JP4298538B2 - 休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーおよびその利用 - Google Patents
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本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムDNA中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖しているものであればよい。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。イネ科植物とは、オオムギ属、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、ムギ類とは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク等を意味する。
ATCAGGCATATGACCCAAGG(配列番号1)に示される塩基配列を有するプライマー、および
AGGGAAATGGTGCACAAGAC(配列番号2)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅されるDNAマーカーであり、上記5H染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から短腕側に2ないし4.5センチモルガン(以下cMと表示する)の距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:bah62n12、配列番号15)に基づいて設計されている。図1に当該ESTの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号1)および上記プライマー配列(配列番号2)の相補配列である。はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間に断片長多型があり、はるな二条のゲノムDNAを鋳型として増幅される断片のサイズは約600bp、H602のゲノムDNAを鋳型として増幅される断片のサイズは約550bpと異なる。図2に第一プライマーセットを用いてPCRにより増幅した断片の電気泳動像を示した。図2(a)、(b)とも両端は分子量マーカーである。図2(a)は、左端(分子量マーカーを除く)から順に、はるな二条、H602、はるな二条とH602の交雑F1、DH集団の1〜45の増幅断片である。図2(b)は、左端(分子量マーカーを除く)から順に、DH集団の46〜93の増幅断片である。図2から明らかなように、増幅産物のサイズを確認することにより、対象個体が当該5H染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。
AGCGATAAGTAACCGAGCCA(配列番号3)に示される塩基配列を有するプライマー、および
GGAGGACGACAAGAACTGGA(配列番号4)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記5H染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から長腕側に0ないし2.5cMの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:baak21h06、配列番号16)に基づいて設計されている。図3に当該ESTの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号3)および上記プライマー配列(配列番号4)の相補配列である。はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にSNP(single nucleotide polymorphisms;一塩基多型)がある。図4に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号9)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号10)である。□で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素HhaIの認識配列(GCGC)を示す。図4から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素HhaIの認識配列(GCGC)を有しているためHhaIで切断されるが、H602の増幅産物は上記認識配列部分のCがGに変異しているため(GCGG)制限酵素HhaIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk00204は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第二プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素HhaI切断により、対象個体が当該5H染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。
GCGGTGCTTTGCTCTTTCTA(配列番号5)に示される塩基配列を有するプライマー、および
CTGCAGCTGTTTGCCAAGT(配列番号6)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記5H染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から短腕側に約3.9cMの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:baak15n22、配列番号17)に基づいて設計されている。図5に当該ESTの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号5)および上記プライマー配列(配列番号6)の相補配列である。はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にSNPがある。図6に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号11)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号12)である。□で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素HhaIの認識配列(GCGC)を示す。図6から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素HhaIの認識配列(GCGC)を有しているためHhaIで切断されるが、H602の増幅産物は上記認識配列部分のGがTに変異しているため(GCTC)制限酵素HhaIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk00101は、CAPSマーカーであり、上記第三プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素HhaI切断により、対象個体が当該5H染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。
TTAACCGGGACAGAATGGAA(配列番号7)に示される塩基配列を有するプライマー、および
GGCAATTTACGCTCTTGCTC(配列番号8)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記5H染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から長腕側に約0.8cMの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:BaAK28L22、配列番号18)に基づいて設計されている。図7に当該ESTの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号7)および上記プライマー配列(配列番号8)の相補配列である。はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にSNPがある。図8に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号13)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号14)である。□で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素AfaIの認識配列(GTAC)を示す。図8から明らかなように、H602の増幅産物は制限酵素AfaIの認識配列(GTAC)を有しているためAfaIで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のCがGに変異しているため(GTAG)制限酵素AfaIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk06472は、CAPSマーカーであり、上記第四プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素AfaI切断により、対象個体が当該5H染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。
〔休眠性に関与する遺伝子座を含むDNA断片の単離方法〕
上述のとおり本発明にかかる遺伝マーカー(k04618、k00204)は、オオムギ5H染色体上に検出された2つの休眠性に関与する遺伝子座のうち、一方の遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー(k00101、k06472)は、他方の遺伝子座に連鎖するものである。よって、k04618、k00204の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ5H染色体上に検出された2つの休眠性に関与する遺伝子座のうち、一方の遺伝子座を含むDNA断片を単離することができ、k00101、k06472の遺伝マーカーを用いることによって他方の遺伝子座を含むDNA断片を単離することができる。
上記本発明にかかる休眠性に関与する遺伝子座を含むDNA断片の単離方法によって得られた休眠性に関与する遺伝子座を含むDNA断片をイネ科植物のゲノムDNAに導入することによって、休眠性改変イネ科植物を生産することが可能である。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。また、例えば、オオムギから単離された休眠性に関与する遺伝子座を含むDNA断片をオオムギ以外のイネ科植物に導入することも可能であり、同一属間のみでの単離、導入に限定されるものではない。
本発明にかかる休眠性改変イネ科植物の選抜方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として休眠性改変イネ科植物を選抜する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。例えば、従来公知の作物育種法を利用することができる。
醸造用オオムギ「はるな二条」(Hordeum vulgare ssp. vulgare variety Harunanijo)と野生オオムギ「H602」(Hordeum vulgare ssp. spontaneum H602)との交配から得られたF1の花粉を培養して半数体(haploid)を育成し、自然倍加した倍加半数体(doubled haploid)93個体からなる集団を使用した。
本発明者らが有するオオムギEST配列約12万をphredによって再度ベースコールした後、quality score 20でトリミングし、ベクターマスキングを行って3’端約6万配列を得た。これらの配列からphrapによってcontig 8,753、 singlet 6,686からなるUnigeneを作成した。プライマー作成ソフトPrimer3によって、400bpを中心として150-500bpのcDNA配列を増幅するプライマーセット約11,000を作成した。このうち約5,100のプライマーセットについて、はるな二条とH602との間に増幅されるゲノム断片の多型の有無を検出するために、それぞれのゲノムDNAをPCR増幅し、アガロースゲル電気泳動によってバンドの有無、バンド数、バンドサイズを調査し、マーカーとなり得るものを選択した。さらに、バンドサイズに多型のない場合は、増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより塩基配列の差異を検出し、39種類の制限酵素に対してCAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)化が可能なものをマーカーとして選択した。
DH集団各個体の遺伝子型の判定は、上記DH集団の連鎖地図にマッピングされたマーカーを用いて行った。すなわち、各個体の新鮮な葉の組織から分離したDNAを鋳型として、EST配列に基づいて設計したプライマーセットを用いてPCRを行った。断片長多型マーカーについてはPCR産物の電気泳動により遺伝子型を判定した。CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーについては、PCR産物を制限酵素で消化し、電気泳動により遺伝子型を判定した。
DH集団の各個体から得られた種子について、5週間または10週間25℃の条件で休眠を覚醒させた後、種子を発芽させ、4日後の発芽粒数を調査してその割合を各DH個体の発芽率(%)とし,その値を休眠性として用いた。覚醒期間5週間後の各DH個体の発芽率の分布を図9(a)に、覚醒期間10週間後の各DH個体の発芽率の分布を図9(b)にそれぞれ示した。図5において、白矢印ははるな二条、黒矢印はH602の発芽率を示し、縦軸は個体数を横軸は発芽率(%)を示す。図9から明らかなように、はるな二条は5週間または10週間の覚醒によりほぼ100%の発芽率を示し、H602はいずれの場合も発芽率は0であった。一方DH集団の各個体は、0〜100%の間に連続的に分布した。
QTL解析のアルゴリズムには、シンプルインターバルマッピング(simple interval mapping、以下「SIM」と略記する。)とコンポジットインターバルマッピング(composite interval mapping以下「CIM」と略記する。)を用い、解析ソフトウエアにはそれぞれ、MAPMAKER/QTLとQTL Cartographerを用いた。LODスコアの閾値を2に設定し、LODスコアが2を超えた場合に当該2つのマーカー区間内の最もLODの大きな位置にQTLの存在を推定した。
結果を表1に示した。表1から明らかなように、覚醒期間5週間後のデータからSIMにより休眠性に関与する1つのQTLが検出された。このQTLは5H染色体上に存在し、遺伝マーカーk04618から2.6cMの位置で遺伝マーカーk00204に挟まれる位置に座乗し、LODスコアは19.8である。このQTLで表現型の分散の71.0%を説明できる。また、このQTLの存在で5週間の覚醒処理により68.1%の種子が発芽する。さらに、覚醒期間10週間後のデータからSIMにより休眠性に関与する1つのQTLが検出された。また、CIMにより休眠性に関与する1つのQTLが検出された。SIMにより検出されたQTLは5H染色体上に存在し、遺伝マーカーk04618から3.9cMの位置で遺伝マーカーk00204に挟まれる位置に座乗し、LODスコアは24.6である。このQTLで表現型の分散の74.7%を説明できる。また、このQTLの存在で10週間の覚醒処理により70.4%の種子が発芽する。CIMにより検出されたQTLも5H染色体上に存在し、遺伝マーカーk00101から3.9cMの位置で遺伝マーカーk06472に挟まれる位置に座乗し、LODスコアは4.2である。このQTLで表現型の分散の34.8%を説明できる。また、このQTLの存在で10週間の覚醒処理により56.9%の種子が発芽する。
Claims (6)
- ムギ類のゲノムDNA中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記休眠性に関与する遺伝子座から0ないし5センチモルガンの範囲内の距離に位置し、
配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。 - 請求項1に記載の遺伝マーカーと、
ムギ類のゲノムDNA中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記休眠性に関与する遺伝子座から0ないし5センチモルガンの範囲内の距離に位置し、
配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号4に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅される遺伝マーカーとを含むことを特徴とする遺伝マーカー。 - ムギ類のゲノムDNA中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記休眠性に関与する遺伝子座から0ないし5センチモルガンの範囲内の距離に位置し、
配列番号5に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号6に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。 - 請求項3に記載の遺伝マーカーと、
ムギ類のゲノムDNA中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記休眠性に関与する遺伝子座から0ないし5センチモルガンの範囲内の距離に位置し、
配列番号7に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号8に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅される遺伝マーカーとを含むことを特徴とする遺伝マーカー。 - 上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか1項に記載の遺伝マーカー。
- 上記ゲノムDNAが5H染色体であることを特徴とする請求項5に記載の遺伝マーカー。
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