JP4291412B2 - リポソーマルホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびｐ−エトキシオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
本発明は、ある種のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリポソーム製剤、具体的にはリポソーマルホスホジエステル、リポソーマルホスホロチオエート、およびリポソーマルｐ−エトキシオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、そのような製剤を製造する方法、および医学的治療においてそのような製剤を使用する方法に関する。
標的mRNAの特異的領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、内在性遺伝子の発現を抑制するために用いられてきた。標的mRNAにアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合すると、DNA-RNAハイブリッドが形成される。このハイブリッド形成はmRNAのトランスレーションを抑制し、それにより、タンパクの遺伝子発現を抑制する。細胞の生存にとってそのタンパク質が必須であるなら、その発現の阻害は細胞死につながるであろう。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは抗癌および抗ウイルス治療において有用な道具となりうる。
遺伝子発現の抑制にアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用するにあたっての主たる障害は，細胞内での不安定さ、細胞への取り込みの低さ、および細胞内デリバリーのしにくさである。天然のホスホジエステルはヌクレアーゼによる加水分解に耐性ではない。従ってなんらかの抑制的効果が見られるためには、高濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドが必要である。ホスホロチオエートなどの修飾したホスホジエステルアナログはこのヌクレアーゼ加水分解の問題を克服するために用いられてきたが、それらはこの問題に対して完全に満足のいく解答を提供するものではなかった。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みは低い。この問題を解決するために、カルシウム−リン酸沈殿、DEAE−デキストラン法、あるいはエレクトロポレーションなどの物理的な技術がオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増大させるために用いられてきた。これらの技術は再現するのが困難で、生体には適用できないものである。リポフェクチンのような陽イオン性脂質もホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをデリバリーするために用いられてきた。陽イオン性脂質と負に帯電したホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの間に静電的相互作用が生じ、その結果複合体が生じ、それが標的細胞に取り込まれる。これらの陽イオン性脂質はヌクレアーゼ消化からオリゴヌクレオチドを保護するものではないため、ヌクレアーゼ耐性のホスホロチオエートをデリバリーするときにのみ有益であって、ヌクレアーゼで切断されるホスホジエステルについてはそうではない。
調製されている他の修飾ホスホジエステル（ＰＤ）アナログにはｐ−エトキシ（ｐＥ）オリゴがある。ｐＥオリゴの修飾は、その修飾がこれらのオリゴが標的mRNAに結合するのを妨げないようにリン酸骨格になされている。ｐＥオリゴはリン酸骨格の結合していない酸素原子にエチル基を導入することにより行われ、それによりこれらのオリゴを電荷を持たない化合物に変化させる。ヌクレアーゼに耐性ではあるが、内部への移行に際してこれらのオリゴはエンドソーム／リソソーム胞に隔離されるため、ｐＥオリゴの細胞内取り込みと細胞内のデリバリーは低く、標的mRNAへの接近が妨げられる。
疾病の治療において用いる改良されたアンチセンス組成物に対する需要があり、またそのような改良組成物を製造する方法に対する需要もある。
本発明の実施態様のひとつは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのリポソーム組成物である。該組成物は（ａ）中性のリン脂質から本質的になるリポソーム、（ｂ）ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびｐ−エトキシオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれ、リポソームに封じ込められたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。リン脂質はホスファチジルコリンが好ましい。特に好ましいリン脂質はジオレオイルホスファチジルコリンである。アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホジエステルである場合は、リン脂質のオリゴに対する好ましいモル比は約3,000:1以下である。アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートである場合は、リン脂質のオリゴに対する好ましいモル比は約10:1と50:1の間である。アンチセンスオリゴヌクレオチドがｐ−エトキシオリゴヌクレオチドである場合は、リン脂質のオリゴに対する好ましいモル比は約5:1と100:1の間である。
本発明の他の実施態様としては哺乳動物の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法がある。該方法は腫瘍のある哺乳動物に、腫瘍細胞の増殖を抑制するのに効果的な上記組成物の量を投与する過程を含む。
本発明の他の実施態様としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドのリポソーム組成物を調製する方法がある。該方法は、（ａ）中性のリン脂質と、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、およびｐ−エトキシオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれたアンチセンスオリゴンクレオチドから本質的になる凍結乾燥組成物を水和させ、それによりフリーのオリゴヌクレオチドとリポソームに封じ込まれたオリゴヌクレオチドを含む水懸濁液を形成させる過程と、（ｂ）透析によってリポソームからフリーのオリゴヌクレオチドを分離する過程を含む。好ましい実施態様において、その水懸濁液は透析の前に超音波処理される。
本発明の組成物は、抗癌治療で用いられるようなアンチセンスオリゴのための改良されたデリバリーシステムを構築する。オリゴのヌクレアーゼ加水分解を最小にすることに加えて、本発明のリポソーム組成物は、従来技術の組成物に比較して細胞への取り込みおよび細胞内のデリバリーが増強されている。従って、このような組成物が、癌細胞で発見されたが正常細胞では見られない遺伝子の発現を抑制するオリゴのデリバリーに用いられるならば、治療の結果がよくなる。本発明に従って治療され得る癌は沢山あり、白血病は一つの顕著な例である。
本発明の製剤はまた、従来技術のリポソーム製剤に比較して、リポソーム中へのオリゴの取り込みを増加させる。
図１Ａおよび図１Ｂは、（Ａ）フリーのオリゴ、（Ｂ）リポソームｐＥオリゴのＡＬＬ−１細胞による取り込みを示す写真である。
図２ＡはＡＬＬ−１およびＨＬ６０細胞を、Bcr-Abl mRNAのＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図２Ｂは、ＡＬＬ−１細胞をＢ１／Ａ２リポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴおよびＢ２／Ａ２リポソーム−ｐＥ対照オリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図３ＡはＢＶ１７３細胞およびＨＬ６０細胞を、Bcr-Abl mRNAのＢ２／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図３Ｂは、ＢＶ１７３細胞をＢ２／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴおよびＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とした対照オリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図４Ａは、Ｋ５６２細胞およびＨＬ６０細胞を、Bcr-Abl mRNAのＢ３／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とするリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図４Ｂは、Ｋ５６２細胞をＢ３／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とするリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴおよびＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とする対照オリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図５は、Ｔｗｅｅｎ２０を含むリポソーム−ｐＥオリゴをＢＶ１７３細胞とインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
「リポソーム」は本明細書においては脂質二重膜を有する、脂質を含む小胞の意味で、また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを包含できる他の脂質キャリアー粒子の意味でも用いられる。リポソームは、脂質が実質的に電荷を持たない限り、１またはそれ以上のリン脂質から作ることができる。本組成物は、陰イオン性および陽イオン性のリン脂質およびコレステロールを実質的に含まないことが重要である。適切なリン脂質には、ホスファチジルコリンおよび当業者によく知られた他のリン脂質が含まれる。リポソームは、例えば単層でも多重層でも、不確定の層構造を持っていてもよい。リポソームを含む製薬上の組成物は通常水または生理食塩水のような、製薬上認められている滅菌された担体または希釈剤を含む。
「封じ込める」、「被胞化する」、「取り込む」の語は、本明細書中では、オリゴが少なくともリポソーム内部の水性空間（二重層の内膜領域を含む）の一部に取り囲まれるという意味で用いられる。
本発明の組成物は、好ましくは、患者に非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、リンパ管内、腹腔内、皮下、胸膜内、もしくは、くも膜下腔内への注射によって投与され、または生体外骨髄パージング（ex vivo bone marrow purging）に用いられる。好ましい投与量は５−２５mg/kgの間である。投与は、癌が消失するまで又は退行するまでタイムスケジュールに従って繰り返すのが好ましく、他の治療形態と組み合わせてもよい。
本発明の製造と使用を以下の実施例によってさらに説明する。
実施例１
材料
ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはGenta Incorporatedより供給された。リン脂質はAvanti Polar Lipidsから購入した。
オリゴヌクレオチドラベル
ホスホジエステルを、３７℃で８時間Ｔ４キナーゼによって、［32Ｐγ］ＡＴＰを用いて５’端ラベルした。ラベルされたオリゴヌクレオチドをエタノールで−２０℃一晩沈殿させた。７０％エタノールで３回洗浄後、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドをMicrocon-3フィルターで２度濾過し、ラベルされたオリゴヌクレオチドをフリーの［32Ｐγ］ＡＴＰから分離した。
35ＳラベルしたホスホロチオエートはGenta Incorporatedから供給された。
リポソーム−ホスホジエステルの調製
蒸留水に溶解したホスホジエステルオリゴヌクレオチドを、過剰のｔ−ブタノール存在下、混合物中のｔ−ブタノールの最終体積が８０−９０％となるようにして、リン脂質と混合した。微量の［3Ｈ］コレスタニルエーテルおよび［32Ｐ］ホスホジエステルも、それぞれ脂質とオリゴヌクレオチドのマーカーとして、その混合物に加えた。その混合物をボルテックッスし、アセトン／ドライアイスバス中で凍結した。凍結した混合物を凍結乾燥し、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１mM Ｈｅｐｅｓおよび１０mM ＮａＣｌ）で一晩水和させた。リポソームを槽タイプのソニケーターで１０分間、２回超音波処理した。
リポソーム−ホスホロチオエートの調製
リポソーム−ホスホロチオエートは、ホスホジエステルの代わりにホスホロチオエートを用いた点を除いて，リポソーム−ホスホジエステルについて記載したのと同様にして調製した。また、オリゴヌクレオチドマーカーとして［32Ｐ］ホスホジエステルの代わりに［35Ｓ］ホスホロチオエートを用いた。
リポソームに取り込まれたオリゴヌクレオチドからのフリーのオリゴヌクレオチドの分離
フリーのホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、リポソームに取り込まれたものからの分離は、混合物を過剰の２５００倍体積のＲＰＭＩ培地に対して室温で一晩透析することによって行った。ホスホジエステル又はホスホロチオエートのリポソームへの取り込みを評価するための液体シンチレーション測定用に、調製したものの一定量を透析の前後で採取した。
リポソーム−ホスホジエステルの生成
ホスホジエステル（ＰＤ）取り込みのためにジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）脂質を選んだ。ＤＯＰＣが中性であるのに対してＰＤは負に帯電しているからである。この脂質を用いることにより、静電的反発（これは取り込みを低下させる）を低減し得るからである。正に帯電した脂質は、非特異的な細胞障害性を引き起こすかもしれないので、用いなかった。ＰＤオリゴヌクレオチドをリポソームへ取り込ませる最初の試みは、凍結−融解法、および脱水−再水和法を用いて行った。
（Ａ）凍結−融解（ＦＴ）法
［3Ｈ］ラベルＤＯＰＣ脂質を窒素ガス存在下で有機溶媒からエバポレートし脂質膜を形成させた。真空乾燥した後、脂質膜をhepes緩衝生理食塩水（１mM Ｈｅｐｅｓ、１０mM ＮａＣｌ，ｐＨ8.0）で水和し槽タイプのソニケーターで超音波処理した。これらの予備形成したリポソームを［32Ｐ］ラベルＰＤオリゴヌクレオチドと１００または１０００対１のモル比で混合した。混合物全体をアセトン／ドライアイスバスで５−１０分間凍結し、室温で２５−３０分間溶解した。この過程を３回繰り返し、リポソーム−ＰＤからフリーのＰＤ−オリゴヌクレオチドを分離するため、試料をＢｉｏＧｅｌ Ａ０．５Ｍカラムに乗せた。凍結−融解操作の前後で一定量を採取し、ホスホジエステルのリポソームへの取り込みを決定するために液体シンチレーション計測にかけた。
取り込みは以下のように決定した。
取り込みはなかった（表１）
（Ｂ）脱水−再水和（ＤＲ）法
［3Ｈ］ラベルＤＯＰＣを窒素ガス存在下で有機溶媒からエバポレートし、脂質膜を形成させた。真空乾燥後、脂質膜をｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で水和し、槽タイプのソニケーターで超音波処理した。これらの予備形成したリポソームをアセトン／ドライアイスバス中で凍結させ凍結乾燥した。乾燥した脂質を次に［32Ｐ］ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを含む蒸留水で再水和した。ＤＯＰＣのＰＤに対するモル比は100/1または1000/1にした。フリーのＰＤオリゴヌクレオチドをリポソーム−ＰＤから分離するために、その混合物をＢｉｏＧｅｌ Ａ０．５Ｍカラムにかけた。カラムにかける前後で一定量を採取し、液体シンチレーション計測にかけた。取り込みは５％より少なかった（表１）
ＰＤに対するＤＯＰＣのモル比が500/1および5000/1では、それぞれ０および２．５％の取り込みが得られた。
その後凍結および凍結乾燥前に混合物にｔ−ブタノールを加えることにより取り込みが１１．９％に上昇することが見いだされた。また、再水和過程において加える蒸留水の体積を２００から５０μｌに低下させることにより、1000/1モル比で１１．９％に対して１．８％の取り込みが得られた。取り込みに対するモル比の影響を上記の改良された条件の下で再び測定した（表２）。
蒸留水に溶解したＰＤを過剰のｔ−ブタノール存在下、混合物中のｔ−ブタノールの最終体積が８０−９０％になるように混合し、アセトン／ドライアイスバス中で凍結し、凍結乾燥した。これは予備形成リポソームの調製を省くためである。この操作により2000/1のモル比において同等の取り込みレベル（１６．２％）が得られた。
脂質およびＰＤの回収率が５０％より低かったためフリーのＰＤをリポソーム−ＰＤから分離する方法を変更することとした。以下の他の２つ分離方法を用いた。すなわち、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０フィルターおよび透析である（表３）。
リポソーム混合物を、透析分離過程の前に１０分間超音波処理すると、同等の取り込みレベルが得られた。
他の脂質、ジミリストイルホスファチジルコリンもＰＤ取り込みのために用いた。８５％を越える取り込みがあった。
リポソーム−ホスホロチオエートの生成
ホスホロチオエート（ＰＴ）とＰＤは構造アナログであるのでＰＴを用いて同様な取り込みプロトコルを用いた。ＰＴに対する種々のモル比のＤＯＰＣのを用いた（表４）。また、リポソーム混合物の（透析前の）超音波処理の効果も調べた。
実施例２
ｐ−エトキシオリゴのリポソームへの取り込み
ｐＥオリゴはOligos Therapeutics（Willsonville,OR）から購入した。リン脂質はAvanti Polar Lipids,Inc.（Alabaster,AL）から購入した。
（ａ）オリゴラベル
ｐＥオリゴを、３７℃２４時間、［32Ｐγ］ＡＴＰを用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５’端をラベルし、エタノールで−２０℃、一晩沈殿させた。次に、フリーの［32Ｐγ］ＡＴＰからレベルされたオリゴを分離するために沈殿を７０％エタノールで３回洗浄した。
（ｂ）リポソーム調製
混合物中のｔ−ブタノールの最終的濃度が少なくとも９５％以上となるような過剰のｔ−ブタノール存在下、蒸留水に溶かしたｐＥオリゴを種々のモル比でリン脂質と混合した。微量の［3Ｈ］コレスタニルエーテルおよび［32Ｐ］ｐＥもそれぞれ脂質およびオリゴのマーカーとして混合物に加えた。混合物をボルテックスし、アセトン／ドライアイスバスで凍結し、その後凍結乾燥した。凍結乾燥した調製品をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（1mM Hepesおよび10mM NaCl）で、オリゴの最終濃度が10-100μＭとなるように水和させた。リポソーム−ｐ−エトキシオリゴを槽タイプのソニケーターで１０−２０分間超音波処理した。
（ｃ）リポソームに取り込まれたｐＥオリゴからのフリーのｐＥオリゴ分離
リポソームに取り込まれたｐＥオリゴからのフリーのｐＥオリゴ分離は、1000倍過剰のＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水に対して、室温で一晩透析（分子量カット＝12-14,000）することによって行った。リポソームへのｐＥオリゴの取り込みを評価するため、リポソーム−ｐＥオリゴの一定量を透析の前後で液体シンチレーション計測のために採取した。
（ｄ）取り込み効率
ホスファチジルコリン脂質（ＰＣ）とｐＥオリゴは双方とも中性分子で共存可能であるはずなので、ｐＥオリゴの取り込みのためにホスファチジルコリン脂質を選んだ。異なるすべてのＰＣの中で、−１５から−２０℃でチェーンメルティング相転移を起こすことからジオレオイルＰＣ（ＤＯＰＣ）を選んだ。従って、室温では、ＤＯＰＣは液晶相となっており、リポソームを調製するのに理想的な相である。
リポソームへｐＥオリゴを取り込ませるために、異なったモル比のｐＥオリゴを過剰のｔ−ブタノール存在下でＤＯＰＣと混合した。微量の放射性ラベルしたｐＥオリゴとＤＯＰＣを混合物に含めた。ＤＯＰＣ／ｐＥオリゴ混合物をドライアイス／アセトンバスで凍結し、凍結乾燥した。次に、凍結乾燥したＤＯＰＣ／ｐＥオリゴ粉末をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で水和し、最終オリゴ濃度を１０μＭとした。ｐＥオリゴは、２８から８３％の効率でＤＯＰＣリポソームにうまく取り込まれた（表５）。取り込みの効率はＤＯＰＣのオリゴに対するモル比に依存し、10＞100＞5＞1000:1であった。
白血病細胞に対するｐＥオリゴのデリバリー
リポソームへのｐＥオリゴの高い取り込み効率（＞８０％）を達成した後、次にそれらのリポソーム−ｐＥオリゴがmRNAの局在する細胞質に到達できるかどうかの試験を進めた。ｐＥオリゴの局在を蛍光顕微鏡で視覚化できるように５’端をローダミンでラベルした16-mer ｐＥオリゴを購入した。
（ａ）白血病細胞とｐＥオリゴとのインキュベーション
ヒト急性リンパ白血病細胞であるＡＬＬ−１細胞を用いた。ＡＬＬ−１細胞を２４穴プレートに0.3mLの培地中、50,000/wellプレートした。プレートした２時間の後、ローダミンと結合した、フリーのあるいはリポソーム−ｐＥオリゴを最終濃度１６μＭとしてＡＬＬ−１細胞に加えた。２４時間のインキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を３回洗浄し、その後共焦点レーザースキャン顕微鏡下で観察した。図１（ＡＬＬ−１細胞による、（Ａ）フリーの、または（Ｂ）リポソーム−ｐＥオリゴの取り込み）を参照のこと。
このデータは、リポソームに取り込まれると、より多量のｐＥオリゴがＡＬＬ−１細胞に取り込まれることを示す。リポソームはｐＥオリゴを細胞質にデリバリーすることができた。
白血病細胞におけるリポソーム−ｐＥオリゴの増殖抑制
次に、リポソーム−ｐＥオリゴが白血病細胞の増殖を特異的に抑制し得るか否かの試験を進めた。３つの異なった種類のヒト白血病細胞株を用いた。すなわち、ＡＬＬ−１（急性リンパ白血病）、ＢＶ１７３およびＫ５６２（両者とも慢性骨髄性白血病）である。３つの細胞株はすべて、９番と２２番の染色体の相互転座に由来する、再編成されたフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）を持つ。この転座は、２２番染色体のブレークポイントクラスター領域の３’端へ、c-Ablプロトオンコジーンの９番染色体からの転座を引き起こし、その結果、Bcr-Ablハイブリッド遺伝子を生成する。BcrとAbl遺伝子が融合するブレークポイントジャンクションは３つの細胞株で異なっている。ＡＬＬ−１細胞では、ブレークポイントジャンクションはBcrエキソン１／Ablエキソン２である。ＢＶ１７３細胞では、ブレークポイントジャンクションはBcrエキソン２／Ablエキソン２である。Ｋ５６２細胞では、ブレークポイントジャンクションはBcrエキソン３／Ablエキソン２である。これらのハイブリッド遺伝子はすべて、新しいBcr-Abl融合タンパク質を産生し、白血病の病因と関係しているチロシンキナーゼ活性を増大させる。従って、Bcr-Ablタンパク質の産生を抑制することで、白血病細胞の増殖抑制および細胞死さえも引き起こせるかもしれない。Bcr-Ablタンパク質の産生を特異的に抑制するため、Bcr-Abl mRNAのブレークポイントジャンクション、これはＰｈ染色体ポジティヴな白血病細胞にのみ見られ正常細胞にはみられないものだが、これに対するアンチセンス配列を標的とすることにした。このようにして、正常細胞には影響がなく白血病細胞の増殖のみが影響を受けるように、非特異的な障害性副作用を最小限にすることを期待した。
（ａ）ｐＥアンチセンスオリゴの配列（５’端から３’端方向に記載する）
ＡＬＬ−１細胞で見いだされたBcrエキソン１／Ablエキソン２（Ｂ１／Ａ２）に対するアンチセンス
ＢＶ１７３細胞で見いだされたBcrエキソン２／Ablエキソン２（Ｂ２／Ａ２）に対するアンチセンス
Ｋ５６２細胞で見いだされたBcrエキソン３／Ablエキソン２（Ｂ３／Ａ２）に対するアンチセンス
（ｂ）白血病細胞に対するリポソームｐＥオリゴのデリバリー
１ウェル当たり、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地100μL中の10,000個のＡＬＬ−１細胞もしくはＢＶ１７３細胞または5,000個のＫ５６２細胞を９６穴プレートにプレートした。プレートした２時間後、最終濃度０−１０μＭのリポソーム−ｐＥオリゴを白血病細胞に加えた。細胞をリポソーム−ｐＥオリゴとともに５日間インキュベートした。フィラデルフィア染色体を持たないヒト前骨髄性細胞株であるＨＬ６０細胞を対照細胞として用いた。ＨＬ６０細胞は同じ条件下で10,000細胞／ウェルプレートした。
（ｃ）白血病細胞の生存率の決定
インキュベーション終了後、１００μＬの培地を各ウェルに加え、各ウェルの最終体積を２００μＬとした。次に５０μＬの細胞を分取し、１３０μＬの培地と２０μＬのアラマールブルー（AlamarBlue）色素の入った９６穴プレートに加えた。細胞を３７℃で更に４−８時間インキュベーションし、５７０および５９５nmでマイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Menlo Park,CA）で直接読み取った。アラマールブルー色素は、細胞増殖の結果による、培地の化学的還元に応答して色が変化する酸化還元指示薬を取り込む。５７０と５９５nmの間の吸光度の違いは白血病細胞全体の吸光度の値として理解される。リポソームｐＥオリゴで処理した白血病細胞の生存率を未処理の対照細胞の生存率と比較した。
ＡＬＬ−１およびＨＬ６０細胞をBcr-Abl mRNAのＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とするリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとインキュベートすると、ＡＬＬ−１の量依存的増殖抑制が見られたが、ＨＬ６０では見られなかった（図２Ａ）。ＢＶ１７３とＫ５６２細胞についても、それぞれBcr-Abl mRNAのＢ２／Ａ２およびＢ３／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴと共にインキュベートしたとき、同様な増殖抑制が見られた（図３Ａ、４Ａ）。同じ条件下で、ＨＬ６０は増殖が抑制されなかった。
この増殖抑制効果が配列依存性であることを確認するために、Ｐｈ染色体ポジティブ細胞株をアンチセンスおよび対照リポソーム−ｐＥオリゴと共にインキュベートした。ＡＬＬ−１細胞をＢ１／Ａ２リポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴまたはＢ２／Ａ２リポソーム−ｐＥ対照オリゴとともにインキュベートすると増殖抑制が引き起こされた（図２Ｂ）。しかし、Ｂ１／Ａ２アンチセンスオリゴははるかに大きな抑制効果を引き起こした。同様に、対照オリゴによりも対応するリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴの方が、ＢＶ１７３およびＫ５６２細胞に対して高い抑制効果が見られた（図３Ｂ、４Ｂ）。
また、リポソーム−ｐＥオリゴ混合物中にＴｗｅｅｎ２０界面活性剤を含めることにより、リポソーム−ｐＥオリゴの抑制効果の能力が高まることが見いだされた。リポソーム−ｐＥオリゴ混合物にＴｗｅｅｎ２０を５％（ｐＥオリゴの重量）加えた。その後、混合物をボルテックスし、アセトン／ドライアイスバス中で凍結し、その後凍結乾燥した。乾燥した混合物を水和し、前述のように超音波処理した。Ｔｗｅｅｎ２０を含むリポソーム−ｐＥオリゴをＢＶ１７３細胞に加えると、５μＭにおいて、１００％の増殖抑制が見られたが（図５）、一方同じ条件下で、通常のリポソーム−ｐＥオリゴ（Ｔｗｅｅｎ２０なし）による１００％増殖抑制は１０μＭで見られた。
本発明の具体的実施態様の前述の記載は、本発明の可能な実施態様の完全なリストを意図するものではない。当業者は本明細書に記載した具体的実施態様に本発明の範囲内で変更を加えうることを理解するであろう。
配列表
配列番号：１の情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｙｅｓ
（xi）配列：配列番号：１：
配列番号：２の情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｙｅｓ
（xi）配列：配列番号：２：
配列番号：３の情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iv）アンチセンス：Ｙｅｓ
（xi）配列：配列番号：３：
標的mRNAの特異的領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、内在性遺伝子の発現を抑制するために用いられてきた。標的mRNAにアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合すると、DNA-RNAハイブリッドが形成される。このハイブリッド形成はmRNAのトランスレーションを抑制し、それにより、タンパクの遺伝子発現を抑制する。細胞の生存にとってそのタンパク質が必須であるなら、その発現の阻害は細胞死につながるであろう。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは抗癌および抗ウイルス治療において有用な道具となりうる。
遺伝子発現の抑制にアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用するにあたっての主たる障害は，細胞内での不安定さ、細胞への取り込みの低さ、および細胞内デリバリーのしにくさである。天然のホスホジエステルはヌクレアーゼによる加水分解に耐性ではない。従ってなんらかの抑制的効果が見られるためには、高濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドが必要である。ホスホロチオエートなどの修飾したホスホジエステルアナログはこのヌクレアーゼ加水分解の問題を克服するために用いられてきたが、それらはこの問題に対して完全に満足のいく解答を提供するものではなかった。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みは低い。この問題を解決するために、カルシウム−リン酸沈殿、DEAE−デキストラン法、あるいはエレクトロポレーションなどの物理的な技術がオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増大させるために用いられてきた。これらの技術は再現するのが困難で、生体には適用できないものである。リポフェクチンのような陽イオン性脂質もホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをデリバリーするために用いられてきた。陽イオン性脂質と負に帯電したホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの間に静電的相互作用が生じ、その結果複合体が生じ、それが標的細胞に取り込まれる。これらの陽イオン性脂質はヌクレアーゼ消化からオリゴヌクレオチドを保護するものではないため、ヌクレアーゼ耐性のホスホロチオエートをデリバリーするときにのみ有益であって、ヌクレアーゼで切断されるホスホジエステルについてはそうではない。
調製されている他の修飾ホスホジエステル（ＰＤ）アナログにはｐ−エトキシ（ｐＥ）オリゴがある。ｐＥオリゴの修飾は、その修飾がこれらのオリゴが標的mRNAに結合するのを妨げないようにリン酸骨格になされている。ｐＥオリゴはリン酸骨格の結合していない酸素原子にエチル基を導入することにより行われ、それによりこれらのオリゴを電荷を持たない化合物に変化させる。ヌクレアーゼに耐性ではあるが、内部への移行に際してこれらのオリゴはエンドソーム／リソソーム胞に隔離されるため、ｐＥオリゴの細胞内取り込みと細胞内のデリバリーは低く、標的mRNAへの接近が妨げられる。
疾病の治療において用いる改良されたアンチセンス組成物に対する需要があり、またそのような改良組成物を製造する方法に対する需要もある。
本発明の実施態様のひとつは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのリポソーム組成物である。該組成物は（ａ）中性のリン脂質から本質的になるリポソーム、（ｂ）ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびｐ−エトキシオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれ、リポソームに封じ込められたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。リン脂質はホスファチジルコリンが好ましい。特に好ましいリン脂質はジオレオイルホスファチジルコリンである。アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホジエステルである場合は、リン脂質のオリゴに対する好ましいモル比は約3,000:1以下である。アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートである場合は、リン脂質のオリゴに対する好ましいモル比は約10:1と50:1の間である。アンチセンスオリゴヌクレオチドがｐ−エトキシオリゴヌクレオチドである場合は、リン脂質のオリゴに対する好ましいモル比は約5:1と100:1の間である。
本発明の他の実施態様としては哺乳動物の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法がある。該方法は腫瘍のある哺乳動物に、腫瘍細胞の増殖を抑制するのに効果的な上記組成物の量を投与する過程を含む。
本発明の他の実施態様としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドのリポソーム組成物を調製する方法がある。該方法は、（ａ）中性のリン脂質と、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、およびｐ−エトキシオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれたアンチセンスオリゴンクレオチドから本質的になる凍結乾燥組成物を水和させ、それによりフリーのオリゴヌクレオチドとリポソームに封じ込まれたオリゴヌクレオチドを含む水懸濁液を形成させる過程と、（ｂ）透析によってリポソームからフリーのオリゴヌクレオチドを分離する過程を含む。好ましい実施態様において、その水懸濁液は透析の前に超音波処理される。
本発明の組成物は、抗癌治療で用いられるようなアンチセンスオリゴのための改良されたデリバリーシステムを構築する。オリゴのヌクレアーゼ加水分解を最小にすることに加えて、本発明のリポソーム組成物は、従来技術の組成物に比較して細胞への取り込みおよび細胞内のデリバリーが増強されている。従って、このような組成物が、癌細胞で発見されたが正常細胞では見られない遺伝子の発現を抑制するオリゴのデリバリーに用いられるならば、治療の結果がよくなる。本発明に従って治療され得る癌は沢山あり、白血病は一つの顕著な例である。
本発明の製剤はまた、従来技術のリポソーム製剤に比較して、リポソーム中へのオリゴの取り込みを増加させる。
図１Ａおよび図１Ｂは、（Ａ）フリーのオリゴ、（Ｂ）リポソームｐＥオリゴのＡＬＬ−１細胞による取り込みを示す写真である。
図２ＡはＡＬＬ−１およびＨＬ６０細胞を、Bcr-Abl mRNAのＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図２Ｂは、ＡＬＬ−１細胞をＢ１／Ａ２リポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴおよびＢ２／Ａ２リポソーム−ｐＥ対照オリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図３ＡはＢＶ１７３細胞およびＨＬ６０細胞を、Bcr-Abl mRNAのＢ２／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図３Ｂは、ＢＶ１７３細胞をＢ２／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴおよびＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とした対照オリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図４Ａは、Ｋ５６２細胞およびＨＬ６０細胞を、Bcr-Abl mRNAのＢ３／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とするリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図４Ｂは、Ｋ５６２細胞をＢ３／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とするリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴおよびＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とする対照オリゴとともにインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
図５は、Ｔｗｅｅｎ２０を含むリポソーム−ｐＥオリゴをＢＶ１７３細胞とインキュベートしたときの増殖抑制の程度を示す。
「リポソーム」は本明細書においては脂質二重膜を有する、脂質を含む小胞の意味で、また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを包含できる他の脂質キャリアー粒子の意味でも用いられる。リポソームは、脂質が実質的に電荷を持たない限り、１またはそれ以上のリン脂質から作ることができる。本組成物は、陰イオン性および陽イオン性のリン脂質およびコレステロールを実質的に含まないことが重要である。適切なリン脂質には、ホスファチジルコリンおよび当業者によく知られた他のリン脂質が含まれる。リポソームは、例えば単層でも多重層でも、不確定の層構造を持っていてもよい。リポソームを含む製薬上の組成物は通常水または生理食塩水のような、製薬上認められている滅菌された担体または希釈剤を含む。
「封じ込める」、「被胞化する」、「取り込む」の語は、本明細書中では、オリゴが少なくともリポソーム内部の水性空間（二重層の内膜領域を含む）の一部に取り囲まれるという意味で用いられる。
本発明の組成物は、好ましくは、患者に非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、リンパ管内、腹腔内、皮下、胸膜内、もしくは、くも膜下腔内への注射によって投与され、または生体外骨髄パージング（ex vivo bone marrow purging）に用いられる。好ましい投与量は５−２５mg/kgの間である。投与は、癌が消失するまで又は退行するまでタイムスケジュールに従って繰り返すのが好ましく、他の治療形態と組み合わせてもよい。
本発明の製造と使用を以下の実施例によってさらに説明する。
実施例１
材料
ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはGenta Incorporatedより供給された。リン脂質はAvanti Polar Lipidsから購入した。
オリゴヌクレオチドラベル
ホスホジエステルを、３７℃で８時間Ｔ４キナーゼによって、［32Ｐγ］ＡＴＰを用いて５’端ラベルした。ラベルされたオリゴヌクレオチドをエタノールで−２０℃一晩沈殿させた。７０％エタノールで３回洗浄後、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドをMicrocon-3フィルターで２度濾過し、ラベルされたオリゴヌクレオチドをフリーの［32Ｐγ］ＡＴＰから分離した。
35ＳラベルしたホスホロチオエートはGenta Incorporatedから供給された。
リポソーム−ホスホジエステルの調製
蒸留水に溶解したホスホジエステルオリゴヌクレオチドを、過剰のｔ−ブタノール存在下、混合物中のｔ−ブタノールの最終体積が８０−９０％となるようにして、リン脂質と混合した。微量の［3Ｈ］コレスタニルエーテルおよび［32Ｐ］ホスホジエステルも、それぞれ脂質とオリゴヌクレオチドのマーカーとして、その混合物に加えた。その混合物をボルテックッスし、アセトン／ドライアイスバス中で凍結した。凍結した混合物を凍結乾燥し、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１mM Ｈｅｐｅｓおよび１０mM ＮａＣｌ）で一晩水和させた。リポソームを槽タイプのソニケーターで１０分間、２回超音波処理した。
リポソーム−ホスホロチオエートの調製
リポソーム−ホスホロチオエートは、ホスホジエステルの代わりにホスホロチオエートを用いた点を除いて，リポソーム−ホスホジエステルについて記載したのと同様にして調製した。また、オリゴヌクレオチドマーカーとして［32Ｐ］ホスホジエステルの代わりに［35Ｓ］ホスホロチオエートを用いた。
リポソームに取り込まれたオリゴヌクレオチドからのフリーのオリゴヌクレオチドの分離
フリーのホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、リポソームに取り込まれたものからの分離は、混合物を過剰の２５００倍体積のＲＰＭＩ培地に対して室温で一晩透析することによって行った。ホスホジエステル又はホスホロチオエートのリポソームへの取り込みを評価するための液体シンチレーション測定用に、調製したものの一定量を透析の前後で採取した。
リポソーム−ホスホジエステルの生成
ホスホジエステル（ＰＤ）取り込みのためにジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）脂質を選んだ。ＤＯＰＣが中性であるのに対してＰＤは負に帯電しているからである。この脂質を用いることにより、静電的反発（これは取り込みを低下させる）を低減し得るからである。正に帯電した脂質は、非特異的な細胞障害性を引き起こすかもしれないので、用いなかった。ＰＤオリゴヌクレオチドをリポソームへ取り込ませる最初の試みは、凍結−融解法、および脱水−再水和法を用いて行った。
（Ａ）凍結−融解（ＦＴ）法
［3Ｈ］ラベルＤＯＰＣ脂質を窒素ガス存在下で有機溶媒からエバポレートし脂質膜を形成させた。真空乾燥した後、脂質膜をhepes緩衝生理食塩水（１mM Ｈｅｐｅｓ、１０mM ＮａＣｌ，ｐＨ8.0）で水和し槽タイプのソニケーターで超音波処理した。これらの予備形成したリポソームを［32Ｐ］ラベルＰＤオリゴヌクレオチドと１００または１０００対１のモル比で混合した。混合物全体をアセトン／ドライアイスバスで５−１０分間凍結し、室温で２５−３０分間溶解した。この過程を３回繰り返し、リポソーム−ＰＤからフリーのＰＤ−オリゴヌクレオチドを分離するため、試料をＢｉｏＧｅｌ Ａ０．５Ｍカラムに乗せた。凍結−融解操作の前後で一定量を採取し、ホスホジエステルのリポソームへの取り込みを決定するために液体シンチレーション計測にかけた。
取り込みは以下のように決定した。
（Ｂ）脱水−再水和（ＤＲ）法
［3Ｈ］ラベルＤＯＰＣを窒素ガス存在下で有機溶媒からエバポレートし、脂質膜を形成させた。真空乾燥後、脂質膜をｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で水和し、槽タイプのソニケーターで超音波処理した。これらの予備形成したリポソームをアセトン／ドライアイスバス中で凍結させ凍結乾燥した。乾燥した脂質を次に［32Ｐ］ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを含む蒸留水で再水和した。ＤＯＰＣのＰＤに対するモル比は100/1または1000/1にした。フリーのＰＤオリゴヌクレオチドをリポソーム−ＰＤから分離するために、その混合物をＢｉｏＧｅｌ Ａ０．５Ｍカラムにかけた。カラムにかける前後で一定量を採取し、液体シンチレーション計測にかけた。取り込みは５％より少なかった（表１）
その後凍結および凍結乾燥前に混合物にｔ−ブタノールを加えることにより取り込みが１１．９％に上昇することが見いだされた。また、再水和過程において加える蒸留水の体積を２００から５０μｌに低下させることにより、1000/1モル比で１１．９％に対して１．８％の取り込みが得られた。取り込みに対するモル比の影響を上記の改良された条件の下で再び測定した（表２）。
脂質およびＰＤの回収率が５０％より低かったためフリーのＰＤをリポソーム−ＰＤから分離する方法を変更することとした。以下の他の２つ分離方法を用いた。すなわち、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０フィルターおよび透析である（表３）。
他の脂質、ジミリストイルホスファチジルコリンもＰＤ取り込みのために用いた。８５％を越える取り込みがあった。
リポソーム−ホスホロチオエートの生成
ホスホロチオエート（ＰＴ）とＰＤは構造アナログであるのでＰＴを用いて同様な取り込みプロトコルを用いた。ＰＴに対する種々のモル比のＤＯＰＣのを用いた（表４）。また、リポソーム混合物の（透析前の）超音波処理の効果も調べた。
ｐ−エトキシオリゴのリポソームへの取り込み
ｐＥオリゴはOligos Therapeutics（Willsonville,OR）から購入した。リン脂質はAvanti Polar Lipids,Inc.（Alabaster,AL）から購入した。
（ａ）オリゴラベル
ｐＥオリゴを、３７℃２４時間、［32Ｐγ］ＡＴＰを用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５’端をラベルし、エタノールで−２０℃、一晩沈殿させた。次に、フリーの［32Ｐγ］ＡＴＰからレベルされたオリゴを分離するために沈殿を７０％エタノールで３回洗浄した。
（ｂ）リポソーム調製
混合物中のｔ−ブタノールの最終的濃度が少なくとも９５％以上となるような過剰のｔ−ブタノール存在下、蒸留水に溶かしたｐＥオリゴを種々のモル比でリン脂質と混合した。微量の［3Ｈ］コレスタニルエーテルおよび［32Ｐ］ｐＥもそれぞれ脂質およびオリゴのマーカーとして混合物に加えた。混合物をボルテックスし、アセトン／ドライアイスバスで凍結し、その後凍結乾燥した。凍結乾燥した調製品をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（1mM Hepesおよび10mM NaCl）で、オリゴの最終濃度が10-100μＭとなるように水和させた。リポソーム−ｐ−エトキシオリゴを槽タイプのソニケーターで１０−２０分間超音波処理した。
（ｃ）リポソームに取り込まれたｐＥオリゴからのフリーのｐＥオリゴ分離
リポソームに取り込まれたｐＥオリゴからのフリーのｐＥオリゴ分離は、1000倍過剰のＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水に対して、室温で一晩透析（分子量カット＝12-14,000）することによって行った。リポソームへのｐＥオリゴの取り込みを評価するため、リポソーム−ｐＥオリゴの一定量を透析の前後で液体シンチレーション計測のために採取した。
（ｄ）取り込み効率
ホスファチジルコリン脂質（ＰＣ）とｐＥオリゴは双方とも中性分子で共存可能であるはずなので、ｐＥオリゴの取り込みのためにホスファチジルコリン脂質を選んだ。異なるすべてのＰＣの中で、−１５から−２０℃でチェーンメルティング相転移を起こすことからジオレオイルＰＣ（ＤＯＰＣ）を選んだ。従って、室温では、ＤＯＰＣは液晶相となっており、リポソームを調製するのに理想的な相である。
リポソームへｐＥオリゴを取り込ませるために、異なったモル比のｐＥオリゴを過剰のｔ−ブタノール存在下でＤＯＰＣと混合した。微量の放射性ラベルしたｐＥオリゴとＤＯＰＣを混合物に含めた。ＤＯＰＣ／ｐＥオリゴ混合物をドライアイス／アセトンバスで凍結し、凍結乾燥した。次に、凍結乾燥したＤＯＰＣ／ｐＥオリゴ粉末をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で水和し、最終オリゴ濃度を１０μＭとした。ｐＥオリゴは、２８から８３％の効率でＤＯＰＣリポソームにうまく取り込まれた（表５）。取り込みの効率はＤＯＰＣのオリゴに対するモル比に依存し、10＞100＞5＞1000:1であった。
リポソームへのｐＥオリゴの高い取り込み効率（＞８０％）を達成した後、次にそれらのリポソーム−ｐＥオリゴがmRNAの局在する細胞質に到達できるかどうかの試験を進めた。ｐＥオリゴの局在を蛍光顕微鏡で視覚化できるように５’端をローダミンでラベルした16-mer ｐＥオリゴを購入した。
（ａ）白血病細胞とｐＥオリゴとのインキュベーション
ヒト急性リンパ白血病細胞であるＡＬＬ−１細胞を用いた。ＡＬＬ−１細胞を２４穴プレートに0.3mLの培地中、50,000/wellプレートした。プレートした２時間の後、ローダミンと結合した、フリーのあるいはリポソーム−ｐＥオリゴを最終濃度１６μＭとしてＡＬＬ−１細胞に加えた。２４時間のインキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を３回洗浄し、その後共焦点レーザースキャン顕微鏡下で観察した。図１（ＡＬＬ−１細胞による、（Ａ）フリーの、または（Ｂ）リポソーム−ｐＥオリゴの取り込み）を参照のこと。
このデータは、リポソームに取り込まれると、より多量のｐＥオリゴがＡＬＬ−１細胞に取り込まれることを示す。リポソームはｐＥオリゴを細胞質にデリバリーすることができた。
白血病細胞におけるリポソーム−ｐＥオリゴの増殖抑制
次に、リポソーム−ｐＥオリゴが白血病細胞の増殖を特異的に抑制し得るか否かの試験を進めた。３つの異なった種類のヒト白血病細胞株を用いた。すなわち、ＡＬＬ−１（急性リンパ白血病）、ＢＶ１７３およびＫ５６２（両者とも慢性骨髄性白血病）である。３つの細胞株はすべて、９番と２２番の染色体の相互転座に由来する、再編成されたフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）を持つ。この転座は、２２番染色体のブレークポイントクラスター領域の３’端へ、c-Ablプロトオンコジーンの９番染色体からの転座を引き起こし、その結果、Bcr-Ablハイブリッド遺伝子を生成する。BcrとAbl遺伝子が融合するブレークポイントジャンクションは３つの細胞株で異なっている。ＡＬＬ−１細胞では、ブレークポイントジャンクションはBcrエキソン１／Ablエキソン２である。ＢＶ１７３細胞では、ブレークポイントジャンクションはBcrエキソン２／Ablエキソン２である。Ｋ５６２細胞では、ブレークポイントジャンクションはBcrエキソン３／Ablエキソン２である。これらのハイブリッド遺伝子はすべて、新しいBcr-Abl融合タンパク質を産生し、白血病の病因と関係しているチロシンキナーゼ活性を増大させる。従って、Bcr-Ablタンパク質の産生を抑制することで、白血病細胞の増殖抑制および細胞死さえも引き起こせるかもしれない。Bcr-Ablタンパク質の産生を特異的に抑制するため、Bcr-Abl mRNAのブレークポイントジャンクション、これはＰｈ染色体ポジティヴな白血病細胞にのみ見られ正常細胞にはみられないものだが、これに対するアンチセンス配列を標的とすることにした。このようにして、正常細胞には影響がなく白血病細胞の増殖のみが影響を受けるように、非特異的な障害性副作用を最小限にすることを期待した。
（ａ）ｐＥアンチセンスオリゴの配列（５’端から３’端方向に記載する）
ＡＬＬ−１細胞で見いだされたBcrエキソン１／Ablエキソン２（Ｂ１／Ａ２）に対するアンチセンス
１ウェル当たり、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地100μL中の10,000個のＡＬＬ−１細胞もしくはＢＶ１７３細胞または5,000個のＫ５６２細胞を９６穴プレートにプレートした。プレートした２時間後、最終濃度０−１０μＭのリポソーム−ｐＥオリゴを白血病細胞に加えた。細胞をリポソーム−ｐＥオリゴとともに５日間インキュベートした。フィラデルフィア染色体を持たないヒト前骨髄性細胞株であるＨＬ６０細胞を対照細胞として用いた。ＨＬ６０細胞は同じ条件下で10,000細胞／ウェルプレートした。
（ｃ）白血病細胞の生存率の決定
インキュベーション終了後、１００μＬの培地を各ウェルに加え、各ウェルの最終体積を２００μＬとした。次に５０μＬの細胞を分取し、１３０μＬの培地と２０μＬのアラマールブルー（AlamarBlue）色素の入った９６穴プレートに加えた。細胞を３７℃で更に４−８時間インキュベーションし、５７０および５９５nmでマイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Menlo Park,CA）で直接読み取った。アラマールブルー色素は、細胞増殖の結果による、培地の化学的還元に応答して色が変化する酸化還元指示薬を取り込む。５７０と５９５nmの間の吸光度の違いは白血病細胞全体の吸光度の値として理解される。リポソームｐＥオリゴで処理した白血病細胞の生存率を未処理の対照細胞の生存率と比較した。
ＡＬＬ−１およびＨＬ６０細胞をBcr-Abl mRNAのＢ１／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的とするリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴとインキュベートすると、ＡＬＬ−１の量依存的増殖抑制が見られたが、ＨＬ６０では見られなかった（図２Ａ）。ＢＶ１７３とＫ５６２細胞についても、それぞれBcr-Abl mRNAのＢ２／Ａ２およびＢ３／Ａ２ブレークポイントジャンクションを標的としたリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴと共にインキュベートしたとき、同様な増殖抑制が見られた（図３Ａ、４Ａ）。同じ条件下で、ＨＬ６０は増殖が抑制されなかった。
この増殖抑制効果が配列依存性であることを確認するために、Ｐｈ染色体ポジティブ細胞株をアンチセンスおよび対照リポソーム−ｐＥオリゴと共にインキュベートした。ＡＬＬ−１細胞をＢ１／Ａ２リポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴまたはＢ２／Ａ２リポソーム−ｐＥ対照オリゴとともにインキュベートすると増殖抑制が引き起こされた（図２Ｂ）。しかし、Ｂ１／Ａ２アンチセンスオリゴははるかに大きな抑制効果を引き起こした。同様に、対照オリゴによりも対応するリポソーム−ｐＥアンチセンスオリゴの方が、ＢＶ１７３およびＫ５６２細胞に対して高い抑制効果が見られた（図３Ｂ、４Ｂ）。
また、リポソーム−ｐＥオリゴ混合物中にＴｗｅｅｎ２０界面活性剤を含めることにより、リポソーム−ｐＥオリゴの抑制効果の能力が高まることが見いだされた。リポソーム−ｐＥオリゴ混合物にＴｗｅｅｎ２０を５％（ｐＥオリゴの重量）加えた。その後、混合物をボルテックスし、アセトン／ドライアイスバス中で凍結し、その後凍結乾燥した。乾燥した混合物を水和し、前述のように超音波処理した。Ｔｗｅｅｎ２０を含むリポソーム−ｐＥオリゴをＢＶ１７３細胞に加えると、５μＭにおいて、１００％の増殖抑制が見られたが（図５）、一方同じ条件下で、通常のリポソーム−ｐＥオリゴ（Ｔｗｅｅｎ２０なし）による１００％増殖抑制は１０μＭで見られた。
本発明の具体的実施態様の前述の記載は、本発明の可能な実施態様の完全なリストを意図するものではない。当業者は本明細書に記載した具体的実施態様に本発明の範囲内で変更を加えうることを理解するであろう。
配列表
配列番号：１の情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｙｅｓ
（xi）配列：配列番号：１：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｙｅｓ
（xi）配列：配列番号：２：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iv）アンチセンス：Ｙｅｓ
（xi）配列：配列番号：３：
Claims (7)
- （ａ）ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）からなるリポソームと、
（ｂ）前記リポソームに封じ込められた16-18merのアンチセンスｐ−エトキシオリゴヌクレオチド、
を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドのリポソーム組成物であって、前記リン脂質の前記オリゴヌクレオチドに対するモル比が5:1〜100:1である、前記リポソーム組成物。 - アンチセンスオリゴヌクレオチドがＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣの配列を有するｐ−エトキシオリゴヌクレオチドである、請求項１の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣの配列を有するｐ−エトキシオリゴヌクレオチドである、請求項１の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＧＧＧＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴの配列を有するｐ−エトキシオリゴヌクレオチドである、請求項１の組成物。
- （ａ）DOPCからなるリポソームと、
（ｂ）前記リポソームに封じ込められた16-18merのアンチセンスｐ−エトキシオリゴヌクレオチドとを含み、
前記リン脂質の前記オリゴヌクレオチドに対するモル比が5:1〜100:1である、腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬組成物。 - （ａ）リン脂質としてDOPCのみと、16-18merのアンチセンスｐ−エトキシオリゴヌクレオチドとを含む凍結乾燥組成物であって、前記リン脂質の前記オリゴヌクレオチドに対するモル比が5:1〜100:1である前記結乾燥組成物を水和し、それにより遊離のオリゴヌクレオチドとリポソームに封じ込められたオリゴヌクレオチドを含む水懸濁液を形成させる過程と、
（ｂ）透析により遊離のオリゴヌクレオチドを前記リポソームから分離する過程とを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドのリポソーム組成物を調製する方法。 - 水懸濁液を透析前に超音波処理する、請求項６記載の方法。
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