JP4321716B2 - Fluorescence image correction method, apparatus, and program - Google Patents
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Description
本発明は、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光色素で標識された蛍光標識検体から発生する蛍光を検出し蛍光画像データとして取得したときに、この蛍光画像データを補正する画像補正方法および装置ならびにプログラムに関するものである。 The present invention relates to an image correction method and apparatus for correcting fluorescence image data when fluorescence generated from a fluorescently labeled specimen labeled with a fluorescent dye hybridized with a specific binding substance is detected and acquired as fluorescence image data. As well as programs.
近年、遺伝子工学分野における技術が急速に発展し、１０万個にも及ぶと考えられているヒトゲノムの塩基配列を解読することを１つの目的とするヒトゲノムプロジェクトが展開されている。一方、各種遺伝子疾患に影響を与えているＤＮＡに関する研究も進んでおり、その１つの方法としてマイクロアレイ技術が注目されている。このマイクロアレイ技術は、既に解読されている多数の異なるｃＤＮＡ（特異的結合物質の一例）を基板となるスライドガラス上の１．８×１．８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０〜１５０（μｍ）のスポットとして約６４００個並べたマイクロアレイと称するもの、またはｃＤＮＡをナイロンメンブレンフィルタ上の８×１２（ｃｍ）、７×５（ｃｍ）または２２×２２（ｃｍ）の範囲にドットサイズ約０．５〜１（ｍｍ）のスポットとしてそれぞれ５８８個、５０００個、２７０００個並べたマクロアレイと称するもの、あるいは合成オリゴヌクレオチドをシリコン基板上の１．２８×１．２８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０（μｍ）のスポットとして約６４０００個並べたＤＮＡチップと称するもの等を用いた技術である（上記マイクロアレイ、マクロアレイおよびＤＮＡチップ等を総称して「マイクロプレート」と称することとする。）。 In recent years, rapid progress in technology in the field of genetic engineering has led to the development of a human genome project with the goal of deciphering the base sequence of the human genome, which is thought to be as many as 100,000. On the other hand, research on DNA affecting various gene diseases is also progressing, and microarray technology is attracting attention as one of the methods. In this microarray technology, a large number of different cDNAs (examples of specific binding substances) that have already been decoded have a dot size of 50 to 150 (μm) in the range of 1.8 × 1.8 (cm) on a glass slide as a substrate. )), A so-called microarray in which about 6400 spots are arranged, or a dot size of about 0. 12 (cm), 7 x 5 (cm) or 22 x 22 (cm) on a nylon membrane filter. Dot size within a range of 1.28 x 1.28 (cm) on a silicon substrate, or a 5 to 1 (mm) spot, called a macroarray with 588, 5000, and 27000, respectively. This technique uses what is called a DNA chip in which about 64,000 spots are arranged as 50 (μm) spots. Roarei are collectively microarray and DNA chips is referred to as a "microplate".).
すなわち、蛍光色素ａで標識された健常者の細胞から取り出したＤＮＡの蛍光標識検体Ａをピペット等でこのマイクロプレート上の各ｃＤＮＡに滴下して、蛍光標識検体ＡとｃＤＮＡとをハイブリダイズさせる。このハイブリタイズの処理の後にマイクロプレートは所定の溶液で処理され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされなかった蛍光標識検体Ａは各スポットから除去され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされた蛍光標識検体Ａは各スポットに残される。そして、上記処理が施されたマイクロプレート上の各検体のスポット（以後スポットと呼ぶ）に、蛍光色素ａを励起する励起光ＦＬを相対的に走査して、この励起光ＦＬの照射により発生した蛍光の検出結果を表す蛍光画像データを得る（たとえば特許文献１、２参照。）。
That is, a fluorescently labeled specimen A of DNA taken out from a healthy person's cells labeled with a fluorescent dye a is dropped onto each cDNA on the microplate with a pipette or the like, and the fluorescently labeled specimen A and the cDNA are hybridized. After this hybridization treatment, the microplate is treated with a predetermined solution, the fluorescently labeled specimen A that has not been hybridized with cDNA is removed from each spot, and the fluorescently labeled specimen A that has been hybridized with cDNA remains in each spot. It is. Then, the spot of each specimen (hereinafter referred to as a spot) on the microplate subjected to the above processing is scanned with the excitation light FL for exciting the fluorescent dye a, and generated by irradiation of the excitation light FL. Fluorescence image data representing the fluorescence detection result is obtained (see, for example,
上記と同様の処理を、蛍光色素ｂで標識された遺伝子疾患を有する者の細胞から取り出したＤＮＡの蛍光標識検体Ｂに関しても行い、励起光の照射により発生した蛍光の検出結果を表す蛍光画像データを得、各スポット毎に蛍光標識検体Ａの各スポットから得られた蛍光画像データと蛍光標識検体Ｂの各スポットから得られた蛍光画像データとの比の値を求める。蛍光画像データの比の値は、異常のあるＤＮＡが滴下されたスポットほど大きくなる（あるいは小さくなる）ことから、各スポットにおける蛍光画像データの比の値が大きい方から順に例えば５０箇所分の蛍光画像データの比の値を、その信号が得られたスポットと対応付ける表として読み取り、この表に基づいて異常のあるＤＮＡが特定される。 Fluorescence image data representing the detection result of the fluorescence generated by the irradiation of excitation light by performing the same process as described above also on the fluorescence-labeled specimen B of DNA extracted from the cell of a person having a genetic disease labeled with the fluorescent dye b The ratio value of the fluorescence image data obtained from each spot of the fluorescently labeled specimen A and the fluorescence image data obtained from each spot of the fluorescently labeled specimen B is obtained for each spot. Since the ratio of the fluorescence image data increases (or decreases) as the spot where the abnormal DNA is dropped, the fluorescence image data for each spot, for example, in order from the largest, the fluorescence for 50 locations. The ratio value of the image data is read as a table corresponding to the spot from which the signal is obtained, and abnormal DNA is identified based on this table.
なお、マイクロプレート上の各スポットから発せられる蛍光を検出する光学系には空間分解能が高く焦点深度が浅い共焦点光学系が多く用いられているので、共焦点光学系の焦点位置に一致させたマイクロプレート上のスポットへの励起光の照射によりスポットから発せられた蛍光を共焦点光学系の他方の焦点位置に配設されたピンホールを通過させて検出することにより、上記スポット以外の位置で発生した蛍光等のノイズを除去することができる。 In addition, the optical system that detects fluorescence emitted from each spot on the microplate often uses a confocal optical system with a high spatial resolution and a shallow depth of focus. By detecting the fluorescence emitted from the spot by irradiating the spot on the microplate through the pinhole located at the other focal position of the confocal optical system, Noise such as generated fluorescence can be removed.
ここで、上述した蛍光画像データの分析には、そのデータ自体の信頼性が保証されていることが必要となる。しかし、実際の実験において温度や湿度等の環境変化やマイクロプレートの傷、ハイブリダイゼーションの反応効率、蛍光の読取精度等の実験環境に起因して、たとえば同一種類の特異的結合物質に対し同一の蛍光標識検体をハイブリダイズさせたときであっても得られる蛍光画像データが異なってしまう場合がある。そこで、マイクロプレートから取得した蛍光画像データを用いて、実験工程における不具合を視覚により把握する方法（たとえば特許文献３参照。）や、マイクロプレート上の複数のスポットからそれぞれ取得した蛍光画像データを統計的に解析することにより、取得した蛍光画像データを補正する方法（たとえば特許文献４参照。）等が提案されている。
上述した特許文献２、３のような実験環境による信頼性低下を防止するための蛍光画像データの補正においては、励起光が照射された蛍光色素から射出される蛍光は常に一定の強度を有していることが前提となっている。つまり、検体を標識している蛍光色素は、励起光が照射されれば常に所定の蛍光を出力することが前提となっている。 In the correction of the fluorescence image data for preventing the deterioration of reliability due to the experimental environment as described in Patent Documents 2 and 3, the fluorescence emitted from the fluorescent dye irradiated with the excitation light always has a constant intensity. It is assumed that. That is, it is assumed that the fluorescent dye that labels the specimen always outputs predetermined fluorescence when irradiated with excitation light.
ところが、特定の蛍光色素と特定の検体との組み合わせにおいては、蛍光色素自体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少することが実験において判明した。すなわち、異なるスポットに存在する同一種類の蛍光標識検体に対し同一の時間に励起光をそれぞれ照射し、各スポットから射出される蛍光を同一の時間に検出したとき、蛍光の強度は同一のものとなる。しかし、異なるスポットに存在する同一種類の蛍光標識検体に対し同一の時間に励起光がそれぞれ照射され、各スポットから射出される蛍光を異なる時間に検出したとき、蛍光の強度が異なったものとなってしまうことがわかった。 However, it has been experimentally found that the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent dye itself decreases with time in the combination of the specific fluorescent dye and the specific specimen. That is, when the same kind of fluorescently labeled specimens existing in different spots are irradiated with excitation light at the same time, and the fluorescence emitted from each spot is detected at the same time, the intensity of the fluorescence is the same. Become. However, when the same kind of fluorescently labeled specimens in different spots are irradiated with excitation light at the same time, and the fluorescence emitted from each spot is detected at different times, the intensity of the fluorescence is different. I understood that.
この蛍光の経時変化により最後に励起光を照射した蛍光標識検体は、最初に検出された蛍光と最後に検出された蛍光とが同じ強度で発光していたときであっても、最初に励起光を照射された蛍光標識検体よりも弱い蛍光を発するものであると認識されてしまい、信頼性の高い分析ができないという問題がある。 The fluorescence-labeled specimen that was last irradiated with the excitation light due to this time-dependent change in fluorescence is the first excitation light, even when the first detected fluorescence and the last detected fluorescence emitted at the same intensity. Therefore, there is a problem that it is difficult to perform a highly reliable analysis.
そこで、本発明は、蛍光が時間経過とともに蛍光強度が小さくなる蛍光標識検体を分析するときであっても、する蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラムを提供することを目的とするものである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a fluorescence image correction method, apparatus, and program for analyzing a fluorescence-labeled specimen whose fluorescence intensity decreases with time.
本発明の蛍光画像補正方法は、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して取得した主蛍光画像データを補正する蛍光画像補正方法において、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正することを特徴とするものである。 The fluorescent image correction method of the present invention detects fluorescence emitted from a fluorescently labeled specimen by irradiating excitation light to the fluorescently labeled specimen hybridized with a specific binding substance present in a spot on a microplate. In the fluorescence image correction method for correcting the main fluorescence image data acquired in this manner, the main fluorescence image data is corrected based on the temporal change characteristic when the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen decreases with time. It is a feature.
本発明の蛍光画像補正装置は、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して主蛍光画像データを取得する画像取得手段と、画像取得手段により取得された主蛍光画像データを補正する画像補正手段とを有し、画像補正手段が、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正するものであることを特徴とするものである。 The fluorescence image correction apparatus of the present invention detects the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen by irradiating the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance present at the spot of the microplate. The image acquisition means for acquiring the main fluorescence image data and the image correction means for correcting the main fluorescence image data acquired by the image acquisition means, and the image correction means is the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescence-labeled specimen. Is characterized in that the main fluorescence image data is corrected on the basis of the temporal change characteristic when the value decreases with time.
本発明の蛍光画像補正プログラムは、コンピュータに、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出し取得した蛍光画像データを補正することを実行させるものであり、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、蛍光画像データを補正することを実行させるためのものである。 The fluorescent image correction program of the present invention is a program that irradiates a fluorescently labeled specimen hybridized with a specific binding substance present in a spot on a microplate to a computer, thereby emitting fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen. The fluorescent image data is detected and corrected, and the fluorescent image data is corrected based on the temporal change characteristic when the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen decreases with time. To make things happen.
ここで、「マイクロプレート」とは、複数のスポットを有し、各スポット上に特異的結合物質が固着されているプレート状のものであればなんでもよい。また、「スポット」とは、マイクロプレート状における特異的結合物質が固着されている単位領域をいう。「ハイブリダイズ」とは、核酸が相補的二重鎖形成する性質を利用して、特定の塩基配列にそれと相補的なヌクレオチド鎖を結合させることをいう。「蛍光標識検体」とは蛍光色素により標識されたホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その外の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の検体をいい、「特異的結合物質」とはホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ヌクレオチド鎖等であって、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その外の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成などが既知の物質をいう。 Here, the “microplate” may be anything as long as it has a plurality of spots and has a plate-like shape in which a specific binding substance is fixed on each spot. A “spot” refers to a unit region to which a specific binding substance in a microplate shape is fixed. “Hybridization” refers to binding of a complementary nucleotide chain to a specific base sequence utilizing the property of nucleic acid forming a complementary duplex. “Fluorescently labeled specimen” means specimens such as hormones labeled with fluorescent dyes, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, abzymes, other proteins, nucleic acids, cDNA, DNA, RNA, etc. "Is hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, abzymes, other proteins, nucleic acids, cDNA, DNA, RNA, mRNA, nucleotide chains, etc., and hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, Abzymes, other proteins, nucleic acids, cDNAs, DNAs, RNAs and the like that can specifically bind to substances derived from living organisms and have known base sequences, base lengths, compositions, and the like.
また、「主蛍光画像データ」とは、蛍光標識検体の分析に用いるための蛍光画像データをいい、「補助蛍光画像データ」とは、主蛍光画像データとは別に励起光の照射が行われることにより取得された、蛍光標識検体の経時変化特性を算出するための蛍光画像データをいう。「時間経過」とは、励起光を照射しているか否かに拘わらず、蛍光標識検体が特異的結合物質とハイブリダイズされてからの時間経過をいう。 “Main fluorescence image data” refers to fluorescence image data for use in analysis of fluorescently labeled specimens, and “auxiliary fluorescence image data” refers to irradiation of excitation light separately from main fluorescence image data. The fluorescence image data for calculating the time-dependent change characteristic of the fluorescently labeled specimen acquired by the above. “Time lapse” refers to the time lapse after the fluorescently labeled specimen is hybridized with the specific binding substance regardless of whether or not the excitation light is irradiated.
なお、画像補正手段は、たとえば主蛍光画像データを取得したときの特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体特有の経時変化特性を有し、この経時変化特性に基づいて主蛍光画像データを補正するようにしてもよいし、主蛍光画像データとは別の補助蛍光画像データを取得したときに、主蛍光画像データから経時変化特性を算出しに基づいて主蛍光画像データを補正するものであればよい。 The image correction means has, for example, a time-dependent change characteristic unique to a fluorescently labeled sample hybridized with a specific binding substance when the main fluorescent image data is acquired, and the main fluorescent image data is obtained based on the time-dependent change characteristic. The auxiliary fluorescent image data may be corrected, and when the auxiliary fluorescent image data different from the main fluorescent image data is acquired, the time-dependent change characteristic is calculated from the main fluorescent image data and the main fluorescent image data is corrected. I just need it.
主蛍光画像データとは別の補助蛍光画像データを取得するとき、画像取得手段は、主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであってもよい。さらに、画像補正手段は、画像取得手段により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データと、主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。 When acquiring auxiliary fluorescence image data different from the main fluorescence image data, the image acquisition means applies to the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance present on the predetermined spot from which the main fluorescence image data was acquired. On the other hand, the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen may be detected by irradiating the excitation light to obtain auxiliary fluorescence image data at a predetermined spot. Furthermore, the image correction means includes main fluorescence image data and auxiliary fluorescence image data at a predetermined spot acquired by the image acquisition means, and an excitation light irradiation time interval when acquiring the main fluorescence image data and auxiliary fluorescence image data. There may be provided a change characteristic acquisition means for calculating and acquiring the time-dependent change characteristic based on the above.
なお、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであってもよい。 The predetermined spot is a plurality of spots, and the auxiliary fluorescent image data at the predetermined spot is excited in a direction different from the scanning direction of the excitation light with respect to the microplate when acquiring the main fluorescent image data at the predetermined spot. Fluorescence image data acquired by scanning
あるいは、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートを励起光で走査して取得した蛍光画像データであってもよい。 Alternatively, the predetermined spot is a plurality of spots, and the auxiliary fluorescent image data at the predetermined spot is a microplate at a speed different from the scanning speed of the excitation light with respect to the microplate when acquiring the main fluorescent image data at the predetermined spot. May be fluorescence image data obtained by scanning with excitation light.
さらに、マイクロプレートが、主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有するものであってもよい。 In addition, the microplate has a plurality of spots for obtaining main fluorescence image data and a plurality of test spots for emitting fluorescence with the same fluorescence intensity, each of which has a fluorescently labeled specimen hybridized with a specific binding substance. It may have.
なお、検査用スポットに存在する特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体は、主蛍光画像データを取得するスポットの特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体と同一の経時変化特性を有するものであって、この各検査用スポットは、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出するようになっている。 The fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance present in the test spot has the same time-varying characteristics as the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance of the spot from which the main fluorescence image data is acquired. Each of the inspection spots emits fluorescence with the same fluorescence intensity.
このとき、画像取得手段は、主蛍光画像データを取得するとともに、検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して複数の検査用蛍光画像データを取得するようにしてもよい。この「検査用蛍光画像データ」とは、主蛍光画像データの取得するための励起光の照射が行われたとき、これと同時に検査用スポットに励起光が照射され取得された、蛍光標識検体の経時変化特性を算出するための蛍光画像データをいう。 At this time, the image acquisition means detects the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen by acquiring the main fluorescent image data and irradiating the fluorescently labeled specimen hybridized at each inspection spot with excitation light. Thus, a plurality of fluorescent image data for examination may be acquired. This “fluorescence image data for examination” refers to the fluorescence-labeled specimen that is obtained by irradiating the examination spot with excitation light at the same time when excitation light irradiation for obtaining main fluorescence image data is performed. Fluorescence image data for calculating the temporal change characteristic.
さらに、画像補正手段は、画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の複数の検査用蛍光画像データと、該検査用蛍光画像データの取得の際の検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。 Further, the image correction means includes a plurality of inspection fluorescent image data for each inspection spot acquired by the image acquisition means, and an excitation light irradiation time between the inspection spots when the inspection fluorescent image data is acquired. Based on the interval, there may be provided a change characteristic acquisition means for acquiring a time-dependent change characteristic unique to the fluorescently labeled specimen present in the test spot.
また、マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するとき、画像取得手段は、各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートを励起光により列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データを取得するものであってもよい。 In addition, when the microplate has a plurality of spots arranged in a grid along the row direction and the column direction, the image acquisition means excites the microplate with respect to the fluorescently labeled specimens hybridized at each spot. A plurality of main fluorescence image data may be acquired by detecting the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen at each spot by moving in the row direction while scanning in the column direction with light.
このとき、画像補正手段は、各スポット列毎の主蛍光画像データの平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。 At this time, the image correction means has change characteristic acquisition means for acquiring a time-dependent change characteristic based on the average value of the main fluorescence image data for each spot row and the time interval of excitation light irradiation between the respective spot rows. It may be a thing.
なお、「スポット列」とは、マイクロプレートの列方向に並んだ複数のスポットをいい、「各スポット列間における励起光照射の時間間隔」とは、たとえば複数のスポット列の中からそれぞれ同一行上に存在するスポット間の時間間隔をいう。 The “spot column” refers to a plurality of spots arranged in the column direction of the microplate. The “time interval of excitation light irradiation between the spot columns” refers to, for example, the same row from among the plurality of spot columns. This is the time interval between the spots existing above.
本発明の蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラムによれば、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに小さくなるときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正することにより、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、この経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データを用いて正確な分析を行うことができる。 According to the fluorescence image correction method and apparatus and program of the present invention, by correcting the main fluorescence image data based on the temporal change characteristic when the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen decreases with time, Even when detecting the fluorescence of a fluorescently labeled specimen that has a characteristic that the fluorescence decreases with time, it can be corrected based on this time-dependent change characteristic, so accurate analysis using the main fluorescence image data It can be performed.
なお、画像取得手段が、主蛍光画像データの取得とは別に、主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、画像取得手段により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データと、主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データの取得する際に補助蛍光画像データを取得し、主蛍光画像データを補助蛍光画像データとを用いて経時変化特性を算出することにより、効率的に経時変化特性を算出し取得することができる。 In addition to the acquisition of the main fluorescence image data, the image acquisition means irradiates the fluorescent labeled sample hybridized with the specific binding substance existing on the predetermined spot from which the main fluorescence image data was acquired. Thus, the fluorescence emitted from the fluorescence-labeled specimen is detected to acquire auxiliary fluorescence image data at a predetermined spot, and the image correction means is the main fluorescence image at the predetermined spot acquired by the image acquisition means. If it has a configuration having change characteristic acquisition means for calculating and acquiring temporal change characteristics based on the data and auxiliary fluorescence image data, and the excitation light irradiation time interval when acquiring the main fluorescence image data and auxiliary fluorescence image data Auxiliary fluorescence image data is acquired when the main fluorescence image data is acquired, and the main fluorescence image data is used as the time-dependent change characteristics using the auxiliary fluorescence image data. The by calculating, it can efficiently calculate the temporal change characteristics to obtain.
また、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データと補助蛍光画像データとを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットから取得した主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データを用いて主蛍光画像データが取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。 Further, the predetermined spot is a plurality of spots, and the auxiliary fluorescent image data at the predetermined spot is excited in a direction different from the scanning direction of the excitation light with respect to the microplate when acquiring the main fluorescent image data at the predetermined spot. If the fluorescent image data is obtained by scanning the main fluorescent image data obtained from a plurality of predetermined spots, the time interval when the main fluorescent image data and the auxiliary fluorescent image data are acquired is different for each spot. In order to calculate the time-varying characteristics unique to the fluorescently labeled specimen from which the main fluorescence image data was acquired using the data and auxiliary fluorescence image data, the time-varying characteristics are calculated for all spots where the same type of fluorescently labeled specimen is hybridized. It is not necessary to calculate, and the time change characteristic can be calculated efficiently.
さらに、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートを励起光で走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データと補助蛍光画像データとを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットから取得した主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データを用いて主蛍光画像データが取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。 Further, the predetermined spot is a plurality of spots, and the auxiliary fluorescent image data at the predetermined spot is a microplate at a speed different from the scanning speed of the excitation light with respect to the microplate when acquiring the main fluorescent image data at the predetermined spot. If the fluorescence image data obtained by scanning with excitation light, the time interval when obtaining the main fluorescence image data and the auxiliary fluorescence image data is made different for each spot, and obtained from a plurality of predetermined spots. In order to calculate the time-varying characteristics unique to the fluorescently labeled specimen from which the main fluorescent image data was acquired using the main fluorescent image data and the auxiliary fluorescent image data, the time-dependent characteristics of all spots where the same kind of fluorescently labeled specimen was hybridized were calculated. It is not necessary to calculate the change characteristic, and the time change characteristic can be calculated efficiently.
また、マイクロプレートが、主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有し、画像取得手段が、検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し各検査スポット毎に異なる時刻に励起光を照射することにより、検査用スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して各検査用スポット毎の検査用蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の複数の検査用蛍光画像データと、検査用蛍光画像データの取得の際の検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであれば、主蛍光画像データの取得とともに検査用蛍光画像データをも取得し、複数の検査用スポットに対する励起光照射の時間間隔とにより蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、効率的に経時変化特性を算出することができる。 The microplate has a plurality of spots for obtaining main fluorescence image data, and a plurality of test spots for emitting fluorescence with the same fluorescence intensity, where there are fluorescently labeled specimens hybridized with specific binding substances. And the image acquisition means emits the excitation light to the fluorescently labeled specimens that are respectively hybridized at the inspection spots at different times for each inspection spot, thereby being emitted from the fluorescently labeled specimens at the inspection spots, respectively. And detecting fluorescent image data for each inspection spot, and image correction means includes a plurality of inspection fluorescent image data for each inspection spot acquired by the image acquisition means, and The inspection spot based on the excitation light irradiation time interval between the inspection spots when acquiring the fluorescent image data for inspection If there is a change characteristic acquisition means that acquires the time-dependent change characteristic unique to the fluorescently labeled specimen that exists, it also acquires the fluorescence image data for examination as well as the main fluorescence image data, and irradiates a plurality of examination spots with excitation light. Since the time-dependent change characteristic peculiar to the fluorescently labeled specimen is calculated based on the time interval, the time-dependent change characteristic can be calculated efficiently.
また、マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するときに、画像取得手段が、各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートを励起光により列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポット毎の蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、各スポット列毎の主蛍光画像データの平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データを用いて経時変化特性を算出することができるため、効率的に主蛍光画像データの補正を行うことができる。 In addition, when the microplate has a plurality of spots arranged in a grid along the row direction and the column direction, the image acquisition means applies the microplate to the fluorescently labeled specimens respectively hybridized at each spot. Image correction means for detecting a fluorescence emitted from a fluorescently labeled specimen for each spot and acquiring a plurality of main fluorescence image data by moving in a row direction while scanning in a column direction with excitation light, However, if the configuration has a change characteristic acquisition means for acquiring a time-dependent change characteristic based on the average value of the main fluorescence image data for each spot row and the time interval of excitation light irradiation between the spot rows, Since the temporal change characteristic can be calculated using the fluorescence image data, the main fluorescence image data can be efficiently corrected.
以下、図面を参照して本発明の蛍光検出システムの実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の画像補正装置を用いて蛍光検出システムの一例を示す構成図である。図１の蛍光検出システム１は、マイクロプレート上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出する蛍光を検出し蛍光画像データとして出力する蛍光検出装置１０と、蛍光検出装置１０から蛍光画像データを取得し、蛍光画像データの補正を行う画像補正装置５０とを有している。
Hereinafter, embodiments of the fluorescence detection system of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a configuration diagram showing an example of a fluorescence detection system using the image correction apparatus of the present invention. The
ここで、蛍光検出装置１０は、マイクロプレートを収容するために開閉するプレート収容部１０ａを有しており、このプレート収容部１０ａからマイクロプレートＭＰが装填される。このマイクロプレートＭＰは、図２に示すように、格子状の複数のスポットＷを有し、このスポットＷには特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在している。
Here, the
図３は蛍光検出装置の一例を示す構成図であり、図１から図３を参照して蛍光検出装置１０について説明する。蛍光検出装置１０は、マイクロプレートＭＰに励起光を走査しながら照射する励起光照射手段２０と、励起光照射手段２０により励起光が蛍光標識検体に照射されたとき、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出する蛍光検出手段３０と、蛍光検出手段３０により検出された蛍光を蛍光画像データとして出力するデータ出力手段４０とを備えている。
FIG. 3 is a block diagram showing an example of the fluorescence detection apparatus. The
ここで、励起光照射手段２０は、励起光ＦＬを射出する励起光源２１と、射出された励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光する集光レンズ２４と、励起光ＦＬを矢印Ｙ方向（主走査方向）に走査させるために集光レンズ２４を移動させるレンズ移動手段２５と、励起光を矢印Ｘ方向に走査させるためにマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるプレート移動手段２６とを備えている。
Here, the excitation light irradiation means 20 includes an
励起光源２１は、蛍光標識検体に用いられる蛍光色素の種類に応じて波長の異なる（たとえば６４０ｎｍ、５３２ｎｍ、４７３ｎｍ）励起光ＦＬを出力する機能を有する。集光レンズ２４は、励起光源２１から射出された励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂを介し穴あきミラー２３の穴を貫通して入射されたときに、励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光するものである。
The
このとき、マイクロプレートＭＰには集光レンズ２４により集光された励起光ＦＬが矢印Ｘ方向およびＹ方向に走査しながら照射されるようになっている。具体的には、集光レンズ２４は揺動可能に設けられており、レンズ移動手段２５に接続されている。そして、レンズ移動手段２５は集光位置がマイクロプレートＭＰの矢印Ｙ方向に走査するように集光レンズ２４を揺動させるようになっている。また、マイクロプレートＭＰは、矢印Ｘ方向（副走査方向）に移動可能に設けられており、プレート移動手段２６に接続されている。そして、プレート移動手段２６はマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるようになっている。つまり、励起光ＦＬは、集光レンズ２４の移動により矢印Ｙ方向に走査し、マイクロプレートＭＰの移動により矢印Ｘ方向に走査することになるため、マイクロプレートＭＰ上に格子状に配列された複数の蛍光標識検体に対して励起光ＦＬを走査しながら照射することができる。
At this time, the microplate MP is irradiated with the excitation light FL condensed by the
蛍光検出手段３０は、たとえばＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｅｉｅｒ Ｔｕｂｅｓ：光電子増倍管）からなっており、蛍光がアナログ信号として検出されるようになっている。なお、蛍光標識検体から射出された蛍光は集光レンズ２４に入射されて平行光になり、穴あきミラー２３のミラー部分により反射されてカラーフィルター３１に入射される。その後カラーフィルター３１から射出した蛍光がミラー３２を介してレンズ３３に入射され、レンズ３３により蛍光検出手段３０に集光されるようになっている。
The fluorescence detection means 30 is composed of, for example, a PMT (Photomultiplier Tubes), and the fluorescence is detected as an analog signal. The fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen enters the
データ出力手段４０は、蛍光検出手段３０から出力されるアナログ信号をデジタル信号に返還するとともに信号処理を行うことにより、検出された蛍光を蛍光画像データとして出力する機能を有している。ここで、上述のようにマイクロプレートＭＰの各スポットＷには、励起光ＦＬが矢印Ｘ方向および矢印Ｙ方向に対して走査しながら照射されていく。このとき、蛍光検出手段３０が励起光ＦＬが蛍光標識検体に照射されるたびに射出される蛍光を検出し、データ出力手段４０が複数の蛍光標識検体からそれぞれ射出される蛍光を蛍光画像データＥＤとして出力するようになっている。 The data output means 40 has a function of outputting the detected fluorescence as fluorescence image data by returning the analog signal output from the fluorescence detection means 30 to a digital signal and performing signal processing. Here, as described above, each spot W of the microplate MP is irradiated with the excitation light FL while scanning in the arrow X direction and the arrow Y direction. At this time, the fluorescence detection means 30 detects the fluorescence emitted every time the excitation light FL is irradiated to the fluorescently labeled specimen, and the data output means 40 detects the fluorescence emitted from the plurality of fluorescently labeled specimens as fluorescence image data ED. As output.
図３を参照して蛍光検出装置１０の動作例について説明する。まず、励起光照射手段２０から励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂおよび集光レンズ２４を介して、マイクロプレートＭＰのスポットＷに照射される。すると、励起光ＦＬが照射されたスポットＷに存在する蛍光標識検体から蛍光が射出する。射出した蛍光が蛍光検出手段３０により検出されてデータ出力手段４０から蛍光画像データとして出力される。このとき、レンズ移動手段２５およびプレート移動手段２６により、励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰに対して走査しながら照射されるため、マイクロプレートＭＰに存在する各スポットＷ毎にそれぞれ蛍光画像データＥＤが出力されていく。
An example of the operation of the
図４は本発明の画像補正装置の実施の形態を示すブロック図であり、図１と図４を参照して画像補正装置５０について説明する。画像補正装置５０は、マイクロプレートＭＰのスポットＷに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を主蛍光画像データＥＤ１として取得する画像取得手段５１と、画像取得手段５１により取得された主蛍光画像データＥＤ１を補正する画像補正手段６０とを有している。
FIG. 4 is a block diagram showing an embodiment of the image correction apparatus of the present invention. The
ここで、画像取得手段５１は、蛍光標識検体を分析するために用いる主蛍光画像データＥＤ１と、主蛍光画像データＥＤ１の取得とは別に、主蛍光画像データＥＤ１を取得した所定のスポットＷ上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光ＦＬを照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットＷにおける補助蛍光画像データＥＤ２とを取得する機能を有している。 Here, the image acquisition means 51 separates the main fluorescence image data ED1 used for analyzing the fluorescence-labeled specimen and the main fluorescence image data ED1 on the predetermined spot W from which the main fluorescence image data ED1 has been acquired. By irradiating the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance with the excitation light FL, the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen is detected, and the auxiliary fluorescence image data ED2 at the predetermined spot W is obtained. It has a function to acquire.
具体的には、画像取得手段５１は、図５（ａ）に示すように、マイクロプレートＭＰ上に配列された複数のスポットＷに対して励起光ＦＬを照射しながら走査したときに取得された複数の補助蛍光画像データＥＤ２と、補助蛍光画像データＥＤ２を取得したときの励起光ＦＬの走査方向とは異なる走査方向で励起光ＦＬの照射したときに取得された主蛍光画像データＥＤ１とを取得するようになっている。つまり、図５（ａ）において、励起光ＦＬがまずスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃの順番で照射されるように走査され、補助蛍光画像データＥＤ２ａ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ｃが取得される。次に、マイクロプレートＭＰが蛍光検出装置１０に対し向きを換えて装着される等することにより、スポットＷｃ、Ｗｂ、Ｗａの順番で励起光ＦＬが照射されるように走査され、補助蛍光画像データＥＤ２ｃ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ａが取得される。
Specifically, as shown in FIG. 5A, the
なお、走査方向の異なる２つの蛍光画像データＥＤ１、ＥＤ２を取得するにあたり、励起光照射手段２０による励起光の走査方向は変えずにマイクロプレートＭＰの向きをかえて２つの蛍光画像データＥＤ１、ＥＤ２を取得するようにしてもよいし、マイクロプレートＭＰの向きを変えずに励起光照射手段２０の励起光の走査方向およびマイクロプレートＭＰの移動方向を逆にすることより、２つの蛍光画像データを取得するようにしてもよい。このような励起光の走査制御は、制御コントローラ７０により行われる。
In acquiring two fluorescent image data ED1 and ED2 having different scanning directions, the two fluorescent image data ED1 and ED2 are changed by changing the direction of the microplate MP without changing the scanning direction of the excitation light by the excitation light irradiation means 20. Or by reversing the scanning direction of the excitation light of the excitation light irradiation means 20 and the moving direction of the microplate MP without changing the direction of the microplate MP. You may make it acquire. Such scanning control of excitation light is performed by the
次に、図４と図５を用いて画像補正手段６０について説明する。図４の画像補正手段６０は、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データＥＤ１を補正するものであって、画像取得手段５１により取得された所定のスポットＷにおける主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２と、主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段６１と、取得された経時変化特性を用いて主蛍光画像データＥＤ１を補正する補正手段６２とを有する。
Next, the image correction means 60 will be described with reference to FIGS. The
具体的には、変化特性取得手段６１は、図５（ａ）に示すように、複数の所定のスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃに存在する蛍光標識検体から取得した３つの補助蛍光画像データＥＤ２ａ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ｃを取得する。また、変化特性取得手段６１は、複数の所定のスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃに存在する蛍光標識検体から取得した３つの主蛍光画像データＥＤ１ａ、ＥＤ１ｂｖ、ＥＤ１ｃを取得する。そして、スポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについて、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔に蛍光の強度がどのぐらい減少したかを算出する。具体的には、補助蛍光画像データＥＤ２の蛍光強度を主蛍光画像データＥＤ１の蛍光強度で割り、蛍光強度の減少率を算出する。
Specifically, as shown in FIG. 5A, the change
このとき、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔は、各スポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なっている。図５（ａ）に示すような励起光の走査を行ったとき、一回目の励起光の照射から２回目の励起光の照射までの時間間隔はスポットＷｃが最も短く、次いでスポットＷｂ、Ｗａの順に短くなる。 At this time, the time interval from the acquisition of the main fluorescence image data ED1 to the acquisition of the auxiliary fluorescence image data ED2 is different for each of the spots Wa, Wb, and Wc. When scanning of the excitation light as shown in FIG. 5A is performed, the time interval from the first excitation light irradiation to the second excitation light irradiation is the shortest in the spot Wc, and then the spots Wb and Wa. It becomes shorter in order.
よって、図５（ｂ）に示すように、変化特性取得手段６１は、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔が異なる３つの減少率を取得することができる。そこで、変化特性取得手段６１は、３つの減少率を線で結ぶことにより、蛍光の強度が時間経過とともに小さくなる経時変化特性を算出し取得する。その後、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻から、主蛍光画像データＥＤ１に用いる減少率を図５（ｂ）の経時変化特性から検出し、主蛍光画像データＥＤ１を減少率で除することにより補正する。
Therefore, as shown in FIG. 5B, the change
これにより、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときであっても、その減少分を補正し、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。すなわち、上述のような蛍光検出システム１において、蛍光色素は励起光を照射すれば蛍光を射出するものであるため、蛍光が時間経過とともに減衰しないと考えられていた。つまり、図５（ｂ）において、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とが等しくなると考えられていた。しかし、実験において、蛍光が時間経過とともに減衰することが認められた。これは、蛍光色素と検査対象である検体とが何らかの化学反応を起こし、蛍光色素による蛍光が時間経過とともに弱くなってしまうことが原因であると考えられる。そこで、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、算出した経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データＥＤ１を用いて正確な分析を行うことができる。
Thereby, even when the fluorescence intensity decreases with time, the decrease can be corrected, and the fluorescence analysis can be performed with high accuracy and high reliability. That is, in the
さらに、１つのマイクロプレートＭＰに対して走査方向を変えて複数回励起光の照射を行い、補助蛍光画像データＥＤ２の取得から主蛍光画像データＥＤ１の取得までの時間間隔が、各スポットのスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なるようにすることにより、すべてのスポットＷに対して経時変化特性を算出する場合に比べて効率よく経時変化特性を算出することができる。 Furthermore, a single microplate MP is irradiated with excitation light a plurality of times while changing the scanning direction, and the time interval from the acquisition of the auxiliary fluorescence image data ED2 to the acquisition of the main fluorescence image data ED1 is the spot Wa of each spot. , Wb, and Wc can be made different from each other, so that the time-varying characteristics can be calculated more efficiently than when the time-varying characteristics are calculated for all the spots W.
図６は本発明の画像補正方法の好ましい実施の形態を示すフローチャートであり、図１から図６を参照して画像補正方法について説明する。まず、蛍光検出装置１０においてスポットＷに存在する蛍光標識検体に対し励起光ＦＬが照射される（ステップＳＴ１）。そして、蛍光標識検体から射出される蛍光が補助蛍光画像データＥＤ２として画像取得手段５１に取得される（ステップＳＴ２）。励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰの複数のスポットＷに対して走査しながら照射され、画像取得手段５１において複数のスポットに対応した補助蛍光画像データＥＤ２が取得される（ステップＳＴ１〜ステップＳＴ３）。
FIG. 6 is a flowchart showing a preferred embodiment of the image correction method of the present invention. The image correction method will be described with reference to FIGS. First, the
次に、励起光ＦＬがマイクロプレートＭＰに対し補助蛍光画像データＥＤ２を取得した際の走査方向とは逆向きに走査される（図５（ａ）参照）（ステップＳＴ４）。励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰの複数のスポットＷに対して走査しながら照射され、画像取得手段５１において複数のスポットに対応した主蛍光画像データＥＤ１が取得される（ステップＳＴ４〜ステップＳＴ６）。 Next, the excitation light FL is scanned in the direction opposite to the scanning direction when the auxiliary fluorescence image data ED2 is acquired with respect to the microplate MP (see FIG. 5A) (step ST4). The excitation light FL is irradiated while scanning a plurality of spots W of the microplate MP, and main fluorescence image data ED1 corresponding to the plurality of spots is acquired by the image acquisition means 51 (step ST4 to step ST6).
その後、画像補正装置５０において、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを用いて蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性が算出され（ステップＳＴ７）、この経時変化特性に基づいて主蛍光画像データＥＤ１が補正される（ステップＳＴ８）。具体的には、変化特性取得手段６１において図５（ｂ）に示すような経時変化特性が算出され、補正手段６２において経時変化特性に基づいて主蛍光画像データＥＤ１が補正される。
Thereafter, the
これにより、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときであっても、経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。 As a result, even when the fluorescence intensity decreases with time, the time-varying characteristics can be calculated, and the decrease in fluorescence intensity can be corrected based on the time-varying characteristics. Highly sensitive fluorescence analysis can be performed.
ところで、経時変化特性を算出する方法としては、上述した励起光の走査方向を変える方法の他に、主蛍光画像データとは異なる走査速度で励起光を照射したときの蛍光を示す補助蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法、同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットにおいてハイブリダイズされた蛍光標識検体の蛍光検出し、得られた複数の検査用蛍光画像データから経時変化特性を取得する方法、特異的結合物質が存在する複数の格子状に配列されたスポットにおいてハイブリダイズされた蛍光標識検体の蛍光を検出し、得られた蛍光画像データから経時変化特性を取得する方法があげられる。以下に、各方法について説明する。 By the way, as a method for calculating the temporal change characteristic, in addition to the method for changing the scanning direction of the excitation light described above, auxiliary fluorescence image data indicating fluorescence when the excitation light is irradiated at a scanning speed different from the main fluorescence image data. A method for acquiring time-varying characteristics using a fluorescence detection method, detecting fluorescence of fluorescently labeled specimens hybridized at a plurality of test spots that emit fluorescence with the same fluorescence intensity, and measuring a plurality of time-lapse values from the obtained plurality of test fluorescence image data. Method for obtaining change characteristics, detecting fluorescence of fluorescently labeled specimens hybridized at a plurality of spots arranged in a lattice form where a specific binding substance exists, and obtaining time-dependent change characteristics from the obtained fluorescence image data There are methods. Each method will be described below.
まず、走査速度の異なる２つの蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図７は主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得方法および経時変化特性の一例を示す模式図である。図７（ａ）において、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰ上の複数の蛍光標識検体に対して励起光ＦＬを照射しながら走査したときに取得された主蛍光画像データＥＤ１と、主蛍光画像データＥＤ１を取得したときの走査速度とは異なる走査速度で励起光ＦＬを照射したときに取得された補助蛍光画像データＥＤ２とを取得するようになっている。 First, a method for obtaining the temporal change characteristic using two fluorescent image data having different scanning speeds will be described. FIG. 7 is a schematic diagram illustrating an example of a method for acquiring the main fluorescence image data ED1 and the auxiliary fluorescence image data ED2, and an aging characteristic. In FIG. 7A, the image acquisition means 51 includes main fluorescence image data ED1 acquired when scanning a plurality of fluorescently labeled specimens on the microplate MP while irradiating the excitation light FL, and the main fluorescence image. The auxiliary fluorescence image data ED2 acquired when the excitation light FL is irradiated at a scanning speed different from the scanning speed when the data ED1 is acquired is acquired.
具体的には、複数の主蛍光画像データＥＤ１は、励起光ＦＬの照射時間が蛍光検出を行うのに必要な時間だけ各スポットに励起光が照射されるような主走査速度ＳＶ１で励起光ＦＬを走査しながら照射したときに取得されたものである（本スキャン）。一方、複数の補助蛍光画像データＥＤ２は、主蛍光画像データＥＤ１の取得前に行われる、主走査速度ＳＶ１よりも速い補助走査速度ＳＶ２で励起光ＦＬを走査しながら照射したときに取得されたものである（プレスキャン）。この主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて上述したように蛍光強度の減少率を算出し、経時変化特性を取得することもできる。このとき、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔は、各スポットＷのスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なっている。図７（ａ）に示すような励起光の走査を行ったとき、一回目の励起光の照射から２回目の励起光の照射までの時間間隔はスポットＷｃが最も短く、次いでスポットＷｂ、Ｗａの順に短くなる。 Specifically, the plurality of main fluorescence image data ED1 is obtained by using the excitation light FL at a main scanning speed SV1 such that the excitation light is emitted to each spot only for the time required for performing the fluorescence detection. Acquired when scanning while scanning (main scan). On the other hand, the plurality of auxiliary fluorescence image data ED2 is acquired when the excitation light FL is irradiated while being scanned at an auxiliary scanning speed SV2 higher than the main scanning speed SV1, which is performed before acquisition of the main fluorescence image data ED1. (Pre-scan). By using the main fluorescence image data ED1 and the auxiliary fluorescence image data ED2, the decrease rate of the fluorescence intensity can be calculated as described above, and the temporal change characteristic can be acquired. At this time, the time interval from the acquisition of the main fluorescence image data ED1 to the acquisition of the auxiliary fluorescence image data ED2 is different for the spots Wa, Wb and Wc of each spot W. When scanning with the excitation light as shown in FIG. 7A, the time interval from the first excitation light irradiation to the second excitation light irradiation is the shortest in the spot Wc, and then the spots Wb and Wa. It becomes shorter in order.
よって、図７（ｂ）に示すように、変化特性取得手段６１は、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔が異なる３つの減少率を取得することができる。そこで、変化特性取得手段６１は、３つの減少率を線で結ぶことにより、蛍光の強度が時間経過とともに小さくなる経時変化特性を算出し取得する。その後、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻から、主蛍光画像データＥＤ１に用いる減少率を図７（ｂ）の経時変化特性から検出し、主蛍光画像データＥＤ１を減少率で除することにより補正する。
Therefore, as shown in FIG. 7B, the change
図７に示すような方法であっても、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときに経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。さらに、蛍光検出装置１０において通常行われるプレスキャンと本スキャンを用いて蛍光標識検体の蛍光強度の減少率を算出し取得することができるため、蛍光検出装置１０に対する特別な制御が不要であり、効率よく蛍光画像データの補正を行うことができる。
Even with the method as shown in FIG. 7, it is possible to calculate the temporal change characteristic when the fluorescence intensity decreases with time, and to correct the decrease in the fluorescent intensity based on the temporal change characteristic. Highly accurate and reliable fluorescence analysis can be performed. Furthermore, since the decrease rate of the fluorescence intensity of the fluorescence-labeled specimen can be calculated and acquired using the pre-scan and the main scan that are normally performed in the
次に、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットから取得した検査用蛍光画像データＥＸＤを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図８は主蛍光画像データＥＤ１を取得するための複数のスポットと、検査用蛍光画像データＥＸＤを取得するための検査用スポットとを有するマイクロプレートＭＰの一例を示す模式図である。具体的には、図８（ａ）において、マイクロプレートＭＰには、それぞれ各検査用スポットＷａ〜Ｗｆに同一の蛍光強度で蛍光を射出するような、ハイブリダイズされた蛍光標識検体がそれぞれ存在している。図８（ａ）においては、マイクロプレートＭＰの各列にそれぞれ１つずつ検査用スポットＷａ〜Ｗｆを配置した場合について例示している。なお、検査用スポットＷａ〜Ｗｆの配置位置は、後述するように、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆに異なる時刻に励起光ＦＬが照射されるようなものであればよい。 Next, a description will be given of a method for acquiring the temporal change characteristic using the inspection fluorescence image data EXD acquired from a plurality of inspection spots that emit fluorescence with the same fluorescence intensity. FIG. 8 is a schematic diagram showing an example of a microplate MP having a plurality of spots for acquiring the main fluorescence image data ED1 and inspection spots for acquiring the inspection fluorescence image data EXD. Specifically, in FIG. 8 (a), each of the microplates MP has a hybridized fluorescently labeled specimen that emits fluorescence with the same fluorescence intensity to each of the inspection spots Wa to Wf. ing. FIG. 8A illustrates a case where inspection spots Wa to Wf are arranged one by one in each row of the microplate MP. The arrangement positions of the inspection spots Wa to Wf only need to be such that the excitation light FL is irradiated to the inspection spots Wa to Wf at different times, as will be described later.
そして、励起光照射手段２０において、検査用スポットＷａ〜Ｗｆを含むマイクロプレートＭＰの各スポットに励起光ＦＬを走査しながら照射する。すると、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆには異なる時刻に励起光ＦＬが照射されることになる。そして、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰ上の各スポットから主蛍光画像データＥＤ１を取得すると共に、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆから検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆを取得する。その後、変化特性取得手段６１は、複数の検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆが示す蛍光強度と、検査用スポットＷａ〜Ｗｆに励起光ＦＬを照射したときの時刻とにより、図８（ｂ）に示すような経時変化特性を算出する。そして、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻に合わせて、算出した減少率を用いて主蛍光画像データＥＤ１を補正することにより、時間経過とともに減少した蛍光の強度を補正する。
Then, the excitation light irradiation means 20 irradiates each spot of the microplate MP including the inspection spots Wa to Wf while scanning the excitation light FL. Then, each of the inspection spots Wa to Wf is irradiated with the excitation light FL at different times. Then, the image acquisition means 51 acquires the main fluorescence image data ED1 from each spot on the microplate MP, and acquires the inspection fluorescence image data EXDa to EXDf from each inspection spot Wa to Wf. Thereafter, the change
図８に示すような方法であっても、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときに経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。 Even with the method shown in FIG. 8, it is possible to calculate the time-varying characteristic when the fluorescence intensity decreases with time, and to correct the decrease in the fluorescence intensity based on the time-varying characteristic. Highly accurate and reliable fluorescence analysis can be performed.
次に、同一の特異的結合物質とハイブリダイズされた複数の蛍光標識検体から射出された主蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図９は同一の特異的結合物質とハイブリダイズされた複数の蛍光標識検体を格子状に配列したマイクロプレートＭＰの一例を示す模式図である。 Next, a method for acquiring time-varying characteristics using main fluorescence image data emitted from a plurality of fluorescently labeled specimens hybridized with the same specific binding substance will be described. FIG. 9 is a schematic diagram showing an example of a microplate MP in which a plurality of fluorescently labeled specimens hybridized with the same specific binding substance are arranged in a lattice pattern.
図９（ａ）において、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰを励起光により列方向（矢印Ｙ１方向）に走査しながら行方向（矢印Ｘ１方向）に移動させたときの複数の主蛍光画像データＥＤ１を取得するようになっている。そして、変化特性取得手段６１は、図９（ｂ）のように、励起光の走査方向に並んだ複数のスポット列Ｗ３１〜Ｗ３６から射出された複数の主蛍光画像データＥＤ１の平均値と、励起光ＦＬを走査したときの時刻とに基づいて経時変化特性を算出し取得する。そして、補正手段６２は、算出した経時変化特性と、各蛍光標識検体に励起光を照射した時刻とを用いて、取得した主蛍光画像データＥＤ１を補正するようになっている。
In FIG. 9A, the image acquisition means 51 has a plurality of main fluorescence image data when the microplate MP is moved in the row direction (arrow X1 direction) while scanning in the column direction (arrow Y1 direction) with excitation light. ED1 is acquired. Then, as shown in FIG. 9B, the change
このように、経時変化特性を算出する際に、実際の画像取得対象である主蛍光画像データＥＤ１を用いることにより、効率よく経時変化特性を算出し画像の補正を行うことができる。 As described above, when calculating the temporal change characteristic, by using the main fluorescence image data ED1 that is an actual image acquisition target, the temporal change characteristic can be efficiently calculated and the image can be corrected.
なお、図９の方法においては、測定対象から得られた主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を求めるようにしている。つまり、経時変化特性を考慮しなければスポット列の主蛍光画像データＥＤ１の平均値は各スポット列同士において略同一となる、という前提の下で経時変化特性を算出している。 In the method of FIG. 9, the temporal change characteristic is obtained using the main fluorescence image data ED1 obtained from the measurement object. That is, the temporal change characteristic is calculated on the assumption that the average value of the main fluorescent image data ED1 of the spot rows is substantially the same in each spot row if the temporal change property is not considered.
つまり、一般的にマイクロプレート（ＤＮＡチップ）には各スポットにＤＮＡはランダムに配置されている。一方、マイクロプレート（ＤＮＡチップ）には数万ものスポットが設けられており、１つの列のスポット数は１００個以上存在することになる。なお、蛍光検出装置１０の検出レベルも０ｄｉｇｉｔ〜６５５３５ｄｉｇｉｔという有限な整数である。ランダムにＤＮＡが配列された数万ものスポットという有限母集団から、数百個のスポットを含むスポット列毎に標本化しその平均値を取った場合、各スポット列同士の平均は統計学的に略同一になる。したがって、主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を効率的に算出することができる。
That is, in general, DNA is randomly arranged at each spot on a microplate (DNA chip). On the other hand, tens of thousands of spots are provided on the microplate (DNA chip), and there are 100 or more spots in one row. Note that the detection level of the
上記各実施の形態によれば、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに小さくなるときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データＥＤ１を補正することにより、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、この経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データＥＤ１を用いて正確な分析を行うことができる。 According to each of the embodiments described above, by correcting the main fluorescence image data ED1 based on the time-varying characteristics when the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen decreases with time, the fluorescence increases with time. Even when detecting fluorescence of a fluorescently labeled specimen having a decreasing characteristic, correction can be made based on this time-varying characteristic, so that accurate analysis can be performed using the main fluorescent image data ED1. it can.
なお、画像取得手段５１が、主蛍光画像データＥＤ１の取得とは別に、主蛍光画像データＥＤ１を取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光ＦＬを照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２を取得するものであり、画像補正手段６０が、画像取得手段５１により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２と、主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段６１を有する構成にすれば、主蛍光画像データＥＤ１の取得する際に補助蛍光画像データＥＤ２を取得し、主蛍光画像データＥＤ１を補助蛍光画像データＥＤ２とを用いて経時変化特性を算出することにより、効率的に経時変化特性を算出し取得することができる。
In addition to the acquisition of the main fluorescence image data ED1, the image acquisition means 51 excites the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance existing on the predetermined spot from which the main fluorescence image data ED1 was acquired. By irradiating the light FL, the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen is detected and the auxiliary fluorescence image data ED2 at a predetermined spot is acquired. The
また、図５に示すように、所定のスポットが複数のスポットＷａ〜Ｗｃであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２が、所定のスポットにおける主蛍光画像データＥＤ１を取得する際の励起光のマイクロプレートＭＰに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットＷａ〜Ｗｃから取得した主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて主蛍光画像データＥＤ１が取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。 Further, as shown in FIG. 5, the predetermined spot is a plurality of spots Wa to Wc, and the auxiliary fluorescent image data ED2 at the predetermined spot is the excitation light when the main fluorescent image data ED1 at the predetermined spot is acquired. If the fluorescence image data is obtained by scanning the excitation light in a direction different from the scanning direction with respect to the microplate MP, the time interval when the main fluorescence image data ED1 and the auxiliary fluorescence image data ED2 are obtained is different for each spot. In order to calculate the time-varying characteristics peculiar to the fluorescence-labeled specimen from which the main fluorescence image data ED1 is obtained using the main fluorescence image data ED1 and the auxiliary fluorescence image data ED2 obtained from a plurality of predetermined spots Wa to Wc. Calculate the time course characteristics for all spots where the same type of fluorescently labeled specimen is hybridized. Becomes unnecessary, it is possible to efficiently calculate the aging characteristics.
さらに、図７に示すように、所定のスポットが複数のスポットＷａ〜Ｗｃであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２が、所定のスポットＷａ〜Ｗｃにおける主蛍光画像データＥＤ１を取得する際の励起光のマイクロプレートＭＰに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートＭＰを励起光ＦＬで走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを取得したときの時間間隔が各スポットＷａ〜Ｗｃ毎に異なるようにし、所定の複数のスポットＷａ〜Ｗｃから取得した主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて主蛍光画像データＥＤ１が取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。 Further, as shown in FIG. 7, the predetermined spot is a plurality of spots Wa to Wc, and the auxiliary fluorescent image data ED2 at the predetermined spot is used when acquiring the main fluorescent image data ED1 at the predetermined spots Wa to Wc. If fluorescence image data acquired by scanning the microplate MP with the excitation light FL at a speed different from the scanning speed of the excitation light with respect to the microplate MP, the main fluorescence image data ED1 and the auxiliary fluorescence image data ED2 are acquired. In which the main fluorescent image data ED1 is acquired using the main fluorescent image data ED1 and the auxiliary fluorescent image data ED2 acquired from a plurality of predetermined spots Wa to Wc. The same type of fluorescently labeled sample is hybridized in order to calculate the time-varying characteristics unique to the labeled sample. It becomes unnecessary to calculate the temporal change characteristics for each of all spots can be efficiently calculated aging characteristics.
また、図８に示すように、画像取得手段５１が、複数の検査用スポットＷａ〜Ｗｆにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し各検査スポット毎Ｗａ〜Ｗｆに異なる時刻に励起光を照射することにより、検査用スポットＷａ〜Ｗｆの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して各検査用スポットＷａ〜Ｗｆ毎の検査用蛍光画像データＥＸＤを取得するものであり、画像補正手段６０が、画像取得手段５１において取得された各検査用スポットＷａ〜Ｗｆ毎の複数の検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆと、検査用蛍光画像データＥＸＤの取得の際の検査用スポットＷａ〜Ｗｆ間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットＷａ〜Ｗｆに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段６１を有することにより、主蛍光画像データＥＤ１の取得とともに検査用蛍光画像データＥＸＤを取得して経時変化特性を算出するため、効率的に経時変化特性を算出することができる。
Further, as shown in FIG. 8, the image acquisition means 51 irradiates the fluorescently labeled specimens hybridized in the plurality of test spots Wa to Wf with excitation light at different times for each test spot Wa to Wf. Thus, the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimens of the inspection spots Wa to Wf is detected to obtain the inspection fluorescent image data EXD for each of the inspection spots Wa to Wf. Excitation between the plurality of inspection fluorescent image data EXDa to EXDf for each inspection spot Wa to Wf acquired by the image acquisition means 51 and the inspection spots Wa to Wf when acquiring the inspection fluorescent image data EXD Based on the time interval of light irradiation, a change characteristic for acquiring a time-dependent change characteristic specific to the fluorescently labeled specimen existing in the inspection spots Wa to Wf. By having an
さらに、図９に示すように、マイクロプレートＭＰが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するときに、画像取得手段５１が、同数の特異的結合物質が存在する複数のスポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートＭＰを励起光ＦＬにより列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポット毎の蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データＥＤ１を取得するものであり、画像補正手段６０が、各スポット列Ｗ３１〜Ｗ３６毎の蛍光画像データＥＤ１の平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を算出することができるため、効率的に蛍光画像データの補正を行うことができる。 Furthermore, as shown in FIG. 9, when the microplate MP has a plurality of spots arranged in a grid along the row and column directions, the image acquisition means 51 has the same number of specific binding substances. By moving the microplate MP in the row direction while scanning in the column direction with the excitation light FL, the fluorescently labeled samples respectively hybridized in the plurality of spots are emitted from the fluorescently labeled samples for each spot. A plurality of main fluorescence image data ED1 is acquired by detecting fluorescence, and the image correction means 60 is adapted to irradiate excitation light between the average value of the fluorescence image data ED1 for each of the spot rows W31 to W36 and between the spot rows. The main fluorescence image data ED1 can be obtained by providing a change characteristic acquisition means for acquiring a change characteristic with time based on the time interval of It is possible to calculate the temporal change characteristics have, it is possible to perform efficiently the fluorescence image data correction.
１ 蛍光検出システム
１０ 蛍光検出装置
２０ 励起光照射手段
２１ 励起光源
３０ 蛍光検出手段
５０ 画像補正装置
５１ 画像取得手段
６０ 画像補正手段
６１ 変化特性取得手段
６２ 補正手段
ＥＤ１ 主蛍光画像データ
ＥＤ２ 補助蛍光画像データ
ＥＸＤ 検査用蛍光画像データ
ＦＬ 励起光
ＭＰ マイクロプレート
Ｗ スポット
DESCRIPTION OF
Claims (7)
取得した前記所定のスポットにおける前記主蛍光画像データおよび前記補助蛍光画像データと、該主蛍光画像データおよび該補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性を算出し、該経時変化特性に基づいて前記主蛍光画像データを補正する
ことを特徴とする蛍光画像補正方法。 Main fluorescence image data obtained by detecting fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen by irradiating the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance present in the spot of the microplate with excitation light; and Irradiating excitation light to the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance existing on the predetermined spot from which the main fluorescence image data was acquired separately from the acquisition of the main fluorescence image data Detecting fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen to obtain auxiliary fluorescence image data at the predetermined spot;
Based on the acquired main fluorescent image data and auxiliary fluorescent image data at the acquired predetermined spot, and the time interval of excitation light irradiation when acquiring the main fluorescent image data and the auxiliary fluorescent image data, the fluorescent label A fluorescence image correction method, comprising : calculating a temporal change characteristic when the intensity of the fluorescence emitted from the specimen decreases with time, and correcting the main fluorescent image data based on the temporal change characteristic.
該画像取得手段により取得された前記主蛍光画像データを補正する画像補正手段とを有し、
該画像補正手段が、前記画像取得手段により取得された前記所定のスポットにおける前記主蛍光画像データおよび前記補助蛍光画像データと、該主蛍光画像データおよび該補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性を算出し、該経時変化特性に基づいて前記主蛍光画像データを補正するものであることを特徴とする蛍光画像補正装置。 Present in microplates spot, by irradiating the excitation light to the specific binding substance and hybridized fluorescently labeled analyte, wherein the fluorescent labeled analytes main fluorescent image data that has detected the emitted fluorescence from the main By irradiating the fluorescence-labeled specimen hybridized with the specific binding substance existing on the predetermined spot from which the main fluorescence image data was acquired separately from the acquisition of the fluorescence image data, Image acquisition means for detecting fluorescence emitted from the labeled specimen and acquiring auxiliary fluorescence image data at the predetermined spot;
Image correction means for correcting the main fluorescence image data acquired by the image acquisition means,
The image correction means includes the main fluorescence image data and the auxiliary fluorescence image data at the predetermined spot acquired by the image acquisition means, and excitation light used when acquiring the main fluorescence image data and the auxiliary fluorescence image data. Based on the time interval of irradiation, a temporal change characteristic is calculated when the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen decreases with time, and the main fluorescent image data is corrected based on the temporal change characteristic A fluorescent image correction apparatus characterized by comprising:
該所定のスポットにおける前記補助蛍光画像データが、該所定のスポットにおける前記主蛍光画像データを取得する際の前記励起光の前記マイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に前記励起光を走査して取得した前記蛍光画像データであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。 The predetermined spot is a plurality of spots;
The auxiliary fluorescent image data at the predetermined spot is acquired by scanning the excitation light in a direction different from the scanning direction of the excitation light with respect to the microplate when acquiring the main fluorescent image data at the predetermined spot. The fluorescence image correction apparatus according to claim 2 , wherein the fluorescence image data is obtained.
該所定のスポットにおける前記補助蛍光画像データが、該所定のスポットにおける前記主蛍光画像データを取得する際の前記励起光の前記マイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度で前記マイクロプレートを前記励起光で走査して取得した前記蛍光画像データであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。 The predetermined spot is a plurality of spots;
The auxiliary fluorescent image data at the predetermined spot is used to drive the microplate with the excitation light at a speed different from the scanning speed of the excitation light with respect to the microplate when acquiring the main fluorescent image data at the predetermined spot The fluorescence image correction apparatus according to claim 2 , wherein the fluorescence image data is acquired by scanning.
前記画像取得手段が、前記主蛍光画像データを取得するとともに、前記検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して複数の検査用蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の前記複数の検査用蛍光画像データと、該検査用蛍光画像データの取得の際の前記検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記検査用スポットに存在する前記蛍光標識検体固有の前記経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。 A plurality of examinations in which the microplate emits fluorescence at the same fluorescence intensity, wherein there are a plurality of spots from which the main fluorescence image data is acquired and the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance. Have a spot for
The image acquisition means acquires the main fluorescence image data and irradiates excitation light to the fluorescently labeled specimens that are respectively hybridized at the inspection spots, thereby obtaining fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimens. Detect and acquire a plurality of fluorescent image data for examination,
Excitation light irradiation between the plurality of inspection fluorescent image data for each inspection spot acquired by the image acquisition unit and the inspection spot at the time of acquisition of the inspection fluorescent image data. 3. The fluorescence image according to claim 2, further comprising a change characteristic acquisition unit that acquires the time-dependent change characteristic unique to the fluorescently labeled specimen existing in the test spot based on the time interval of Correction device.
前記画像取得手段が、前記各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し、前記マイクロプレートを前記励起光により前記列方向に走査しながら前記行方向に移動させることにより、前記各スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の前記主蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記各スポット列毎の前記主蛍光画像データの平均値と、前記各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。 The microplate has the plurality of spots arranged in a grid along the row direction and the column direction,
The image acquisition means moves the microplate in the row direction while scanning the microplate in the column direction with the excitation light with respect to the fluorescence-labeled specimens that are respectively hybridized in the spots. A plurality of the main fluorescence image data is obtained by detecting fluorescence emitted from each fluorescently labeled specimen,
The characteristic correction means for acquiring the time-varying characteristic based on the average value of the main fluorescence image data for each spot row and the time interval of excitation light irradiation between the spot rows. The fluorescence image correction apparatus according to claim 2, wherein
マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、前記蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して取得した主蛍光画像データと、該主蛍光画像データの取得とは別に該主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、前記特異的結合物質とハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して前記所定のスポットにおける補助蛍光画像データとを取得し、
取得した前記所定のスポットにおける前記主蛍光画像データおよび前記補助蛍光画像データと、該主蛍光画像データおよび該補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性を算出し、該経時変化特性に基づいて前記主蛍光画像データを補正する
ことを実行させるための蛍光画像補正プログラム。 On the computer,
Main fluorescence image data obtained by detecting fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen by irradiating the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance present in the spot of the microplate with excitation light; and Irradiating excitation light to the fluorescently labeled specimen hybridized with the specific binding substance existing on the predetermined spot from which the main fluorescence image data was acquired separately from the acquisition of the main fluorescence image data Detecting fluorescence emitted from the fluorescently labeled specimen to obtain auxiliary fluorescence image data at the predetermined spot;
Based on the acquired main fluorescent image data and auxiliary fluorescent image data at the acquired predetermined spot, and the time interval of excitation light irradiation when acquiring the main fluorescent image data and the auxiliary fluorescent image data, the fluorescent label A fluorescence image correction program for calculating a temporal change characteristic when the intensity of the fluorescence emitted from the specimen decreases with time and correcting the main fluorescent image data based on the temporal change characteristic.
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