JP4294688B2 - 細胞融合促進剤、及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ＡＴＰ又はその代謝産物からなる細胞融合の促進剤を提供するものであり、ＡＴＰ又はその代謝産物を有効成分とする細胞融合促進剤、及び、ＡＴＰ又はその代謝産物の存在下に、細胞を融合させて融合した細胞(融合細胞)を製造する方法に関する。
また、本発明は、ＡＴＰ又はその代謝産物及び製薬上許容される担体を含有してなる、生体組織又は臓器の損傷又は変成による機能不全又は機能低下を幹細胞を用いて機能の再生又は改善をするための医薬組成物、それを製造するためのＡＴＰ又はその代謝産物の使用、及びそれを用いた治療方法に関する。
再生医療とは、病気や事故によって失われた体の細胞、組織、器官の再生や機能の回復を目的とした医療として再生医療が注目されてきている。皮膚移植や臓器移植といった生きた細胞を使った細胞移植も再生医療に含まれるが、特に近年、自然再生不能な臓器や組織を再生及び機能を回復させるべく、幹細胞から各組織の機能を有する細胞を分化せしめる技術が発達し、これを利用した再生医療が脚光を浴びている。
幹細胞は、死滅を迎えた細胞を補給すべく組織や臓器に成長する元となる自己再生能をもつ幼若、未分化の親細胞である。胚からの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が注目されているが、体細胞の核移植を行わなければ自己細胞とはならず、移植の際拒絶反応を起こす為、遺伝子組み換え、ＨＬＡ適合性の確認及び免疫抑制剤の併用等の必要性がある。拒絶反応の危険性の無い自己細胞として自己の体性幹細胞（組織幹細胞、臓器幹細胞）の利用が着目されている。このために哺乳動物からの間葉系幹細胞の分離法（特許文献１参照）、その培養方法（特許文献２参照）、また新規な体性幹細胞（特許文献３参照）についての特許出願もなされてきている。
体性幹細胞は、分化によって、それが存在した組織細胞に変化するための方向性が決まっているので、成体幹細胞が採取できない組織の再生は難しいとされていたが、多くの体性幹細胞は、本来の分化とは異なる細胞に分化する性質を持っていることが発見された。このような性質は体性幹細胞の可塑性（plasticity）と呼ばれている。例えば、造血幹細胞は血球細胞だけでなく、肝細胞、骨格筋細胞、神経細胞などのあらゆる細胞に分化可能であることも知られてきた。このような体性幹細胞の性質を利用した新たな再生医療への道が展開されてきている。
しかし、このような幹細胞を単に生体へ投与するだけでは、組織や臓器への再生誘導を実現することはできない。細胞の分化や増殖には、当該細胞の周辺環境との相互作用が極めて重要であり、投与した幹細胞に適した周辺環境を構築する技術（生体組織工学）が必要であり、再生医療への道にはまだまだ大きくの課題が残されている。例えば、軟骨および他の組織の修復および再生のための細胞増殖を支持するように、アデノシンリン酸塩などを含有する温度依存性ポリマーゲル組成物を組織に導入することからなる組織を修復する方法についての特許出願もなされている（特許文献４参照）。
このような体性幹細胞の可塑性は、分化形質転換によるという説と、細胞融合によるという説が提唱されている。例えば、アルバレツドラド（Alvarez-dolado）らは、骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）がインビトロで神経前駆細胞と自然に融合することを示し、骨髄移植によってインビボで肝細胞、脳のプルキンエ細胞、及び心筋細胞と融合し、融合した多核細胞を形成することを報告した（非特許文献１参照）。また、バッシロポウラス（Vassilopoulos）らは、骨髄の造血幹細胞を肝臓に移植したところ、造血幹細胞が肝細胞と細胞融合をし、肝臓を再生するという結果を報告した（非特許文献２参照）。さらに、造血幹細胞を心臓に移植した後の、心筋細胞に特異的に発現する遺伝子をレポーター遺伝子としたマウスによる遺伝学的検討では、心筋細胞への分化形質転換が認められなかったことも報告されている（非特許文献３参照）。体性幹細胞の可塑性の機構について各方面から研究されているが、未だ完全には解明されていない。
体性幹細胞の可塑性の機構は解明されていないが、体性幹細胞の可塑性を利用した体性幹細胞を臓器や組織と細胞融合させ、拒絶反応を起こすことなく、損傷部位を再構築させるという新しい治療手法の可能性が明らかにされてきている。
心不全は生死に関わる重篤な疾患である。心筋の一部が壊死することによる心不全は、心不全の状態を回復しても、壊死した心筋は再起することができず、再発の危険性にさらされることになる。特に予後不良な拡張型心筋症の患者が増加してきているが、これに対する確立された治療法は未だ見出されていない。心臓移植が有力な治療法ではあるが、ドナー不足という問題もあり、治療には限界がある。
心筋細胞は、生後間もなく増殖能力を持たない成人型心筋細胞になる。心筋梗塞などで心筋が壊死し、心筋の一部が線維組織になってしまうと二度と心筋に再生することはない。線維組織となった心筋は薄くなり、心臓のポンプ機能を維持できなくなり、心機能を維持することが困難となる。
近年になって、このような心機能の低下した心臓に直接細胞を移植して心機能を再生される試みが行われてきている。移植される細胞として、胎児の心筋細胞（非特許文献４及び５参照）、骨格筋の前駆細胞である骨格筋芽細胞（非特許文献６及び７参照）、脱メチル化剤である５−アザシチジンを曝露した骨髄細胞（非特許文献８参照）を用いた例が報告されている。これらの報告は、いずれも動物モデルによるものであるが、臨床応用も行われてきている。例えば、ハマノらは、５人の虚血性心疾患の患者に自己骨髄細胞を移植した。この結果、５人中３人に心筋虚血の改善が認められたと報告している（非特許文献９参照）。また、ストラウエル（Strauer）らは、急性心筋梗塞の患者に対し自己骨髄細胞をカテーテル的に心筋梗塞部位に注入した。この結果、３カ月後には梗塞部位の縮小、心機能の改善が認められたと報告している（非特許文献１０参照）。
これらの細胞移植による心機能の改善がどのような機構によるものか明確にはされていないが、前記した遺伝学的検討では、心筋細胞への分化形質転換が認められなかったという報告（非特許文献３参照）からすれば、細胞融合によるものとも考えられる。心筋細胞や骨格筋細胞は、多核細胞が存在しており、骨格筋細胞では細胞の周辺に多数の核が存在、心筋細胞では中央部に１個又は２〜３個の核が存在している。
細胞融合は、抗体の製造などにおいて広く使用されている技術ではあり、細胞融合を引き起こす際に使用される化合物としては、センダイウイルス等のウイルスの他、ポリエチレングリコール等の化合物が広く使用されてきている。しかしながら、これらの細胞融合技術はインビトロのものであり、生体内でこれらの細胞融合促進剤を再生医療に適応した場合、目的細胞以外の臓器細胞を融合させてしまう恐れがあり、実質的に臨床医療への応用は非常に困難である。現在、再生医療として利用が期待される、臓器又は組織の損傷部位への幹細胞の細胞融合による再構築において、幹細胞と当該臓器又は組織の細胞融合を促進させる薬剤は未だ知られていない。
本発明は、体性幹細胞を利用した組織の再生のための再生促進剤を提供する。また、本発明は、生体内においても安全に使用できる細胞融合促進剤を提供する。
体性幹細胞の可塑性の機構については、未だ十分に解明されていないが、細胞融合によるという説が有力になってきている。また、細胞融合は投与された体性幹細胞が分化・増殖する過程において、残存している体細胞と融合することから、投与した体性幹細胞に適した周辺環境を構築する、例えば、組織の形態を形成するための足場を構築することが無いという利点もある。したがって、生体内で安全に使用できる細胞融合促進剤があれば、各種の体性幹細胞を用いて、損傷を受けた生体組織を再生できることになる。特に、骨格筋細胞や心筋細胞などはもともと多核細胞としている存在しているものであり、細胞融合により多核化することに格別の問題も生じない。
本発明は、損傷を受けた生体組織を再生するための細胞融合促進剤を提供するものである。
本発明者らは、幹細胞を用いた再生医療において、幹細胞の損傷部位への定着について検討してきたところ、幹細胞に適した周辺環境を構築することなく、すなわち細胞の定着のための足場を構築することなく幹細胞を損傷部位に定着させる手法として細胞融合が適していることに着目し、細胞融合についてさらに検討を重ねてきた。その結果、ＡＴＰ又はその代謝産物が細胞の融合、とりわけ体細胞と幹細胞との細胞融合を促進することを見出した。
即ち、本発明は、ＡＴＰ又はその代謝産物からなる細胞融合の促進剤を提供するものであり、ＡＴＰ又はその代謝産物を有効成分とする細胞融合促進剤に関する。そして、本発明は、ＡＴＰ又はその代謝産物の存在下に、 融合細胞を製造する方法に関する。
また、本発明は、ＡＴＰ又はその代謝産物及び製薬上許容される担体を含有してなる、生体組織又は臓器の損傷又は変成による機能不全又は機能低下を幹細胞を用いて機能の再生又は改善をするための医薬組成物に関する。そして、本発明は、ＡＴＰ又はその代謝産物及び製薬上許容される担体を含有してなる、生体組織又は臓器の損傷又は変成による機能不全又は機能低下を幹細胞を用いた機能の再生又は改善をするための医薬組成物を製造するためのＡＴＰ又はその代謝産物の使用に関する。さらに、本発明は、ＡＴＰ又はその代謝産物及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物の有効量を、生体組織又は臓器の損傷又は変成による機能不全又は機能低下に基づく疾患を患っている患者に投与することからなる当該疾患を治療する方法に関する。
本発明は、細胞におけるＡＴＰの作用を初めて明らかにするものであり、ＡＴＰ又はその代謝産物による細胞融合促進作用を明らかにしたものである。細胞融合はモノクローナル抗体などの製造に有用なだけでなく、生体の組織や臓器の再生にも極めて有用なものであり、とりわけ近年になって体性幹細胞の可塑性が見出されてからは、体細胞の再生や増殖のための利用が期待されていた。
本発明は、このような生体外や生体内における細胞融合における細胞融合促進剤を提供するものであり、しかも本発明の有効成分として使用される物質はいずれも生体内において産生されている安全性の高い物質であることから、細胞融合を利用する医療分野や抗体製造分野において大きく寄与するものである。
また、心筋細胞などの筋細胞の多くは多核細胞として存在しており、本発明の方法により製造される融合細胞をそのまま生体内の細胞として利用することができることから、本発明は再生医療、特に心筋細胞の再生医療に極めて有用なものである。
本発明におけるＡＴＰ又はその代謝産物としては、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、又はその生体内での代謝産物若しくはそのホモログとして生体内で認識されるものが含まれ、例えばＡＤＰ（アデノシン５’−二リン）、ＡＭＰ（アデニル酸）、５’−イノシン酸などが挙げられる。ＡＴＰ又はその代謝産物の１種又は２種以上からなる成分を使用することができるが、通常はＡＴＰの使用が簡便でよい。本発明のＡＴＰ又はその代謝産物は塩を形成してもよく、その塩は薬学的に許容できるものであれば特に制限されるものではない。ＡＴＰ又はその代謝産物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が好ましい。
本発明の細胞融合促進剤としては、前記したＡＴＰ又はその代謝産物を有効成分として含有するものであり、必要により、ＡＴＰ及びその代謝産物、並びに細胞融合の処理において許容される担体を含有してなる細胞融合促進用組成物として使用することもできる。本発明の細胞融合促進剤又は細胞融合促進用組成物は、細胞を融合する際の培地に添加又は生体内に投与して使用することができる。
本発明のＡＴＰ又はその代謝産物の存在下に、融合細胞を製造する方法としては、通常の細胞融合の条件下に、本発明のＡＴＰ若しくはその代謝産物、又は細胞融合促進剤若しくは細胞融合促進用組成物を添加又は投与することにより行うことができる。添加又は投与する量としては、細胞に副作用が生じない範囲であれば特に制限はない。本発明のＡＴＰ又はその代謝産物自体は通常の状態で生体内に存在することができる物質であるから、毒性が低く多量に使用することもできるが、細胞融合の促進のためには、通常は細胞融合の培地中に好ましくは０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、又は０．１ｍＭ〜３ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜３ｍＭの濃度になるように添加して使用される。
本発明の細胞融合において使用される細胞としては、各種の細胞、例えば微生物細胞、植物細胞、動物細胞などを使用することができるが、好ましい細胞としては動物細胞、より好ましくは哺乳動物の細胞が挙げられる。本発明の細胞融合としては、免疫細胞と癌細胞との融合も挙げられるが、好ましくは体細胞と幹細胞の細胞融合が挙げられる。幹細胞としては、胚性幹細胞、体性幹細胞のいずれも使用できるが、自己細胞を使用するという観点からは体性幹細胞の使用が好ましい。体性幹細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などのいずれの細胞であってもよいが、入手の容易性からは骨髄細胞が好ましい。骨髄細胞を精製分離して目的の幹細胞を選択して使用することもできる。
本発明の細胞融合において、融合される細胞としては、生体外にある細胞でも生体内の細胞でもよく、特に制限はないが、各種の生体組織又は臓器からの細胞、例えば、神経、筋肉（平滑、横紋、心筋）、骨、軟骨、肝臓、腎臓、膵臓、呼吸上皮、造血細胞、脾臓、皮膚、毛、歯、角膜、胃、腸等の組織や臓器からの細胞、例えば、肝細胞、骨細胞、血液細胞、免疫細胞、神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞などが挙げられる。また、本発明の細胞融合により生成される細胞が２核細胞となることから、２核細胞として生存できかつ目的の機能を発現できるものが好ましい。このような細胞としては、免疫細胞、骨格筋細胞、心筋細胞などが挙げられる。
例えば、免疫細胞では、生体内又は生体外において、本発明の方法により特定の免疫細胞と融合させ、分化誘導した後、生体内において分化誘導された部位に固着させることも可能性がある。
骨格筋細胞では、骨格筋細胞が減少した部位において、本発明の細胞融合を行うことにより、減少した骨格筋を再生させ、筋ジストロフィー症などの疾患の治療として有用となる。また、心筋細胞では、心筋梗塞などにより心機能が低下した部位において、本発明の細胞融合を行うことにより、心機能の再生又は改善をすることができる。
さらに、本発明の細胞融合により、幹細胞の可塑性を利用することも可能となる。例えば、心筋細胞と造血幹細胞を細胞融合させて２核の心筋細胞を再生させることも可能となる。
本発明の細胞融合は、生体内又は生体外において生体の機能を有する融合細胞を容易にかつ迅速に再生させることができ、各種の組織又は臓器における機能不全又は機能低下を再生又は改善させることができる。とりわけ、骨格筋細胞や心筋細胞は、元々多核細胞であることから、細胞融合が容易であり、格別の細胞融合の条件を設定することなく、本発明の融合細胞を容易に実施することができる。また、生成された２画細胞も生来の多核細胞と同様のものであり、同種の機能を保持することが可能となる。
本発明の細胞融合の方法としては、生体外では、細胞融合させる２種の細胞を混合して培養する方法が簡便で好ましい。また、生体内では、細胞融合をさせる細胞、例えば骨髄細胞などの体性幹細胞を、生体組織又は臓器の損傷又は変成により機能不全又は機能低下を生じている部位に移植し、そこに本発明のＡＴＰ又はその代謝産物からなる有効成分を含有する組成物を添加又は投与して行うことができる。
また、心臓などの血流の多い部位においては、血液中に含有されている体性幹細胞、例えば造血幹細胞をそのまま利用することもできる。この場合には、生体組織又は臓器の損傷又は変成により機能不全又は機能低下を生じている部位に本発明のＡＴＰ又はその代謝産物からなる有効成分を含有する組成物を添加又は投与して行うことができる。
これらの場合に使用される本発明のＡＴＰ又はその代謝産物の量としては、生体組織又は臓器の損傷又は変成により機能不全又は機能低下を生じている部位において、ＡＴＰ又はその代謝産物の濃度が０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、又は０．１ｍＭ〜３ｍＭ、又は１ｍＭ〜３ｍＭとなるように調整するのが好ましい。
本発明における生体組織又は臓器としては、筋肉、免疫系、肝臓、心臓、骨、軟骨、関節などが挙げられるが、多核細胞が存在している心臓や筋肉が好ましい。また、本発明における損傷又は変成としては、本来存在すべき細胞の欠損、傷害、変成、奇形などあらゆる種類の変形が包含される。傷害や変成により周囲の正常細胞の機能が阻害されている場合には、これらの変形された細胞を除去してから本発明の細胞融合を行うのが好ましい。
また、本発明の機能不全又は機能低下としては、生体の組織又は臓器が有する本来の機能の全部又は一部の機能が、全面的に停止するか量的に減少しているあらゆる機能不全減少又は機能低下減少を包含している。このような機能の一部が減少している場合における本発明の方法の適用は、治療だけでなく予防を包含している。
本発明の医薬組成物における「製薬上許容され得る担体」としては、製剤化において使用される賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の製剤化された医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができるが、好ましくは非経口投与が挙げられる。本発明の医薬組成物は、静脈注射、カテーテルによる注入、外科的方法による組織又は臓器への直接的な注入などの方法により投与されるのが好ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき１ｍｇから５０００ｍｇ、１０ｍｇから１０００ｍｇの範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に有効成分が０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。
このようにして製造された注射剤は、処置を必要とする患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、５０μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは２００μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
本発明における再生医療として適用が期待される疾患としては、パーキンソン病、骨髄損傷、アルツハイマー病などの神経系疾患、心筋梗塞、拡張型心筋症、などの循環器疾患、火傷、外傷性皮膚欠損、床ずれなどの皮膚疾患、外傷性骨欠損、外傷性軟骨欠損、骨粗しょう症、歯周病の骨疾患及び白内障などが挙げられ、特に心筋梗塞及び拡張型心筋症など左室機能の低下した虚血性及び非虚血性心疾患が好ましい。
次に本発明の作用をより具体的に説明するが、これは本発明を理解するためのものであり、これにより本発明は技術的な範囲が制限されるものではない。
生後１〜２日齢のWistar-Kyotoラットより、心臓を採取し心筋細胞を単離し培養した。養した。これに、ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）トランスジェニックラットの骨髄から分離された骨髄単核球細胞を入れ、共培養した。
共培養１週間後の細胞の状態をパラホルムアルデヒドで固定し、心筋細胞特異的１次抗体としてＭＦ２０（赤色）、２次抗体としてＲ−ＰＥ会合抗マウスＩｇ抗体で蛍光免疫染色したものを蛍光顕微鏡で観察した結果を、図１に図面に変わるカラー写真で示す。図１の右側の（Ａ）はＰＥフィルターを用いた場合であり、中央の（Ｂ）はＦＩＴＣフィルターを用いた場合であり、左側の（Ｃ）はＰＥ／ＦＩＴＣのダブルフィルターを用いた場合をそれぞれ示す。心筋細胞はＭＦ２０陽性で赤色で示され、骨髄細胞はＥＧＦＰ陽性のため緑色で示さる。図１の（Ｃ）の矢印の細胞のように、ＭＦ２０及びＥＧＦＰともに陽性を示す融合細胞が認められた。
これらの融合細胞の数を定量的に測定するためフローサイトメトリーを用いた。前記と同様にパラホルムアルデヒド固定後、浮遊の状態で１次抗体としてＭＦ２０、２次抗体としてビオチン会合抗マウス抗体、３次抗体としてストレプトアビジン−プレＣＰ（PerCP）−シエ５．５（cye5.5）複合体を用い蛍光免疫染色し、フローサイトメトリーによる解析を行った。なお１回の解析で５００００個の細胞を解析した。結果を図２にカラーのグラフで示す。図２の（Ａ）はＲ１のゲイトのものを示し、（Ｂ）はＲ２のゲイトのものを示し、（Ｃ）はＲ３のゲイトのものを示し、（Ｄ）はＲ４のゲイトのものを示す。図２の(Ｄ)のゲイトＲ４内の細胞は、ＭＦ２０、ＥＧＦＰともに陽性を示す融合細胞であることが確認された。
次に、前記と同様にして心筋細胞と骨髄細胞の共培養の系に、ＡＴＰを０ｍＭ (対照)、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭをそれぞれ加え、融合細胞の数について検討した。ＡＴＰの各濃度の群で、図２の場合と同様に染色を行い、フローサイトメトリーによる解析を行った結果を図３にグラフ化して示す。
この結果から、全細胞数に対する融合細胞（Ｒ４のゲイト内の細胞）数の割合を計算した。結果を図４にグラフ化して示す。図４のグラフの縦軸は全細胞数に対する融合細胞の数の割合（％）を示し、横軸はＡＴＰがそれぞれ０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ及び３ｍＭの場合を示す。図４中のアスタリスク（＊）はｐ＜０．０５で対照群に比べて有意差があったことを示す。この結果、ＡＴＰが無い場合（対照）では、約０．１％の融合細胞しか生成しなかったのに対し、ＡＴＰを１ｍＭ、２ｍＭ加えた群では、コントロール群に比べ融合細胞の割合は約０．５強となり約５倍の増加が確認された。ＡＴＰを１ｍＭ、２ｍＭ加えた群では、コントロール群に比べ有意に融合細胞の数の割合が増加した。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
生後１〜２日齢のウイスター−キョウト（Wistar-Kyoto）ラットより、南野らの方法（Minamino T, Gaussin V, DeMayo FJ, et al., Circ Res. 2001;88:587-592.）に準じて心臓を採取し心筋細胞を単離した。得られた心筋細胞を６穴のプレートにおいて、各ウエルに１０５細胞／ｃｍ２の濃度で、１０％ＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地で培養した。
一方、生後８週齢のＥＧＦＰ（Enhanced green fluorescent protein）トランスジェニックラット（日本ＳＬＣ）の大腿骨と脛骨より、骨髄を採取し、テラダらの方法（Naohiro Terada, Takashi Hamazaki, Masahiro Oka, et.al., Nature 2002;416:542-545）に準じてパーコール法により単核球成分のみを分取した。得られた骨髄単核球細胞を１０％ＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地に再懸濁した。この懸濁液を、心筋細胞培養２日目に、６穴のプレートの各ウエルの心筋細胞に対し１０６細胞ずつの骨髄単核球細胞が入るようにし、共培養した。
共培養１週後に、０．０８％トリプシンで細胞を個々に単離し、２ウエル ラボテックテェンバースライド（2 well Lab-Tek chamber slide）にまき直し接着後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ−１００で処理し、心筋細胞特異的１次抗体ＭＦ２０（赤色）、及び２次抗体としてＲ−ＰＥ抗マウスＩｇ抗体（R-PE conjugated anti-mouse Ig's antibody）（BIOSOURCE）で蛍光免疫染色したものを蛍光顕微鏡で観察した結果を図１に示す。図１の（Ｃ）の矢印の細胞のように、ＭＦ２０、ＥＧＦＰともに陽性を示す融合細胞が認められた。
次に、融合細胞の数を定量的に測定するためフローサイトメトリーを用いた測定した。共培養１週において、前記と同様にトリプシン処理・パラホルムアルデヒド固定後、浮遊の状態で１次抗体ＭＦ２０（プレＣＰ−シエ５．５（PerCP-cye5.5）にて標識しＦＬ−３陽性としてとらえられる）、２次抗体としてビオチン会合抗マウスＩｇ抗体（Biotin-conjugated anti-mouse Ig's antibody）（BD Pharmingen）、３次抗体としてストレプトアビジン プレＣＰ−シエ５．５複合体（Streptavidin PerCP-cye5.5 conjugate）（BD Pharmingen）を用い蛍光免疫染色し、フローサイトメトリーによる解析を行った。結果を図２に示す。なお１回の解析で５００００個の細胞を解析した。骨髄細胞はＥＧＦＰ陽性のためＦＬ−１陽性としてとらえられ、図２の(Ｄ)のゲイトＲ４内の細胞は、ＭＦ２０、ＥＧＦＰともに陽性を示す融合細胞であることが確認された。
さらに、実施例１に示した心筋細胞と骨髄細胞の共培養の系に、各ウエルにＡＴＰを０ｍＭ（対照）、１ｍＭ、２ｍＭ、又は３ｍＭをそれぞれ加え、実施例１と同様にして融合細胞の数について検討した。なお共培養３日目、５日目に浮遊細胞を集め、ＡＴＰがそれぞれの濃度になるよう培地交換を行った。
融合細胞の数を定量的に測定するためフローサイトメトリーを用いて測定した。共培養１週において、実施例１と同様にトリプシン処理・パラホルムアルデヒド固定後、浮遊の状態で１次抗体ＭＦ２０（プレＣＰ−シエ５．５（PerCP-cye5.5）にて標識しＦＬ−３陽性としてとらえられる）、２次抗体としてビオチン会合抗マウスＩｇ抗体（Biotin-conjugated anti-mouse Ig's antibody）（BD Pharmingen）、３次抗体としてストレプトアビジン プレＣＰ−シエ５．５複合体（Streptavidin PerCP-cye5.5 conjugate）（BD Pharmingen）を用い蛍光免疫染色し、フローサイトメトリーによる解析を行った。結果を図３に示す。なお１回の解析で５００００個の細胞を解析した。骨髄細胞はＥＧＦＰ陽性のためＦＬ−１陽性としてとらえられ、図３の（Ｄ）のゲイトＲ４内の細胞は、ＭＦ２０、ＥＧＦＰともに陽性を示す融合細胞であることが確認された。ＡＴＰ１ｍＭ、又は２ｍＭを加えた群では、コントロール群に比べ融合細胞の数は増加していることが確認された。
また、解析された全細胞中に占める融合細胞の割合（％）を各群でグラフ化した。結果を図４に示す。ＡＴＰ１ｍＭ、又は２ｍＭを加えた群では、コントロール群に比べ有意に融合細胞の数の割合が増加していた。
本発明は、細胞融合における細胞融合の促進作用を有する組成物を提供するものであり、細胞融合を利用する産業分野、例えば、抗体製造分野、医薬分野などにおいて有用であり、産業上の利用性を有するものである。
Claims (14)
- ＡＴＰを有効成分とする体性幹細胞と体細胞との細胞融合促進剤。
- 体性幹細胞が、骨髄細胞である請求項１に記載の細胞融合促進剤。
- 細胞融合における体細胞が、心筋細胞である請求項１又は２に記載の細胞融合促進剤。
- 生体組織又は臓器の損傷又は変成による機能不全又は機能低下を体性幹細胞を用いて機能の再生又は改善をするための請求項１〜３のいずれかに記載の細胞融合促進剤。
- 体性幹細胞を用いた機能の再生又は改善が、体性幹細胞の移植によるものである請求項４に記載の細胞融合促進剤。
- 体性幹細胞が、自己細胞である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞融合促進剤。
- 生体の臓器が、心臓である請求項４〜６のいずれかに記載の細胞融合促進剤。
- 生体組織又は臓器の損傷又は変成による機能不全又は低下が、心不全である請求項４〜７のいずれかに記載の細胞融合促進剤。
- 心不全が、心筋梗塞によるものである請求項８に記載の細胞融合促進剤。
- 細胞融合促進剤が、血管注入用の液剤である請求項１〜９のいずれかに記載の細胞融合促進剤。
- 細胞融合促進剤が、凍結乾燥製剤である請求項１〜９のいずれかに記載の細胞融合促進剤。
- 生体外において、ＡＴＰの存在下で体性幹細胞と体細胞とを融合させて融合した細胞を製造する方法。
- 体性幹細胞が、骨髄細胞である請求項１２に記載の方法。
- 細胞融合における体細胞が、心筋細胞である請求項１２又は１３に記載の方法。
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