JP4291442B2 - Arabinofuranosidase - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用し、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに対する加水分解活性を有するアラビノフラノシダーゼ、および糖転移活性を有するアラビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、当該アラビノフラノシダーゼ生産菌株、および当該アラビノフラノシダーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アラビノースは天然に存在する五単糖であり、適度な甘みを有する。自然界ではフラノースの形で、アラビノキシランやアラビナン、アラビノガラクタンとして存在している。アラビノースを主な構成糖とするアラビナンは、ある種の種子、果実、野菜、樹皮あるいは木材などから抽出され、構造解析がなされている。基本的にはα−Ｌ−アラビノフラノース残基が（１→５）結合した主鎖のところどころに、Ｏ−３位あるいはＯ−２位でα−Ｌ−アラビノフラノース残基が結合した構造を持つことが示されている。
【０００３】
近年、世利らにより、単糖Ｌ−アラビノースが小腸スクラーゼを阻害すること、また経口投与により砂糖負荷後の血糖上昇、インスリン上昇を抑制することが明らかにされた（世利他、メタボリズム、４５巻、p．１３６８（１９９６）；Ｋ．Ｓｅｒｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４５，p．１３６８（１９９６））。さらに、讃井らにより、Ｌ−アラビノースはスクロースとともに摂取した場合、スクロースの消化吸収を抑制し、そのエネルギー利用を低減することが示され（讃井他、日本栄養食料学会誌、５０巻、ｐ．１３３（１９９７））、その生理活性とともに製造法に関して注目が高まっている。
【０００４】
アラビノース含有多糖を分解する酵素がアラビナナーゼであり、現在までその作用様式からエンド型とエキソ型の二系統が知られている。エンド型のアラビナナーゼはエンド−（１→５）−α−Ｌ−アラビナナーゼ（EC.3.2.1.99）と呼ばれており、エキソ型はアラビノフラノシダーゼ（EC.3.2.1.55）と呼ばれている。
【０００５】
アラビノフラノシダーゼはこれまで様々な起源のものが報告されている。現在のところ、以下の２種類に大きく分類されている（Ｇ．Ｂｅｌｄｍａｎら、アドバンシス・イン・マクロモレキュラー・カーボハイドレート・リサーチ、１巻、ｐ．１（１９９７））。
（１）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＡ
（２）α−Ｌ−アラビノフラノジターゼＢ
【０００６】
この分類は、ビートアラビナンなどのアラビノース含有多糖への作用の有無によるものである。しかしながら、アラビノース含有多糖の構造が未だ不明瞭であり、そのためアラビノフラノシダーゼの分類についてもはっきりしていないのが現状である。アラビノース含有多糖に作用するアラビノフラノシダーゼにおいて、今まで発見されている酵素の多くは、ビートアラビナンから（１→２）または（１→３）結合したα−Ｌ−アラビノース残基を優先的に加水分解し、その結果直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを生じて溶液中から沈殿する（ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｂ．Ｖ．、エンザイムズ・イン・バイオマス・コンバージョン、Ｐ．４２２（１９８４）；ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｂ．Ｖ．，Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，ｐ．４２２（１９８４））。アラビナンの主鎖である直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンはほとんど分解されないため、これら公知の酵素でビートアラビナンを高収率で単糖まで分解することは困難であった。
【０００７】
ワイン・果汁ジュースなどでしばしば発生する濁りは、この直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを主成分とするものである（Ｍ．Ｐ．Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅら、ファイトケミストリー、３３巻、Ｐ．２２７（１９９３）；Ｍ．Ｐ．Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅ ｅｔ．ａｌ．、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、Ｐ．２２７（１９９３））。上述した理由により、公知のアラビノフラノシダーゼによってこれら濁りの発生を防止することや濁りを除去することは困難であった。
【０００８】
様々なグリコシダーゼがその特異性を利用して多糖やオリゴ糖などの構造解析に広く利用されている。アラビノース含有多糖などの構造研究には基質特異性の高い酵素が必須であるが、これまで基質特異性が明確になっているアラビノフラノシダーゼは数少ない。我々は幾つかのアラビノフラノシダーゼの基質特異性について、３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシド位置異性体（１→２、１→３、１→５）等を用いて詳細に調べた。これまで（１→２）あるいは（１→３）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基を優先して切断する酵素の存在はいくつか確認したが、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的な酵素は得られていない。
【０００９】
近年、グリコシダーゼの糖転位反応により様々なオリゴ糖や配糖体が合成され、食品分野を中心に幅広く利用されている。しかしながら、アラビノフラノシダーゼによる糖転位反応についてはほとんど報告がなく、アラビノオリゴ糖やアラビノース配糖体の応用例も知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に高い特異性を有して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率良く分解することができ、またその高い基質特異性から研究用試薬としても利用価値の高いアラビノフラノシダーゼ、および糖転移活性を有し各種アラビノオリゴ糖やアラビノース含有配糖体の製造に利用できるアラビノフラノシダーゼを提供するものである。また、当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、新規な性質を有するアラビノフラノシダーゼ、特に直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できる酵素、および糖転移活性を有する酵素の生産が可能な微生物を見い出すべく鋭意研究を行った結果、ストレプトマイセス属に属する放線菌に由来するアラビノフラノシダーゼが（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に高い特異性を有して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できることを見い出し、また本菌に由来する別の酵素が糖転移活性を有することを見い出し、この菌株の培養液から目的とする酵素を取り出してその性質を解明し、発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できるアラビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼを生産する菌および当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、糖転移活性を有するアラビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼを生産する菌株および当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は、これらの遺伝子を有する菌株を培地中に接種し、培養してアラビノフラノシダーゼを菌体内または培地中に蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、アラビノフラノシダーゼの製造法を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のアラビノフラノシダーゼを生産する菌としては、発明者らによって新たに分離され、ＧＳ−９０１と名付けられた株があるが、当該菌株は以下に示すような菌学的性質を有する。
【００１６】
１Ａ．形態的性質
栄養菌糸は、合成寒天培地および天然培地において良く発達し、不規則に分岐する。
胞子は、イースト・麦芽寒天培地、オートミール寒天培地、スターチ・無機塩寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡観察によると、胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で、胞子はらせん状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、培養の後期には長い鎖状を呈する。胞子の表面はとげ状で、形状は円筒形である。
【００１７】
１Ｂ．培地上での生育状態
各種培地で３０℃、１４日間培養したときの肉眼的観察結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】

【００１９】
１Ｃ．生理的性質
（１）生育至適温度
２５〜３７℃である。４０℃でもわずかに生育する。
（２）生化学的性質
（ａ）ゼラチンの液化
陽性
（ｂ）デンプンの加水分解
陽性
（ｃ）メラニン様色素生成
陽性
（ｄ）硝酸塩の還元
陽性
（ｅ）食塩に対する耐性
７％まで耐性がある
（３）炭素源の利用性
ＧＳ−９０１株の炭素源の利用性を表２に示した。なお、培地はプリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ９）を使用し、２８℃、１４日間培養後に判定した。
【００２０】
【表２】

【００２１】
（注）＋＋：顕著に利用、＋：利用する、−：利用しない
【００２２】
（４）細胞壁のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）のタイプ,
ＬＬ−ＤＡＰ
【００２３】
以上の性質から、本菌株が放線菌に属することは明らかであって、「放線菌の同定実験法」（日本放線菌研究会編、1985年）等を参照して分類学的位置を検討した結果、Streptomyces sp.と同定した。
【００２４】
この放線菌は下記のとおり命名し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
Streptomyces sp.GS-901（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６９１６）
【００２５】
次に上記微生物を培養して、培養物から新規アラビノフラノシダーゼを採取する方法について説明する。
使用可能な培地としては、通常の微生物の培養に用いられる培地で本発明の菌株が生育可能であれば特に制限はないが、例えば、有機炭素源および窒素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、ビートアラビナン、ペプトン、酵母エキスなどが適しており、無機塩類としてはリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、食塩などの添加が有効である。その他、必要に応じて菌の生育、酵素の生産に必要な各種有機物、無機物を適宣添加することができる。
【００２６】
上記培地での培養方法は、振盪培養または発酵槽等を用いての、通気撹拌培養が適している。培養温度は、生育できる範囲内なら特に限定されないが、30℃付近が望ましい。
【００２７】
上述のようにして培養した後、培養物中から、目的物質であるアラビノフラノシダーゼを採取および精製するには、一般的な酵素の採取および精製方法に準じて行うことができる。すなわち、ろ過あるいは遠心分離等の方法により、まず培養液から菌体等の固形分を除去し、粗酵素液を得る。このようにして得られる粗酵素液はそのまま使用することもできるが、この粗酵素液を通常の酵素精製法、すなわち硫安塩析、アセトン、アルコール等による有機溶媒沈殿、限外ろ過、イオン交換樹脂、ゲルろ過法などの手法を、単独あるいは組み合わせて用いることで、より純度の高いアラビノフラノシダーゼを得ることができる。
【００２８】
アラビノフラノシダーゼの活性は、次に示す方法により測定する。すなわち、２ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド０．２５ml、マクイルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．０）０．２mlに、酵素液０．０５mlを加え、４０℃で１０分間反応させる。０．５％炭酸ナトリウム０．５mlを加えることにより反応を停止し、４０８nmの吸光度を測定する。酵素活性の表示は、上記条件において、１分間あたり１μmolのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。
【００２９】
次に本発明で得られるアラビノフラノシダーゼの理化学的性質を示す。なお、便宜上、以下の記述においては、糖転移活性を有するアラビノフラノシダーゼをアラビノフラノシダーゼ１、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを加水分解するアラビノフラノシダーゼをアラビノフラノシダーゼ２と称する。
【００３０】
（１）分子量
アラビノフラノシダーゼ１：約８０キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動による）
アラビノフラノシダーゼ２：約３７キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動による）
（２）等電点
アラビノフラノシダーゼ１：ｐＨ６．６付近（等電点電気泳動法による）
アラビノフラノシダーゼ２：ｐＨ７．５付近（等電点電気泳動法による）
（３）作用ｐＨおよびｐＨ安定性
４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ１の作用ｐＨはｐＨ５．５近傍に至適がある。３０℃、２時間放置した際のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．５〜８．５の範囲で安定である。
４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ２の作用ｐＨはｐＨ７近傍に至適がある。３０℃、２時間放置した際のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定である。
（４）至適温度および安定性
ｐＨ５．５、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ１の作用温度は５５℃近傍に至適がある。ｐＨ７、２時間放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃までである。
ｐＨ７．０、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ２の作用温度は５０℃近傍に至適がある。ｐＨ７、２時間放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃までである。
【００３１】
本発明のアラビノフラノシダーゼ１は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列を有するものである。また、本発明のアラビノフラノシダーゼ２は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列を有するものである。かかる欠失、置換または付加の程度は、前記アラビノフラノシダーゼ活性を有する限り制限されない。なお、配列番号１においてＮ末端側のＭｅｔから２９番目のＡｌａまで、および配列番号２においてＮ末端側のＭｅｔから４３番目のＡｌａまではリーダー配列を示す。
【００３２】
本発明のアラビノフラノシダーゼ１をコードする遺伝子は、たとえば配列番号１に示す塩基配列を有するか、またはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、置換若くは付加された塩基配列を有するものであり、アラビノフラノシダーゼ２をコードする遺伝子は、たとえば配列番号２に示す塩基配列を有するかまたはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、置換若くは付加された塩基配列を有するものである。該アラビノフラノシダーゼ遺伝子のクローニングは、たとえば以下の方法にしたがって行うことができる。
【００３３】
すなわち、例えばストレプトマイセスのゲノムＤＮＡを用いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ここで用いるストレプトマイセスとしては、ストレプトマイセスｓｐ．ＧＳ−９０１またはその変異株が望ましい。次に、精製した該アラビノフラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列から推定される遺伝子を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、強くハイブリダイズするクローンを得る。得られたクローンより既知のアラビノフラノシダーゼとは異なる性質、すなわち本発明のアラビノフラノシダーゼを発現しているクローンを選択する。
【００３４】
得られたクローンの例としてプラスミド（図１）が挙げられる。
【００３５】
本発明のアラビノフラノシダーゼは、例えば配列番号１および２に示す塩基配列を有するか、またはその塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは負荷された塩基配列を有する菌株を培地中に接種し、培養してアラビノフラノシダーゼを菌体内または培地中に蓄積せしめ、これを採取することによっても製造できる。
【００３６】
本発明のアラビノフラノシダーゼ１について、メチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオシドに対して作用させたときの反応生成物のＨＰＬＣチャートを図２に示した。なお、ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りであった。すなわちカラム：昭和電工（株）製 Ｓｕｇｅｒ ＫＳ−８０１、溶離液：水、温度：８０℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計である。
【００３７】
アラビノフラノシダーゼ１の作用により、加水分解産物であるＬ−アラビノースとメチル−α−Ｌ−アラビノフラノシド以外に、矢印で示した新たなピークが生じた。本物質を分取し構造研究を行ったところ、構成糖としてＬ−アラビノースのみからなる三糖であることが確認され、本酵素は糖転移活性を有していることが明らかとなった。
【００３８】
本発明のアラビノフラノシダーゼ２について、ビートアラビナン及び直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに対する分解の経時変化を図３（ａ）に、化学合成した３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシド位置異性体（１→２、１→３、１→５）に対する分解の経時変化を図３（ｂ）に示した。
【００３９】
アラビノフラノシダーゼ２はビートアラビナンにほとんど作用せずに、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンによく作用することが示されている。また、本酵素はメチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオシドやメチル−α−（１→３）−Ｌ−アラビノフラノビオシドにほとんど作用せずに、メチル−α−（１→５）−Ｌ−アラビノフラノビオシドに良く作用することが示されている。
これらのことから、アラビノフラノシダーゼ２は（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用する新規なアラビノフラノシダーゼであることが確認された。
【００４０】
【実施例】
本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１株について、以下の培地を調製し培養を行った。すなわち、ビートアラビナン１．０％、リン酸水素２アンモニウム０．３％、リン酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、酵母エキス０．３％である。
上記培地２０mlを含む１００ml容三角フラスコに１白金耳接種し、３０℃、２１０rpmで３日間振とう培養し、種培養液とした。ついで、同培地１００mlを含む５００ml容三角フラスコに種培養液２mlを植菌し、３０℃、２１０rpmで４日間振とう培養を行った。
培養終了時のアラビノフラノシダーゼ活性はおよそ０．０３unit／mlであった。
【００４２】
実施例２
実施例１で得た上清液を硫安塩析により濃縮し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーにより電気泳動的に単一タンパクにまで精製した。精製したアラビノフラノシダーゼ１の比活性は約１０unit／mg、アラビノフラノシダーゼ２の比活性は約３unit／mgであった。これらのアラビノフラノシダーゼは前記の基質特異性及び酵素学的性質を有していた。
【００４３】
実施例３
クローニング
精製したアラビノフラノシダーゼ１、２のＮ末端、並びにＶ８−プロテアーゼで限定分解した内部ペプチドのＮ末端アミノ酸配列を基に合成したプライマーを用い、斉藤・三浦法（バイオキミカ・バイオフィス・アクタ、７２巻、p.６１９（１９６３）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，p.６１９（１９６３））により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。その結果、精製酵素のＮ末端及び内部アミノ酸配列をコードしている領域を含む増幅断片が得られた。 次に、この断片をプローブとしてジェノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、アラビノフラノシダーゼ１はＢａｍＨ１およびＢｇｌIIでゲノムＤＮＡを共切断したときに、またアラビノフラノシダーゼ２ではＳａｌ Iで切断したときに単一なバンドが得られた。
【００４４】
以上の結果を基にアラビノフラノシダーゼ１、２遺伝子のクローニングを試みた。まず、Ｔｒｉｇｌｉａらの方法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ、１６巻、p.８１８６（１９８８）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，p.８１８６（１９８８））に従いインバースＰＣＲを行ったところアラビノフラノシダーゼ１では約３．５ｋｂｐの、アラビノフラノシダーゼ２では約２．３ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片が得られた。これらのシークエンスを確認し、それぞれの全長を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明のアラビノフラノシダーゼ１は、糖転移活性を有するため、各種アラビノース含有配糖体やアラビノオリゴ糖の調製に有用である。
また、本発明のアラビノフラノシダーゼ２は、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンによく作用するため、アラビナンの酵素分解や単糖Ｌ−アラビノースの製造などに有効である。さらに、その高い基質特異性から、アラビノース含有多糖の構造研究などのための試薬としても有用である。
【００４６】
【配列表】

【００４７】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素遺伝子を保有するプラスミド、ｐＣＲ−２．１の構造を示す図である。プラスミドの分子量は約６．３ｋｂである。図中、ＡＦａｓｅ１と記した矢印部分が本発明の酵素遺伝子であり、矢印は遺伝子の転写方向を示している。また、図中の引出し線は本プラスミド中の代表的な制限酵素サイトを示す。
【図２】本発明のアラビノフラノシダーゼ１について、メチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオシドに対して作用させたときの反応生成物のＨＰＬＣチャートである。
【図３】本発明のアラビノフラノシダーゼ２について、（ａ）はビートアラビナン及び直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに対する分解の経時変化を、（ｂ）は３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシド位置異性体（１→２、１→３、１→５）に対する分解の経時変化を示した図である。それぞれ、縦軸は分解率、横軸は反応時間を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an arabinofuranosidase that specifically acts on a (1 → 5) -bound α-L-arabinofuranose residue and has a hydrolysis activity for linear (1 → 5) -α-L-arabinan. And an arabinofuranosidase having transglycosylation activity, a gene encoding the arabinofuranosidase, the arabinofuranosidase-producing strain, and a method for producing the arabinofuranosidase.
[0002]
[Prior art]
L-arabinose is a naturally occurring pentasaccharide and has moderate sweetness. In nature, it exists in the form of furanose as arabinoxylan, arabinan, and arabinogalactan. Arabinan containing arabinose as the main constituent sugar has been extracted from certain seeds, fruits, vegetables, bark, wood, etc., and has undergone structural analysis. Basically, a structure in which an α-L-arabinofuranose residue is bonded at the O-3 or O-2 position in the main chain where the α-L-arabinofuranose residue is (1 → 5) bonded. Has been shown to have.
[0003]
Recently, Seiri et al. Revealed that monosaccharide L-arabinose inhibits small intestinal sucrase, and that oral administration suppresses the increase in blood glucose and insulin after sugar loading (Seiri et al., Metabolism, Vol. 45). P. 1368 (1996); K. Seri et al., Metabolism, 45, p. 1368 (1996)). Furthermore, Sakurai et al. Showed that when L-arabinose was ingested with sucrose, it suppressed digestion and absorption of sucrose and reduced its energy utilization (Sakui et al., Journal of Japanese Society of Nutrition and Food Science, Vol. 50, p. 133). (1997)), and its physiological activity has attracted attention as to production methods.
[0004]
The enzyme that degrades arabinose-containing polysaccharides is arabinanase. Until now, two types of endo-type and exo-type are known from its mode of action. Endo type arabinanase is called endo- (1 → 5) -α-L-arabinanase (EC.3.2.1.99), and exo type is called arabinofuranosidase (EC.3.2.1.55). .
[0005]
Various arabinofuranosidases have been reported so far. At present, it is broadly classified into the following two types (G. Beldman et al., Advances in Macromolecular Carbohydrate Research, Vol. 1, p. 1 (1997)).
(1) α-L-arabinofuranosidase A
(2) α-L-arabinofuranodidase B
[0006]
This classification is based on the presence or absence of an action on arabinose-containing polysaccharides such as beet arabinan. However, the structure of arabinose-containing polysaccharides is still unclear, and therefore the classification of arabinofuranosidases is not clear. Among arabinofuranosidases that act on arabinose-containing polysaccharides, many of the enzymes that have been discovered so far preferentially (1 → 2) or (1 → 3) linked α-L-arabinose residues from beet arabinan. As a result, linear (1 → 5) -α-L-arabinan is produced and precipitated from the solution (McCleary, BV, Enzymes in Biomass Conversion, P.422 (1984). McClary, BV, Enzymes In Biomass Conversion, p.422 (1984)). Since linear (1 → 5) -α-L-arabinan, which is the main chain of arabinan, is hardly decomposed, it has been difficult to decompose beet arabinan to monosaccharides in a high yield with these known enzymes.
[0007]
Turbidity that often occurs in wine, fruit juice juice, etc. is mainly composed of this linear (1 → 5) -α-L-arabinan (MP Bellevile et al., Fight Chemistry, Vol. 33, P.A. 227 (1993); MP Belleville et.al., Phytochemistry, 33, P.227 (1993)). For the reasons described above, it has been difficult to prevent the occurrence of turbidity and remove the turbidity by using known arabinofuranosidases.
[0008]
Various glycosidases are widely used for structural analysis of polysaccharides and oligosaccharides by utilizing their specificity. Enzymes with high substrate specificity are indispensable for structural studies of arabinose-containing polysaccharides, but few arabinofuranosidases have been clarified so far. We detail the substrate specificity of several arabinofuranosidases using three kinds of methyl-α-L-arabinofuranobioside positional isomers (1 → 2, 1 → 3, 1 → 5) etc. I investigated. Up to now, we have confirmed the presence of some enzymes that preferentially cleave α-L-arabinofuranose residues bound (1 → 2) or (1 → 3), but (1 → 5) bound α-L. -Enzymes specific for arabinofuranose residues have not been obtained.
[0009]
In recent years, various oligosaccharides and glycosides have been synthesized by glycosidase transglycosylation and are widely used mainly in the food field. However, there are almost no reports on the sugar transposition reaction by arabinofuranosidase, and there are no known applications of arabino-oligosaccharides or arabinose glycosides.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is capable of efficiently degrading linear (1 → 5) -α-L-arabinan with high specificity to (1 → 5) linked α-L-arabinofuranose residues, In addition, it provides arabinofuranosidase that is highly useful as a research reagent because of its high substrate specificity, and arabinofuranosidase that has transglycosylation activity and can be used for the production of various arabino-oligosaccharides and arabinose-containing glycosides. It is. Moreover, the gene which codes the said arabinofuranosidase is provided.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors can produce an arabinofuranosidase having novel properties, particularly an enzyme capable of efficiently degrading linear (1 → 5) -α-L-arabinan, and an enzyme having transglycosylation activity. As a result of diligent research to find microorganisms, arabinofuranosidase derived from actinomycetes belonging to the genus Streptomyces has (1 → 5) high specificity for α-L-arabinofuranose residues bound thereto. Thus, it was found that linear (1 → 5) -α-L-arabinan can be efficiently decomposed, and that another enzyme derived from this bacterium has transglycosylation activity. I took out the enzyme, and elucidated its properties, and completed the invention.
[0012]
That is, the present invention relates to an arabinofuranosidase capable of efficiently degrading linear (1 → 5) -α-L-arabinan, a bacterium that produces the arabinofuranosidase, and a gene encoding the arabinofuranosidase. It is to provide.
[0013]
The present invention also provides an arabinofuranosidase having transglycosylation activity, a strain producing the arabinofuranosidase, and a gene encoding the arabinofuranosidase.
[0014]
Furthermore, the present invention relates to an arabinofuranosidase characterized in that a strain having these genes is inoculated in a medium, cultured to accumulate arabinofuranosidase in the microbial body or in the medium, and then collected. The manufacturing method of this is provided.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As a bacterium that produces the arabinofuranosidase of the present invention, there is a strain that has been newly isolated by the inventors and named GS-901. The bacterium has the following mycological properties.
[0016]
1A. Morphological properties Vegetative mycelium develops well on synthetic agar and natural media and branches off irregularly.
Spores are well formed in yeast / malt agar, oatmeal agar, starch / inorganic salt agar, and the like. According to microscopic observation, the branching method of the spore-forming mycelium is simple branching, and the spore is formed in a spiral shape. Spores usually have 3 or more linkages, and show a long chain at the later stage of culture. The surface of the spore is barbed and the shape is cylindrical.
[0017]
1B. Growth Status on Medium Table 1 shows the results of macroscopic observation when cultured in various media at 30 ° C. for 14 days.
[0018]
[Table 1]

[0019]
1C. Physiological properties (1) Optimal growth temperature is 25 to 37 ° C. It grows slightly even at 40 ° C.
(2) Biochemical properties (a) Gelatin liquefaction positive (b) Starch hydrolysis positive (c) Melanin-like pigment formation positive (d) Nitrate reduction positive (e) Resistance to sodium chloride up to 7% ( 3) Availability of carbon source Table 2 shows the availability of the carbon source of the GS-901 strain. In addition, the culture medium was determined using a Prideham goat-living agar medium (ISP9) at 28 ° C. for 14 days.
[0020]
[Table 2]

[0021]
(Note) ++: Notably used, +: Used,-: Not used [0022]
(4) Cell wall diaminopimelic acid (DAP) type,
LL-DAP
[0023]
Based on the above properties, it is clear that this strain belongs to actinomycetes, and the taxonomic position was examined with reference to "Methods for identifying actinomycetes" (edited by the Japanese Actinomycetes Study Group, 1985), etc. As a result, it was identified as Streptomyces sp.
[0024]
This actinomycete is named as follows and deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry.
Streptomyces sp.GS-901 (Accession number FERM P-16916)
[0025]
Next, a method for culturing the above microorganism and collecting a novel arabinofuranosidase from the culture will be described.
The medium that can be used is not particularly limited as long as the strain of the present invention can grow on a medium used for normal microorganism culture. Examples of the organic carbon source and nitrogen source include glucose, starch, dextrin, and beet. Arabinan, peptone, yeast extract and the like are suitable, and as inorganic salts, addition of potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like is effective. In addition, various organic substances and inorganic substances necessary for the growth of bacteria and the production of enzymes can be added as necessary.
[0026]
As the culture method in the above medium, aeration and agitation culture using a shaking culture or a fermenter is suitable. The culture temperature is not particularly limited as long as it can be grown, but it is preferably around 30 ° C.
[0027]
After culturing as described above, the target substance arabinofuranosidase can be collected and purified from the culture according to a general method for collecting and purifying enzymes. That is, first, solid components such as cells are removed from the culture solution by a method such as filtration or centrifugation to obtain a crude enzyme solution. The crude enzyme solution thus obtained can be used as it is, but this crude enzyme solution can be used in a conventional enzyme purification method, ie, ammonium sulfate salting out, organic solvent precipitation with acetone, alcohol, etc., ultrafiltration, ion exchange resin. Further, arabinofuranosidase with higher purity can be obtained by using a technique such as gel filtration alone or in combination.
[0028]
The activity of arabinofuranosidase is measured by the following method. Specifically, 0.05 ml of enzyme solution was added to 0.25 ml of 2 mM p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside and 0.2 ml of McIlvine buffer (pH 7.0), and the mixture was kept at 40 ° C. for 10 minutes. React. The reaction is stopped by adding 0.5 ml of 0.5% sodium carbonate and the absorbance at 408 nm is measured. The enzyme activity is expressed in units of the amount of enzyme that liberates 1 μmol of paranitrophenol per minute under the above conditions.
[0029]
Next, the physicochemical properties of arabinofuranosidase obtained by the present invention will be shown. For the sake of convenience, in the following description, arabinofuranosidase having transglycosylation activity acts directly on arabinofuranosidase 1, (1 → 5) -bound α-L-arabinofuranose residue. The arabinofuranosidase that hydrolyzes the chain (1 → 5) -α-L-arabinan is called arabinofuranosidase 2.
[0030]
(1) Molecular weight arabinofuranosidase 1: about 80 kilodaltons (by SDS electrophoresis)
Arabinofuranosidase 2: Approximately 37 kilodaltons (by SDS electrophoresis)
(2) Isoelectric point arabinofuranosidase 1: around pH 6.6 (by isoelectric focusing method)
Arabinofuranosidase 2: around pH 7.5 (by isoelectric focusing method)
(3) Working pH and pH stability The working pH of arabinofuranosidase 1 at 40 ° C. is optimal in the vicinity of pH 5.5. The stability of the arabinofuranosidase action when left at 30 ° C. for 2 hours is stable in the range of pH 5.5 to 8.5.
The working pH of arabinofuranosidase 2 at 40 ° C. is optimal in the vicinity of pH 7. The stability of the arabinofuranosidase action when left at 30 ° C. for 2 hours is stable in the range of pH 5.0 to 9.0.
(4) Optimum temperature and stability The reaction temperature of arabinofuranosidase 1 at the reaction of pH 5.5 and 10 minutes is optimal at around 55 ° C. The stability of arabinofuranosidase action after standing at pH 7 for 2 hours is up to 40 ° C.
The reaction temperature of arabinofuranosidase 2 at the time of reaction at pH 7.0 for 10 minutes is optimal around 50 ° C. The stability of arabinofuranosidase action after standing at pH 7 for 2 hours is up to 40 ° C.
[0031]
The arabinofuranosidase 1 of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or has an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence are deleted, substituted, or added. . The arabinofuranosidase 2 of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added. It is. The degree of such deletion, substitution or addition is not limited as long as it has the arabinofuranosidase activity. In SEQ ID NO: 1, from N-terminal side Met to 29th Ala and in SEQ ID NO: 2 from N-terminal side Met to 43rd Ala indicate leader sequences.
[0032]
The gene encoding arabinofuranosidase 1 of the present invention has, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a base sequence in which one or several bases of the base sequence are deleted, substituted or added The gene encoding arabinofuranosidase 2 has, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, or one or several bases of the nucleotide sequence has been deleted, substituted or added It has a base sequence. The arabinofuranosidase gene can be cloned, for example, according to the following method.
[0033]
That is, for example, a genomic DNA library is prepared using Streptomyces genomic DNA. As Streptomyces used here, Streptomyces sp. GS-901 or a mutant thereof is desirable. Next, colony hybridization is performed using a gene deduced from the N-terminal amino acid sequence of the purified arabinofuranosidase to obtain a clone that hybridizes strongly. A clone having a property different from that of the known arabinofuranosidase, that is, expressing the arabinofuranosidase of the present invention is selected from the obtained clones.
[0034]
An example of the obtained clone is a plasmid (FIG. 1).
[0035]
The arabinofuranosidase of the present invention is obtained by, for example, culturing a strain having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, or having a base sequence in which one or several bases of the base sequence are deleted, substituted or loaded It can also be produced by inoculating the medium and culturing it to accumulate arabinofuranosidase in the microbial cells or in the medium, and collecting it.
[0036]
FIG. 2 shows an HPLC chart of the reaction product when arabinofuranosidase 1 of the present invention is allowed to act on methyl-α- (1 → 2) -L-arabinofuranobioside. The HPLC analysis conditions were as follows. That is, column: Shower Denko Co., Ltd., Sugar KS-801, eluent: water, temperature: 80 ° C., flow rate: 1 ml / min, detection: differential refractometer.
[0037]
Due to the action of arabinofuranosidase 1, in addition to L-arabinose and methyl-α-L-arabinofuranoside which are hydrolysis products, a new peak indicated by an arrow was generated. When this substance was collected and subjected to structural studies, it was confirmed that it was a trisaccharide composed only of L-arabinose as a constituent sugar, and it was revealed that this enzyme has transglycosylation activity.
[0038]
With respect to arabinofuranosidase 2 of the present invention, the time course of degradation of beet arabinan and linear (1 → 5) -α-L-arabinan is shown in FIG. FIG. 3 (b) shows the change over time in the decomposition of L-arabinofuranobioside positional isomers (1 → 2, 1 → 3, 1 → 5).
[0039]
It has been shown that arabinofuranosidase 2 acts well on linear (1 → 5) -α-L-arabinan with little effect on beet arabinan. In addition, this enzyme has little effect on methyl-α- (1 → 2) -L-arabinofuranobioside and methyl-α- (1 → 3) -L-arabinofuranobioside, and methyl-α It has been shown to act well on-(1 → 5) -L-arabinofuranobioside.
From these facts, it was confirmed that arabinofuranosidase 2 is a novel arabinofuranosidase that specifically acts on (1 → 5) -bound α-L-arabinofuranose residues.
[0040]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described in detail by examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0041]
Example 1
Streptomyces sp. For the GS-901 strain, the following medium was prepared and cultured. That is, beet arabinan 1.0%, diammonium hydrogen phosphate 0.3%, dipotassium hydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate 0.05%, yeast extract 0.3%.
One platinum loop was inoculated into a 100 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml of the above medium and cultured with shaking at 30 ° C. and 210 rpm for 3 days to obtain a seed culture solution. Subsequently, 2 ml of the seed culture solution was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of the same medium, and cultured with shaking at 30 ° C. and 210 rpm for 4 days.
The arabinofuranosidase activity at the end of the culture was approximately 0.03 unit / ml.
[0042]
Example 2
The supernatant obtained in Example 1 was concentrated by ammonium sulfate salting out, and purified by ion exchange chromatography and gel filtration chromatography to a single protein by electrophoresis. The specific activity of purified arabinofuranosidase 1 was about 10 units / mg, and the specific activity of arabinofuranosidase 2 was about 3 units / mg. These arabinofuranosidases had the substrate specificity and enzymological properties described above.
[0043]
Example 3
Using primers synthesized based on the N-terminal of cloned and purified arabinofuranosidases 1 and 2, and the N-terminal amino acid sequence of the internal peptide limitedly digested with V8-protease, Saito-Miura method (Bio-Kimika Bi-Office Acta, 72, p. 619 (1963); Biochim. Biophys. Acta, 72, p. 619 (1963)) was used as a template to amplify the DNA by PCR. As a result, an amplified fragment containing a region encoding the N-terminus of the purified enzyme and the internal amino acid sequence was obtained. Next, genomic Southern hybridization was performed using this fragment as a probe. As a result, a single band was obtained when arabinofuranosidase 1 was cleaved with BamH1 and BglII, and when arabinofuranosidase 2 was cleaved with SalI.
[0044]
Based on the above results, cloning of arabinofuranosidase 1 and 2 genes was attempted. First, when inverse PCR was performed according to the method of Triglia et al. (Nucleic Acid Research, Vol. 16, p. 8186 (1988); Nucleic Acid Research, 16, p. 8186 (1988)), about arabinofuranosidase 1 In the case of arabinofuranosidase 2 of 3.5 kbp, a DNA amplified fragment of about 2.3 kbp was obtained. These sequences were confirmed, and DNA containing the full length of each was amplified by the PCR method.
[0045]
【The invention's effect】
Since arabinofuranosidase 1 of the present invention has transglycosylation activity, it is useful for the preparation of various arabinose-containing glycosides and arabino oligosaccharides.
Moreover, since arabinofuranosidase 2 of the present invention acts well on linear (1 → 5) -α-L-arabinan, it is effective for enzymatic degradation of arabinan, production of monosaccharide L-arabinose, and the like. Furthermore, because of its high substrate specificity, it is useful as a reagent for structural studies of arabinose-containing polysaccharides.
[0046]
[Sequence Listing]

[0047]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing the structure of pCR-2.1, a plasmid carrying the enzyme gene of the present invention. The molecular weight of the plasmid is about 6.3 kb. In the figure, the arrow marked AFase1 is the enzyme gene of the present invention, and the arrow indicates the transcription direction of the gene. The leader line in the figure shows typical restriction enzyme sites in this plasmid.
FIG. 2 is an HPLC chart of reaction products when arabinofuranosidase 1 of the present invention is allowed to act on methyl-α- (1 → 2) -L-arabinofuranobioside.
FIG. 3 shows arabinofuranosidase 2 of the present invention. It is the figure which showed the time-dependent change of decomposition | disassembly with respect to-(alpha) -L-arabinofuranobioside positional isomer (1-> 2, 1-> 3, 1-> 5). In each case, the vertical axis represents the decomposition rate and the horizontal axis represents the reaction time.

Claims (8)

（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用し、次の酵素学的性質を有するアラビノフラノシダーゼ。
（１）分子量
３７キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動法による）
（２）等電点
ｐＨ７．５（等電点電気泳動法による）
（３）作用ｐＨおよびｐＨ安定性
４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ作用ｐＨはｐＨ７．０に至適がある。３０℃、２時間放置した際のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定である。
（４）至適温度および安定性
ｐＨ７．０、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ作用温度は５０℃に至適がある。ｐＨ７．０、２時間放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃までである。(1 → 5) An arabinofuranosidase that specifically acts on the bound α-L-arabinofuranosyl residue and has the following enzymatic properties.
(1) Molecular weight 37 kilodaltons (by SDS electrophoresis)
(2) Isoelectric point pH 7.5 (by isoelectric focusing method)
(3) Working pH and pH stability The working pH of arabinofuranosidase at 40 ° C is optimal at pH 7.0. The stability of the arabinofuranosidase action when left at 30 ° C. for 2 hours is stable in the range of pH 5.0 to 9.0.
(4) Optimum temperature and stability The pH of arabinofuranosidase during the reaction at pH 7.0 for 10 minutes is optimal at 50 ° C. The stability of arabinofuranosidase action after standing at pH 7.0 for 2 hours is up to 40 ° C. 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列を有するものである請求項１記載のアラビノフラノシダーゼ。  The arabinofuranosidase according to claim 1, which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or has an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence are deleted, substituted or added. 請求項１または２記載の性質を有するアラビノフラノシダーゼを生産するストレプトミセス・エスピーＧＳ−９０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１）。  The Streptomyces sp. GS-901 strain (Streptomyces sp. GS-901) which produces the arabinofuranosidase which has the property of Claim 1 or 2. ストレプトミセス・エスピーＧＳ−９０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１）またはその変異株由来のものである請求項１または２記載のアラビノフラノシダーゼ。  The arabinofuranosidase according to claim 1 or 2, which is derived from Streptomyces sp. GS-901 (Streptomycins sp. GS-901) or a mutant thereof. 請求項２記載のアラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子。A gene encoding arabinofuranosidase according to claim 2 . 配列番号２に示す塩基配列を有するか、またはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、置換若くは付加された塩基配列を有するものである請求項５記載の遺伝子。  6. The gene according to claim 5, which has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, or has a base sequence in which one or several bases of the base sequence are deleted, substituted or added. ストレプトミセス・エスピーＧＳ−９０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１）またはその変異株由来のものである請求項６記載の遺伝子。  The gene according to claim 6, wherein the gene is derived from Streptomyces sp. GS-901 strain (Streptomyces sp. GS-901) or a mutant strain thereof. 請求項５〜７のいずれか１項記載の遺伝子を有する菌株を培地中に接種し、培養してアラビノフラノシダーゼを菌体内または培地中に生成蓄積せしめ、培養物から該酵素を採取することを特徴とする、請求項１または２記載のアラビノフラノシダーゼの製造方法。  Inoculating a strain having the gene according to any one of claims 5 to 7 in a culture medium, culturing the strain to produce and accumulate arabinofuranosidase in the bacterial body or the culture medium, and collecting the enzyme from the culture The method for producing arabinofuranosidase according to claim 1 or 2, characterized in that:

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