JP4314232B2 - 生化学的アッセイ - Google Patents

Description

本発明は、生化学サンプル中の少なくとも1種の標的分析物、特に血液サンプル中の、糖化および全ヘモグロビンを決定するための、生化学的アッセイおよび方法に関する。また本発明は、そのような生化学的アッセイに基づく分析試験要素にも関する。

ヘモグロビンの糖化は、糖尿病患者の血液中で増大する。この増大は、赤血球膜を自由に通過するグルコースの濃度と、非酵素反応を介したグルコースとのタンパク質のインキュベーション時間に依存する。このため、糖化ヘモグロビン(すなわちHbAlc)の決定によって、平均グルコース濃度、したがって糖尿病患者の代謝制御の質を、遡及的に評価することが可能になる。血液からのHbAlcの消失は、赤血球の寿命に依存する(これらの細胞の平均寿命は約120日であり、半減期は60日である)。HbAlcは、β鎖のN末端バリン残基上での緩慢な、しかし不可逆的な反応により、グルコースによって糖化されたヘモグロビンAであると定義される。HbAlc値は、通常、全ヘモグロビンのパーセンテージで表されるが、これは、HbAlc含量の他に、同じ血液サンプルからヘモグロビン濃度を決定する必要があるものである。

これに関係して、簡単な取扱いおよび迅速な決定を行うために、試験要素を使用することがすでに知られている。試験要素は、一般に、実験室環境に依存しない、直接分析用の、サンプル調製が可能な担体結合(マイクロ)システムとして理解される。そのような試験要素は、通常、患者の近くで行う診断用の、使い切りの物品または使い捨ての物品とされ、すなわち試験を実施するのに必要な全ての試薬が担体または成分上に提供され、その結果、特殊な取扱いをせずにそれらの試薬を使用することができるようになるものである。

これに関連して、米国特許第6,399,293B1号は、サンプル適用ゾーンと、非固定化シグナル生成分子を含有する試薬ゾーンと、糖化ヘモグロビンに結合していない過剰なシグナル生成分子を分離するための分離ゾーンと、検出ゾーンと含む、試験ストリップベースのシステムを開示している。分離は、過剰な、負に帯電したシグナル生成リガンドのみを分離ゾーンに結合させる、正に帯電した膜を用いて行う。標識されたHbAlcを含む全ヘモグロビンは、膜に結合しなくなり、したがって、サンプル液中の異なるゾーンを通して輸送することができる。

より一般には、種々の結合アッセイ用の試験要素を使用することが、周知である。例えば、米国特許第4,094,647号は、毛管作用によって溶液を輸送することが可能な材料を含む装置について述べている。ストリップ上の種々のゾーンは、分析物がこれらのゾーンを通して輸送されるときに、結合アッセイを行うこと、および検出可能なシグナルを生成することが必要とされる試薬を含有している。結合反応は、抗原と相補的抗体との間で生ずる。この方法の多くの変形例が、わかっている。しかし、この分野での全ての取組みにかかわらず、方法は、常に同じ方向で開発されており、すなわち試薬と化学的作用の一体化により多くの努力とコストを必要とする、若干の固定化された試薬の使用、たいていは抗体の使用を含み、かつ/または、反応および検出条件に適合させるよう空間および時間を介して分析物をいくつかの段階に通すことが一般に必要とされる、クロマトグラフィ実験操作を含んだ方向で開発されてきた。
米国特許第6,399,293B1号 米国特許第4,094,647号

本発明の目的は、従来技術のほとんどの制約を克服することであり、詳細には、アッセイの複雑さを低減すること、必要なサンプル量を最小限に抑えること、より少ない試薬を使用することであり、特に、固定化および免疫化学作用を回避すると同時に、容易な取扱いで試験の精度および再現性を維持することである。

独立クレームに列挙された特徴の組合せは、これらの利点を実現することを提示する。

本発明の、好ましい実施形態およびさらなる展開は、従属クレームから得られる。

本発明は、適用、反応、および検出を、固体支持体または基材の1つのスポットで重ね合わせるという概念に基づく。これに応じて、
-流体サンプル中に含有される、少なくとも標的分析物および最終的にはその他の化学種を、非特異的に結合することが可能な基材と、
-サンプルを適用するための、基材上にある試験ゾーンと、
-分析物を標識するための、試験ゾーン内に提供された非固定化接合試薬であって、分析物に特異的に結合することが可能であるが基材には結合しないままである接合試薬と、
-試験ゾーンを通して洗浄液を輸送し、過剰な非結合接合試薬を試験ゾーンから洗い落とすための流路と
を含み、
-試験ゾーンが、標識された分析物を検出するための検出領域でもある、
生化学的アッセイが提示される。

これによって、いくつかの利点が実現される。サンプルの適用、反応、および検出は、全く同一のスポットまたはゾーン内で行う。したがって、必ずしも分析物を輸送する必要がなく、すなわちこれは、より高い再現性が期待できることを意味する。反応およびサンプルの体積を最小限に抑え、ストリップの長さを最小限に抑え、かつ洗浄する体積を低下させた状態で、コンパクトな設計を実現することができる。取扱いは容易になり、手の込んだ分離ステップは必要としない。

好ましい実施形態では、一体化された貯留部に洗浄液が入っており、この貯留部は、流路と流体接続することができる。別の改善例によれば、貯留部は、この貯留部の壁面を破裂させる要素によって、流路と接続可能である。

自己制御された輸送の場合、流路は、毛管力によって洗浄液を輸送することが可能な多孔質または毛管構造であることが有利である。

あるいは、サンプルの適用を行うために、微小流体システムを提供することにより、サンプル流体を試験ゾーンに輸送することができる。

吸着要素は、液状廃棄物を吸収するために、試験ゾーンの下流の流路上に配列することが有利である。

さらに、基材が固相クロマトグラフィ層である場合が有利である。分析物は、典型的な場合にタンパク質であり、接合試薬は、タンパク質に比べて比較的小さく、かつタンパク質以外の分子である。

そのような接合分子は、シグナル伝達部分としてのいくらか極性の有機基と、リガンド部分としての小さい有機または無機基とからなり、例えばボロン酸やキレート基、ペプチドエピトープ、またはオリゴヌクレオチドなどの標的分析物を認識しかつそこに特異的に結合するものである。

接合試薬は、基材に比べ、洗浄液に対して高い分配係数を有するべきである。接合体の化学構造に応じて、洗浄液は、有機溶媒、水と混和性有機溶媒との混合物、または単なる水溶液にすることができ、界面活性剤を含有することができ、最適なpHで緩衝することができ、したがって分析物は基材に固着するが、このとき接合体の結合反応は依然として生じたままであり、過剰な非結合試薬を除去することができる。

有利な実施形態で、接合試薬は、サンプル適用前に、乾燥形態で試験ゾーンに提供される。

また本発明は、本発明による生化学的アッセイのための、分析用使い捨て試験要素と、分析用試験要素を処理するための装置とからなる実施形態にも関する。

この方法に関し、上述の目的は、生化学サンプル中の少なくとも1種の標的分析物を決定する方法であって、以下のステップ、すなわち
-サンプル中に含有される、少なくとも標的分析物、および最終的にはその他の構成成分を結合させることが可能な基材を提供するステップと、
-分析物を標識するために、試験ゾーン内に非固定化接合試薬を提供するステップであって、前記接合試薬が、分析物に特異的に結合することが可能であるが基材には結合しないままであるステップと、
-サンプルを、基材の有限な試験ゾーンに適用するステップと、
-試験ゾーンを通して洗浄液を輸送し、過剰な非結合接合試薬を試験ゾーンから洗い落とすステップと、
-試験ゾーン内の、標識された分析物を、検出するステップと
を含むプロセスによって達成される。

特定の好ましいアッセイでは、サンプルとして血液を使用する。標的分析物はヘモグロビンであり、特に糖化ヘモグロビンである。血液は、適切な基材内に、好ましくは乾燥形態でも存在する溶血試薬によって溶血し、この基材表面に、全ヘモグロビンが吸着される。サンプル適用ゾーン内にも乾燥形態で存在する接合試薬は、サンプルによって可溶化し、糖化ヘモグロビンに結合する。次いで過剰な非結合接合試薬を、横方向に流れる洗浄液によって、運び去る。全ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを、異なるそれぞれの波長で測光検出し、したがって糖化ヘモグロビンと全ヘモグロビンとの比を決定することができる。

本発明を、図面に概略的に示す実施形態に基づき、以下でより詳細に明らかにする。

図1に示す測定装置10では、1回だけの試験において、血液サンプルの全ヘモグロビンおよびHbAlcの値を決定するために、使い捨てストリップ形状試験要素12を処理することが可能になる。図2にさらに示すように、試験要素12は、本質的に、担体14と、内部に試験ゾーン18が形成されている基材16と、洗浄液22が入っている貯留部20と、試験ゾーンを通して洗浄液を輸送するための流路24とを含む。

担体14は、プラスチックまたは金属箔製の、細長くて薄いストリップとして形成され、その中央部分には、TLCプレートに類似したクロマトグラフィ材料の薄層が、基材16としての層状に重ねられている。基材16は、ストリップ14の長軸に本質的に平行な流路24として働く、微孔質構造26を有する。

貯留部20は、一体化した棘30で破裂させまたは穿刺することができる底壁28を有する変形性ブリスタであり、その結果、洗浄液22が、生成された穴から外へ出て、軟質圧縮性U字フレーム34で縁取られた軟質圧縮性吸着材料32へと押しやられるようになる。機械的な作動は、ブリスタを穿刺するための押圧ブロック36と、液体22を押し出す押圧シリンダ38とによって実現することができる。

吸着材料32は、微孔質構造26への液体移動が可能になるように、基材16の上流端に重ねられている。吸着要素40は、液状廃棄物を吸収するために、試験ゾーン18の下流に配列されている。

図2に単に概略的に示すように、これまで述べてきた線形液体輸送システムは、より複雑な微小流体システムの一部と考えられる。直接的なサンプルスポッティングの代わりに、サンプル流体は、処理前に、チャネル42を介して側面から試験ゾーンに到達することもできる。例えば、血液の溶血と、最終的には接合体との結合反応も、吸着および試験ゾーン18とは異なるゾーンで行うことができる。この場合、過剰なサンプルが試験ゾーン18の外側に拡がらないように、好ましくは注意を払うべきである。微小流体の流れの制御は、好ましくは所与の量を所与の位置に送達するために使用すべきである。

光度測定を実施するため、試験要素12の試験ゾーン18に対応させて、検出器42を装置10内に位置付ける。精密な位置合せを行うため、装置10のハウジング44は、試験要素12を内外に滑らせることが可能な案内路46を有することができる。

一実施例では、試験を行うため、分析がなされるサンプル体積(μl)の小さい血液サンプルを、試験ゾーン18に送達する。新鮮な毛細管血または全血を使用することができる。赤血球からのヘモグロビンの放出は、基材に染み込んだ溶血試薬の動作によって、行われる。

このように利用し易くなった糖化ヘモグロビンは、試験ゾーン18内に存在する非固定化接合試薬との反応によって、選択的に標識することができる。接合体は、最大吸光度が波長>600nmにある有機色素に連結された、フェニルボロン酸からなる。これは、糖化ヘモグロビン糖残基に選択的に結合し、したがって検出可能になりかつ識別可能になる。反応が定量的であることを確実にするために、期待される量の糖化ヘモグロビンに比べて過剰な接合体を使用する。したがって、糖化ヘモグロビンに結合していない過剰な、または少量の接合試薬は、試験ゾーン18から、サンプルを適用した後に分離することが重要である。

本発明による分離メカニズムは、単純な吸着によって、試験ゾーン18内に分析物を固定化するのに対し、洗浄液22の助けを借りて、非結合接合体を除去するという原理に基づく。これを可能にするには、分析物と接合体とが異なる化学種に属しなければならない。分析物がタンパク質である場合、接合体は、タンパク質以外の何かでなければならない。これは、多かれ少なかれ極性を持つ比較的小さい有機分子であることが、むしろ好ましい。

上述のように、非糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンおよびボロン酸-色素接合体の複合体とは、特定の洗浄条件下でTLC基材にしっかりと付着するが、過剰な非結合接合体は、移動洗浄相によって運び去られる。

最適な分離作用をもたらすには、接合体が、基材16に比べ、洗浄液22に対して高分配係数を有することが重要である。pH値には、特別な注意を払わなくてはならない。これは、一方では標的分析物と接合体との間の反応に影響を及ぼすのに対し、他方では、どのくらい強力に分析物が基材に吸着されるのか、また、遊離した接合体の、移動相に対する親和性を決定することができる。

サンプル適用後の所与の時間で、メカニズム36、38を用いることにより、洗浄流体の流れを動かすことができ、その結果、液体が、吸着材料32および微孔質構造26へと輸送され、試験ゾーン18を通過して、過剰な接合体を吸収し、最終的には廃棄物40になる。

一実施例(図3)では、市販の酸化アルミニウムTLCプレートを基材として使用し、極性の低い有機色素にフェニルボロン酸を連結させたもの(約650nmで最大吸光度、約670nmで発光)を、接合試薬(MW<700ダルトン)として使用し、pHが好ましくは≧7であり、最も好ましくは≧9であり、約1%の臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム(TTAB)を含有するリン酸緩衝液/EDTAを、移動相として使用した。TTABは、溶血試薬としても使用した。

中央のHbAlc試験(10%糖化ヘモグロビンおよび非固定化接合体を含有する血液サンプル)と並行して、2種の対照についても実験を行った。すなわち左側が、接合体のない血液サンプルであり、右側が、血液のない接合体である。図3aの2つの画像は、検出器としてCCDカメラを使用し、かつ光源用の一組のフィルタおよびカメラの対物レンズを使用することにより、異なる波長で、すなわち540nmと665nmで得たものである。図3bで、分離長d全体にわたる相対吸光度aを示す3種の吸光度グラフは、同じ順序で並べられた3種のスポット済みサンプルを指し、実線が540nmを、また破線が665nmをそれぞれ表している。これから、接合体を持ち、または接合体を持たない全ヘモグロビンは(540nmで吸収)、基材に強力に吸着されるが、非固定化および非結合接合体(665nmで検出される)は、これらの洗浄条件下、適用スポットから運び去られることが明らかである。接合体と糖化ヘモグロビンとの間の反応が生ずる場合のみ(真中のスポット)、存在するHbAlcのパーセンテージに比例する665nmでの吸光度を、適用ゾーンで検出することができる。

原則として、既知の方法、すなわち吸光度、反射、または蛍光は、試験ゾーン18内に残留するヘモグロビンが決定されるように実施することができる。本発明による方法では、全ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを共に検出しなければならない。ボロン酸接合体は、ヘモグロビンの吸収する範囲外の波長に、吸収極大を有するという事実が利用される。次いで糖化ヘモグロビンと全ヘモグロビンとの比は、異なる波長で、例えば540nm(ヘモグロビンの総量に関し)と665nm(ボロン酸を介して糖化ヘモグロビンに結合する色素に関して)の波長で、試験ゾーン18の反射率を測定することにより、決定することができる。

問題となっている分析物を付着させつつ、特定の洗浄条件下、過剰な非結合状態の非固定化接合試薬を反応/検出領域から除去するメカニズムは、分析物がタンパク質であり、好ましくは豊富なタンパク質であり、標識されたリガンドが、抗体以外の何かである非タンパク質である、ほとんどのアッセイに一般化することができる。これはむしろ、多かれ少なかれ極性を持った比較的小さい有機分子、または小ペプチドエピトープ、またはさらに、核酸結合タンパク質に対するオリゴヌクレオチドであることが好ましい。基材は、静電的なまたは親水性の相互作用、水素結合、疎水性相互作用、またはこれらの組合せによって、タンパク質分析物をしっかりと吸着することができるように、酸化アルミニウム以外、例えばシリカや逆相またはその他のクロマトグラフィ材料にすることができる。移動相は、分析物が固相に付着するが反応は依然として生ずるようなpHを持つ、緩衝液でよい。これは、TTAB以外の洗浄剤を、任意の最適な濃度で含有することができる。それは、酸または塩基を含有することができる。それは、有機溶媒を含有することができ、または混和性有機溶媒と水との単純混合物でよい。直接に較正するために、既知の濃度の予めスポッティングしたサンプルも、同じ試験片上に存在させることができる。この全てを考慮する場合、この方法を使用することにより、血液や尿、乳などの生物流体において、あるいはヒト組織または細菌を含むその他の生物体の細胞抽出物において、特異的に安定なリガンドがわかっていれば必ず、またそれ自体が自己シグナル伝達しないときにはシグナル生成分子で誘導体化できれば必ず、抗体およびリガンド結合タンパク質の存在および量を決定することができる。

最終的には、異なる分析物を、同じスポット上で同時に標的とすることができるように、または内部較正標準物質を導入するために、異なるリガンドに対して異なるシグナルを使用することも可能である。より良好な感度にするには、蛍光検出が最適な方法と考えられる。この方法によって実施することができるアッセイの、より具体的な例には、異なる種類のリガンド結合タンパク質が含まれる。免疫グロブリンの他に、DNAおよびRNA結合タンパク質、脂質結合タンパク質(例えばβ-ラクトグロブリン、血清レチノール結合タンパク質、尿α2-グロブリン、脂肪酸結合タンパク質)、レクチン、血清アルブミン、フェロモン結合タンパク質、臭気結合タンパク質、免疫抑制剤結合タンパク質を挙げることができる。

生化学的アッセイのための試験要素を含む測定装置を、縦断面で示す図である。 試験要素を平面で示す図である。 図3aは、標準フォーマットのTLCプレート上で実施された、好ましいアッセイの試験結果を示す図である。 図3bは、標準フォーマットのTLCプレート上で実施された、好ましいアッセイの試験結果を示す図である。

Claims (15)

1. a)生体サンプル中に含有される、少なくとも標的分析物を結合することが可能な基材(16)と、
   b)サンプルを適用するための、基材(16)上の試験ゾーン(18)と、
   c)分析物を標識するための、試験ゾーン(18)内に提供された非固定化接合試薬であって、分析物に特異的に結合することが可能であるが基材(16)には結合しないままである接合試薬と、
   d) 洗浄液(22)を、試験ゾーン(18)を通過させて輸送し、過剰な非結合接合試薬を試験ゾーン(18)から洗い落とすための流路(24)と
   を含み、
   e)試験ゾーン(18)が、標識された分析物を検出するための検出領域でもある、
   生化学的アッセイ用器具。
2. 貯留部(20)には、前記洗浄液(22)が入っており、該貯留部(20)は、前記流路(24)に流体接続できることを特徴とする、請求項1に記載の生化学的アッセイ用器具。
3. 前記流路(24)が、前記洗浄液(22)を毛管輸送するための、基材(16)の多孔質または毛管構造(26)であることを特徴とする、請求項1または2に記載の生化学的アッセイ用器具。
4. 前記基材(16)が、ポリマーまたは金属支持体(14)上の固相クロマトグラフィ層であることを特徴とする、請求項1から3の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
5. 前記基材(16)が、酸化アルミニウムまたはシリカまたは逆相材料からなることを特徴とする、請求項1から4の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
6. 前記分析物がタンパク質であることを特徴とする、請求項1から5の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
7. 前記接合試薬が、標識された有機または無機分子、またはペプチドエピトープ、またはオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項1から6の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
8. 前記接合試薬がボロン酸色素を含有することを特徴とする、請求項1から7の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
9. 前記サンプルが、血液であり、分析物がヘモグロビンであることを特徴とする、請求項1から8の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
10. 前記基材(16)に、溶血剤を含浸させることを特徴とする、請求項1から9の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
11. 前記洗浄液(22)が、前記分析物が前記基材(16)に付着しかつ前記接合試薬の結合反応が生ずるpHを有する緩衝液であることを特徴とする、請求項1から10の一項に記載の生化学的アッセイ用器具。
12. 血液サンプル中の糖化ヘモグロビンと全ヘモグロビンとの比を決定するための、分析試験要素であって、
    a)血液サンプル中に含有される、少なくともヘモグロビンを結合させることが可能な基材(16)と、
    b)サンプル適用のための、基材(16)上の試験ゾーン(18)と、
    c)糖化ヘモグロビンを標識するために、試験ゾーン(18)内に非固定化状態で提供される接合体と、
    d) 洗浄液(22)を、試験ゾーン(18)を通過させて輸送し、過剰な非結合接合体を試験ゾーン(18)から洗い落とすための流路(24)と
    を含み、
    e)試験ゾーン(18)が、標識されたヘモグロビンと全ヘモグロビンとを検出するための検出領域でもある、分析試験要素。
13. 生化学サンプル中の少なくとも1種の標的分析物を決定する方法であって、
    a)サンプル中に含有される、少なくとも標的分析物を結合することが可能な基材(16)を提供するステップと、
    b)分析物を標識するために、試験ゾーン(18)内に非固定化接合試薬を提供するステップであって、前記接合試薬が、分析物に特異的に結合することが可能であるが基材(16)には結合しないままであるステップと、
    c)サンプルを、基材(16)の有限な試験ゾーン(18)内に適用するステップと、
    d)洗浄液(22)を、試験ゾーン(18)を通過させて輸送し、過剰な非結合接合試薬を試験ゾーン(18)から洗い落とすステップと、
    e)試験ゾーン(18)内の、標識された分析物を検出するステップと
    を含む方法。
14. サンプルとして、血液を使用し、非糖化ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを前記基材(16)に吸着させ、前記接合試薬が前記糖化ヘモグロビンに結合することを特徴とする、請求項13に記載の方法。
15. 全ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを、異なるそれぞれの波長で測光検出し、糖化ヘモグロビンと全ヘモグロビンとの比を決定することを特徴とする、請求項13または14に記載の方法。

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