nucleicos en un segundo recipiente de recepción (13) y así son
purificados o aislados.
26. Método como se ha reivindicado en la
reivindicación 25, caracterizado porque se emplea un
dispositivo como se ha reivindicado en la reivindicación 16 ó 17, y
porque antes de la transferencia dentro del dispositivo, se añaden
reactivos caotrópicos adicionalmente a la muestra a través de la
abertura de entrada en el primer cuerpo hueco de tal manera, que la
concentración de los reactivos caotrópicos está entre 1 M y 8 M.
27. Método de acuerdo con la reivindicación 25,
caracterizado porque el paso de la muestra en el paso d), el
lavado opcional en el paso e), el lavado en el paso g) ó la elución
en el paso h), se efectúan aplicando una diferencia de
presiones.
28. Método como se ha reivindicado en la
reivindicación 25, caracterizado porque el paso de la muestra
en el paso d), el lavado opcional en el paso e), el lavado en el
paso g) ó la elución en el paso h), se efectúan mediante
centrifugación.
29. Método de acuerdo con la reivindicación 28,
caracterizado porque la centrifugación en los pasos g) y h)
se efectúa con una fuerza centrífuga mayor, comparada con la
centrifugación en los pasos d) y e).
30. Método de acuerdo con la reivindicación 28,
caracterizado porque la centrifugación en los pasos d) y e)
se efectúa con una fuerza centrífuga menor de 5000 g.
31. Método de acuerdo con la reivindicación 28,
caracterizado porque la centrifugación en los pasos g) y h)
se efectúa con una fuerza centrífuga mayor de 5000 g.
32. Kit para la purificación y aislamiento de
ácidos nucleicos a partir de una muestra, compuesto de
a) un dispositivo como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 1 a 23, ó un recipiente (400) como se ha
reivindicado en la reivindicación 24,
b) reactivos caotrópicos para la unión de ácidos
nucleicos al material para la unión con ácidos nucleicos.
33. Empleo de un dispositivo como se ha
reivindicado en una de las reivindicaciones 1 a 23, ó de un
recipiente (400) como se ha reivindicado en la reivindicación 24
para purificar o aislar ácidos nucleicos a partir de una
muestra.
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