JP4331403B2 - Tshレセプター自己抗体についてのアッセイ - Google Patents
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Description
本発明は、TSHレセプター自己抗体を検出またはモニターするためのアッセイ(キットおよび分析方法)に関する。
【0002】
グレーブズ病と関連する甲状腺機能亢進は、甲状腺刺激ホルモン(TSH)についての甲状腺レセプターに対する自己抗体に起因することが公知である。この自己抗体は、そのレセプターに結合し、そして天然のリガンド(TSH)の作用を模倣し、それにより、甲状腺に高レベルの甲状腺ホルモンを産生させる(Endocrine Reviews 1988、第9巻、No.1、106−117頁に記載される)。
【0003】
TSHレセプター自己抗体(TRAb)の検出またはモニターは、グレーブズ病の診断および管理において、重要であり、そして現在2つのタイプのアッセイが使用されている。すなわち、
(a)TRAbがTSHレセプターの調製物に対する125I標識TSHの結合を阻害する能力を測定する競合結合アッセイ;および
(b)TRAbが培養中の甲状腺細胞(またはTSHレセプター遺伝子をトランスフェクトした他の細胞)を刺激する能力を測定するバイオアッセイ。
【0004】
現在、競合結合アッセイ(上記のタイプ(a))がより広範に用いられている。なぜなら、上記(b)で言及した型のバイオアッセイは、高価で、時間がかかり、非常に熟練したスタッフを必要とし、そして広範な慣用用途には適切ではないからである。現在の競合結合アッセイでは、一般的には試験血清サンプル(50μl)が、界面活性剤で可溶化したブタTSHレセプター(50μl)とともにインキュベートされる。試験血清に存在するTRAbは、このインキュベーション中にそのTSHレセプターと結合する。次いで、125I標識TSHを添加し、そしてそのインキュベーションを継続する。この第二のインキュベーションの間に、標識TSHは、まだTRAbに占有されていないTSHレセプターに結合する。最後に、TSHレセプターに結合した125I標識TSHは、遊離の標識TSHから、ポリエチレングリコール(PEG)の添加により分離される。PEGは、レセプターに結合したTSHを沈澱させるが、遊離のTSHは沈澱させない。次いで、沈澱物(遠心分離によって分離される)における放射能を計測する。このアッセイでは、試験サンプル中のTRAbがTSHレセプターに対する標識TSHの結合を阻害し、そしてこれが沈殿物における放射能を低下させる。アッセイ結果は、標識TSH結合の阻害指数として、または1セットのアッセイ標準物質の使用により表現され得る。
【0005】
この従来のアッセイの主な制限は以下のとおりである。
【0006】
(a)このアッセイは、標識TSHとTSHレセプターとの間の競合を測定し、そしてこのレセプターとよく結合するがTSH結合を強くは阻害しないような方法ではないTRAbを検出しないかもしれない。
【0007】
(b)このアッセイは、ポリエチレングリコールを使用して結合したレセプターと遊離の標識TSHとを分離する。これは、すべての血清イムノグロブリンの共沈および比較的大きなペレットの形成をもたらす。このペレットは、放射能について計測され得るが、酵素または化学発光物質のような非放射性物質で標識したTSH(または他のタンパク質もしくはペプチド)を検出するには適切な調製物ではない。これは、そのペレット中の血清成分が発光のようなプロセスに干渉するからである。さらに、PEG沈澱の使用は、遠心分離の使用を必要とし、
そしてこれは、自動化には不適切な、時間がかかり、かつ煩雑な手順であるからである。
【0008】
本発明は、上記に言及した競合結合型のTRAbについてのアッセイのための手順およびキットに関する。本発明はまた、直接結合型のTRAbアッセイのための手順およびキットに関する。このアッセイでは、レセプターとTRAbとの間の直接の相互作用が使用される。
【0009】
本発明に従って、体液サンプル中の甲状腺刺激ホルモン(TSH)レセプターに対する自己抗体をモニターする方法が提供される。この方法は、以下の順で、以下の工程:
(a)(i)固相に固定したブタTSHレセプターもしくはそのフラグメント、または(ii)標識抗体と複合体化しているTSHレセプターを提供する工程;
(b)このTSHレセプターを体液サンプルとインキュベートする工程;
(c)このTSHレセプターを含むこのインキュベートされた体液サンプルを、TSHレセプター自己抗体(TRAb)との競合反応においてこのTSHレセプターと結合し得る結合剤の少なくとも1つと反応させる工程、または、このTSHレセプターが(ii)である場合、このインキュベートされた体液サンプルを、工程(b)の間または後に、このTRAbとこのTSHレセプターとの結合に実質的に干渉しないような方法でTRAbと結合し得る結合剤の少なくとも1つと反応する工程;ならびに
(d)この反応したインキュベートされた体液サンプル中の結合したTRAbを定性的または定量的に検出する工程、を包含する。
【0010】
本発明の好ましい特徴に従って、この体液サンプルは血液、血漿または血清を含む。
【0011】
本発明は、TSHレセプターを標識または固定化するための抗体の使用を包含し、この固定化または標識したTSHレセプターは、それがTSHおよび/またはTRAbを結合する能力を保持するように存在する。
【0012】
本発明は好ましくは、このTSHレセプターに対するモノクローナル(またはポリクローナル)抗体の使用に関し、この抗体は、TSHおよびTRAbを結合するレセプターの部分とは異なる部位にてこのレセプターと強力に結合している。この抗体は、TSHまたはTRAbと同時に強力にそのレセプターと結合し得、そしてこれを使用して現在のTRAbアッセイ方法の制限の多くを軽減し得る。
【0013】
本発明の第一の実施態様において、この抗体は、標準的な手順を用いて、固相(例えば、プラスチックチューブまたはプラスチックプレートあるいは磁性粒子または非磁性粒子)に固定化され得る。次いで、この固相は、PEGの代わりに用いられて、遊離の標識TSHから、TSHレセプターに結合した標識TSHを分離し得る。TSH(または類似のリガンド)は、同位体標識または非同位体標識で標識され得る。
【0014】
この第一の実施態様にはいくつかの適用が存在し、このうち以下が模式的な例である。
【0015】
【化1】
【0016】
【化2】
(iii) 上記の(i)および(ii)において、レセプターAbは、固相に「間接的」に結合され得る。例えば、Abは、ビオチン化され得、そしてアビジンまたはストレプトアビジンを含む固相と反応し得る。
【0017】
【化3】
【0018】
【化4】
本発明の第二の実施態様において、この抗体は、125Iのような同位体標識で、または酵素、色素もしくは化学発光化合物のような非同位体標識で、直接標識され得る。あるいは、この抗体は、例えば、アビジン−ビオチン系を用いて間接的に標識され得る。次いで、この標識抗体を用いて、TSHレセプター自体を標識し、次いでレセプターと抗体とのこの複合体を用いてTRAbを検出および/またはモニターする(定性的または定量的のいずれかで)。
【0019】
このアプローチの例を以下に模式的に記載する。
【0020】
【化5】
この系において、試験サンプル中の漸増量のTRAbは、最終複合体において漸増量の標識Abをもたらす。
【0021】
(ii)この例は、抗体(それ自体が同位体標識または非同位体標識で標識されている)で標識された固相(□−TSH)レセプターとTSH(または類似のリガンド)との、直接または間接的な結合に依存する。この抗体は、この固定化したTSH(または類似のリガンド)と結合し得る。この結合は、以下のようにTRAbによって阻害される。
【0022】
【化6】
本発明の第一および第二の実施態様を参照して上記に記載されたスキームは、本発明の特定の利点を例示する。固定化された抗体を使用して、TSHレセプターを、そのレセプターが、それがTSHおよび/またはTRAbを結合する能力を保持するような様式でTSHレセプターを標識または固定し得る。あるいは、その固定化された抗体は、患者の血清においてTRAb(またはTSHレセプターと相互作用する他のリガンド)をモニターするため、またはTSHレセプターの精製のために使用され得る。
【0023】
特に、この抗体を用いてTSHレセプターを標識する能力は、上記の本発明の第二の実施態様におけるように、TRAbとTSHレセプターとの直接の相互作用のモニターを可能にする。さらに、本発明は、TSHおよびTRAbとの相互作用の前、間または後のレセプターの固定化を可能にする。このレセプターを固定化するこの能力を使用して、PEGおよび/または同位体標識に依存しない新たなTRAbアッセイを作製し得る。このようなアッセイは、自動化および免疫クロマトグラフィー系に適切であり得る。
【0024】
TSHレセプター(TSHR)は、甲状腺細胞の表面上にはほんのわずかな数しか存在しない(1細胞当たり約103レセプター)。このことで、天然の供給源からレセプターを精製することは非常に困難であった(「Bailliere’s Clinical Endocrinology and Metabolism」、1997、第II巻、451〜474頁、Sandersに記載される)。
【0025】
対照的に、組換えTSHRは、哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)において、1細胞当たり約105〜106レセプターというはるかに高いレベルで発現され得る(Sanders)。さらに、非甲状腺細胞において産生される組換えTSHR調製物には、サイログロブリンまたは甲状腺ペルオキシダーゼのような他の甲状腺自己抗原は混入していない(Springer Seminars in Immunopathology、1993、309−318頁、Furmaniak)。
【0026】
哺乳動物細胞において産生される組換えTSHR調製物は、天然のレセプターのものと類似のTSHおよびTRAb結合特性を示す唯一のものである。例えば、このような結合特性は、酵母、昆虫細胞または細菌において産生されない。これは、TSHRの構造とTSH/TRAbの結合部位との間の非常に複雑な関係のためである。このTSHRの翻訳後プロセシングおよび「成熟」タンパク質の折り畳みは、哺乳動物細胞環境において最も良く達成される(Sandersを参照のこと)。
【0027】
そのTSHおよびTRAb結合活性がインタクトな、哺乳動物細胞からの組換えTSHRの大量精製は、報告されていない。主要な問題の一つは、TSHRの細胞外部分と相互作用するマウスモノクローナル抗体との結合後のTSH/TRAb結合活性の欠失である(Sanders)。また、これまでに、TRAbの慣用される測定についての新たな、そして簡便な戦略の開発には成功していない。
【0028】
本発明の好ましい特徴は、以下の非限定的な詳細な実施例によって例示される。
【0029】
(実施例)
(1.ブタTSHR cDNAのクローニング)
RNAをブタ甲状腺組織から、グアニジウムチオシアネート−フェノールクロロホルム法(ChomczynskiおよびSacchi,Anal.Biochem.第162巻、1987、156−159頁)を用いて抽出した。mRNAを総RNAから、DynalビーズmRNA精製キット(Dynal、Wirral L62 SAZ UK)を用いて精製した。このmRNAを用いてcDNAライブラリを、ZapExpress cDNA Gigapack Cloning Kit III(Strategene Ltd.、Cambridge CB4 4DF UK)を用いて作製した。4つの縮重オリゴヌクレオチドを、公知のTSHR配列(マウス、ラット、ヒト、イヌおよびウシ)に対して作製し、そしてブタTSHRの2つのフラグメントを、PCRを用いて増幅した。これらを配列決定して、TSHR cDNAとのそれらの相同性を確認し、そしてこれを用いて全長ブタTSHRクローンについてこのcDNAライブラリーをスクリーニングした。3つの全長クローンを得、そして全配列決定した。
【0030】
(2.CHO細胞におけるブタ組換えTSHRタンパク質の発現)
全長pTSHR cDNAの5’非翻訳領域(5’UTR)におけるATG開始コドンをPCRにより取り出し、そしてこのcDNAをpcDNA3.1(+)(Invitrogen BV、9351、NV、Leek、The Netherlands)にクローニングした。全長TSHRをコードするDNAをCHO細胞(ECACC,Porton Down SP4 OJG UKからのCHO−KI)に、エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。TSHRを発現するクローンを、24ウェルプレート上に増殖する細胞に対する直接的な125I TSH結合を用いて検出した。最高のTSH結合を示すクローンを増殖させ、そして限界希釈により二回再クローニングした。1細胞当たり約4×105TSHRを発現する1つの安定な細胞株を、組換えTSHRの増殖および産生のために選択した。
【0031】
(3.界面活性剤で可溶化した組換えブタTSHRの調製)
TSHRを発現するCHO細胞をコンフルエントにまで増殖させ、ローラーボトルから剥離し、そしてこの細胞ペレットを、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含む氷冷50mM NaCl、10mM Tris−HCl、pH7.5で洗浄し、次いで同一の緩衝液中にホモジナイズした。12000gで30分間4℃で遠心分離した後の細胞膜を、1%Triton X−100を添加したことを除いてホモジナイズするために使用したのと同じ緩衝液(約4×108細胞について4mlの緩衝液)中に可溶化した。可溶化したレセプター調製物を90,000gで2時間4℃で遠心分離し、そしてその上清を−70℃で保存した。
【0032】
(4.ブタTSHRタンパク質のC末端の発現)
Escherichia coliにおいて、グルタチオン S−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質としての発現を、標準的なプロトコル(Journal of Molecular Endocrinology(1998)第20巻、233−244頁、Odaに記載される)を用いて、実施した。最後の160アミノ酸をコードする、cDNAの3’末端(1809〜2295bp)をpGEX2Tベクター(Pharmacia Biotech、St.Albans AL1 3AW UK)においてGST融合タンパク質とインフレームにクローニングした。pGEX−2T/TSHRプラスミドで形質転換したE.coli(UT580株)の一晩培養物を、2×YTG培地(1リットル当たり、16gトリプトン、10g酵母抽出物、5gNaCl、20gグルコース、pH7.0)中に1/5に希釈し、30℃で3時間インキュベートした。その後、イソプロピル−3−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を、タンパク質発現を誘導するために1mMの最終濃度で添加し、次いでさらに3時間インキュベートした。細菌ペレットを、1% Triton X−100を含むPBS(1リットル当たり、8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4および0.24g KH2PO4、pH7.4)中に再懸濁し、そして氷上で1分間の超音波処理を3回行った。封入体をペレット化し、4M尿素で洗浄し、8M尿素中に可溶化し、そして9%ポリアクリルアミドゲル(SDS−ポリアクリルアミド電気泳動、SDS−PAGE)上で、還元条件下で分離した。TSHR/GST融合タンパク質(分子量44kDa)を、0.1M NaHCO3および0.1% SDS pH7.8中でポリアクリルアミドゲルスライスから電気溶出し、50mM Tris−HCl(pH8.0)に対して透析し、そして−70℃でアリコートで保存した。
【0033】
(5.ブタTSHRに対するモノクローナル抗体の調製および精製)
電気溶出したTSHR/GSTタンパク質を使用して、TSHRに対する抗体力価が高くなるまでBALB Cマウスを免疫した(マウス1匹1回の注射あたり50μg)。マウス血清中のTSHR抗体レベルを、インビトロ転写/翻訳系(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism、第82巻(1997)No.4、1288〜1292頁、Prenticeに記載されている方法を参照のこと)において産生された35S標識したTSHRに基づく免疫沈降アッセイを用いて試験した。マウス脾細胞を、標準的な技術(Oda)を用いて、マウスミエローマ細胞株(ECACCからのX63−Ag8.653)と融合し、そしてクローニングしてTSHR抗体を分泌する安定なハイブリドーマを産生した。抗体4E31は、免疫沈降アッセイにおいて35S−TSHR抗体を沈降させること、およびウェスタンブロット分析においてTSHRと良好に反応することが見い出された。4E31を、ハイブリドーマ培養上清から、Prosep−A(Bioprocessing、Consett DH8 6TJ UK)カラム上のクロマトグラフィーにより精製した。Fab2フラグメントを、ペプシンによる消化(70mM酢酸ナトリウム、50mM NaCl pH4.0中の1mg/mlのペプシン濃度、IgG対酵素比は5:1である)およびインタクトなIgGを吸着するためのProsep A上のクロマトグラフィー後に得た。約1mg/mlの4E31 Fab2調製物を、−70℃でアリコートで保存した。
【0034】
(6.4E31抗体のTSHレセプター結合特性)
可溶化した組換えブタTSHレセプターを、125I標識TSHとインキュベートして、125I標識TSH−TSHレセプター複合体を形成した。4E31 IgG(またはコントロールIgG)を、それを磁性ラテックスビーズに結合させることにより固定化し、そしてこれらのビーズ(100μl;1μgの4E31)を、予め形成した125I標識TSH−TSHレセプター複合体(100μl)とインキュベートした。37℃で1時間後、ビーズを、磁石上で分離し、洗浄しそして125Iについて計測した。125I標識TSH−TSHレポーター複合体のサンプルをPEGを用いて沈澱させて、存在する遊離の標識TSHの量を決定した。表1は得られた結果を示す。
【0035】
【表1】
(使用したコントロールIgGは、グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するマウスモノクローナル抗体であった)
これらの研究は、4E31がTSHと同時にTSHレセプターと結合し得ることを明らかに示した。さらに、固体支持体に結合した4E31を使用して、TSHレセプターに結合したTSHを遊離のTSHから分離して、PEGを用いて得られたものと類似の結果を得た。
【0036】
表2は、個々の健常ヒトドナー血清の存在下で、添加した標識TSHのうちの約55%が4E31および組換えブタTSHレセプターでコートしたチューブに結合したことを示す(本発明の第一の実施態様、上記のスキームiiに従う)。類似の結合が、橋本甲状腺炎の患者および全身性エリテマトーデス(SLE)の患者の血清の場合においても観察された。しかし、グレーブズ病の5人の患者からの血清では、顕著に少ない標識TSH結合(約35%)が存在した。5つすべての血清は、天然ブタTSHレセプターへのTSH結合の阻害およびPEGを用いてレセプターに結合したTHSと遊離のTSHとの分離により判断される場合に容易に検出可能な量のTSHレセプター自己抗体を含んでいた。
【0037】
(表2.4E31(Fab)2、次いで組換えブタTSHレセプターでコートしたプラスチックチューブに対する標識TSHの結合。異なる血清の効果)
【0038】
【表2】
表3は、4E31を介して天然の(すなわち、組換えでない)ブタTSHレセプターでコートしたチューブでの類似の結果を示す。ここでも、このコートされたチューブのアッセイで得られた結果は、PEG分離法で得られた結果と類似する。
【0039】
(表3.4E31(Fab)2、次いで天然の界面活性剤で可溶化したブタTSHレセプターでコートしたプラスチックチューブに対する標識TSHの結合)
【0040】
【表3】
表2および表3に示した125I結合−TSHに対する阻害効果は、血清中のTRAbの濃度に依存していた。表4に示されるように、漸増量のTRAbの標準調製物(甲状腺刺激抗体、第一国際基準90/672)は、TSH結合阻害に対して、用量依存効果を有していた。
【0041】
【表4】
(125I−4E31 Fab2−TSH複合体の直接の沈降)
本発明の別の実施例(本発明の第二実施態様、上記スキーム(i)に従う)は、4E31(Fab)2が125Iで標識され、そしてTSHレセプターと反応するアッセイである。次いで、この複合体を、患者血清中のTSHレセプター自己抗体とインキュベートし、そして得られた三分子(termolecular)複合体は、固相プロテインAの添加により沈降する。1例を表5に示す。
【0042】
(表5.125I−4E31(Fab)2で標識した組換えブタTSHレセプターと、TSHレセプター自己抗体との間の反応)
【0043】
【表5】
(グレーブズ病の血清18および19は、天然のブタTSHレセプターを用いたPEG沈降方法においてそれぞれ31%および73%のTSH結合の阻害値を与えた。
【0044】
4E31は、ビオチンで標識され得、ストレプトアビジンコートチューブに結合され得、次いでブタTSHレセプターと反応され得る。本発明の第一の実施態様、スキーム(iii)bを参照のこと。この方法で固定化したレセプターは、容易に125I標識TSHに結合し、そしてこの結合は、患者の血清においてTSHレセプター自己抗体によって阻害された。1例を表6に示す。
【0045】
(表6 ビオチン化4E31(Fab)2を介してストレプトアビジンでコートしたチューブに結合したTSHレセプターに対する標識TSHの結合、およびTRAbの効果)
【0046】
【表6】
本発明は、今や、例示の目的のみである以下の図面を参照することにより例示される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、TRAbでコートしたチューブを用いて甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する自己抗体をモニターする方法を用いた結果と、PEG沈降アッセイを用いる方法を用いた結果の間の相関を示す。ここで両方の方法は、125I標識ウシTSHを使用する。さらに、TRAbでコートしたチューブを用いた方法での異なる患者群における結果を示す。
【図2】 図2は、TSHレセプターでコートしたプレートを用いるELISA方法の結果を示す。2aはTRAb基準90/672の、レセプターでコートしたプレートへのブタTSH結合に対する効果を示す。2bは、ELISA方法およびPEG沈降アッセイの比較を示す。そして、ウシTSHを用いるTRAb ELISA方法での異なる患者群における結果を2cに示す。
【図3】 図3は、従来使用されているTRAbアッセイ方法と、本発明による直接沈降アッセイ方法との間の相関を示す。さらに、直接TRAbアッセイでの異なる患者群における結果を示す。
Claims (32)
- 体液サンプル中の甲状腺刺激ホルモン(TSH)レセプターに対する自己抗体のサンプルをスクリーニングする方法であって、自己抗体がTSHと同様にTSHレセプターの同じ部分と相互作用し、以下の工程:
(a)TSHレセプターの供給源を提供する工程;
(b)該TSHレセプターを体液サンプルとともにインキュベートする工程;
(c)該インキュベートされた体液サンプル中のTSHレセプターに結合したTSHレセプター抗体を定性的または定量的に検出する工程、
を包含し、
(a)のTSHレセプターがさらにTSHレセプターに対する少なくとも一つの抗体または抗体フラグメントと接触し、ここで抗体はTSHおよびTSHレセプター自己抗体を結合するTSHレセプターの部分とは異なる部位でTSHレセプターに結合し、それゆえ該抗体または抗体フラグメントが、(i)TSHレセプターを固相に固定化し、それにより固定化されたTSHレセプターがTSHまたはTSHレセプター自己抗体を同時に結合し得るか、または(ii)該TSHレセプターのための標識方法を提供し、それにより結果として生じる標識されたTSHレセプターがTSHまたはTSHレセプター自己抗体を同時に結合し得るかのいずれかである、
方法。 - 前記体液サンプルが、血液、血漿または血清を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記固相がプラスチック材料、磁性材料または非磁性材料を含む、請求項1または2に記載の方法。
- TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが固相に固定化されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが標識されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識が、同位体標識を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記同位体標識が125Iを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが、酵素、色素、蛍光物質または化学発光物質の手段で非同位体的に標識されている、請求項1〜4、または6のいずれか1項に記載の方法。
- TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが、有機化合物で間接的に標識されている、請求項1〜4、または6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有機化合物がビオチンを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記有機化合物が、該化合物について親和性を有するタンパク質と複合体化している、請求項10または11に記載の方法。
- 前記タンパク質が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項12に記載の方法。
- 請求項6〜13のいずれか1項に記載の方法であって、工程(c)が、抗ヒトIgG試薬を工程(b)で得られるインキュベーション混合物に加えることを含む、方法。
- 工程(b)で得られる前記インキュベーション混合物が、TSHをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記TSHが標識されている、請求項15に記載の方法。
- 前記TSHが、固相に固定化されている、請求項15に記載の方法。
- 請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法であって、TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントとの前記TSHレセプターの接触後、TSHがTSHレセプターと接触させられる、方法。
- 請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法であって、TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントとの前記TSHレセプターの接触前に、TSHがTSHレセプターと接触させられる、方法。
- 甲状腺刺激ホルモン(TSH)レセプターに対する自己抗体について体液サンプルをスクリーニングするためのキットであって、自己抗体がTSHと同様にTSHレセプターの同じ部分と相互作用し、該キットが以下:
(a)TSHレセプターの供給源;
(b)該TSHレセプターを体液サンプルとともにインキュベートするための手段;
(c)該TSHレセプターに結合したTSHレセプター自己抗体を定性的または定量的に検出するための手段、およびさらに、
(d)TSHレセプターに対する少なくとも一つの抗体または抗体フラグメントであって、抗体がTSHレセプターのTSHを結合する部分とは異なる部位でTSHレセプターを結合する抗体または抗体フラグメント、
を含み、
ここで該抗体または抗体フラグメントが、
(i)TSHレセプターを固相に固定化し、それにより固定化されたTSHレセプターがTSHまたはTSHレセプター自己抗体を同時に結合し得るか、または(ii)該TSHレセプターを標識し、それにより結果として生じる標識されたTSHレセプターがTSHまたはTSHレセプター自己抗体を同時に結合し得るかのいずれかである、
キット。 - 前記体液サンプルが、血液、血漿または血清を含む、請求項20に記載のキット。
- 前記固相がプラスチック材料、磁性材料または非磁性材料を含む、請求項20または21に記載のキット。
- TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、請求項20〜22のいずれか1項に記載のキット。
- 前記TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが、固相に固定化されている、請求項20〜23のいずれか1項に記載のキット。
- 前記TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが標識されている、請求項20〜23のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標識が同位体標識を含む、請求項25に記載のキット。
- 前記同位体標識が 125 Iを含む、請求項26に記載のキット。
- 前記TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが、酵素、色素、蛍光物質または化学発光物質の手段で非同位体的に標識されている、請求項20〜23、または25のいずれか1項に記載のキット。
- TSHレセプターに対する前記抗体または抗体フラグメントが、有機化合物で間接的に標識されている、請求項20〜23、または25のいずれか1項に記載のキット。
- 前記有機化合物がビオチンを含む、請求項29に記載のキット。
- 前記有機化合物が、該化合物について親和性を有するタンパク質と複合体化している、請求項29または30に記載のキット。
- 前記タンパク質が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項31に記載のキット。
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