ES2391111B1 - Compuesto de regeneración celular - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a un compuesto de regeneración celular que permite la administración intravenosa, intramuscular y local de células madre con fines terapéuticos en padecimientos crónicos degenerativos en los que se incluye la Insuficiencia Renal Crónica, la Diabetes Mellitus y sus complicaciones, enfermedades neurodegenerativas, vitíligo, insuficiencia cardiaca, cardiopatía isquémica y el antienvejecimiento. La fórmula del compuesto ?CRC? permite inyectar paraenteralmente, localmente y tópicamente células madre pluripotenciales criopreservadas o liofilizadas en frascos o cajas de líneas celulares en cultivo, después de ser descongeladas gradualmente de -20º C a 8º C, son prehidratadas con la primera solución base del compuesto de regeneración celular (frasco ?A?). El ?Compuesto de Regeneración Celular? (?CRC?) se prepara secuencialmente a través de cinco soluciones ?A?, ?B?, ?C? y ?D?, el objeto de esta invención es describir la forma de preparación de las cuatro soluciones base, que integran el ?Compuesto de Regeneración Celular? (?CRC?) el cual es una invención no existente en el mercado como tal, la cual facilita la aplicación de células madre en forma de inyecciones paraenterales o tópicamente, evitándose estudios de gen tipificación de HLA, e intervenciones quirúrgicas y de radiología intervencionista que se emplean en el implante o trasplante de células madre. El ?CRC? (frascos ?A?, ?B?, ?C? y ?D?) sirve de vehículo para liberar cantidades suficientes y seguras de células madre en protocolos de terapia celular, medicina regenerativa y antienvejecimiento, el compuesto ha sido empleado y ha mostrado ser útil para tratar múltiples padecimientos crónico degenerativos, que no cuentan con tratamientos convencionales que puedan revertir la progresión y requieren de regeneración celular como son: la insuficiencia renal crónica, la Diabetes Mellitus, la insuficiencia cardiaca, infartos cerebrales y del miocardio, artrosis, la Enfermedad de Parkinson, el Vitíligo, etc.#Para lo cual se requiere aplicar un mínimo de 5 a 10 inyecciones intravenosas con 6 ml del ?CRC? por lo menos cada siete días.

Description

Compuesto de regeneración celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células madre conocidas en inglés como stem cells, también se les conoce como “células troncales”, “células tronco”, “células precursoras”, “células progenitoras” y “células estaminales”. La célula madre es la precursora de aproximadamente 250 estirpes de células diferenciadas y sus estadios de diferenciación parcial que van perdiendo la capacidad pluripotencial de la célula madre original y se van comprometiendo con un determinado linaje celular para formar células especializadas específicas, como son las neuronas, las células beta pancreáticas, los cardiomiocitos, entre otras muchas más.

Las células madre se caracterizan por que pueden dividirse simultáneamente para mantener una autorenovación celular; es decir una producción sostenida de células madre semejantes a ella. Así como la transdiferenciación y tropismo que permite generar células hijas comprometidas hacia una estirpe celular específica, además de que tienen la capacidad de migrar al sitio de lesión o daño en el que ocurre la diferenciación celular, después de que ocurra la implantación, observándose la regeneración celular en los tejidos sanos y enfermos (Sánchez-González DJ, Trejo-Bahena NI. Biología Celular y Molecular. Editorial Alfil; México Distrito Federal, 2006). Estas características hacen ver a la inyección de células madre como una terapia potencial, útil para llevar a cabo la regeneración celular en enfermos. (González-López GM, Sánchez-González DJ y Sosa-Luna CA. Terapia Celular con Células Madre y Medicina Regenerativa. México 2008; Editorial Alfil).

Thomson y colaboradores (U.S. Pat. No. 5,843,780; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995) fueron los primeros en aislar y propagar células madre de primates. En forma subsiguiente derivaron la primera línea celular de células madre humana a partir de los blastocistos. Gearhart y colaboradores derivaron células madre germinales a partir de tejidos fetales de origen gonadal (Shamblott et.al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; and U.S. Pat. No. 6,090,622).

Tanto las células madre derivadas de blastocistos como las que se obtienen de tejidos gonadales, tienen características que las definen como células madre pluripotenciales, es decir; pueden ser cultivadas durante largos periodos de tiempo sin que éstas entren en diferenciación, manteniendo una morfología con cariotipo normal y son capaces de diferenciarse un importante número de células especializadas.

El problema más importante para utilizar células madre pluripotentes en protocolos de terapia celular es que estas células madre son cultivadas tradicionalmente sobre una cama de células (feeder cells) que previenen la diferenciación (U.S. Pat. No. 5, 843,780; U.S. Pat. No. 6, 090,622). De acuerdo a los experimentos de Thomson y colaboradores (Science 282:114, 1998), cuando las células madre son cultivadas sin su cama de células (feeder cells), las células madre mueren y comienzan a diferenciarse en forma desordenada. En la patente Internacional publicada por Geron Corp. (WO 99/20741), titulada: “Métodos y materiales para el crecimiento de células madre derivadas de células primordiales de primate”; se refiere a un medio de cultivo celular para hacer crecer células madre de primates y que permanezcan en un estado de indiferenciación bajo condiciones de presión osmótica baja y bajo nivel de endotoxinas. Este medio de cultivo celular puede combinar suero para soportar las células madre y la cama de células, el medio de cultivo celular además incluye aminoácidos no esenciales, antioxidantes, factores de crecimiento nucleótidos y sales de piruvato. Otra patente Internacional publicada por Geron Corp. (WO 01/51616) titulada: “Técnicas de crecimiento y diferenciación de células madre humanas pluripotentes”. Y el articulo de Xu y colaboradores (Nature Biotechnology 19:971, 2001) titulado: “Crecimiento de células madre indiferenciadas, sin cama de células (feeder cells”). El artículo de Lebkowski y colaboradores (Cancer J. 7 Suppl. 2:S83, 2001) titulado: “Células madre embrionarias humanas: cultivo, diferenciación, y modificación genética para aplicaciones de medicina regenerativa”. Estas publicaciones reportan ejemplos de estado del arte de la técnica y siempre se trata de medios y métodos de cultivo celular para propagar células madre y mantenerlas en un estado de indiferenciación. Sin embargo, no existe ningún “Compuesto de Regeneración Celular” que permita inyectar células madre en forma de terapia celular a seres humanos. Ni existe algún producto farmacéutico similar que pueda actuar como “Compuesto de Regeneración Celular”, que haya tenido éxito en revertir la progresión de enfermedades crónicas degenerativas, como la Insuficiencia Renal Crónica inducida por la Diabetes Mellitus u otras patologías (Chirino YI, Sánchez-González DJ et. al. Protective effects of apocynin against cisplatin-induced oxidative stress and nephrotoxicity. Toxicology 2008; 245: 18–23 y Razo-Rodríguez AC, Chirino YI, Sánchez-González DJ et. al. Garlic powder ameliorates cisplatin-induced nephrotoxicity and oxidative stress. J Med Food 2008; 11(3):582-586.)

Si bien las células madre se han aplicado en algunos protocolos clínicos de investigación en Medicina en fase I a III (Traynor A. et. al. “Treatment of severe systemic lupus erythematosus with high-dose chemotherapy and haematopoietic stem-cell transplantation: a phase I” publicados en Agosto del 2000 en la revista The Lancet. Vol.

356. Andrew P. et. al., “The Adult Blood and Marrow Stem Cell Transplant Service” Hackensack. Bone Marrow Transplantation, Abril del 2000, Sykes M. et. al. “Treatment of severe autoimmune disease by stem-cell transplantation” Nature No. 2; Vol. 435 (7042), pp. 620-7. June 2005, Shamblott MJ et. al. ”Cell therapies for type 1 diabetes mellitus”. Expert Opin Biol Ther 2004 Mar; Vol. 4 (3), pp. 269-77); en todos estos protocolos las células madre son cultivadas y en ocasiones expandidas con los métodos y medios de cultivo descritos previamente en los

antecedentes de la presente invención, y las células madre se administran en masa o como bolos mediante procedimientos conocidos como trasplante de médula ósea, de forma muy similar a las convencionales transfusiones sanguíneas, o bien se aplican inyecciones de células madre purificadas, en las que se incluyen procedimientos quirúrgicos altamente especializados, en los que se pueden integrar procedimientos de radiología intervencionista, los cuales además requieren de la erogación de gasto de honorarios médicos, los de hospitalización, anestesia, estudios de laboratorio clínico y gabinete. Orlic y colaboradores inyectaron células madre en la zona periférica del infarto agudo al miocardio; , estas células se diferenciaron en estructuras del corazón, mejorando la función del corazón infartado. La reparación cardiaca producida por las células madre redujo la mortalidad en un 68% y el tamaño del infarto en un 40%.(Orlic D. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98(18):10344–10349). Otros trabajos relacionados con la células madre están contribuyendo a establecer que cuanto más altos sean los niveles de células madre en circulación, mayor es la habilidad del cuerpo para regenerarse y estar por más tiempo sano (Werner et.al. N Engl J Med.2005; 8; 353 (10):999-1007). Este tipo de invenciones e investigaciones están cambiando el paradigma en la historia de la humanidad en la que se pensó que era imposible reparar el daño causado una vez que se ha establecido la muerte o daño celular en un órgano vital como es el caso de los infartos al corazón.

Otras investigaciones complementarias son las de Bozlar M et. La. (2005) Saudi Med J. 26(8):1250-4. Kong D, et. al. (2004) Circulation. 110(14):2039-46. Eroglu E, et al. Agalar F, Altuntas I, Eroglu F. (2004) Tohoku J Exp Med. 204(1):11-6. Tomoda H, Aoki N.et.al. Clin Cardiol. 2003 Oct; 26(10):455-7. Krause DS et. Al. Cell 105:369-77. Eglitis M. et. Al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94, pp. 4080–4085. Camargo FD, et. Al. Nature 2003 9(12):1520-27; y el de Ianus A, et. Al. J. Clin. Invest. (2003) 111:843-850. Secretaría de Salud.Manual de Procedimiento Operativo de la Unidad de Transplante de Progenitores Hematopoyéticos del Instituto Nacional de Pediatría (2008).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Como se puede constatar en el estado de la técnica, hasta el momento de la presente invención, la aplicación terapéutica de células madre en inyecciones o transfusiones no incluye un “Compuesto de Regeneración Celular”, ya que la terapia celular con células madre se ha realizado en forma directa y empleando células frescas de médula ósea, cordón umbilical o líneas celulares de células madre pluripotenciales cultivadas y purificadas, las cuales son implantadas en el sitio de daño o a través de trasplantes de médula ósea (similares a la transfusión sanguínea), procedimientos terapéuticos que incluyen necesariamente la gen tipificación del haplotipo HLA del donador y receptor del trasplante, procedimientos que elevan el costo, que igualmente se ve incrementado por la mano de obra altamente especializada, como de cirujanos subespecialistas, como son los neurocirujanos y los cirujanos cardiovasculares, que están capacitados para llevar las células madre en grandes cantidades a los sitios anatómicos específicos donde se requieren, a través de avanzados procedimientos quirúrgicos (Sánchez-González DJ, Trejo-Bahena NI. Practicas de Histología. Editorial Alfil; México Distrito Federal, 2007). Con la finalidad de suprimir estos y otros inconvenientes, se pensó en el desarrollo de la presente invención, un “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC), que se pretende proteger por medio de la presente solicitud, pues se trata de un compuesto integrado por cuatro frascos con soluciones base (“A”, “B”, “C” y “D”) en las cuales se suspenden elementos celulares (células madre en estado de criopreservación a una temperatura de menos ciento noventa y seis grados centígrados (-196º C) y el polvo derivado de la misma cantidad de células deshidratadas por liofilización) para diversas aplicaciones terapéuticas en Terapia Celular, Medicina Regenerativa y Antienvejecimiento. Los detalles característicos de nuestra invención titulada “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) se muestran claramente en la siguiente descripción y en las 3 figuras que le acompañan. La figura 1/3 muestra un esquema de la invención, la figura 2/3 se refiere a los resultados obtenidos después de aplicar “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC), en animales de experimentación ratas Wistar con Diabetes Mellitus inducida previamente con estreptozotocina, en donde se aprecia el aumento de la función renal medida por la depuración de creatinina (ml/min) y el análisis morfológico de los cortes histológicos de los glomérulos. La figura 3/3 se refiere a los resultados obtenidos clínicamente en nuestro grupo de pacientes con insuficiencia renal crónica en donde se aprecia claramente el incremento estadísticamente significativo de la función renal medida por la depuración de creatinina (ml/min), existiendo consistencia entre los resultados en animales como en pacientes humanos, hecho inédito que no ha sido publicado hasta la presente solicitud de patente, todos ellos son ejemplos que demuestran la efectividad del “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) descrito en la presente solicitud de patente de invención.

La descripción de la figura 1/3, se refiere a la forma en que se debe preparar el CRC; así mismo se indican las cantidades, condiciones y elementos que se requieren para producir el CRC (“Compuesto de regeneración Celular”): En el No. 1; se refiere a una caja de cultivo celular con una línea purificada de células madre pluripotenciales criopreservadas -198ºC, las cuales se descongelan gradualmente aumentado la temperatura a una velocidad de 2 grados centígrados por minuto (

LX�ºC/min) hasta alcanzar la temperatura de menos veinte grados centígrados (-20 ºC).

En el No. 2 de la figura 1/3; muestra la segunda opción de la fuente de células madre las cuales se encuentran en polvo en un estado de deshidratación total obtenido por un proceso de liofilización convencional.

En el No. 3 de la figura 1/3 se muestra que ambas fuentes de células madre deben ser hidratadas con la solución “A” la cual se debe encontrar a una temperatura de 8 ºC.

En el No. 4 de la figura 1/3 se encuentra la base del “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) que es la solución “A”, ésta se prepara en condiciones de esterilidad y en un ambiente controlado a una temperatura de refrigeración menor a dieciséis grados centígrados (16°C) y mayor a cuatro grados centígrados (4°C). La solución base “A” del “CRC”, se prepara con un litro de agua bidestilada en una botella de vidrio o de plástico con tapón de goma la cual se somete a un proceso tradicional de esterilización como el de la autoclave, en la que previamente se disolvió cloruro de sodio (NaCl), lactato de sodio (NaC3H5O3), cloruro de calcio (CaCl2) y cloruro de potasio (KCl) para alcanzar la siguiente proporción iónica: Na+= 130 mEq, Cl- = 109 mEq, Lactato= 28 mEq, Ca2+ = 3 mEq y K+ = 4 mEq; esta solución debe alcanzar una osmolaridad de 273 mOsm/L, y no debe rebasar los 300 mOsm/L la cual es verificada empleando un osmómetro convencional. Después de esterilizar esta solución por cualquier método convencional de esterilización, se le agregan una solución estéril con 55 mg de cloruro de zinc, 16,9 mg de sulfato cúprico pentahidratado, 38,1 mg de sulfato de magnesio, 1,3 mg de yoduro de sodio, 14 mg de fluoruro de sodio, 163,9 mg de cloruro de sodio, 10 mg de tiamina, 250 mg de piridoxina, 1000 mg de ácido ascórbico, 1,0 mg de activina, 0,2 mg de factor estimulador de células pluripotenciales (C-kit), 0,6 mg de derivado procaínico G1, 0,4 mg de derivado procaínico G2, y 0,4 mg de derivado procaínico G3.

En el No. 5, las células madre prehidratadas en la solución base “A” son evaluadas en el microscopio confocal que emplea una fuente de luz láser (láser), la cual permite realizar diversas imágenes transversales de la células madre (No. 6) (Ordóñez RM, Espinosa AM, Sánchez-González DJ et. al. Enhanced oncogenicity of Asian-American human papillomavirus 16 is associated with impaired E2 repression of E6/E7 oncogene transcription. J Gen Virol 2004; 85: 1433-1444), las cuales son reflejadas y enfocadas por las lentes ópticas (No. 7) emitidas por las células en suspensión con la solución base “A” (No. 8) obteniendo diversas imágenes microscópicas (No. 9) (Floriano-Sánchez E, Villanueva C, Medina-Campos ON, Rocha D, Sánchez-González DJ et. al. Nordihydroguaiaretic acid is a potent in vitro scavenger of peroxynitrite, singlet oxygen, hydroxyl radical, superoxide anion, and hypochlorous acid and prevents in vivo ozone-induced tyrosine nitration in lungs. Free Radic Res 2006; 40 (5): 523-533). Las células madre con morfología saludable son tomadas en una jeringa estéril (No. 10).

En el No. 11 de la figura 1/3, se refiere al estudio morfológico minucioso que descarte alteraciones de la membrana, infección, alteraciones genéticas.

En el No. 12 de la figura 1/3 se refiere a la cuantificación del número de células por mililitro de solución base por diversos métodos de microscopia confocal o FACs en éste se suspenden aproximadamente 1000.000.000 células madre en 500 ml de la solución base “A” del CRC anteriormente ya descrita.

En el No. 13 de la figura 1/3 se refiere a la segunda solución base “B” del CRC; útil para inducir regeneración celular por condrogénesis, hematopoyesis y osteogénesis. La cual se prepara de la siguiente forma: 500 ml de solución base “A” del CRC con una concentración de 2000.000 elementos celulares (células madre) cuantificadas y verificadas previamente por análisis morfológico en microscopio confocal, a este volumen (500 ml) se le agrega además: L-cisteína 1,0 mg, 0,5 μg de interleucina 7 (IL-7), 0,5XIgXdeXinterleucinaX3X(IL-3), 0,1 mg de Factor de crecimiento mesodérmico A1 (FGM), 0,1 mg de factor estimulador de colonias de monocitos (M-CSF), y 0,1 mg de factor estimulador de colonias de granulocitos (GM-CSF); todos adicionados y mezclados en forma controlada en condiciones estériles almacenados a ocho grados centígrados (8º C) por no más de una semana, o a menos cuatro grados centígrados (-4º C) por no más de cinco semanas o a menos veinte grados centígrados (-20 ºC ) por no más de veinticuatro semanas.

En el No. 14 de la figura 1/3 se refiere a la tercera solución base “C” del CRC; útil para inducir regeneración celular por angiogénesis y vasculogénesis. La cual se prepara de la siguiente forma, 500 ml de solución base “B” del CRC anteriormente preparada a la que se le adiciona lo siguiente: a la que se le agrega 0,3 mg de factor de transformación de crecimiento beta (TGF-B) y 0,2 mg de factor de crecimiento endodérmico K2 (FGE); todos adicionados y mezclados en forma controlada en condiciones estériles almacenados a ocho grados centígrados (8º C) durante no más de una semana, o a menos cuatro grados centígrados (-4º C) durante no más de cinco semanas

o a menos veinte grados centígrados (-20 ºC ) durante no más de veinticuatro semanas. En el No. 15 de la figura 1/3 se refiere a la cuarta solución base “D” del CRC; útil para inducir regeneración celular por neurogénesis, angiogénesis y vasculogénesis. La cual se prepara de la siguiente manera: 500 ml de solución base “C” del CRC anteriormente descrita a la que se le adiciona lo siguiente: 100 mg de retinol, 0,5 mg factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y 0,2 mg de factor de crecimiento neurológico (FGFN).

Finalmente el “Compuesto de Regeneración Celular” CRC para aplicación en Terapia Celular, Medicina Regenerativa y Antienvejecimiento se integra por las cuatro soluciones base (“A”,”B”,”C” y “D”), formando una composición líquida integrada por una concentración de 2 x 109 células madre hidratadas, previamente analizadas y cuantificadas por microscopia confocal, la cual se prepara adicionando diversas sustancias en las concentraciones y condiciones ya antes descritas (oligometales, activina, factores de crecimiento de fibroblastos,etc.).

La fórmula y el procedimiento para preparar el “CRC” permite aplicar células madre pluripotenciales sin modificación genética alguna, las cuales se encuentran criopreservadas o liofilizadas en frascos o cajas de líneas celulares en cultivo, después de descongelarlas gradualmente de -20ºC a 8ºC, son prehidratadas en la solución base del compuesto de regeneración celular (solución base “A”) el cual es la solución base para preparar el compuesto de regeneración celular (frascos “B”, “C” y “D”).

El “CRC” (en sus soluciones base “B”, “C” y “D”) sirven de compuestos inductores de las células madre en los protocolos de terapia celular, favoreciendo su capacidad regenerativa y de antienvejecimiento. La aplicación del procedimiento para preparar el compuesto de regeneración celular (frascos “A”, “B”, “C” y “D”) incluye condiciones de esterilidad, análisis morfológico y la cuantificación de células madre.

La aplicación de este “CRC” en terapia celular No. 16 y No. 17, figura 1/3 (frascos “A”, “B”, “C” y “D” ) permite que la terapia celular con células madre sea muy segura y no requiera de estudios de gen tipificación para haplotipos HLA porque tanto la base como el compuesto de regeneración celular (frascos “A”, “B”, “C” y “D”) sirven de vehículo para transportar las células madre en los protocolos de terapia celular, medicina regenerativa y antienvejecimiento útil para diversos padecimientos crónico-degenerativos que requieren de una regeneración celular como: la Insuficiencia Renal Crónica; las Diabetes Mellitus, las artrosis, la Enfermedad de Parkinson, el Vitíligo, etc. Para lo cual se requieren aplicar un mínimo de 5 aplicación intravenosa cada 7 días de 6 ml del compuesto de regeneración celular empleando “2 ml de frasco “B”, 2 ml de frasco “C” y 2 ml del frasco “D”, además de aplicar un volumen de 1.0 ml intramuscularmente en la región deltoidea del compuesto “B” y de ser necesario 3 ml más del compuesto de regeneración celular, empleando un volumen de 1 ml del frasco “B”, 1 ml del frasco “C” y 1 ml del frasco “D” este volumen se aplica localmente en el sitio que se pretende regenerar.

Finalmente, el “Compuesto de Regeneración Celular” CRC queda preparado como un compuesto en estado líquido color transparente con diversas tonalidades de color rojizo, para aplicación en forma de inyecciones, que es útil en Terapia Celular, Medicina Regenerativa y Antienvejecimiento, y que se integra por las cuatro soluciones base (“A”,”B”,”C” y “D”), descritas ampliamente en la descripción de la invención. El “CRC” forma una composición líquida integrada por una concentración de 2 x 109 células madre pluripotenciales, previamente analizadas y cuantificadas por microscopia confocal, la cual se prepara adicionando diversas sustancias en las concentraciones y condiciones ya antes descritas (oligometales, activina, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), Factor de Transformación Beta (TGF-�),Xácido ascórbico, tiamina, riboflavina, Factor de Crecimiento Neurológico, retinol, derivado procaínico G1, derivado procaínico G2, derivado procaínico G3, L-Cisteína, Factor de Crecimiento Mesodérmico A1 (FGM), Factor de crecimiento endodérmico K2 (FGE), Factor estimulador de células pluripotenciales (cKit), Interleucina 7 (IL7), interleucina 3 (IL-3), Factor Estimulador de Colonias de Monocitos (M-CSF) y Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos (GM-CSF)). Estas composiciones se extraen del frasco contenedor del “CRC” empleando siempre una jeringa con agujas estériles, aplicando procedimientos convencionales de asepsia y antisepsia (limpieza del tapón de goma con torunda con alcohol del 96º), y de forma inmediata un volumen de 5 a 6 ml “CRC” es aplicado por vía intravenosa, (vea la figura 1/3 No. 16) y por vía intramuscular en el mismo paciente región deltoidea (vea la figura 1/3 No. 17). El “CRC” debe ser almacenado a temperatura de refrigeración a 4ºC a 8ºC, tiene un periodo de caducidad de 10 días y no debe emplearse después de una semana. En la figura 1/3 en los No. 16 y No. 17, se refieren al protocolo que se debe seguir para aplicar las inyecciones con el “CRC”, una vez que se han preparado las cuatro soluciones base “A”, ”B”,”C” y “D”; descritas con anterioridad.

El “CRC” puede aplicarse por diversas vías de administración paraenteral, a una dosis de 0.1 mililitros por kilogramo de peso; generalmente se emplean cinco aplicaciones por vía intravenosa con un volumen de 5 mililitros del compuesto de regeneración celular y cinco inyecciones por vía intramuscular preferentemente en la región deltoidea (No. 17), inyectando 0,5 mililitros del mismo compuesto cada 7 días, obteniéndose efectos de regeneración celular para inducir: neurogénesis, hematopoyesis, condrogénesis, osteogénesis, vasculogénesis y angiogénesis que pueden ser valorados en la piel, pruebas de función renal, así como la desaparición de síntomas neurológicos, inflamación y dolor articular que se presentan por el envejecimiento biológico y por el desarrollo enfermedades crónico degenerativas. Este ciclo de diez inyecciones del compuesto puede emplearse en dos a tres ocasiones hasta completar treinta inyecciones en un periodo de cuatro meses. La aplicación del CRC es la más segura, ya que la mayoría de nuestros pacientes (más 700 pacientes con 10 aplicaciones del CRC cada uno) no han tenido que correr riesgos quirúrgicos y no han requerido del apoyo de radiología intervencionista, y solamente en algunos casos se han requerido procedimientos que exigen quirófano, y cirujanos subespecializados y anestesiólogos. Generalmente no se requiere terapia intensiva, y después de tres años de aplicación no se han observado complicaciones, sin embargo, todos los pacientes mejoran en forma suficientemente notoria apreciándose clínicamente, con signos y síntomas de regeneración celular. El “CRC” es en la actualidad la única opción real de regeneración celular para enfermedades incurables que no cuentan con tratamiento actual. El “CRC” es una fuente de sustitución de células muertas, desvitalizadas y de regeneración celular en tejidos enfermos, prolongan y mejoran la calidad de vida en personas sanas o enfermas. Las células madre circulantes liberadas por el “CRC” pueden incorporarse a órganos no dañados, y actuar como agentes antienvejecimiento, al aumentar el promedio de vida de las células del órgano y de la persona en cuestión (Méndez-Bolaina E, Sanchez-Gonzalez DJ et. al. . Effect of caveolin-1 scaffolding peptide and 17f-estradiol on intracellular Ca2+ kinetics evoked by angiotensin II in human vascular smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol 2007; 293: C1953 - C1961).

El objeto de esta invención es proporcionar un compuesto de regeneración celular no existente en el mercado, que permite aplicar células madre en forma de terapia celular, evitándose estudios de gen tipificación de HLA, e intervenciones quirúrgicas y de radiología intervencionista que se emplean en el implante o trasplante de células. El “CRC” actúa empleando el principio de regeneración celular, que de forma natural ocurre en los tejidos del cuerpo. Si consideramos que a lo largo de la vida los organismos sufren de un desgaste continuo, si no existiera la regeneración celular, la esperanza de vida de los seres vivos se reduciría en forma notable. Por otro lado, gran parte del amplio elenco de las enfermedades que afectan al ser humano tienen su origen en la degeneración y muerte de los diferentes tipos de células diferenciadas que conforman los tejidos y órganos de nuestro cuerpo, que se ven afectados en forma nociva de manera aguda como suele ocurrir en un infarto agudo de miocardio o de manera crónica como en las enfermedades degenerativas y el envejecimiento biológico. Queda ampliamente descrito que la invención a que se refiere la presente solicitud de patente de invención es un “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) que permite la administración intravenosa, intramuscular y local de células madre con fines terapéuticos en padecimientos crónicos degenerativos en los que se incluye la insuficiencia renal crónica y la Diabetes Mellitus, Después de describir ampliamente su composición y forma de preparar el “Compuesto de Regeneración Celular” los inventores Gerardo Martín González-López, Dolores Javier Sánchez- González y Carlos Armando Sosa-Luna, reclaman el “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) como su invención, declarando que a su real saber y entender han descrito en la forma más sencilla, la manera de llevar a cabo su invención, además de incluir los resultados de sus investigaciones y hasta llegar al desarrollo del “CRC”, los que constatan el funcionamiento de la presente invención al que han denominado “Compuesto de Regeneración Celular” “CRC” declarando que es la manera más segura de llevar células madre pluripotenciales al organismo de los seres humanos, evitándose en la mayoría de las veces de hospitalización y estudios de laboratorio (p. e. genotipificación como los haplotipos HLA).

Las enfermedades crónicas, degenerativas, el envejecimiento y las agresiones del medio ambiente contaminado por la industrialización humana aceleran considerablemente la reserva de células madre de los seres vivos limitando la capacidad de regeneración celular intrínseca de los organismos (Trejo-Bahena NI, Pérez-Astudillo LH, Orjuela-Henry DJ, Balderas-Cornelio A, Salinas-Cano F, Martínez-Martínez CM, Sánchez-González DJ. Estudio comparativo para determinar ácido hipúrico (HA) en orina mediante los métodos colorimétricos de Ogata y de Astudillo. Rev Sanid Milit Mex 2008; 62 (1): 35-41).

En diversas publicaciones científicas recientes señaladas anteriormente en los antecedentes de la presente solicitud de patente, se ha concluido que el número de células madre en la sangre es uno de los mejores indicadores para la salud en los seres humanos. Por lo tanto se requiere un compuesto que permita introducir células madre sanas en la sangre, esto se logra en forma segura aplicando el “Compuesto de Regeneración Celular” CRC, ampliamente descrito en la presente solicitud de invención.

El funcionamiento del “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) se explica debido a que incrementa las reservas de células madre incrementando la capacidad intrínseca de regeneración celular en pacientes y personas sanas, obteniéndose un mejor estado de salud y calidad de vida en muchas maneras, de esto no hay duda ya que cada día aumenta el número de investigaciones que comprueban que las células madre en circulación son el factor más importante en la salud de las personas, que permite la regeneración celular; cuanto mayor sea la cantidad de células madre en circulación, mayor será la habilidad del cuerpo para regenerarse. El funcionamiento de nuestra invención denominada “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) trabaja induciendo la capacidad regenerativa de las células madre en una suspensión líquida estéril que permite llevar en un volumen adecuado (6 a 0,5 ml ) un número suficiente de células madre (10,000,000 de elementos celulares) que permiten en forma segura y práctica elevar el número de células madre en la circulación sistémica o en forma local empleando diversas vías de administración farmacológica, como son: la intravenosa, intramuscular, local.

Al aplicar por vía intravenosa e intramuscular el “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC), permite la liberación inteligente de células madre pluripotenciales y moléculas bioactivas, las cuales promueven la activación de los elementos necesarios para que se lleve a cabo la regeneración celular, lo que facilita su ingreso a la circulación hacia los tejidos dañados y acelera la transdiferenciación, es decir las células madre adquieren las características propias de las células del tejido donde se implantan en forma más rápida. En el sitio de lesión se forman cambios en el microambiente que atraen a las células madres liberadas y activadas por el “CRC” que se encuentran circulantes. Las células madre circulantes del “CRC” pueden incorporarse a órganos no dañados, actuando como agentes antienvejecimiento al proveer de moléculas bioactivas de regeneración celular, que aumentan el promedio de vida de las células del órgano y de la persona en cuestión.

El mejor ejemplo de que el “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC) es un inductor de hematopoyesis, vasculogénesis, angiogénesis, miogénesis y neurogénesis, es el efecto de regeneración en la insuficiencia renal crónica, el cual se ejemplifica ampliamente en la presente solicitud de patente. Sin embargo, el “Compuesto de Regeneración Celular” (CRC), también es útil para tratar diversas afecciones y enfermedades de índole crónica, degenerativa o por envejecimiento celular biológico, obteniéndose buenos resultados en los pacientes en los que la enfermedad o padecimiento es el resultado de la destrucción y/o disfunción de células diferenciadas especificas, como por ejemplo: la enfermedad de Parkinson que es el resultado de la destrucción o degeneración de las neuronas dopaminérgicas del cerebro (González López GM et. al. Neurol Neurocir Psiquiat 2007; 40 (3): 80-91). Hemos observado como los pacientes que son tratados con 10 inyecciones intravenosas de “CRC” disminuyen los niveles de estrés oxidativo y aumentan los niveles de neurotransmisores principalmente dopamina, cuantificado mediante las modernas técnicas de impedanciometria transcutánea computarizada con el sistema de Escáner Intersticial (EIS); la Diabetes Mellitus, que es el resultado de la destrucción o degeneración de las células B pancreáticas y sus complicaciones vasculares, las cuales pueden ser tratadas con el CRC ya que se induce una regeneración celular induciendo vasculogénesis, angiogénesis, neurogénesis y miogénesis que permite revertir la historia natural o evolución clínica de los pacientes con insuficiencia renal crónica, con pérdida o disfunción de las células endoteliales, manifestándose con hipertensión arterial, y nefropatía diabética; además de la vasculopatía periférica que se presenta con insuficiencia venosa, arterial, úlceras e infecciones de difícil cicatrización en las extremidades inferiores, padecimiento conocido como pie diabético. (Sosa Luna CA et. al. Rev Sanid Milit Mex 2005 59(1):32-50 y Rev Sanid Milit Mex 2006 60(5):324-333), anemia falciforme, talasemia, distrofia muscular, Demencia de Alzheimer, Epilepsia, Esquizofrenia, Enfermedad Cerebro-vascular, (Sosa Luna CA et. al. Rev Sanid Milit Mex 1999; 53(2):123-128 y Sosa Luna CA et. al. Rev. Neurología, Neurocirugía y Psiquiatría 2002; 35(4):183-202) lesión traumática de la columna vertebral, degeneración de las células de Purkinje, isquemia cardiaca, insuficiencia hepática, distrofia muscular de Duchenne, artrosis, osteogénesis imperfecta, Síndrome de Down, y como apoyo regeneración en los pacientes con cáncer que se encuentra recibiendo esquemas de radioterapia y quimioterapia, etc.(Vásquez-Moctezuma I, Meraz-Ríos MA, Magaña M, Villanueva-López GC, Sánchez-González DJ. Quimiorresistencia en el melanoma. Informe preliminar. Actas Dermatol Dermatopatol 2006; 6: 8-10 y Torres-Salazar JJ, Sánchez-González DJ et. al. Distribución y estado de maduración de células dendríticas y activación de linfocitos CD4+ en adenocarcinoma prostático. Rev Mex Urol 2007; 67: 140-146)

El “CRC” tiene un efecto de antienvejecimiento biológico, esto se explica ya que al pasar el tiempo las células madre se vuelven más escasas, tal vez esta disminución sea la que condicione la mayor vulnerabilidad de las personas ancianas. Si nosotros inyectamos el “CRC” en la circulación de estos pacientes, tendrán más capacidad de regeneración celular, ya que en la circulación se incrementa el número de células madre activadas y liberadas por el “CRC” tienen la capacidad de migrar a partir de la circulación a los órganos, aparatos y sistemas que se están envejeciendo. Las células madre del “CRC” tienen la capacidad de transdiferenciarse en diferentes tipos de células diferenciales como: las endoteliales y otras más que conforman los órganos y tejidos del cuerpo, observándose una regeneración celular de la piel, mayor hidratación, luminosidad, turgencias de la piel, así como el anciano percibe un estado de revitalización (recuperación de la energía) (Tapia E, Sánchez-González DJ, et. al. Treatment with pyrrolidine dithiocarbamate improves proteinuria, oxidative stress and glomerular hypertension in overload proteinuria. Am J Physiol Renal Physiol 2008 Aug 27).

En los cromosomas de personas que presentan envejecimiento biológico, se observan entrecruzamientos de ADN y con frecuencia se producen roturas de una sola cadena; disminuyen las metilaciones del ADN y perdiéndose las secuencias teloméricas en dicho ácido nucleico. También al envejecimiento biológico se suma la agresión ambiental (en los que se incluyen infecciones diversas, accidentes, traumatismos y otras enfermedades cuyo origen y fisiopatología todavía no se conoce), así como la agresión endógena la cual se divide en las alteraciones del ADN heredados por nuestros padres, la cual se asocia a la aparición de enfermedades crónicodegenerativas como la Diabetes Mellitus, Hipertensión, cáncer etc. (Pou-López VC, Gallardo-Ollervides FJ, García-Mendoza JA, Sánchez-González DJ. Dexametasona transtimpánica en hipoacusia súbita neurosensorial tardía. Rev Sanid Milit Mex 2008; 62 (2): 57-65). Estas agresiones continúan con la serie de impactos nocivos, si bien la estructura primaria de las proteínas no se altera con el envejecimiento del ADN, las agresiones ambientales y endógenas aumentan los cambios posteriores a la traducción (Sánchez-González DJ et. al. Ozone exposure induces iNOS expression and tyrosine nitration in rat aorta. Environ Toxicol Pharmacol 2004; 17: 1-7 y Sánchez-González DJ et. al. Producción de iNOS y nitración de proteínas en la aorta de ratas expuestas a ozono. Rev Sanid Milit Mex 2005; 59 (4): 223-240).

Los daños en las proteínas pueden explicarse mejor por una mala alimentación (rica en carbohidratos, pobre en aminoácidos y proteínas) y daño en las mitocondrias, que también se deterioran con el tiempo, aunque no siempre los hacen de forma constante. Cuando el daño existe, es posible evidenciarlo estructuralmente con microscopía confocal de alta resolución (Sánchez-González DJ et. al. Microscopio confocal en el diagnóstico dermatológico de las enfermedades ampollosas autoinmunitarias. Actas Dermatol Dermatopatol 2007; 7: 9-15 e Imágenes de microscopía confocal en el diagnóstico de las enfermedades ampollosas autoinmunes. Rev Sanid Milit Mex 2006; 60 (2): 82-90).

En el envejecimiento y en organismos que reciben este tipo de nutrición rica en carbohidratos y pobre en proteínas, hemos observado como las mitocondrias son más susceptibles de sufrir alteraciones del ADN de las mismas condicionan estados de estrés oxidativo ocasionan alteraciones en los procesos bioquímicos de desaminación, oxidación, entrecruzamientos y glicosilación no enzimática, en las enzimas prostaciclina sintasa y tromboxano sintasa, ocasionando un desequilibrio en la biodisponibilidad del tromboxano liberado en la circulación y una reducción de la prostaciclina, provocando una mayor predisposición a la trombosis y vasoconstricción en los vasos sanguíneos de los pacientes que presentan Diabetes Mellitus e Hipertensión Arterial (Sosa Luna CA et. al. Rev Sanid Milit Mex 2005 59(1):32-50 y Rev Sanid Milit Mex 2006 60(5):324-333).

El efecto de regeneración celular es más evidente cuando, por motivo de alguna enfermedad, alguna estirpe celular diferenciada se encuentra bajo un gran reto o estrés; tal es el caso de las células productoras de insulina conocidas como células B de los islotes de Langerhans del páncreas, las cuales se encuentran disminuidos

o destruidas en los pacientes con Diabetes Mellitus, ocasionando una sensación de fatiga crónica, y cuando se ocasiona la insuficiencia de insulina, se observa el incremento de la glucosa sanguínea, apareciendo incremento en la orina, sed y aumento del apetito, sintomatología característica de esta enfermedad (Shamblott MJ; Clark GO, Cell therapies for type 1 diabetes mellitus. Expert Opin Biol Ther 2004 Mar; Vol. 4 (3), pp. 269-77).

En la figura 2/3 se presentan algunos resultados de nuestros experimentos aplicando “Compuesto de Regeneración Celular” CRC (Terapia Celular) en animales con insuficiencia renal en un modelo experimental de Diabetes Mellitus de nuestro laboratorio con insuficiencia de insulina, en ratas de la cepa wistar hiperglicémicas (glucosa sanguínea >300 mg/dl), por inducción con estreptozotocina. La aplicación de Compuesto de Regeneración Celular” CRC (Terapia Celular) permitió regenerar los riñones dañados, evidenciado por el aumento en la depuración de creatinina y el análisis morfológico. Podemos apreciar que la primera barra comenzando por la izquierda (animales de laboratorio sanos o control) presentan una depuración de creatinina promedio de 2,84 ml/min que equivale a una función renal del 94,66%; mientras que los animales de laboratorio representados por la segunda barra, enfermos con Diabetes Mellitus, sin tratamiento alguno durante la evolución de la hiperglicemia), presentaron un depuración de creatinina promedio de 1,84 ml/min, que equivale a una función renal del 61,3%, valor que permite hacer el diagnóstico de insuficiencia renal crónica (<70%). Los animales enfermos representados por la tercera barra con Diabetes Mellitus que recibieron un tratamiento nefroporotector estándar con un fármaco inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina Ramipril a una dosis 1 mg/kg de peso diariamente por vía oral presentaron una depuración de creatinina de 2,6 ml/min que equivale a una función renal de 86,6% y los animales enfermos con Diabetes Mellitus representados por la cuarta barra que recibieron el “Compuesto de Regeneración Celular” (Terapia Celular) presentaron una depuración de creatinina de 3,7 ml/min equivalente a una función renal de 123,3%, observándose regeneración celular. Los animales con Diabetes Mellitus referenciados en la quinta barra recibieron un tratamiento con fármaco inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa, Celecoxib a una dosis de 4 mg/kg de peso diariamente por vía oral. Estos animales presentaron un efecto nefrotóxico, observándose la presencia de proteinuria franca en la cápsula de Bowman, y una depuración de creatinina de 1,4 ml/min equivalente a una función renal de 46,66% en franca insuficiencia renal.

De forma natural, las células madre son liberadas desde la médula ósea y otros reservorios, atravesando el torrente sanguíneo hacia aquellos tejidos que tienen mayor necesidad. Cuando un órgano está sujeto a exigencias por enfermedad, este órgano dispara compuestos que emiten una señal para que las células madre sean liberadas a la circulación. El órgano inicia la cascada de la inflamación lanzando a la circulación compuestos que atraen a las células madre a este órgano en particular. Entonces las células madre que fueron liberadas por nuestro compuesto de regeneración celular, siguen el camino de la concentración de esos compuestos y dejan el torrente sanguíneo para migrar al órgano donde se están proliferando y comienzan a diferenciarse en células de ese órgano en particular. La habilidad del “CRC” de liberar las células madre activadas en la circulación a través de nuestra invención y los protocolos descritos de terapia celular para medicina regenerativa y antienvejecimiento son de gran relevancia ya que las células madre en circulación disminuyen al aumentar en edad y en las enfermedades crónicas y degenerativas (Pacheco-Ramírez MA, Rodríguez-Perales MA, López-Chavira A, Canul-Andrade LP, Martínez-Martínez CM, Sánchez-González DJ. Expresión de las sintasas de óxido nítrico en tumores glómicos de cabeza y cuello. Rev Sanid Milit Mex 2006; 60 (6): 369-378). De esta manera, se podría concluir que los niños y bebés tienen un “sistema de células madre” muy efectivo y no necesita del apoyo del “CRC”. Sin embargo, hemos aplicado “CRC” en niños menores de 10 años como apoyo al tratamiento de quimioterapia y radioterapia en leucemias agudas, así también en pacientes pediátricos con Síndromes Genéticos como el de de Down, Turner, etc. También en niños con problemas del neurodesarrollo, autistas, debilidad mental, parálisis cerebral infantil, déficit de atención y jóvenes con esquizofrenia. Estamos recibiendo testimonios con información acerca de experiencias muy fuertes indicando que la terapia celular con células madre podría brindar beneficios significantes para los niños pequeños (Aguilera-Hernández P, Chánez-Cárdenas ME, Sánchez-González DJ et. al. Regulación de las sintasas de óxido nítrico en el estriado de rata en el modelo de la enfermedad de Huntington inducido por quinolínico. Arch Neurocien Mex 2006;

11: 31).

La terapia celular empleando el “CRC” es la forma más segura de tratar los daños que sufre el material genético que se encuentra en el núcleo celular y las mitocondrias. Estos daños son uno de los factores más relevantes del proceso de envejecimiento biológico y la senescencia celular. En los ancianos se producen un mayor número de alteraciones estructurales de los cromosomas (material genético) los cuales están compuestos del ácido desoxirribonucléico (ADN) que se manifiestan con la sintomatología propia del envejecimiento como deterioro de la función cardiovascular, osteomuscular, presbiacusia y presbiopía, etc (Béjar-Cornejo F, Olivares D, Cantero MA, Sánchez-González DJ. Grosor corneal determinado mediante topografía corneal ORBSCAN en pacientes diagnosticados con glaucoma en población mexicana. Rev Sanid Milit Mex 2007; 61 (5): 310-319). Las células madre contienen ADN intacto así como mitocondrias saludables y muchas proteínas que tienen la capacidad de revertir muchos de los efectos del envejecimiento. Las células madre son ricas en la enzima telomerasa la cual puede disminuir la pérdida de las secuencias teloméricas del ADN en las células envejecidas o senescentes. Desde el punto de vista de “terapia génica”, podemos considerar que las células madre son el mejor vector, y pueden ser consideradas como “micro-esferas inteligentes” (ya que son organismos vivos microscópicos, con la total capacidad de autorreplicación así como de tropismo, es decir reconocen y viajan al sitio del daño o lesión, así como de transdiferenciación de diferencian en el tipo celular faltante o lesionado) (Sánchez-González DJ et. al. Efectos biológicos de campos electromagnéticos de frecuencia industrial. Modelo en ratas. Rev Sanid Milit Mex 2007; 61 (6): 371-380). Ya que contienen en su interior el genoma humano completo, el cual, a diferencia de los protocolos de terapia génica, se encuentra intacto, indiferenciado y puede dar origen a todas las proteínas que dan origen a los diverso tipos celulares que constituyen el cuerpo humano, cabe resaltar que en la terapia celular con células madre, las células madre no han sido modificadas, alteradas o ni siquiera tocadas en su maquinaria genética (ADN), solamente han sido protegidas de todos los agentes nocivos antes mencionados como son la irradiación, agentes infecciosos, etc. De manera que las células que se trasplantan tienen una edad biológica de cero años (nuevas).

A continuación presentamos diversos ejemplos de la utilidad en el empleando de “Compuesto de Regeneración Celular (CRC):

Ejemplo 1: Las enfermedades crónicas y las neurodegenerativas son un grupo de entidades clínicas que se diagnostican cada vez con más frecuencia en nuestro país y en el mundo. Entre estas enfermedades se incluyen: la demencia de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la Esclerosis Lateral Amiotrófica (Aguilera P, Sánchez-González DJ et. al. Time-related changes in constitutive and inducible nitric oxide synthases in the rat striatum in a model of Huntington's disease. Neurotoxicology 2007; 28 (6):1200-1207). La particularidad que guardan estas entidades clínicas es que no cuentan con una forma de tratamiento que limite o revierta el severo deterioro e incapacidad que producen. Tienen un curso invariablemente progresivo, incapacitante y con mortalidad a corto plazo en algunas, e incapacidad significativa en todas ellas. Dado el poco efecto curativo de los tratamientos actuales, se ha explorado el uso de la terapia celular como una alternativa terapéutica. La reparación cerebral mediante la aplicación de trasplantes celulares es el foco de atención en las investigaciones recientes. Adicionalmente, el sistema nervioso tiene privilegios inmunológicos que reducen la necesidad de los inmunosupresores habituales en trasplantes, incluso en los heterólogos. Adicionalmente, el trasplante autólogo de células madre favorece el que estas células puedan establecerse en el cerebro y transdiferenciarse a neuronas.

Ejemplo 2: Los pacientes con angina refractaria y con antecedentes de isquemia al miocardio o infarto, cuando ya no pueden ser tratados con terapias convencionales como son la angioplastias coronarias y colocaciones de Sten, con fracción de eyección de 37.5% después de recibir la terapia celular con “CRC” pueden mejorar en meses su fracción de eyección quedando en un 47% y disminuyendo los requerimientos de medicamentos y la sintomatología. Los pacientes con insuficiencia cardiaca con clase funcional III y fracción de eyección basal del 30% mejoran después de cinco a quince sesiones de terapia celular con “CRC”. Todos los pacientes mejoraran a una clase funcional II. Algunos de los estudios de SPECT Sestamibi Tc99m a los posteriores al tratamiento con “CRC” durante el seguimiento clínico muestran mejoría por la regeneración celular traducida en un incremento de la vascularización y viabilidad del miocardio. Uno de nuestros pacientes con enfermedad de tres vasos coronarios fuera de tratamiento por angioplastía coronaria después de haber sido valorada por el especialista Dr. Hugo Gutiérrez Leonard en el Hospital Central Militar, mejoró la perfusión miocárdica SPECT Sestamibi Tc99m después de recibir cinco inyecciones intravenosas del “CRC” encontrándose una mejoría notable evidenciada por los mismos familiares, ya que ahora podía caminar más cuadras sin presentar dolor en el tórax, cansancio y falta de aire; el estudio mostró isquemia en un sola rama coronaria es decir de los tres vasos con isquemia se regeneraron dos, con la aplicación de células madre.

Ejemplo 3: Insuficiencia Renal Crónica y complicaciones de la Diabetes Mellitus, en la figura 3/3 se muestra una gráfica con el promedio del resultado de la depuración de creatinina antes y después del tratamiento con “CRC” en nuestros pacientes con insuficiencia renal crónica, obtenidos de los estudios de depuración de creatinina antes y después de recibir diez aplicaciones del “CRC” por vía intravenosa e intramuscular. Presentaron reversión en la progresión del deterioro de la función renal en sus estudios de laboratorio clínico y sintomatología, sin precedentes (Cruz C, Correa-Rotter R, Sánchez-González DJ et. al. Renoprotective and antihypertensive effects of Sallylcysteine in 5/6 nephrectomized rats. Am J Physiol Renal Physiol 2007; 293: F1691–F1698 y Chirino YI, Trujillo J, Sánchez-González DJ et. al. Selective iNOS inhibition reduces renal damage induced by cisplatin. Toxicol Lett 2008;176 (1): 48-57). En la figura 2/3 se mostró la grafica, elaborada con los resultados de nuestros experimentos realizados en animales de laboratorio, ratas cepa wistar con nefropatía diabética por Diabetes Mellitus; inducidas con una inyección intraperitoneal de estreptozotocina.

Se pueden observar cambios a las 5 a 10 semanas después del tratamiento con “CRC”, que corroboran los resultados de la depuración de creatinina en coherencia con los obtenidos en humanos en los expedientes clínicos (Pedraza-Chaverri J, Yam-Canul P, Chirino YI, Sánchez-González DJ et. al. Protective effects of garlic powder against potassium dichromate-induced oxidative stress and nephrotoxicity. Food Chem Toxicol 2008; 46 (2): 619-627 y Segoviano-Murillo S, Sanchez-Gonzalez DJ et. al. S-allylcysteine ameliorates ischemia and reperfusion induced renal damage. Phytother Res 2008; 22 (6): 836-840). Los experimentos en animales figura 2/3, no sólo nos permitieron evaluar la función, sino que también pudimos observar los cambios en el microscopio de los glomérulos en los cortes de histología renal. Los cortes de los animales control fueron similares a los cortes de ratas diabéticas tratadas con nuestro tratamiento de Medicina Regenerativa que se ofrece a los pacientes en la SITECEM (Orozco-Ibarra M, Medina-Campos ON, Sanchez-Gonzalez DJ et. al. Pedraza-Chaverri J. Evaluation of oxidative stress in dserine induced nephrotoxicity. Toxicology 2007; 229: 123-135; Yam-Canul P, Chirino YI, Sánchez-González DJ et. al. PJ34, a poly adenosine diphosphate-ribose polymerase inhibitor, attenuates chromate-induced nephrotoxicity. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2008; 102 (5): 483-488 y Yam-Canul P, Chirino YI, Sánchez-González DJ et. al. Nordihydroguaiaretic acid attenuates potassium dichromate-induced oxidative stress and nephrotoxicity. Food Chem Toxicol 2008; 46 (3):1089-1096).

Ejemplo 4: en las enfermedades neurodegenerativas, a partir de los años 2001 y 2003, se reportaron los resultados de estudios controlados de trasplante de neuronas de dopamina de origen embrionario en pacientes con enfermedad de Parkinson ligero-moderado. En estos estudios se concluyó que la aplicación de implantes múltiples, incluyendo la sustancia nigra y cuerpo estriado en modelos animales producen mejor resultado. Igualmente, estos hallazgos se confirmaron en pacientes, los cuales mostraron mejoría clínica al igual que con el uso de la tomografía por emisión de positrones con fluorodopa (PET), y sin desarrollar complicaciones motoras. El objetivo de implantar células madre en la enfermedad de Parkinson es reconstruir la vía neuronal nigroestriada con precursores de células madre neurales o injertos de neuronas de dopamina. El trasplante de neuronas dopaminérgicas derivadas de células madre se ha intentado con el objetivo de estimular sinapsis local o liberación de citoquinas por el injerto. Los pacientes con enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson mejoran clínicamente con el tratamiento de células madre humanas disminuyendo la torpeza generalizada y la lentitud en la realización de movimientos; mejorando la escasez de motilidad espontánea, disminuye el temblor de reposo y la rigidez (Sánchez-González DJ et. al. Óxido nítrico en el sistema nervioso central. Neuronas nitrérgicas. Neurol Neurocir Psiquiat 2004; 37 (2): 7378). Los pacientes recuperan la respuesta a la administración farmacológica del precursor (levodopa). Hoy la aplicación del “CRC” es una alternativa para los pacientes con Parkinson. Se pueden realizar estudios de resonancia magnética al inicio y a los 6 meses de la terapia celular, con espectroscopia de N-acetilaspartato (NAA)/creatina (Cr) y estudios de perfusión SPECT con Tc 99m sestamibi. Los resultados clínicos han sido muy satisfactorios. No han ocurrido complicaciones y todos los pacientes mejoran sus parámetros clínicos.

Ejemplo 5: en las demencias que son síndrome clínico caracterizado por pérdida severa de las habilidades cognitivas y emocionales adquiridas que interfieren con el desempeño diario y la calidad de vida. La demencia puede ser ocasionada por más de 55 enfermedades, algunas no progresivas y ocurre principalmente en etapas tardías de la vida. La prevalencia es del uno % en personas de 60 años de edad y se duplica cada cinco años, para incrementarse hasta llegar al 30 o 50 % en las personas de 85 años y mayores.

Existen múltiples formas de demencia; sin embargo, la más común es la demencia de Alzheimer, que explica entre el 80 y el 85 % de las causas de demencia. Otras formas son la demencia vascular (por infartos cerebrales múltiples); demencia en enfermedad de Huntington, demencia fronto-temporal, demencia con cuerpos de Lewy y demencia por SIDA, entre otras. De la totalidad de los casos con demencia, menos del 15 % son susceptibles de tratamiento con el “CRC”

No obstante que existen varios medicamentos útiles en el tratamiento de la demencia, ninguno de ellos ha sido eficaz en detener la progresión inevitable de esta enfermedad neurodegenerativa. La frecuencia y prevalencia de este trastorno se incrementa paulatinamente en el mundo. Este hecho se debe principalmente al incremento en la esperanza de vida de la población. Una estimación efectuada por nuestro grupo de investigadores en el año 1999 reportó que en México existía una prevalencia de 814 mil personas con trastornos cognitivos asociados a la edad, y más de medio millón de mexicanos con demencia de tipo Alzheimer. Los pacientes con Alzheimer mejoran su capacidad intelectual y memoria. Los autistas y niños con síndrome de Down mejoran su capacidad de lenguaje, articulación de palabras, mejorando las comunicaciones con sus padres y maestros.

Ejemplo 6: Tenemos grandes expectativas debido a la mejoría que se observa en pacientes con padecimientos neurológicos, parálisis facial por lo cual hemos utilizado el “CRC” en pacientes con síndrome de Down, autismo, sordera, mudez, secuelas por eventos vasculares cerebrales y todos han presentado mejoría en la síntomas y signos que presentan, todos estos se han tratado con protocolo externos y estamos en proceso de construcción de una área de internamiento para aplicar la terapia celular con “CRC” en pacientes con padecimientos mentales y psiquiátricos graves, como la Esquizofrenia Crónica, y tenemos un acuerdo de cooperación e investigación con la Asociación Mexicana de Amigos de Pacientes Esquizofrénicos A.C. (AMAPE).

Ejemplo 7: En lesiones traumáticas artrosis, esguinces, para una recuperación más rápida de una cirugías o durante la lesión traumática de la médula espinal no es una enfermedad neurodegenerativa. Sin embargo, en nuestro laboratorio hemos estado trabajando en la búsqueda de la metodología más apropiada para buscar la reparación de la médula espinal dañada. Desafortunadamente, jóvenes y adultos jóvenes presentan secuelas de diferente magnitud que van desde hernias discales con una excelente respuesta al tratamiento con “CRC” hasta consecuencia de parálisis por lesión medular ocasionada en accidentes o enfermedades degenerativas y congénitas. Por lo anterior, estamos investigando clínicamente el efecto del “CRC” para tratar de reparar la médula espinal dañada. En nuestro país no se han realizado estudios de frecuencia y prevalencia de lesión traumática de la médula espinal; no obstante, se ha estimado que la frecuencia anual de personas con daño en la médula espinal es de 40 casos por un millón de habitantes (Estados Unidos), lo cual representa una incidencia de 11 mil casos nuevos cada año. En esta estimación no se incluyen los casos de las personas que mueren en el accidente. Las causas más frecuentes de lesión en la médula espinal son, en forma consistente, los accidentes en vehículo (41 %), lesiones por violencia (22 %) y caídas (21 %). Debido a que la edad de presentación de la lesión espinal es en jóvenes y adultos jóvenes, con potencial para prolongada sobrevida, la prevalencia de esta entidad clínica es bastante alta y se incrementa cada año. Se ha estimado que más de un cuarto de millón de personas en los Estados Unidos viven en la actualidad con incapacidad, por secuelas debidas a lesión de médula espinal. La mayoría de los casos de trauma en la médula espinal ocurre en adultos jóvenes. El promedio de edad de estos casos es de 28.7 años; la mayor parte de los traumas medulares ocurrieron entre los 16 y los 30 años de edad. El 77.8 % de los casos de lesión espinal son del sexo masculino, por lo general jóvenes o adultos jóvenes que se encuentran en etapa

productiva o en el inicio de la misma. Se ha observado que más de la mitad de los enfermos (64.2 %) tenían empleo

antes de sufrir la lesión medular. Posteriormente al evento traumático, al décimo año de evolución sólo una tercera

parte de los pacientes con Paraplejia volvían a tener empleo remunerativo. Por lo anterior, se considera que esta

5 entidad clínica tiene importante repercusión económica en el paciente y en su familia, por los costos directos e

indirectos que produce. El gasto promedio anual por el cuidado de salud del enfermo y los costos directos, varían de

acuerdo con la severidad de la lesión. Sin embargo, los costos indirectos que incluyen pérdida del salario, pérdida de

beneficios suplementarios y productividad, se estiman que son en promedio alrededor de los 60 mil dólares por año;

no obstante, esta cifra puede variar dependiendo del nivel educativo del paciente, el tipo de empleo y el historial 10 laboral antes del accidente, además de la severidad de la lesión medular. Por lo anterior, consideramos justificada la

aplicación del “CRC” como una opción alternativa terapéutica para este tipo de problemas.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1) Procedimiento para la preparación de un Compuesto para la Regeneración Celular que comprende las siguientes etapas:

   a) proporcionar una línea purificada de células madre pluripotenciales a partir de, o bien células madre criopreservadas a -198ºC que se descongelan gradualmente aumentado la temperatura a una velocidad de 2 ºC/min hasta alcanzar la temperatura de -20 ºC, o bien células madre en polvo en estado de deshidratación total obtenido por un proceso de liofilización convencional, en donde las células madre no han sido obtenidas mediante métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima;

   b) preparar una solución base “A” de acuerdo con el siguiente procedimiento:

   i) disolver cloruro de sodio (NaCl), lactato de sodio (NaC3H5O3), cloruro de calcio (CaCl2) y cloruro de potasio (KCl) en agua bidestilada hasta alcanzar la siguiente proporción iónica: Na+= 130 mEq, Cl-= 109 mEq, lactato= 28 mEq, Ca2+ = 3 mEq y K+ = 4 mEq, alcanzando una osmolaridad de al menos 273 mOsm/L y no superior a 300 mOsm/L en condiciones de esterilidad y en un ambiente controlado a una temperatura de refrigeración menor de 16°C y mayor de 4°C;

   ii) esterilizar la solución de la sub-etapa i) mediante un proceso tradicional de esterilización tal como el de autoclave;

   iii) agregar a la solución de la sub-etapa ii) una solución estéril con 55 mg de cloruro de zinc, 16,9 mg de sulfato cúprico pentahidratado, 38,1 mg de sulfato de magnesio, 1,3 mg de yoduro de sodio, 14 mg de fluoruro de sodio, 163,9 mg de cloruro de sodio, 10 mg de tiamina, 250 mg de piridoxina, 1000 mg de ácido ascórbico, 1,0 mg de activina, 0,2 mg de factor estimulador de células pluripotenciales (C-kit), 0,6 mg de derivado procaínico G1, 0,4 mg de derivado procaínico G2, y 0,4 mg de derivado procaínico G3;

   c) hidratar las fuentes de células madre de la etapa a) en la solución base “A” obtenida en la etapa b) a una temperatura de 8 ºC;

   d) seleccionar las células madre prehidratadas con morfología saludable y recogerlas en una jeringa estéril;

   e) suspender aproximadamente 1.000.000.000 células madre en 500 ml de la solución base “A”, proporcionando así una solución base “A” enriquecida con células madre;

   f) preparar una solución base “B” mezclando en forma controlada y en condiciones estériles 500 ml de solución “A” con una concentración de 2.000.000 células madre, con 1,0 mg de L-cisteína, 0,5 μg de interleucina 7 (IL7),X0,5XIgXdeXinterleucinaX3X(IL-3), 0,1 mg de Factor de crecimiento mesodérmico A1 (FGM), 0,1 mg de factor estimulador de colonias de monocitos (M-CSF), y 0,1 mg de factor estimulador de colonias de granulocitos (GM-CSF), almacenados a 8º C durante no más de una semana, o a -4º C durante no más de cinco semanas,

   o a -20 ºC durante no más de veinticuatro semanas;

   g) preparar una solución base “C” mezclando en forma controlada y en condiciones estériles 500 ml de la solución “B” con 0,3 mg de factor de transformación de crecimiento beta (TGF-B) y 0.2 mg de factor de crecimiento endodérmico K2 (FGE), almacenados 8º C por no más de una semana, o a -4º C por no más de cinco semanas, o a -20 ºC por no más de veinticuatro semanas;

   h) preparar una solución base “D” mezclando 500 ml de solución “C” con 100 mg de retinol, 0,5 mg factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y 0,2 mg de factor de crecimiento neurológico (FGFN).

   i) proporcionar el Compuesto para la Regeneración Celular integrado por las cuatro soluciones base “A”, “B”, “C” y “D”.

   2) Compuesto para la Regeneración Celular obtenido mediante el procedimiento de la reivindicación 1.

   3) Uso del Compuesto para la Regeneración Celular obtenido según el procedimiento de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar padecimientos crónicos degenerativos que requieren de una regeneración celular.

   4) Uso según la reivindicación 3, en el que los padecimientos crónicos degenerativos se seleccionan del grupo que consiste en insuficiencia renal crónica, insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica, diabetes mellitus, artrosis, fibromialgias, demencias, enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, vitíligo, hernias discales, síndrome de Down, autismo, esquizofrenia, pérdida de la audición y otros sentidos, parálisis e insuficiencia vascular arterial o venosa.

   OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

   N.º solicitud: 201190033

   ESPAÑA

   Fecha de presentación de la solicitud: 11.11.2009

   Fecha de prioridad:

   INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

   51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

   DOCUMENTOS RELEVANTES

   Categoría

   56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

   A

   US 20050181502 A1 (FURCHT ET AL.) 18/08/2005, ver resumen; párrafos [0019], [0027], [00350037], [0089-0097], [0110-0115], [0128-0141], [0231-0238], [0246-0264]; y figuras 5-14. 1-4

   A

   WO 2004085630 A1 (MEDVET SCIENCE PTY LTD & ANGIOBLAST SYSTEMS INC) 07/10/2004, ver resumen; página 22, líneas 19-28; reivindicaciones 2, 3, 11, 17, 66 y 67; figuras. 1-4

   A

   TARE, R.S., et al. Skeletal stem cells: phenotype, biology and environmental niches informing tissue regeneration. Molecular and cellular endocrinology. . Vol. 288, nº 1-2, páginas 11-21. ISSN 0303-7207. Ver resumen, introducción, párrafo 4.1, figura 1 y conclusiones. 1-4

   Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

   El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

   Fecha de realización del informe 05.11.2012

   Examinador B. Pérez Esteban Página 1/4

   INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

   Nº de solicitud: 201190033

   CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD C12N5/071 (2010.01)

   A61K35/12 (2006.01) A61P43/00 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

   A61K, A61P

   Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXTE, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP.

   Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

   OPINIÓN ESCRITA

   Nº de solicitud: 201190033

   Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 05.11.2012

   Declaración

   Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

   Reivindicaciones Reivindicaciones 1-4 SI NO

   Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

   Reivindicaciones Reivindicaciones 1-4 SI NO

   Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

   Base de la Opinión.-

   La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

   Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

   OPINIÓN ESCRITA

   Nº de solicitud: 201190033

   1. Documentos considerados.-

   A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

   Documento

   Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

   D01

   US 20050181502 A1 (FURCHT et al.) 18.08.2005

   D02

   WO 2004085630 A1 (MEDVET SCIENCE PTY LTD & ANGIOBLAST SYSTEMS INC) 07.10.2004

   D03

   TARE, R.S., et al. Skeletal stem cells: phenotype, biology and environmental niches informing tissue regeneration. Molecular and cellular endocrinology. . Vol. 288, nº 12, páginas 11-21. ISSN 0303-7207. Ver resumen, introducción, párrafo 4.1, figura 1 y conclusiones.

2. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

   La presente solicitud de patente describe y reivindica un procedimiento de preparación de un compuesto de regeneración celular que consiste en preparar una linea purificada de células madre pluripotenciales, a la que se añaden a diferentes soluciones que contienen compuestos inorgánicos y factores de crecimiento, los cuales, empleados en determinadas combinaciones, permiten la diferenciación de las mencionadas células madre hacia procesos de condrogénesis, hematopoyesis y osteogénesis en un caso, de angiogénesis y vasculogénesis en otro, y de neurogénesis, angiogénesis y vasculogénesis en otro. La solicitud reivindica también el compuesto preparado mediante este procedimiento, y su uso para preparar un medicamento para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas.

   A pesar de existir en el estado de la técnica numerosos documentos en los que se divulga la diferenciación de células madre a los diferentes linajes celulares, y los medios de cultivo y factores necesarios para obtener cada tipo de tejido, en ningún documento se ha encontrado la composición de la invención tal y como está descrita y reivindicada, por lo que las reivindicaciones 1 a 4 de la presente solicitud se consideran nuevas y con actividad inventiva según los artículos 6 y 8 de la ley 11/1986 de Patentes.

   En el documento D01, por ejemplo, se describe el uso terapéutico de células madre capaces de formar células de múltiples tipos de tejido. En este documento se detallan los medios de cultivo empleados, y los factores necesarios para que la diferenciación celular ocurra en uno u otro sentido, y se consigue diferenciación a tejido mesodérmico (osteoblastos y condroblastos) y a células endoteliales, hematopoyéticas y neuronales. Sin embargo, aunque algunos de los factores y compuestos empleados en D01 coinciden con los de la solicitud internacional, las composiciones utilizadas son totalmente diferentes, por lo que D01 no afecta la novedad ni la actividad inventiva de la solicitud.

   En el documento D02, los inventores aíslan células madre mesenquimales de nichos perivasculares, identifican los marcadores de superficie que las caracterizan, y las diferencian in vitro a osteocitos, adipositos y condrocitos (ver página 22, líneas 19 a 28). De nuevo, las composiciones descritas para cada diferenciación celular difieren de las de la solicitud, que, por tanto, tendría novedad y actividad inventiva a la luz de lo divulgado en D02.

   En el documento D03 se obtienen células madre de médula ósea humana y se estudian los factores de crecimiento y los componentes de la matriz necesarios para su diferenciación, con especial hincapié en la diferenciación condrogénica y su uso para regeneración musculoesquelética. Tampoco en este caso se emplea la composición reivindicada en la solicitud para favorecer la diferenciación de las células madre, por lo que D03 no afecta la novedad ni la actividad inventiva de la solicitud.

   Informe del Estado de la Técnica Página 4/4