JP4279677B2 - 炎症性疾患および敗血症の診断および治療のためのアルドース１−エピメラーゼ（ムタロターゼ）の使用 - Google Patents

炎症性疾患および敗血症の診断および治療のためのアルドース１−エピメラーゼ（ムタロターゼ）の使用 Download PDF

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Description

本発明は、炎症性疾患および敗血症の医学的診断および治療のためのアルドース１-エピメラーゼ(ムタロターゼとしても知られる；以下“A1E”または単に“エピメラーゼ”としばしば略記する)の新規な使用に関する。本発明は、毒素の投与によって敗血症または全身的炎症を実験的に引き起こした霊長類の肝臓組織で、アルドース１-エピメラーゼ濃度が非常に増大することを初めて検出したことに基づいている。
本発明は、炎症および感染、特に感染に原因のある炎症および敗血症、の診断および治療をさらに改善することに関して出願人によって行われた集約的な研究活動にその起源を有する。
炎症は、例えば、切傷、火傷、アレルゲン、細菌、菌類、およびウィルスなどの微生物による感染などの種々のタイプの外的影響、拒絶反応を引き起こす外来組織、または、例えば、自己免疫疾患および癌における身体のある種の炎症性の内因的状態に対する、生物体のある種の生理的反応であると、ごく一般的に規定される。炎症は、無害な局所的な体の反応として発症し得るが、個々の組織、器官、器官の一部、および組織の一部の数々の重篤な慢性および急性疾患の典型的特徴でもある。
局所的炎症は、一般的には、有害な影響に対する体の健全な免疫反応の一部であり、したがって体の生命を保存しようとする防御機構の一部である。しかし、仮に炎症が、例えば、自己免疫疾患などのある種の内因的過程に対する体の誤った反応の一部および/または慢性的特質であるか、あるいは全身性炎症反応症候群(SIRS)の場合のようにまたは炎症によって生じる重篤な敗血症の場合のように、局所的炎症が全身的範囲に達する場合、炎症反応に特有の生理的過程が制御不能となり、現実に頻繁に生命を脅かす病的な過程となる。
炎症過程の原因および経過は、圧倒的にタンパクまたはペプチド性の少なからぬ数の物質によって制御されているか、または、ある種の生体分子の存在を、ある程度の一定時間伴うことが現在知られている。炎症反応に関与する内因性物質には、具体的に、サイトカイン、メディエータ、血管作用性物質、急性期タンパクおよび/またはホルモン性調整物質に属し得る物質があげられる。炎症性反応は、炎症過程を活性化する内因性物質(例えば、TNF-α)と不活性化する物質(例えば、インターロイキン-10)とがともに関与する複合的な生理的反応である。
全身性炎症では、敗血症または敗血症性ショックの場合のように、炎症特異的反応カスケードが、制御不能な形で全身にわたって広がって、過剰な免疫応答をするという理由で、生命を脅かすことになる。内在的炎症特異的物質の個々のグループの存在とその潜在的役割に関する現在の知見については、例えば、A.Beishuizenらの「敗血症および敗血症性ショックの内因性メディエータ」(「Endogenous Mediators in Sepsis/and Septic Shock」)、Advances in Clinical Chemistry、Vol.33、1999、55-131)、およびC.Gabayらの「炎症に対する急性期タンパクおよび他の全身性反応」(「Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation」)、The New England Journal of Medicine、Vol.340、No.6 1999、448-454)を参照されたい。敗血症および関連する全身炎症性疾患の理解およびその認識されている定義もまたこれに従いやはり近年は変化してきているので、敗血症の最新の定義を与えるK.Reinhartらの「敗血症および敗血症性ショック」(「Sepsis und septischer Schock」[Sepsis and septic shock])、Intensivmedizin、Georg Thieme Verlag、Stuttgart、New York、2001、756-760)を参照されたい。本発明に関して、使用される敗血症および炎症性疾患という用語は、前記の3報の参照文献中で示されている定義を基にしている。
ところが、少なくともヨーロッパでは、陽性血液培養物によって検出可能な全身的な細菌性感染が、長い間敗血症の特徴とされてきたが、敗血症は現在、感染によって引き起こされるが、病理的な過程としては、他の原因によって引き起こされる全身的な炎症と大きな類似性を有する全身的炎症であると本質的に理解されている。しかし、敗血症の理解が前述したように変わったことで、診断的取り組みに変化が起こった。すなわち、細菌性病因を直接検出していたことから、生理学的パラメータを複合的にモニターすること、つい最近は、特に、敗血症過程または炎症過程に関与するある種の内因性の物質、すなわち、特異的「生体マーカー」を検出することにより置き換えられているかまたは補足されている。
炎症過程に関与することが知られている多くのメディエータおよび急性相タンパクの中で、診断目的に適合するメディエータとは、具体的には、炎症性疾患または炎症性疾患のある段階に非常に特異的に存在し、その濃度が、劇的および診断的に意味のある様式で変化し、さらに慣行的な測定に必要とされる安定性を有し、高濃度値に達するものである。診断目的のためには、病理的過程(炎症、敗血症)とそれぞれの生体マーカーとが信頼できる相関関係にあることが第一に重要であって、炎症過程に関与する内因的物質の複合カスケードにおける生体マーカーの役割を知る必要はない。
敗血症の生体マーカーとして特に適切であるこのような内因性物質は、プロカルシトニンである。プロカルシトニンは、プロホルモンで、その血清濃度は、感染病因が全身的な炎症となった状態(敗血症)で非常に高い値に達するが、健常者ではほとんど検出されない。プロカルシトニンはまた、敗血症の比較的初期の段階で高い値に達するので、プロカルシトニンの測定は、敗血症の早期診断、または感染によって生じる敗血症を、他の原因を有する重篤な炎症から、早い時期に区別することにも適する。敗血症のマーカーとしてプロカルシトニンを測定することは、M.Assicotらの刊行物「敗血症および炎症を有する患者の高い血清プロカルシトニン濃度」「High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection」、The Lancet、Vol.341、No.8844、1993、515-518;特許:ドイツ特許42 27 545 C2、ヨーロッパ特許0 656 121 B1および米国特許5,639,617の主題である。本発明の記載を補うため、前記特許および前記刊行物中に記載されている初期の文献を参照されたい。近年、プロカルシトニンを主題とする刊行物の数は、非常に増加してきている。W.Karzaiら「プロカルシトニン:重篤な感染に対する全身反応の新インディケーター」(「Procalcitonin-A New Indicator of the Systemic Response to Severe Infection」、Infection、Vol.25、1997、329-334)およびM.Oczenskiら「プロカルシトニン:手術中の細菌感染診断のための新パラメータ」(「Procalcitonin:a new parameter for the diagnosis of bacterial infection in the perioperative period」、European Journal of Anaesthesiology 1998、15、202-209)、さらにH.Redlら「外傷および敗血症のヒヒモデルにおけるプロカルシトニンの分泌パターン:サイトカインおよびネオプテリンに対する関係」(「Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis:Relationship to cytokines and neopterin」、Crit Care Med 2000、Vol.28、No.11、3659-3663、およびH.Redlら「敗血症の非ヒト霊長類モデル」(「Non-Human Primate Models of Sepsis」、Sepsis 1998、2:243-253)、およびそこに引用されている別の文献も、近年公表された典型的な概説として参照されたい。
敗血症マーカー、プロカルシトニンが利用できるようになったことで、敗血症研究にかなりの拍車がかかり、また、プロカルシトニン測定を補いおよび/または精細な診断または鑑別診断のために、付加的な情報を提供し得る別の生体マーカーを見い出すための努力が現在鋭意行われている。しかし、炎症または敗血症過程に関与するある種の内在物質の存在に対しては、その正確な機能また正確な原因について非常にわずかしか知られていないかまたは何も知られていないことが多く、この事実により、有望な新生体マーカーの探索は複雑になっている。
さらに有望な敗血症マーカーを決定するために、純粋に仮説に基づいた実りの多い取り組みのテストが実験的に行われ、その結果が、ドイツ特許198 47 690 A1および国際公開特許00/22439中に見られる。これらの文献は、敗血症の場合、プロホルモンであるプロカルシトニンの濃度が上昇するばかりでなく、著しい濃度の上昇が、ペプチドプロホルモンの範疇に含まれる他の物質についても観察できることを示している。ここに記載された現象は十分に記録されているが、敗血症においてプロホルモンの濃度が上昇する原因は未だ実質的に説明されていない。
本願では、別の炎症特異的または敗血症特異的な生物分子の探索にあたって、他の純粋に実験的な実りの多い取り組みの結果を報告する。これらの実験的研究もまた、感染原因の全身的炎症反応に関連するプロカルシトニンを測定することから始まる。すなわち、敗血症の際、プロカルシトニンはホルモンカルシトニンの前駆体の場合と同様の方法では形成されないことが明白であることが極めて初期段階で観察されている。だから、高レベルのプロカルシトニンが、甲状腺を除去した患者でも観察されたのである。したがって、甲状腺は、そこでプロカルシトニンが敗血症の間に形成されまたは分泌される器官ではあり得ない。H.Redlら「外傷および敗血症のヒヒモデルにおけるプロカルシトニンの分泌パターン:サイトカインおよびネオプテリンに対する関係」(「Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis:Relationship to cytokines and neopterin」)、Crit Care Med 2000、Vol.28、No.11、3659-3663)およびH.Redlら「敗血症の非ヒト霊長類モデル」(「Non-Human Primate Models of Sepsis」、Sepsis 1998、2:243-253)の文献では、敗血症におけるプロカルシトニンの形成を説明することを企図したと言われる実験的研究の結果が報告されている。この研究で、霊長類(ヒヒ)に内毒素を投与して人工敗血症を引き起こし、血液中のプロカルシトニン濃度が最高となる実験的に作製した状態が決定された。本願では、この研究に記載されている実験動物モデルをさらに進展させて、敗血症またはある型の敗血症に特徴的に存在し、これによって敗血症の特異的な診断を可能にさせるペプチドまたはタンパク性の新規の内在性敗血症特異的生体マーカーを測定するために使用した。霊長類のモデルは、霊長類とヒトとの生理が大変多く類似しており、多くの治療および診断のためのヒト試薬と高い交差反応性であるという理由で選ばれた。
炎症中に形成される内在性物質が体の複雑な反応カスケードの一部であるので、このような物質にはまた診断的に興味があるばかりでなく、例えば敗血症中に観察される、炎症の全身的拡大をできるだけ初期に停止させるため、このタイプの各物質の形成および/または濃度に影響を与えることによって、炎症過程中に治療的に介入する試みも現在、かなりの努力を払ってなされている。こうした状況で、炎症過程に関与していることがわかっている内在性物質もやはり、有望な治療目標であるとみなすべきである。炎症過程のある種のメディエータであって炎症過程にポジティブな治療的影響を与えるメディエータに基づいた試みが、例えば、E.A.Panacekの「抗TNF戦略」(「Anti-TNF strategies」、Journal fur Anasthesie und Intensivbehandlung;No.2、2001、4-5)、T.Calandraら「マクロファージ移動阻害ファクターの中性化による敗血症ショックからの防御」(「Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor」、Nature Medicine、Vol.6.、No.2、2000、164-170)、またはK.Garberの「プロテインCは敗血症の解決策となり得る」(「Protein C may be sepsis solution」、Nature Biotechnology、Vol.18、2000、917-918)に記載されている。これらの治療的取り組みは、炎症促進物質の濃度を低下させること、またはこのような物質の形成を阻害すること、および、具体的には、特異的抗体[TNF-αまたはMIFに対する抗体:E.A.Panacekの「抗TNF戦略」(「Anti-TNF strategies」、Journal fur Anasthesie und Intensivbehandlung;No.2、2001、4-5)、T.Calandraら「マクロファージ移動阻害ファクターの中性化による敗血症ショックからの防御」(「Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor」、Nature Medicine、Vol.6.、No.2、2000、164-170)を参照]の使用によってそれを行うこと、または炎症カスケードで阻害的影響を与える内在性物質の濃度を増加させること (プロテインC;K.Garberの「プロテインCは敗血症の解決策となり得る」(「Protein C may be sepsis solution」、Nature Biotechnology、Vol.18、2000、917-918))を企図している。上記の最後の刊行物は、選定された内在性の目標分子に影響を与えることによって炎症過程に治療的影響を与えるといった試みの概要を示しているが、こうした試みは、今日まで残念ながら一般的には少しの成功も収めていない。今日までの、どちらかといえば期待を裏切る治療的取り組みを考慮すると、できるだけ炎症特異的または敗血症特異的で、また治療目標として炎症との戦いを成功させるための新しい展望を切り開く別の内在性生物分子を同定することに大きな関心がもたれる。
A.Beishuizenら、「Endogenous Mediators in Sepsis/and Septic Shock」、Advances in Clinical Chemistry、Vol.33、1999、55-131 C.Gabayら、「Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation」、The New England Journal of Medicine、Vol.340、No.6 1999、448-454 K.Reinhartら、「Sepsis und septischer Schock」[Sepsis and septic shock]、in Intensivmedizin、Georg Thieme Verlag、Stuttgart、New York、2001、756-760 M.Assicotら、「High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection」、The Lancet、Vol.341、No.8844、1993、515-518 ドイツ特許42 27 545 C2 ヨーロッパ特許0 656 121 B1 米国特許5,639,617 W.Karzaiら、「Procalcitonin-A New Indicator of the Systemic Response to Severe Infection」、Infection、Vol.25、1997、329-334 M.Oczenskiら、「Procalcitonin:a new parameter for the diagnosis of bacterial infection in the perioperative period」、European Journal of Anaesthesiology 1998、15、202-209 H.Redlら、「Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis:Relationship to cytokines and neopterin」、Crit Care Med 2000、Vol.28、No.11、3659-3663 H.Redlら、「Non-Human Primate Models of Sepsis」in Sepsis 1998、2:243-253 ドイツ特許198 47 690 A1 国際公開特許00/22439 E.A.Panacek、「Anti-TNF strategies」、Journal fur Anasthesie und Intensivbehandlung;No.2、2001、4-5 T.Calandraら、「Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor」、Nature Medicine、Vol.6.、No.2、2000、164-170 K.Garber、「Protein C may be sepsis solution」、Nature Biotechnology、Vol.18、2000、917-918
本発明は、酵素アルドース１-エピメラーゼ（ムタロターゼ）が、霊長類およびヒトでは感染によって引き起こされる炎症の間はかなりの濃度で検出可能であって、これに対して、健常者では、検出されないかまたは検出の分析限界の濃度でしか検出されないという事実に基づいており、この事実により、エピメラーゼは、炎症診断/敗血症診断のどちらにも適し、また新規の治療標的として適する。
炎症または敗血症の実験的シミュレーションでアルドース１-エピメラーゼの存在を初めて検出した結果もたらされた診断および治療への使用を、請求項1で一般的な型で請求している。
請求項2から9は、診断目的での使用および方法に関する。
請求項10は、一般に、特に敗血症を含む炎症および感染の治療の分野における新規で有望な治療目的での使用に関し、請求項11から14は、生理的A1E濃度またはA1E酵素効果に影響を与えることを狙った、薬学的組成物の治療的適用に関する。
後記の実験のセクションでより詳細に説明するように、本発明は、内毒素の投与(サルモネラティフィムリウム由来LPS)によって、ヒヒで人工敗血症を実験的に誘導し、この処置した動物の肝臓組織を2次元ゲル電気泳動によって処理した後、処置した動物中にのみ、同定可能なペプチドまたはタンパク産物が見い出されたという事実に基づいている。この特異的な産物を電気泳動ゲルから単離し、トリプシン消化し、質量分析により調べた。選択した２つのピーク（タンデム質量分析によりさらに詳細に特徴決定して、ヒトのｃＤＮＡデータベースに見出される仮想のタンパクに割り当てることができた）を同定し、かつ、それに引き続いて、ヒトのアルドース１-エピメラーゼ断片または豚のアルドース１-エピメラーゼのデータと比較してこのタンパクをさらに同定することにより、アルドース１-エピメラーゼ（ヒヒ）であることが示された。
データベースに見出されるアルドース１-エピメラーゼに関する配列データの部分配列と、質量分析により同定した配列との同一性に基づいて、アルドース１-エピメラーゼとして単離されたタンパクのスポットとヒトの同等部分を確定することは、公認の基準に従って明瞭であるとみなされる。
本明細書で、診断目的を意図するまたは治療目的で提案されるペプチドを「エピメラーゼ」と呼ぶ場合、これは、このようなエピメラーゼが配列番号3に従う配列と100%同一でなくてはならないことを意味するものではない。むしろ、本願で、エピメラーゼは、生理学的に存在する形態で、配列番号1(FGELPS)および配列番号2(PDGEEGY)に従う部分ペプチド配列を有し、配列番号3に従うヒトエピメラーゼの配列と高度の相同性(すなわち、好ましくは60%、より好ましくは、80%より高い相同性)を有するペプチドであると定義される。
またエピメラーゼという用語は、上記に定義されたペプチドの部分ペプチドを包含し、エピメラーゼは、特に、エピメラーゼ測定用の分析法または生物学的サンプル中のエピメラーゼ測定用の分析法の調製のための試薬の調製、例えば、選択的抗体の調製に使用できる。配列番号3に従うペプチドから、1種または複数のアミノ酸または短ペプチド配列が欠損して得られた配列も、やはりエピメラーゼまたはその部分配列としてみなされる。さらに、診断および/または治療目的に適する部分配列(断片)は、特に配列番号3のペプチドの少なくとも3個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも6個のアミノ酸からなる配列を含む配列である。
特定の診断または治療目的については、本発明によるエピメラーゼペプチドは、動物のペプチド、特に哺乳類のペプチドであっても良く、そのペプチドは、配列番号3を有するペプチドと少なくとも60%の相同性を有すべきであり、例えば、診断目的にまたは獣医用医薬に使用される。
ヒヒ肝臓組織中で敗血症または炎症を引き起こした後にのみ発見されるタンパクが、アルドース１-エピメラーゼ（ムタロターゼ；A1E；EC5.1.3.3.）と同定されるのは、公認の基準に従って明らかであるとみなされ、相当な科学的、診断的、治療的関心が持たれる。エピメラーゼは、酵素的組織活性について長い間にわたって知られている。完全なヒトのアルドース１-エピメラーゼをコードする配列として、データベースにおいて調べられたヒトのｃＤＮＡ配列の同定は、我々の知る限りにおいて実施されたことがない。エピメラーゼ活性は、これまで、主に科学的な目的を有する研究の対象である。Michael K.Wibel:Analytical Biochemistry 70,489-494(1976)、またはJane A.Beebeら:Biochemistry 1998,37,14989-14997(ガラクトースムタロターゼに関する)、およびこれらに引用される刊行物を、例えばここで挙げることができる。前記論文には、エピメラーゼは、アルドースのα-およびβ-アノマーの相互変換を触媒し、かつ腎臓および腸における糖の輸送および糖代謝に関与すると推定される酵素として主に議論されている。医学的診断および治療に関しては、アルドース１-エピメラーゼは、これまでなんの役割も果たして来なかった。
請求項1による本発明では、エピメラーゼと称され、かつ、上記定義によれば配列番号１および２による６または７アミノ酸の部分配列の存在によって本質的に定義され、さらにアミノ酸配列の長さおよび性質についてはわざわざ制限する必要のない、ペプチドのそこに記載された使用に関する。ヒトのA1Eは、前記二つの部分配列の存在により、データベースにおいて公知および／または記載されている他の全てのヒトペプチドおよびタンパクから区別可能である。
現在知られている配列番号３、および炎症および敗血症の場合にヒトエピメラーゼ形成が増加することに関する知見と組み合わせた場合のヒトエピメラーゼの生理的役割に基づいて、ヒトエピメラーゼまたはその一部は、現在では従来技術の一部となっている方法によって診断および/または治療を行うために、組換え産物として合成または遺伝子工学によって調製することができる。
さらに、エピメラーゼペプチドは、特定のポリクローナル、特に、本発明によるペプチドの診断測定の補助剤および/または有望な治療剤として適するモノクローナル抗体を産生するために、最新の従来技術で公知の方法によって使用できる。既知の部分ペプチド配列に対して適切なモノクローナル抗体を産生することは、現在では一般の従来技術の一部となっている。
配列番号３に従うエピメラーゼまたはその選択的部分ペプチドの医学的診断測定においては、例えば、選択的にプロカルシトニンを測定することは、P.P Ghillaniら「密接に関連した遺伝子産物を分析するためのツールとしてのモノクローナル抗ペプチド抗体」(Monoclonal antipeptide antibodies as tools to dissect closely related gene products)、The Journal of Immunology、Vol.141、No.9、1988、3156-3163;およびP.P Ghillaniら「悪性疾患罹患患者の血清中のカルシトニン前駆体の同定および測定」(Identification and Measurement of Calcitonin Precursors in Serum of Patients with Malignant Diseases)、Cancer Research、Vol.49、No.23、1989、6845-6851に記載したように進める事が原理的に可能であり、そこに記載された免疫学的技法(これは、エピメラーゼの部分配列に対するモノクローナル抗体を得る可能性を示す)は、引用によって本明細書に取りこまれている。記載された技法および/またはさらに免疫化する技法の変更は、当該分野の技術者であれば、関連標準研究および刊行物から採択でき、また状況を考慮して応用することができる。
さらに、エピメラーゼ抗体が、DNAによる直接的な遺伝子免疫化の技法を使用して産生されることも、明記すべきである。入手可能な抗体の範囲は、前記免疫化技法によって拡大することが可能であるとの知見が過去にあるので、さらに、本発明の範疇に入るのは、例えば、所望のエピメラーゼまたはその部分ペプチドのcDNAを免疫化のために使用することである。配列番号3に従うエピメラーゼまたはその部分ペプチド、例えば、配列番号1、配列番号2の部分配列および/または他の部分配列を含むペプチドは、入手可能な結果をもとにして、炎症ならびに感染(特に、敗血症タイプの全身的の感染)の診断および進行をモニターするための特異的マーカーペプチド(生体マーカー)として働く。プロカルシトニンの測定の場合のように、エピメラーゼは、初期の鑑別診断、検出、および重篤性の評価、ならびに敗血症および感染の進行の治療を伴う評価のための方法を使用して測定でき、このような方法では、エピメラーゼまたはその部分ペプチドの量が、患者の生物学的流体または組織サンプル中で測定され、炎症、重篤な感染、または敗血症の存在に関して、確定された存在および/または測定されたペプチドの量から結論が導かれ、得られた結果は、評価される敗血症の重篤性、および治療の可能性、および/または治療の展望と相関する。
エピメラーゼまたはその断片もしくは場合により翻訳後に修飾された形態を測定する代わりに、対応するmRNAを測定することも診断を目的とする場合には可能である。診断を目的とする場合に、炎症を起こしている器官または組織もしくは生物学的流体中で酵素活性を測定するといったように、間接的にエピメラーゼを測定することもできる。
さらに、予後マーカーおよび炎症(具体的には全身性炎症)および敗血症の進行をモニターするマーカーとして、エピメラーゼの測定を、一部、他のマーカーとの組合せ測定として、行うことができる
プロカルシトニン測定との組合せの他に、エピメラーゼの測定と敗血症および全身性炎症の他のマーカーの測定とを組み合わせることが特に適切であり、とりわけ、炎症の調節に関与するタンパクCA19-9、CA125、S100BまたはS100A、もしくは新規敗血症マーカー、インフラミン(ドイツ特許101 19 804.3)および以下に記載する当該出願人による先願の非公開ドイツ特許出願に記載されるCHP(ドイツ特許101 31 922.3)の測定、酵素グリシンN-アシルトランスフェラーゼ(GNAT)の測定、および/または溶解性サイトケラチン断片、具体的には、近年見い出された溶解性サイトケラチン-1断片(sCY1F;ドイツ特許101 30 985.6)の測定、および既知腫瘍マーカーCYFRA-21またはTPS、および/または1種または複数の上記記載のプロホルモンの測定との組合せが適切である。既知の炎症パラメータであるC反応性タンパク(CRP)を同時に測定することも可能である。本願およびこれと平行する対応出願に記載した新たな結果に基づいて、既知または未だ発見されていない生物分子であって組織特異的または器官特異的な炎症マーカーとして適切な生物分子の測定と組み合わせることも、敗血症を精細に診断するため一般的に考慮すべきである。
出願人の前記先願は参照により本明細書に組み入れられる。
エピメラーゼまたはその断片もしくは融合産物またはそれをコードするDNAは、予防的薬剤または治療に使用することもできる。したがって、例えば、適切なエピメラーゼ断片は、それ自身公知の技法で、能動免疫化によるエピメラーゼ結合抗体のin vivo産生に使用することができる。完全エピメラーゼまたは適切な部分配列を、翻訳後修飾させた形態(例えば、グリコシル化されまたはリン酸化された形態)もしくは製剤用賦形剤例えばポリエチレングリコール基で置換された形態で含む分子もまた、エピメラーゼとみなすべきである。
エピメラーゼまたはその適切な部分配列は、エピメラーゼまたはその部分ペプチドに適切な特異的バインダーによって、エピメラーゼが体内的に不活性化されるか、または場合によって、適切な免疫吸着剤もしくは灌流可能な固体相(この相は、エピメラーゼ用の特異的バインダーで被覆される)を使用して、患者の循環系から「血液の洗浄」または血漿交換療法という状況で、やはり体外的に排除されるという意味で、治療的介入の標的として働くことができる。例えば感染性疾患および風邪に対する医薬シクロオキシゲナーゼインヒビターによる既知の影響のような、関連酵素の効果および活性を変更することにより病理学的工程に影響を与える既知の他の例のように、治療目的のためにA1Eの作用も、酵素阻害、より詳細にはA1E阻害効果を有する医薬を用いて影響されうる。
医薬に加えて、特に特異的抗体、特にヒト化したモノクローナル抗体がin vivoでエピメラーゼを不活性化するのに適する。しかし、炎症カスケードもまた、エピメラーゼ自身またはエピメラーゼアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して治療的に影響を受ける可能性がある。このような治療的介入は、特に、炎症過程におけるエピメラーゼの生理学的機能に関するさらなる知見が確認されてくれば、可能性がある。したがって、現時点では、エピメラーゼが、おそらくはペプチド、タンパク、脂質、糖分子および他の物質の活性化または不活性化における（脱）グリコシル化工程および他の代謝工程に関与することにより、病理過程に直接または間接的に影響を与えることによって、炎症過程に重要な役割を果たすということを除外できない。
エピメラーゼの発見および同定を、添付の配列表を参照して下記にさらに詳細に説明する。
動物モデル(ヒヒ)での内毒素投与による感染シミュレーション
内毒素の注射によってプロカルシトニン分泌を刺激する、ヒヒで実施された実験に基づいて(H.Redlら「外傷および敗血症のヒヒモデルにおけるプロカルシトニン分泌パターン:サイトカインおよびネオプテリンに対する関係」「procalcitonin release pattern in a baboon model of trauma and sepsis:relationship to cytokines and neopterin」、Crit Care Med 2000、Vol.28、No.11、3659-3663;およびH.Redlら、「敗血症の非ヒト霊長類モデル」「Non-Human Primate Models of Sepsis」in:Sepsis 1998;2:243-253参照)、ヒヒ(雄、約2歳、27〜29kg)それぞれに、体重kgあたり100μgのLPS(サルモネラティフィムリウム由来のリポポリサッカライド:供給源はシグマ)を静脈内投与した。投与5〜5.5時間後に、10mlのドレータルを静脈内投与して動物を犠牲にした。その死から60分以内に、すべての器官および組織を切開し、液体窒素で凍らせることによって安定化した。
さらに処理を行う間に、1.5mlの緩衝液A(50mMトリス/塩酸、pH7.1、100mM ＫＣｌ、20%グリセロール)を、窒素で冷却中の個々の冷凍された組織(1g)のサンプルに加え、サンプルを磁器すり鉢中で粉砕し粉体とした(J.Klose、「2次元電気泳動のためのネズミおよびヒト由来の全組織タンパクの分画抽出」「Fractionated Extraction of Total Tissue Proteins from Mouse and Human for 2-D Electrophoresis」、in Methods in Molecular Biology、Vol.112:2-D Proteome Analysis Protocols Humana Press Inc、Totowa、NJを参照のこと)。引き続いて遠心分離を1時間100,000g、+4℃で行った後、得られた上澄み液を回収して、別の処理に必要とされるまで-80℃で貯蔵した。
上記のように得られたサンプルによる実験では、最大量のプロカルシトニンが処理動物の肝臓組織で見い出されることがわかったので、ヒヒの肝臓からのタンパク抽出物を、新規な敗血症特異的生体マーカーの探索に使用した。
ヒヒの肝臓細胞の細胞質タンパクを使用したプロテオームの分析
一方では、健常なヒヒ(対照)、他方では、LPSが注入されているヒヒの肝臓細胞の細胞質タンパク抽出物をプロテオーム分析に使用した。初回の2次元ゲル電気泳動分析では、タンパク100μgを含む肝臓抽出物を、9M尿素、70mMDTT、2%両性電解質、pH2〜4に対して安定化させ、次に2次元ゲル電気泳動分析で、J.Kloseら(「タンパクの2次元電気泳動:ゲノムの機能的分析の最新プロトコルおよび含意」、「Two-dimensional electrophoresis of proteins:An updated protocol and implications for a functional analysis of the genome」、Electrophoresis 1995、16、1034-1059)に記載のように分離した。2次元電気泳動ゲルにおけるタンパクの視覚化は、銀染色(J.Huekeshovenら 「ファストシステム開発ユニットIにおける高速染色のための改良銀染色手順:ソディウムドデシルゲルの染色」「Improved silver staining procedure for fast staining in Phast-System Development Unit.I.Staining of sodium dodecyl gels」、Electrophoresis 1988、9、28-32)で行った。
評価のために、非処理動物のサンプルのタンパクのスポットパターンと、処理動物の肝臓組織サンプルから得られたタンパクのスポットパターンとを比べた。対照サンプル中で発生しておらず、すべての処理動物中で付加的に生じた物質を、さらに分析調査するために選択した。図1は、対照サンプル(A)と処理動物のサンプル(B)についての2次元電気泳動ゲルの比較を示す。(B)における付加的タンパクのスポットはエピメラーゼに対応し、その位置は矢印および丸印で選び出してある。
2次元ゲル電気泳動分析のタンパクのスポットパターンで同定した新規特異的タンパクは、次に、350μgのタンパクを使用して分離用2次元ゲル電気泳動によって調製する(もう一度(10)を参照)。分離用2次元電気泳動では、染色をクマシーブリリアントブルーG250(V.Neuhoffら「クマシーブリリアントブルーG250およびR-250を使用した、ナノグラムの感度で透明なバックグラウンドを有する、等電集束ゲル含むポリアクリルアミドゲルにおけるタンパクの改良染色」「Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250」、Electrophoresis 1988、9、255-262参照)で行った。
さらに分析するために予め選択されたタンパクスポットをゲルから切り出した。これをA.Ottoら(「質量分析用に調製された有効なサンプルを使用して2次元電気泳動によって分離されたヒト心筋タンパクの同定「Identification of human myocardial proteins separated by two-dimensional electrophoresis using an effective sample preparation for mass spectrometry」、Electrophoresis 1996、17、1643-1650)に記載された方法を使用してトリプシンで消化し、次に質量分析手段、特に、例えばG.Neubauerら(「質量分析およびESTデータベース研究はマルチタンパクスプライスゾーム複合体の特徴付けを行うことが可能である」「Mass spectrometry and EST-database searching allows characterization of the multi-protein spliceosome complex」、in nature genetics vol.20、1998、46-50);L.Lingnerら、(「テロメレースの触媒性サブユニット中の逆転写酵素モチーフ」「Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerase」、in Science、Vol.276、1997、561-567);M.Mannら(「質量分析から得られるデータを使用してヌクレオチドおよびタンパク配列データベースにラベル付けをする」「Use of mass spectrometry-derived data to annotate nucleotide and protein sequence databases」、in TRENDS in Biochemical Sciences Vol.26、1、2001、54-61.)に記載され検討された質量分析研究を利用して分析した。ESI(ElectroSprayIonization)の後、トリプシンで消化されたサンプルをタンデム質量分析にかけた。いわゆるナノフロ-Z-スプレーイオン源(Micromass、UK)を有するQ-TOFマススペクトルメータを使用した。手順は、装置メーカーの実施説明書に従った。
エピメラーゼの同定
図1(A)および1(B)に示すように、LPSの注入物が予め投与されているヒヒの肝臓細胞抽出物が、とりわけ新規タンパクを含んでいた。このタンパクは、ゲル電気泳動のデータを基にして既知分子量のマーカー物質と比べて、分子量が約40000±2000ダルトンであると推定され、一方、1次元のタンパク相対的位置から等電点が約6から6.4であると推定された。
このタンパクは、質量分析によって分析された。図2はトリプシンに消化された全タンパクの質量スペクトルを示す。
図2による「親スペクトル」の断片をタンデム質量分析によって同定した。これらの二つの断片について得られた質量スペクトルは、図３および４に示されている。これらの断片は、それ自体公知の通りのコンピューター計算により、部分ペプチド配列：配列番号1および配列番号2であると同定できた。
タンデム質量スペクトルで同定された配列番号1および配列番号2に従う部分配列を、次にシークエンスデータベースで利用可能なタンパク配列と比べた。配列番号1および配列番号2の部分配列が９−１４の位置と１３４−１４０の位置にそれぞれ含まれている37765ダルトンの理論分子量を有する342アミノ酸を含む仮想的ヒトタンパクのアミノ酸配列（配列番号１参照）が、ｃＤＮＡデータベースＮＣＢＩ、アクセション番号AAH14916に見出された。二つのアミノ酸配列（TrEMBLのNiceProt Viewを用いて見出され、一方はヒト由来で２０４アミノ酸を含み（Entry name/Primary accession No.Q12915)、他方は豚の腎臓に由来し（Entry name/Primary accession No.Q9GKX6)、これらの両方がアルドース1-エピメラーゼに帰せられる）を配列比較することにより、配列番号３に係る配列をヒトのアルドース1-エピメラーゼのアミノ酸配列であると同定することができた。
このようにして解明されたヒトエピメラーゼの完全配列によって、ヒト医薬品(診断または治療)用のヒトエピメラーゼまたはその任意の部分配列(断片)の調製が、目的に応じて可能となり、またペプチドを調製するための公知の合成法または遺伝子工学方法を使用してその調製が可能となる。同じことは獣医用薬剤にも適用され、このような場合は、対応する既知の、例えばウシのエピメラーゼ配列、または既知のウシおよびヒト配列との類似性を基にした対応する動物特異的データベースで、簡単に見つけられる動物に特異的なエピメラーゼ配列に基づいて行うことが可能である。このようなペプチドは、例えばP.P Ghillaniら (「緊密に関連した遺伝子産物を分析するためのツールとしてのモノクローナル抗ペプチド抗体」「Monoclonal antipeptide antibodies as tools to dissect closely related gene products)、the Journal of Immunology、Vol.141、No.9、1988、3156-3163」)およびP.P Ghillaniら(「悪性疾患罹患患者の血清中のカルシトニン前駆体の同定および測定」「Identification and Measurement of Calcitonin Precursors in Serum of Patients with Malignant Diseases」、Cancer Research、Vol.49、No.23、1989、6845-6851)に記載の方法と同じように使用することができ、適切な抗体、具体的には、モノクローナル抗体が提供され、これがまた、エピメラーゼまたはその選択された部分ペプチドの免疫診断測定用分析の提供を可能にする。
上記に記載された既知の方法で得ることが可能なモノクローナル抗体もまた特に、それ自体既知のヒト化を行った後、新規治療剤の開発に使用することができる(K.Garberの「プロテインCは敗血症の解決策となり得る」「Protein C may be sepsis solution」、Nature Biotechnology、Vol.18、2000、917-918に要約されている治療的取り組みを参照のこと)。さらに、エピメラーゼ遺伝子の発現を阻止することによって、エピメラーゼをin vivoで中和することもできる。本願における発見からもたらされる治療的介入には、エピメラーゼの酵素活性を阻害する活性物質を投与することも含まれる。
さらに、エピメラーゼ自身またはその部分ペプチドを薬剤学的に活性な物質として使用することも本発明の範疇に入る。したがって本発明はまた、実際に活性な物質として、本発明に従うペプチドまたはこれらのペプチドに対して産生される抗体の1種を含み、適切な製薬用キャリアと共に、患者へ投与するために調製される医薬組成物にも関する。
健常なヒヒ(A)の肝臓細胞の細胞質タンパクのスポットパターンとLPS投与による敗血症誘導後5時間のヒヒ(B)の肝臓細胞のタンパクを比べることができる2次元電気泳動ゲルを示す図である。矢印は、本発明による敗血症特異的産物エピメラーゼの位置を示し、表示(B)に丸印で強調してある。 二次元ゲル電気泳動により分離され、単離、およびトリプシン消化された完全産物A1Eの質量スペクトルを示す。 ESI-MS分析にかけられた図２のA1E断片710.3のタンデム質量スペクトルを示す。 ESI-MS分析にかけられた図２のA1E断片738.80のタンデム質量スペクトルを示す。

Claims (9)

  1. ヒトおよび獣医用医薬における、炎症および感染の検出、経過の予後および進行のモニターのためのマーカーペプチドとしての体液または体組織由来のアルドース１-エピメラーゼ(A1E)の使用。
  2. 患者の生物学的流体または組織サンプル中のアルドース１-エピメラーゼの存在および/または量を測定することによって、敗血症および重篤な感染、特に、敗血症様の全身性感染の経過の予後、重篤さの評価、および治療に伴う経過の評価を行うための、早期の鑑別分析および検出における、請求項1に記載のアルドース１-エピメラーゼの使用。
  3. 敗血症および重篤な感染、特に、敗血症様の全身性感染の検出、経過の予後、重篤さの評価、および治療に伴う経過の評価を行うための方法であって、患者の生物学的流体または組織サンプル中のヒトのアルドース１-エピメラーゼ（配列番号３）の存在および/または量を測定し、その検出可能性および／または量が、敗血症または感染の存在、予想される経過、重篤性、または治療の成功を示すことを特徴とする方法。
  4. 免疫診断アッセイ法であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
  5. 前記アルドース１-エピメラーゼの測定を、対応するA1E-mRNAまたはA1E酵素活性の測定として間接的に行うことを特徴とする、請求項3に記載の方法。
  6. 少なくとも1種の別の敗血症パラメータを同時に測定するマルチパラメータ測定の一部として行い、測定された結果は少なくとも2つの測定量からなるひと組の形で得られ、敗血症の高精度の分析のために評価されることを特徴とする、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記マルチパラメータの測定の過程で、プロカルシトニン、CA19-9、CA125、S100B、S100Aタンパク、溶解性サイトケラチン断片、具体的に、CYFRA21、TPS、および/または溶解性サイトケラチン-1断片(sCY1F)、ペプチドインフラミンおよびCHP、ペプチドプロホルモン、グリシンN-アシルトランスフェラーゼ(GNAT)、およびC-反応性タンパク(CRP)からなる群から選択される少なくとも1種の別のパラメータをアルドース１-エピメラーゼの他に測定することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
  8. 前記マルチパラメータ測定はチップ技法測定装置または免疫クロマトグラフィー測定装置による同時測定として行われることを特徴とする、請求項6または7に記載の方法。
  9. 前記測定装置を使用して得られた複合的測定結果の評価が、コンピュータプログラムを用いて行われることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
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