JP4273157B2

JP4273157B2 - 抗アレルギー効果のあるケフィア様炭酸含有ヨーグルトおよびその製造方法

Info

Publication number: JP4273157B2
Application number: JP2007016594A
Authority: JP
Inventors: 昇二中村; 忠彦久山; 敬章藤原; 信之佐藤; 洋介砂田; 祐介藤井
Original assignee: OHAYO DAIRY PRODUCTS CO., LTD.
Current assignee: OHAYO DAIRY PRODUCTS CO., LTD.
Priority date: 2007-01-26
Filing date: 2007-01-26
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2027-01-26
Also published as: JP2008182900A

Description

本発明は、抗アレルギー効果のあるケフィア様炭酸含有ヨーグルトおよびその製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、乳糖非発酵性酵母菌と乳糖発酵性乳酸菌を種菌としてつくられる、製造後の過剰なガス生成を抑えたケフィア様炭酸含有ヨーグルトであって、好ましくは乳糖非発酵性酵母菌として抗アレルギー効果を有するサッカロミセス・セレビシエを、また乳糖発酵性乳酸菌として少なくともラクトバチルス・ブルガリカスとストレプトコッカス・サーモフィルスを含む混合乳酸菌を種菌として製造されるＩ型アレルギー症状の改善に有効なケフィア様炭酸含有ヨーグルトに関するものである。

従来、酵母菌と乳酸菌の共生関係を利用してつくる発酵乳としては、中央アジアから旧ソ連邦の広い地域にかけて伝統的に食されているケフィアがよく知られている。
ケフィアは、酵母菌と乳酸菌から構成されるカリフラワー状の形をしたケフィア粒といわれる種菌を乳に加え、発酵させてつくられる酸乳で、適度な酸味に加え、さわやかな炭酸感が味わえることが特徴である。またケフィアは保健的機能性に富んだ食品としても良く認知されており、今までに抗アレルギー、胃腸病、糖尿病、高血圧、抗癌作用などの効用が見つかっている。
特に近年、先進国を中心にアトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギーといったＩ型アレルギー疾患の患者が年々増加していることから、ケフィアによるアレルギー治療は大いに期待されるところである。

このように味覚的にも保健機能的にも優れたケフィアではあるが、従来のケフィア粒を使った工業的生産には技術的課題が存在している。
それは、ケフィア粒を構成している酵母菌の中には乳糖を資化してアルコール発酵をおこない、その結果多量のエタノールと炭酸ガスを生成する菌種が含まれていることである。そのため、過剰に生成された炭酸ガスが原因で、しばしば容器の膨張や破裂が生じることが問題となっている。

こうしたトラブルを防ぐ手段として、ケフィア粒を使わずに特定の酵母菌種、具体的には乳糖非発酵性酵母菌種、ならびに乳酸菌種を種菌として併用することで過剰な炭酸ガス生成を抑えたケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製法がすでに提案されている（特許文献１〜５参照）。

これらによれば、乳糖非発酵性酵母を唯一の酵母種菌として、この酵母菌と乳酸菌を併用して乳を発酵させることにより、酵母菌による乳糖からのアルコール発酵を抑えることが出来き、過剰なガス生成を心配すること無くケフィア様炭酸含有ヨーグルトの工業的生産が可能となるのである。
この場合、乳糖非発酵性酵母菌は、乳酸菌による乳酸発酵の過程で蓄積されたグルコースやガラクトースを利用することでアルコール発酵をおこない、僅かな量のエタノールと炭酸ガスを生成することになる。

しかしながら現在までのところ、乳糖非発酵性酵母菌を唯一の酵母種菌として乳酸菌と併用して乳を発酵させる製法では、過剰な炭酸ガス生成を抑えたケフィア様炭酸含有ヨーグルトは提供できるものの、望まれているような抗アレルギー効果のあるケフィア様炭酸含有ヨーグルトを提供するには至っていない。

このような状況のもと、最近になって、エンテロコッカス・フェカリス（特許文献６〜７参照）、ラクトバチルス・ロイテリ（特許文献７参照）、ラクトバチルス・アシドフィルス（特許文献８参照）、ラクトバチルス・パラカゼイ（特許文献９参照）といった乳酸菌種の中から抗アレルギー作用を有する菌株が見出され、それら菌株を使った抗アレルギー剤が提案されている。

そしてこれにより、それら有用乳酸菌株と乳糖非発酵性酵母菌を併用することで抗アレルギー効果のあるケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造が可能となったが、この方法においても製法上充分満足できるものではない。

その理由としては、上記乳酸菌種はいずれも乳中での増殖性が悪く、そのためにこれら乳酸菌を種菌にしてケフィア様炭酸含有ヨーグルトをつくる場合、ヨーグルト状に固まる（カード形成）まで長い時間を必要とするからである。

それを解決する手段としては、ヨーグルトミックスに乳酸菌の増殖促進物質、例えば大豆ペプチドや酵母エキスを添加し種菌の増殖力を高める方法が考えられるが、一般に増殖促進物質の添加は製造コストがかかるうえ、ヨーグルトの味にも悪い影響を与えるので現実的な対処法とはいえない。

すなわち、このようにすでに見出だされている有用乳酸菌株をもってしても、抗アレルギー効果のあるケフィア様炭酸含有ヨーグルトを工業的に製造することは難しいのが現状である。
特公昭４９−１１４３２号公報特開昭６３−２６３０４４号公報特開昭６４−４７３３８号公報特開平１−３１７３５５号公報特開平９−１５４４８３号公報特開平１１−１９９４９５号公報特開２０００−０９５６９７特開２００４−０２６７２９特開２００５−１３９１６０

本発明の第１の目的は、種菌として酵母菌と乳酸菌を併用してつくられるケフィア様炭酸含有ヨーグルトであって、特に製造後の過剰なガス生成が抑えられ、且つアトピー性皮膚炎、花粉症、通年性鼻炎などＩ型アレルギーの改善に有効なケフィア様炭酸含有ヨーグルトを提供することであり、
本発明の第２の目的は、そのようなケフィア様炭酸含有ヨーグルトを工業的に容易に製造できる方法を提供することである。

上記課題を解決するために本発明者らは創意工夫を重ねた結果、乳糖非発酵性酵母菌サッカロミセス・セレビシエ、特に乳糖非発酵性酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）にＩ型アレルギー症状を改善する効果があることを見出し、さらにこの酵母菌と乳糖発酵性乳酸菌を種菌としてケフィア様炭酸含有ヨーグルトを製造することで本発明を完成させるに至った。

本発明の請求項１記載の、製造後の過剰な炭酸ガス生成を抑えた、Ｉ型アレルギー症状の改善に有効なケフィア様炭酸含有ヨーグルトは、乳糖非発酵性で、且つ抗アレルギー作用を有する酵母菌サッカロミセス・セレビシエである馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）と乳糖発酵性乳酸菌を含有することを特徴とする。

本発明の請求項２は、請求項１記載のケフィア様炭酸含有ヨーグルトにおいて、前記乳糖発酵性乳酸菌が、少なくともラクトバチルス・ブルガリカスとストレプトコッカス・サーモフィルスを含む混合乳酸菌であることを特徴とする。

本発明の請求項３は、獣乳に対して、必要に応じて生クリーム、脱脂粉乳、乳清パウダーを含む乳成分、酵母菌サッカロミセス・セレビシエである馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）の非発酵性糖、保型剤、離水防止剤を適量添加混合して調製される原料を主成分として含む主原料に対して、必須の種菌として乳糖非発酵性で且つ抗アレルギー作用を有する前記酵母菌サッカロミセス・セレビシエと乳糖発酵性乳酸菌を併用して所定量接種して醗酵せしめることを特徴とする製造後の過剰な炭酸ガス生成を抑えた、Ｉ型アレルギー症状の改善に有効なケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造方法である。

本発明の請求項４は、請求項３記載のケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造方法において、前記酵母菌サッカロミセス・セレビシエと乳糖発酵性乳酸菌の接種量が、前記主原料に対してそれぞれ０．５〜１０質量％であることを特徴とする。

本発明の請求項１は、乳糖非発酵性で、且つ抗アレルギー作用を有する酵母菌サッカロミセス・セレビシエである馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）と乳糖発酵性乳酸菌を含有することを特徴とするケフィア様炭酸含有ヨーグルトであり、
馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株は、薬物塗布によって皮膚炎を誘発させたアトピー性皮膚炎発症モデルマウスに対して皮膚炎症状の改善および皮膚炎発症にともなう痒みの抑制をもたらす微生物として、本発明者らが中華人民共和国・内蒙古自治区で採取した馬乳酒から分離した株であり、アトピー性皮膚炎、花粉症、通年性鼻炎などＩ型アレルギーの改善に確実に有効である上、前記Ｓ４−Ａ株と乳糖発酵性乳酸菌を併用して乳を発酵させることにより、前記Ｓ４−Ａ株による乳糖を利用したアルコール発酵が抑えられる一方、前記乳糖発酵性乳酸菌によって生成された乳糖分解物であるグルコースおよびガラクトースを、前記Ｓ４−Ａ株が利用することによってアルコール発酵が僅かに生ずることから、過剰な炭酸ガス生成のないケフィア様炭酸含有ヨーグルトを工業的に容易に生産可能となり、特に製造後の過剰なガス生成が抑えられ、そのためこのケフィア様炭酸含有ヨーグルトの保存中において、容器の膨張や破裂を防止する効果があるという顕著な効果を奏する。

本発明の請求項２は、請求項１記載のケフィア様炭酸含有ヨーグルトにおいて、前記乳糖発酵性乳酸菌が、少なくともラクトバチルス・ブルガリカスとストレプトコッカス・サーモフィルスを含む混合乳酸菌であることを特徴とするものであり、
前記酵母菌サッカロミセス・セレビシエと、前記乳糖発酵性乳酸菌として、少なくともラクトバチルス・ブルガリカスとストレプトコッカス・サーモフィルスを含む混合乳酸菌を種菌に用いることでヨーグルトのカード形成までの時間を短縮できるので生産効率を向上できるとともに、過剰な炭酸ガス生成を確実に抑制でき、しかもＩ型アレルギーの改善に有効であるというさらなる顕著な効果を奏する。

本発明の請求項３は、獣乳に対して、必要に応じて生クリーム、脱脂粉乳、乳清パウダーを含む乳成分、酵母菌サッカロミセス・セレビシエである馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）の非発酵性糖、保型剤、離水防止剤を適量添加混合して調製される原料を主成分として含む主原料に対して、必須の種菌として乳糖非発酵性で且つ抗アレルギー作用を有する前記酵母菌サッカロミセス・セレビシエと乳糖発酵性乳酸菌を併用して所定量接種して醗酵せしめることを特徴とする製造後の過剰な炭酸ガス生成を抑えた、Ｉ型アレルギー症状の改善に有効なケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造方法であり、
本発明のケフィア様炭酸含有ヨーグルトを工業的に容易に製造できるという顕著な効果を奏する。

本発明の請求項４は、請求項３記載のケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造方法において、前記酵母菌サッカロミセス・セレビシエと乳糖発酵性乳酸菌の接種量が、前記主原料に対してそれぞれ０．５〜１０質量％であることを特徴とするものであり、
両種菌の接種量が多すぎると乳酸や炭酸による酸味・発泡感が強くなる恐れがあり、接種量が少なすぎると発酵までの時間がかかったり、炭酸感が弱くなったりする恐れがあるが、この接種量の範囲内でより優れた本発明のケフィア様炭酸含有ヨーグルトを工業的に容易に製造できるというさらなる顕著な効果を奏する。

以下、本発明を詳細に説明する。以下の説明において％は、質量％を示す。
本発明で使用する酵母菌サッカロミセス・セレビシエは、乳糖非発酵性で、且つ抗アレルギー作用を有する菌株であれば特に限定されるものではない。
本発明で使用する酵母菌Ｓ４−Ａ株は、本発明者らが中華人民共和国・内蒙古自治区において昔から伝統的製法でつくられている馬乳酒から分離した酵母菌であり、本発明において好ましく使用できる。
本菌株は、馬乳酒を適宜希釈したのち、その希釈液をポテトデキストロース寒天培地上に塗沫することによって分離できる。そしてこのようにして得られる菌株は、食経験が豊富なことから、安全性には何ら問題のない菌株である。

酵母菌Ｓ４−Ａ株は、以下の菌学的性質を有し、２８ＳｒＤＮＡＤ１／Ｄ２領域の塩基配列解析によってサッカロミセス・セレビシエと同定された菌種である。

酵母菌Ｓ４−Ａ株と、標準酵母菌サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ−２８８Ｃ）の炭素類の資化性を対比した結果を表１に示す。

さらに酵母菌Ｓ４−Ａ株の特筆すべき特性としては、薬物塗布によって皮膚炎を誘発させたアトピー性皮膚炎発症モデルマウスに本菌株を経口投与した場合、明らかな皮膚炎症状の改善および皮膚炎発症にともなう痒みの抑制をもたらすことである。
このことから酵母菌Ｓ４−Ａ株は、ＩｇＥ抗体量の上昇によって引き起こされるＩ型アレルギー反応を改善する機能をもった微生物であると云える。

また、その抗アレルギー作用は培養菌体そのもので認められることから、本菌株は抗アレルギー効果を発揮せしめる目的でさまざまな発酵食品に利用することができる。
特に本菌株は乳糖非発酵性であることから、乳糖発酵性乳酸菌と併用することで過剰な炭酸ガス生成を抑えたケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造に使用できる。

通常、酵母の培養には、バクトトリプトン、酵母エキス、麦芽エキスおよびぶどう糖を成分とする培地が適しており、本発明における酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株も同培地で培養できる。
一方、コスト面を考慮するならば、酵母エキス１〜２％およびぶどう糖１〜５％から成る液体培地で培養することが望ましく、同組成の液体培地で培養したＳ４−Ａ株はそのまま種菌として使用できる。
また酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株の種菌は乳を成分とする培地でもつくることができ、その場合は、１０％脱脂乳に酵母エキス１〜２％と本菌株の資化性糖であるグルコース、ガラクトースあるいはスクロースを１〜５％の範囲で任意に添加すればよい。

本菌株に関しては、その他培養条件も通常の酵母菌と変わるものではなく、例えば、酵母エキス１〜２％およびぶどう糖１〜５％から成る液体培地で、培養温度２０℃〜３７℃、培養時間１８〜２４時間の範囲で撹拌あるいは振とう培養することによって、菌数濃度がおよそ６×１０⁶ 〜９×１０⁶ コロニー数／ｍｌの酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株の種菌をつくることができる。

本発明のケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造には、乳糖非発酵性酵母菌で、且つ抗アレルギー作用を有するＳ４−Ａ株と乳糖発酵性乳酸菌が種菌として使用される。
酵母菌Ｓ４−Ａ株は、乳中の主たる糖である乳糖を分解してアルコール発酵をおこなうことはできないが、乳糖発酵性乳酸菌による乳酸発酵の過程で分解され乳中に蓄積される乳糖分解物、すなわちグルコースとガラクトースを資化することでアルコール発酵をおこない、その結果ヨーグルトに炭酸ガスとアルコールを付与することができる。

その際に酵母菌Ｓ４−Ａ株と併用できる乳酸菌は、乳糖発酵性を有し、乳中での増殖性に優れた菌種であれば特に制限されるものではないが、好ましくは増殖性ならびに生酸性に優れた乳酸菌種、すなわちヨーグルト製造において常用されているラクトバチルス・ブルガリカスとストレプトコッカス・サーモフィルスの混合乳酸菌を種菌として用いることが望ましい。

そしてそのときの両乳酸菌の混合比は、通常のヨーグルト製造に用いられる比率であれば何ら問題はない。

上記ラクトバチルス・ブルガリカスとストレプトコッカス・サーモフィルスの混合乳酸菌とその他菌種、例えばラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスから選ばれる少なくとも１種は併用して種菌とすることができる。

特に抗アレルギー作用のある乳酸菌株と本発明の酵母菌Ｓ４−Ａ株を併用することで、両菌株による抗アレルギー効果が相乗的に期待できる。

本発明のケフィア様炭酸含有ヨーグルトは獣乳を原料として作られるが、必要に応じて生クリーム、脱脂粉乳、乳清パウダーなどの乳成分を原料乳に適量添加してヨーグルト用ミックスをつくることができる。

また、添加できる甘味原料は、本発明で使用されるサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株の非発酵性糖であれば特に制限はなく、甘味度にあわせて原料乳に添加できる。具体的にはキシリトール、トレハロース、エリスリトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、イノシトールなどの糖アルコールが挙げられる。

さらにヨーグルトの保型性を高めたり、離水防止の目的でゼラチンや寒天などを加えることができるほか、適度な芳香を付与する目的で香料も添加することができる。

このように調製されたヨーグルトミックスは通常のヨーグルト製造の場合と同様の殺菌条件で処理を施したのちに使用される。

本発明では、上記ヨーグルトミックスに乳糖非発酵性で、且つ抗アレルギー作用を有する酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株と乳糖発酵性乳酸菌の両種菌を接種し、発酵させることで目的のケフィア様炭酸含有ヨーグルトが製造できるが、その際、酵母菌と乳酸菌の種菌接種量は、ヨーグルトミックス量に対してそれぞれ０．５〜１０％量の範囲であれば任意に添加できる。

しかしながら、両種菌の接種量が多すぎると乳酸や炭酸による酸味・発泡感が強くなり、接種量が少なすぎると発酵までの時間がかかったり、炭酸感が弱くなったりするので、通常はヨーグルトミックスの量に対して酵母菌１％量、乳酸菌３％量の割合で種菌を接種するのが好ましい。

後発酵タイプのケフィア様炭酸含有ヨーグルトは、通常のヨーグルトと同じくミックスの容器への充填に続き、恒温室内での発酵工程を経て作られるが、その際、容器の密閉には紙やアルミシール、さらにはスクリュータイプの蓋が使用できる。

また、発酵は２０〜３９℃の広い温度帯でおこなうことができるが、カードが凝固するまでに要する時間や出来上がりのヨーグルトの風味・炭酸感を考慮すると、３５〜３７℃で発酵させるのが望ましく、そのときの培養時間は８〜１８時間である。この場合、発酵時間が短いと酸味と炭酸感の弱いヨーグルトが、また発酵時間が長いと酸味と炭酸感の強いヨーグルトができるので、好みに応じて適宜発酵時間を設定する。

こうしてつくられるケフィア様炭酸含有ヨーグルトの品質は、酸度：１〜１．２％、エタノール含量：０．１〜０．３％、容器内圧：０．０３〜０．０５ＭＰａ、乳酸菌数：１×１０⁹ 〜３×１０⁹ ／ｍｌ、酵母菌数：３×１０⁶ 〜６×１０⁶ コロニー数／ｍｌである。

さらに１０℃で４週間保存後の容器内圧は０．０６〜０．０７ＭＰａであり、製造直後とほぼ変わらない。すなわち、アルコール発酵が抑制され、過剰な炭酸ガスが生成されていないことがわかる。
一方、前発酵タイプのヨーグルトは、種菌を接種したヨーグルトミックスをタンク内にて適温で発酵させたのち、冷却撹拌、容器充填の工程を経てつくることができる。

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は本発明の主旨を逸脱しない限り実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
試験方法：アレルギー抑制効果
（酵母菌体の調製）
ポテトデキストロース寒天培地上で増殖した酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株のコロニーを、バクトトリプトン１．０％、酵母エキス０．５％、麦芽エキス０．３％、ぶどう糖５．０％から成る液体培地１００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。
続いてこの培養液を同じ成分組成の液体培地１０リットルに移し、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を集め、さらに蒸留水で２回洗浄した。その後、この洗浄菌体を凍結乾燥処理することで粉末化し、得られた粉末菌体をマウスの投与試験に供した。

（動物種）
ＮＣ／Ｎｇａマウス雌性５週齢３２匹

（区分け）
各群のマウスには、固型飼料（オリエンタル酵母工業（株））および水を自由摂取させた。
（１）対照群：蒸留水０．３ｍｌ／匹／日を７４日間強制経口投与した群(8匹）
（２）Ｓ４−Ａ株０．１ｍｇ群：Ｓ４−Ａ菌体０．１ｍｇ／匹／日を７４日間強制経口投与した群（８匹）
（３）Ｓ４−Ａ株１．０ｍｇ群：Ｓ４−Ａ菌体１．０ｍｇ／匹／日を７４日間強制経口投与した群（８匹）
（４）Ｓ４−Ａ株１０．０ｍｇ群：Ｓ４−Ａ菌体１０．０ｍｇ／匹／日を７４日間強制経口投与した群（８匹）

（試験菌体の投与方法および投与期間）
Ｓ４−Ａ株の粉末菌体は蒸留水で懸濁したのち、経口ゾンデで強制投与した。期間は、ピクリルクロライド［ＰＣｌ：2, 4, 6 − trinitrochlorobenzene、東京化成工業（株）］で感作する１４日前から感作後６０日目まで連続投与した（計７４日間）。

（ＰＣｌによる感作）
あらかじめ背部と腹部を毛狩りしておいたマウスの背部、腹部、後脚フットパットに、５％ＰＣｌ溶液をそれぞれ５０μｌ、５０μｌ、２５μｌずつマイクロピペットで滴下し、塗布した（感作０日目）。
初回感作から４日目に１％ＰＣｌ溶液を左右耳介部の表裏に１０μｌずつ計４０μｌ、さらに背部に１５０μｌ塗布し、その後は７日毎に同じ感作を８回（５６日間）繰り返した。

（皮膚炎症状の観察）
皮膚炎症状の観察は、Leung らのClinical Skin Condition Scoreをもとに評価した。
すなわち、ＰＣｌ塗布後の耳介部および背部皮膚について（１）紅斑・発赤・出血、（２）浮腫・丘疹、（３）痂皮・乾燥、（４）組織剥離・糜爛の状態を各々４段階評価し（スコア０ ;無症状、スコア１ ;皮膚面積の２５％未満の範囲で発症、スコア２ ;皮膚面積の２５％以上５０％未満の範囲で発症、スコア３ ;皮膚面積の５０％以上の範囲で発症）、これらスコアの合計点数を臨床スコアとした。
背部および耳介部の臨床スコアの測定は、ＰＣｌ溶液を塗布したのち、２日目および７日目に実施した。また耳介部については臨床スコアによる評価に加え、肥厚（耳の厚さ）の測定もThickness Dial Gage を用いて実施した。なお、耳介肥厚はＰＣｌ溶液塗布後１日目および６日目に測定した。

（痒みによる引っかき行動の計測）
皮膚症状の悪化に伴う痒み度合いを調べるため、マウス用自動掻痒測定装置(MicroAct)を用いてマウスの背部引っかき行動を測定した。
最初に、マウスの後肢に小型強力磁石（横１ｍｍ、縦３ｍｍ）を埋め込む手術を行った。この手術は引っかき行動測定の最低１日以上前に行った。観察箱に入れたマウスが後肢で引っかき行動を起こすと後肢に埋め込まれた磁石の動きにより、観察箱内の磁場が変化する。その磁場の変化を観察箱の電磁コイルが感知して、情報をconnection boxに伝える。
Connection boxは送られてきた情報を整理して、パソコンの画面上に波形として表示する。この波形を解析することにより引っかき行動回数を測定することができる。
引っかき行動はＰＣｌ溶液塗布後２４時間後に測定し、Ｓ４−Ａ株菌体の投与は引っかき行動測定６０分前に行い、続いて投与５０分後にマウスを観察箱に移して１０分間順化させのち、引っかき行動を６０分間測定した。

試験結果：アレルギー抑制効果
（Ｓ４−Ａ株による皮膚炎症状の緩和）
背部および耳介の皮膚炎症状の観察結果はそれぞれ図１と図２に示した。
図１に示すように、背部の皮膚炎症状を観察した結果、対照群では感作３２日目以降症状の悪化が見られ臨床スコアが増加した。一方、Ｓ４−Ａ株投与群の場合、０．１ｍｇ投与群では対照群に比べ臨床スコアの有意な低減効果は見られなかったものの、１ｍｇ投与群では感作４１日目以降、１０ｍｇ投与群では感作３９日目以降、臨床スコアの増加が有意に抑制された。

図２に示すように、耳介の皮膚炎症状も同様に観察した結果、対照群では感作１１日目以降症状の悪化が見られ臨床スコアが増加したのに対して、Ｓ４−Ａ株投与群の場合、０．１ｍｇ投与群では対照群に比べ感作１３日目および３２日目で臨床スコアが有意に低かったが、それ以外の日にちでは有意な低減効果は見られなかった。一方、１および１０ｍｇ投与群では感作１３日目以降、臨床スコアの増加が有意に抑制された。

さらに耳介肥厚の測定結果を図３に示した。図３より、対照群では感作開始直後から耳介肥厚が増加し、感作後６１日目には感作前の２．５倍程度にまで増加した。一方、Ｓ４−Ａ株投与群では、０．１ｍｇおよび１ｍｇ投与群において対照群に比べ感作１０日目以降で耳介肥厚の増加が有意に抑制され、１０ｍｇ投与群では感作５日目以降で同じく耳介肥厚の増加が有意に抑制されることが認められた。

（痒みによる引っかき行動の計測）
引っかき行動回数の測定結果を図４に示した。対照群では感作初日に比べ、５日目以降で引っかき行動回数が有意に増加したのに対してＳ４−Ａ株投与群では、０．１ｍｇ投与群において感作後２６日目以降、１ｍｇ投与群においては感作後４７日目以降で感作初日に比べ引っかき行動回数が有意に増加した。そして、１０ｍｇ投与群では試験期間を通して引っかき行動の有意な増加は認められなかった。

このように本発明の酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株は、経口摂取によってＩ型アレルギー症状を劇的に改善する能力をもっており、抗アレルギー食品に応用できることがわかった。

（実施例２）
次に、酵母菌サッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株および混合乳酸菌を種菌とする抗アレルギー作用のあるケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造実施例を示す。

（酵母菌Ｓ４−Ａ株の種菌調製）
濃度０．５％量の酵母エキスおよび１％量のぶどう糖を成分とする液体培地１００mlにサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株のコロニーを接種し、３０℃で２０時間浸とう培養した。こうして得られたＳ４−Ａ株の種菌は６×１０⁷ コロニー／ｍｌの生菌数であった。

（乳酸菌株の種菌調製）
ラクトバチルス・ブルガリカス菌およびストレプトコッカス・サーモフィルス菌の種菌は、いずれも定法に従い１０％還元脱脂乳培地にて３７℃、１６時間培養したものを用いた。またラクトバチルス・アシドフィルス菌の種菌は、濃度０．１％量の酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地で３７℃、１６時間培養したものを用いた。

（ケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造）
牛乳１０００ｇ、脱脂粉乳２５０ｇ、生クリーム２５０ｇ、キシリトール１００ｇ、水３２００ｇを成分とするヨーグルトミックスを均質化（１５０Ｋｇ／ｍｌ）、殺菌処理（９５℃、４０秒）したのち、４０℃まで冷却した。
次にこのミックスに酵母菌Ｓ４−Ａ株の種菌５０ｇ、ラクトバチルス・ブルガリカス菌の種菌５０ｇ、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌の種菌５０ｇ、ラクトバチルス・アシドフィルス菌の種菌５０ｇを加えて１０分間撹拌した後、鉄製スクリュー蓋付ガラス瓶に９０ｇずつ充填し、蓋をした。
なお発酵は３７℃の恒温室内で１０時間おこない、発酵後は冷蔵庫内にて冷却・保存した。
このようにして出来上がったヨーグルトの品質は、酸度：１．０％、酵母菌数：３．５×１０⁶ コロニー／ｍｌ、乳酸菌数：１．５×１０⁹ コロニー／ｍｌであった。さらにヨーグルト中のエタノール濃度をエタノール測定用Ｆキット（ロッシュ）で測定したところ、０．１７％であった。
また、缶テスター（横山計器）を用いて容器内圧力を測定した結果、０．０５ＭＰａであった。
１０人のパネラーを対象にした味覚試験では、全員がヨーグルト本来の酸味と風味に加え、酵母菌による炭酸味とアルコール味を感じた。

本発明のケフィア様炭酸含有ヨーグルトは、種菌として乳糖非発酵性で、且つ抗アレルギー作用を有する酵母菌サッカロミセス・セレビシエである馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）と乳糖発酵性乳酸菌を併用して醗酵せしめて工業的に容易に製造でき、特に製造後の過剰なガス生成が抑えられ、そのためこのケフィア様炭酸含有ヨーグルトの保存中において、容器の膨張や破裂を防止する効果があり、且つアトピー性皮膚炎、花粉症、通年性鼻炎などＩ型アレルギーの改善に有効であるという顕著な効果を奏するものであり、
本発明の製造方法により本発明のケフィア様炭酸含有ヨーグルトを工業的に容易に製造できるという顕著な効果を奏するので、産業上の利用価値が高い。

マウスを使用したアレルギー抑制効果の確認試験における、マウス背部の臨床スコアに対するＳ４−Ａ株投与の効果を示すグラフである。マウスを使用したアレルギー抑制効果の確認試験における、マウス耳介部の臨床スコアに対するＳ４−Ａ株投与の効果を示すグラフである。マウスを使用したアレルギー抑制効果の確認試験における、マウス耳介肥厚に対するＳ４−Ａ株投与の効果を示すグラフである。マウスを使用したアレルギー抑制効果の確認試験における、マウスの引っかき行動に対するＳ４−Ａ株投与の効果を示すグラフである。

Claims

乳糖非発酵性で、且つ抗アレルギー作用を有する酵母菌サッカロミセス・セレビシエである馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）と乳糖発酵性乳酸菌を含有することを特徴とする、製造後の過剰な炭酸ガス生成を抑えた、Ｉ型アレルギー症状の改善に有効なケフィア様炭酸含有ヨーグルト。
前記乳糖発酵性乳酸菌が、少なくともラクトバチルス・ブルガリカスとストレプトコッカス・サーモフィルスを含む混合乳酸菌であることを特徴とする請求項１記載のケフィア様炭酸含有ヨーグルト。
獣乳に対して、必要に応じて生クリーム、脱脂粉乳、乳清パウダーを含む乳成分、酵母菌サッカロミセス・セレビシエである馬乳酒由来のサッカロミセス・セレビシエＳ４−Ａ株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭＡＰ−２１１２４）の非発酵性糖、保型剤、離水防止剤を適量添加混合して調製される原料を主成分として含む主原料に対して、必須の種菌として乳糖非発酵性で且つ抗アレルギー作用を有する前記酵母菌サッカロミセス・セレビシエと乳糖発酵性乳酸菌を併用して所定量接種して醗酵せしめることを特徴とする製造後の過剰な炭酸ガス生成を抑えた、Ｉ型アレルギー症状の改善に有効なケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造方法。
前記酵母菌サッカロミセス・セレビシエと乳糖発酵性乳酸菌の接種量が、前記主原料に対してそれぞれ０．５〜１０質量％であることを特徴とする請求項３記載のケフィア様炭酸含有ヨーグルトの製造方法。