JP4272377B2 - ウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼの新用途 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、ウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼ（別名：ウリジン二リン酸ガラクトース４−エピメラーゼ）の新用途に関し、当該酵素を応用したウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）への変換法などに関するものである。
背景技術
近年、糖鎖についての分子及び生化学的研究が急速に進み、その重要な機能、役割が明らかになるにつれ、生理活性を有する糖鎖（オリゴ糖）の医薬品および機能性素材としての用途開発が注目を集めている。しかし、現在、試薬として市販されているオリゴ糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでしか製造できず、大量に供給されうるものではない。
従来、オリゴ糖の製造は、天然物からの抽出法、化学合成法、あるいは酵素合成法、さらにはそれらの併用により行われていたが、医薬用、もしくは機能性素材として大量に製造するためには酵素合成法が最も適していると考えられている。
すなわち、（１）酵素合成法が、化学合成法にみられる保護、脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的とするオリゴ糖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性により、きわめて構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。さらに、近年の遺伝子組換え技術など、バイオテクノロジーの進展により種々の合成酵素が安価に生産できるようになりつつあることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げている。
酵素合成法によりオリゴ糖を合成する方法としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い単糖を用いることができるという利点はあるものの、反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点では実用化は極めて困難である。
一方、後者は特異的な糖転移酵素を用いる合成法であり、複雑な構造を持つオリゴ糖製造への応用や合成収率といった点で前者の方法よりも有利であると考えられており、また、近年の遺伝子組換え技術などのバイオテクノロジーの進展により、各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。
しかしながら、糖供与体である糖ヌクレオチドは一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないのが現状である。例えばＯ−結合型糖タンパク質の糖鎖コア部分またはスフィンゴ糖脂質などに含まれるＮ−アセチルガラクトサミンの供与体であるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは、従来、動物組織由来あるいは枯草菌由来のウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン４−エピメラーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ）を用いてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから合成する方法が報告されている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２７，１７１−１７７（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２３４（１１），２８０１−２８０５（１９５９）特開平７−７９７９２公報）。
しかし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは大量調製が比較的容易な糖ヌクレオチドであるものの、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼは、動物組織または菌体に極く少量しか存在せず、また、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ遺伝子を用いて組換えＤＮＡ手法により調製されたとの報告もないことから、当該酵素の大量調製はもとより、当該酵素を利用したＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造は事実上困難なことであった。
発明の開示
本発明者らは、上記問題点を解決するため鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、枯草菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼ（ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ）が下記（１）の本来の変換反応を触媒する活性を有するほかに、下記（２）の変換反応も触媒する活性を有していることを見出した。
（１）ＵＤＰ−グルコース ⇔ ＵＤＰ−ガラクトース
（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ⇔ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ
従来、ほ乳類由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、上記（１）の変換反応を触媒する活性および上記（２）の変換反応を触媒する活性の両方を有することが報告されている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ，２５８，Ｎｏ．１７，１０７７４−１０７７８（１９８３）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６１，５９０−５９８（１９９７））。
しかしながら、動物組織由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは生産量が僅かで調製が困難であること、また、当該酵素を用いる変換反応の際には、補酵素として高価なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）が必要であることなど、当該酵素を用いる方法は実用的な方法とはいえなかった。
一方、大腸菌及び酵母由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応を触媒する活性を有していないと報告されており（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ，，２４４，２１３２−２１３６（１９６９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，１６４５−１６５４（１９６８）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５８，Ｎｏ．１７，１０７７４−１０７７８（１９８３）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６１，５９０−５９８（１９９７））、また、枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼは全く異なる別個の酵素であると報告されていたがために（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ，，２３４（１１），２８０１−２８０５（１９５９）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５８，Ｎｏ．１７，１０７７４−１０７７８（１９８３））、枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼがＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースへの変換反応以外にもＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応をも触媒する活性を有しているという知見はまったく意外なことであった。
本発明者らは上記知見を基に、さらに検討を重ねた結果、枯草菌のみに限定されることなく、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼはＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースへの変換反応以外にもＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応をも触媒する活性を有していることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、エピメラーゼを用いてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する方法において、エピメラーゼとして、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いる、エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換方法に関するものである。
また、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼからなるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの供給系に関するものである。
さらに、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃにエピメラーゼを作用させてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを製造する方法であって、エピメラーゼとして、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いる、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
さらに、本発明は、エピメラーゼを用いてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する方法において、エピメラーゼとして、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼを用いる、エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換方法に関するものである。
さらに、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、および配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼからなる、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの供給系に関するものである。
さらに、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃにエピメラーゼを作用させてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを製造する方法であって、エピメラーゼとして、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼを用いる、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明において使用するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、胞子形成能を有する細菌由来の酵素であって、かつ下記の２つの反応を触媒するものであれば特に制限されない。
（１）ＵＤＰ−グルコース ⇔ ＵＤＰ−ガラクトース
（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ⇔ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ
このようなＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、バシラス属などの胞子形成能を有する細菌から調製することができる。
より具体的に、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等を例示することができ、特に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）は既にクローン化され、その塩基配列が報告されており（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ９９３３９）、このクローン化された遺伝子の塩基配列に基づき、公知の組換えＤＮＡ手法により枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを調製し、当該酵素を本願発明に使用するのが好ましい。該酵素は、そのクローン化された遺伝子の塩基配列から分かる通り、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。本発明では、このアミノ酸配列を有する酵素に限らず、配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素と同様の酵素活性を有する酵素であってもよい。
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）を得るには、例えば報告されている塩基配列をもとにプローブを合成し、枯草菌の染色体ＤＮＡよりＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。また、上記した配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素と同様の酵素活性を有する酵素の遺伝子は、遺伝子ｇａｌＥに基づいて、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができる。
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザムーギルバートの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））もしくはジデオキシチェーンターミネーター法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０（１９８３））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを大腸菌内で大量生産させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０，２１（１９８３）、Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２））、ｔｒｃプロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３５３９（１９８５））などを例示することができる。
ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的には、ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７５））、ｐＵＣ１８，ｐＵＣＴ９（Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９８５））などを例示することができる。
作製した組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１９８５））などが使用可能である。
大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））などにより大腸菌を形質転換することができる。
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子の発現を誘導して菌体内に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
培養中にＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターなどを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を適当量添加する。また、使用するプロモーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加する必要はない。
枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子は、上記した枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子ｇａｌＥの塩基配列を参考にしてプライマーを合成し、合成したプライマーをプローブとして、枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌の染色体ＤＮＡ中のｇａｌＥと相同性の高いＤＮＡ断片を探索し、このＤＮＡ断片をクローニングすることにより得ることができる。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の一つであるＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓについては、その全ゲノム配列が既に明らかにされており（Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，３（１），２１−２８（１９９９））、これらの情報によりクローニングを比較的容易に行うことができる。このようにしてクローニングされたＤＮＡ断片を用いて、組換ＤＮＡ法により枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを調製するには、上記した枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子ｇａｌＥを用いて調製する方法と同様にして実施することができる。
あるいは、枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、該細菌を通常の方法で培養し、その培養物から通常の精製法により調製することもできる。具体的には、培地としてＳＣＤ培地、標準寒天、普通寒天を用いて、細菌を培養する。培養は、通常の液体培養法によって行えばよく、培養温度は培養する菌に適した温度、例えば２５℃〜６５℃で、必要により通気攪拌しながら行う。このようにして得られた培養物から、膜分離あるいは遠心分離等により菌体を回収し、次いで集菌した菌体を超音波などで破壊後、熱処理、硫安分画処理、透析処理、イオン交換、ゲル濾過などの各種クロマトグラフィー処理を単独でまたは組み合わせて行うことにより、目的とするＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを調製することができる。精製の際のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの追跡及び確認は、例えば本明細書の実施例に記載するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ活性の測定法に準じて実施することができる。
かくして得られるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを本発明の方法に適用する際の使用態様としては、組換えＤＮＡ法により得られるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの場合には、上記した形質転換体そのもの、該形質転換体の処理物、該処理物を精製処理して得られる酵素タンパク質などを利用することができる。また、組換えＤＮＡ法によらず通常の精製法により調製した場合には、上記した精製法により得られるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼをそのまま用いることができる。
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼとして形質転換体を利用する場合、上記の方法で得られる形質転換体の培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収した微生物の菌体を例示することができる。また、形質転換体の処理物としては、上記回収した微生物菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体処理物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。さらに、該処理物を精製処理して得られる酵素タンパク質としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
このようなＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応、あるいはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃのエピマー化は、例えば以下の条件で行うことができる。
すなわち、反応に使用するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは既に市販されており、この市販品を使用することができる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの濃度としては、たとえば１〜５０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、反応系に添加するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの濃度としては、たとえば０．００１〜１００ユニット／ｍｌの範囲から適宜設定すればよい。
上記反応は、トリス塩酸、リン酸カリウムなどの適当な緩衝液（ｐＨ７〜９、好ましくは７．５〜８．５）中、６０℃以下、好ましくは１５〜５０℃で１〜５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施することができる。
上記反応系には、必要に応じてマグネシウムを添加するのが好ましい。マグネシウムとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機酸のマグネシウム塩を使用することができ、その使用濃度としては５〜５０ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
生成したＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとの混合物から単離する必要がある場合には、糖ヌクレオチドの通常の精製法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する方法、また、塩析など）を単独で、あるいは適宜組み合わせて行えばよい。
また、本発明のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ供給系は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼから構成される。この供給系を、例えば糖転移酵素（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）単独あるいは糖転移酵素とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ再生系とを組み合わせた系とリンクさせることにより、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含有するオリゴ糖合成に利用することもできる（特開平７−７９７９２号公報参照）。
実施例
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの定量はＨＰＬＣ法により行った。すなわち、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として１ｍＭ テトラブチルアンモニウム、５０ｍＭ 酢酸マグネシウム溶液を用いた。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどは宝酒造（株）より入手した。
実施例１
（１）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子のクローニング
枯草菌１６８Ｍ（ＡＴＣＣ ２７３７０）の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（配列表の配列番号２及び３）を使用し、ＰＣＲ法により枯草菌ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）遺伝子を増幅した。
プライマー（Ａ）：５’−ＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＧＧ−３’
プライマー（Ｂ）：５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＣＧＣＡＣＴ−３’
ＰＣＲによるｇａｌＥ遺伝子の増幅は、反応液［１００μｌ中５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット］をＰｅｒｋｉｎ−ＥＬｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５７℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌（宝酒造より入手）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＥ−１を単離した。ｐＴｒｃ−ｇａｌＥ−１は、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に枯草菌ｇａｌＥ遺伝子のプロモーター及び構造遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの調製
プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＥ−１を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収し、５０ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
このようにして得られた上清画分を酵素調製物とし、酵素調製物におけるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌）の測定結果と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるエピメラーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
ｉ）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ活性の測定と単位の算出法
２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−グルコースを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素調製物を添加して３７℃でインキュベーションすることで反応を行い、５分間煮沸することにより酵素を失活させる。ＨＰＬＣにより反応液中のＵＤＰ−ガラクトースを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−ガラクトースを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
ｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性の測定と単位の算出法
２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素調製物を添加して３７℃でインキュベーションすることで反応を行い、５分間煮沸することにより酵素を失活させる。ＨＰＬＣにより反応液中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（３）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ部分精製品の調製
上記（２）で調製した酵素調製物に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム粉末を添加し、４℃、一晩の撹拌の後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により沈殿物を除去した。続いて得られた上清画分に８０％飽和になるように再度硫酸アンモニウム粉末を添加し、４℃、一夜の撹拌を行い、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）を行った。得られた沈殿画分を５ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液１リットルで２回の透析を行った。このようにして得られた試料を酵素調製液とし、以下（４）の合成反応に供した。なお、該酵素調製液におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性は４．３８ユニット／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。
（４）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成
１８０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液５００μｌに上記（３）で調製した酵素調製液を０．２１２ユニット添加し、３７℃で２１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、５０．３８ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが生成することが認められた。
産業上の利用可能性
従来報告されていた、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの調製方法は、動物組織または菌体内での当該酵素生産量が微少である等の理由で調製が困難であったことから、到底実用的な方法とはなり得なかった。
本発明者らは、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼがＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースへの変換反応を有するほかに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応を触媒する活性を有していることを見出し、このような知見により、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応が実用的に初めて利用可能になった。
【配列表】
本発明は、ウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼ（別名：ウリジン二リン酸ガラクトース４−エピメラーゼ）の新用途に関し、当該酵素を応用したウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）への変換法などに関するものである。
背景技術
近年、糖鎖についての分子及び生化学的研究が急速に進み、その重要な機能、役割が明らかになるにつれ、生理活性を有する糖鎖（オリゴ糖）の医薬品および機能性素材としての用途開発が注目を集めている。しかし、現在、試薬として市販されているオリゴ糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでしか製造できず、大量に供給されうるものではない。
従来、オリゴ糖の製造は、天然物からの抽出法、化学合成法、あるいは酵素合成法、さらにはそれらの併用により行われていたが、医薬用、もしくは機能性素材として大量に製造するためには酵素合成法が最も適していると考えられている。
すなわち、（１）酵素合成法が、化学合成法にみられる保護、脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的とするオリゴ糖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性により、きわめて構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。さらに、近年の遺伝子組換え技術など、バイオテクノロジーの進展により種々の合成酵素が安価に生産できるようになりつつあることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げている。
酵素合成法によりオリゴ糖を合成する方法としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い単糖を用いることができるという利点はあるものの、反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点では実用化は極めて困難である。
一方、後者は特異的な糖転移酵素を用いる合成法であり、複雑な構造を持つオリゴ糖製造への応用や合成収率といった点で前者の方法よりも有利であると考えられており、また、近年の遺伝子組換え技術などのバイオテクノロジーの進展により、各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。
しかしながら、糖供与体である糖ヌクレオチドは一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないのが現状である。例えばＯ−結合型糖タンパク質の糖鎖コア部分またはスフィンゴ糖脂質などに含まれるＮ−アセチルガラクトサミンの供与体であるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは、従来、動物組織由来あるいは枯草菌由来のウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン４−エピメラーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ）を用いてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから合成する方法が報告されている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２７，１７１−１７７（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２３４（１１），２８０１−２８０５（１９５９）特開平７−７９７９２公報）。
しかし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは大量調製が比較的容易な糖ヌクレオチドであるものの、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼは、動物組織または菌体に極く少量しか存在せず、また、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ遺伝子を用いて組換えＤＮＡ手法により調製されたとの報告もないことから、当該酵素の大量調製はもとより、当該酵素を利用したＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造は事実上困難なことであった。
発明の開示
本発明者らは、上記問題点を解決するため鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、枯草菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼ（ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ）が下記（１）の本来の変換反応を触媒する活性を有するほかに、下記（２）の変換反応も触媒する活性を有していることを見出した。
（１）ＵＤＰ−グルコース ⇔ ＵＤＰ−ガラクトース
（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ⇔ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ
従来、ほ乳類由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、上記（１）の変換反応を触媒する活性および上記（２）の変換反応を触媒する活性の両方を有することが報告されている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ，２５８，Ｎｏ．１７，１０７７４−１０７７８（１９８３）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６１，５９０−５９８（１９９７））。
しかしながら、動物組織由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは生産量が僅かで調製が困難であること、また、当該酵素を用いる変換反応の際には、補酵素として高価なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）が必要であることなど、当該酵素を用いる方法は実用的な方法とはいえなかった。
一方、大腸菌及び酵母由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応を触媒する活性を有していないと報告されており（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ，，２４４，２１３２−２１３６（１９６９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，１６４５−１６５４（１９６８）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５８，Ｎｏ．１７，１０７７４−１０７７８（１９８３）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６１，５９０−５９８（１９９７））、また、枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼは全く異なる別個の酵素であると報告されていたがために（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ，，２３４（１１），２８０１−２８０５（１９５９）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５８，Ｎｏ．１７，１０７７４−１０７７８（１９８３））、枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼがＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースへの変換反応以外にもＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応をも触媒する活性を有しているという知見はまったく意外なことであった。
本発明者らは上記知見を基に、さらに検討を重ねた結果、枯草菌のみに限定されることなく、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼはＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースへの変換反応以外にもＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応をも触媒する活性を有していることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、エピメラーゼを用いてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する方法において、エピメラーゼとして、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いる、エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換方法に関するものである。
また、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼからなるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの供給系に関するものである。
さらに、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃにエピメラーゼを作用させてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを製造する方法であって、エピメラーゼとして、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いる、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
さらに、本発明は、エピメラーゼを用いてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する方法において、エピメラーゼとして、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼを用いる、エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換方法に関するものである。
さらに、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、および配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼからなる、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの供給系に関するものである。
さらに、本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃにエピメラーゼを作用させてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを製造する方法であって、エピメラーゼとして、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼを用いる、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明において使用するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、胞子形成能を有する細菌由来の酵素であって、かつ下記の２つの反応を触媒するものであれば特に制限されない。
（１）ＵＤＰ−グルコース ⇔ ＵＤＰ−ガラクトース
（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ⇔ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ
このようなＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、バシラス属などの胞子形成能を有する細菌から調製することができる。
より具体的に、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等を例示することができ、特に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）は既にクローン化され、その塩基配列が報告されており（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ９９３３９）、このクローン化された遺伝子の塩基配列に基づき、公知の組換えＤＮＡ手法により枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを調製し、当該酵素を本願発明に使用するのが好ましい。該酵素は、そのクローン化された遺伝子の塩基配列から分かる通り、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。本発明では、このアミノ酸配列を有する酵素に限らず、配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素と同様の酵素活性を有する酵素であってもよい。
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）を得るには、例えば報告されている塩基配列をもとにプローブを合成し、枯草菌の染色体ＤＮＡよりＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。また、上記した配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素と同様の酵素活性を有する酵素の遺伝子は、遺伝子ｇａｌＥに基づいて、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができる。
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザムーギルバートの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））もしくはジデオキシチェーンターミネーター法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０（１９８３））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを大腸菌内で大量生産させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０，２１（１９８３）、Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２））、ｔｒｃプロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３５３９（１９８５））などを例示することができる。
ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的には、ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７５））、ｐＵＣ１８，ｐＵＣＴ９（Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９８５））などを例示することができる。
作製した組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１９８５））などが使用可能である。
大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））などにより大腸菌を形質転換することができる。
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子の発現を誘導して菌体内に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
培養中にＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターなどを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を適当量添加する。また、使用するプロモーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加する必要はない。
枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子は、上記した枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子ｇａｌＥの塩基配列を参考にしてプライマーを合成し、合成したプライマーをプローブとして、枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌の染色体ＤＮＡ中のｇａｌＥと相同性の高いＤＮＡ断片を探索し、このＤＮＡ断片をクローニングすることにより得ることができる。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の一つであるＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓについては、その全ゲノム配列が既に明らかにされており（Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，３（１），２１−２８（１９９９））、これらの情報によりクローニングを比較的容易に行うことができる。このようにしてクローニングされたＤＮＡ断片を用いて、組換ＤＮＡ法により枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを調製するには、上記した枯草菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子ｇａｌＥを用いて調製する方法と同様にして実施することができる。
あるいは、枯草菌以外の胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼは、該細菌を通常の方法で培養し、その培養物から通常の精製法により調製することもできる。具体的には、培地としてＳＣＤ培地、標準寒天、普通寒天を用いて、細菌を培養する。培養は、通常の液体培養法によって行えばよく、培養温度は培養する菌に適した温度、例えば２５℃〜６５℃で、必要により通気攪拌しながら行う。このようにして得られた培養物から、膜分離あるいは遠心分離等により菌体を回収し、次いで集菌した菌体を超音波などで破壊後、熱処理、硫安分画処理、透析処理、イオン交換、ゲル濾過などの各種クロマトグラフィー処理を単独でまたは組み合わせて行うことにより、目的とするＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを調製することができる。精製の際のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの追跡及び確認は、例えば本明細書の実施例に記載するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ活性の測定法に準じて実施することができる。
かくして得られるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを本発明の方法に適用する際の使用態様としては、組換えＤＮＡ法により得られるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの場合には、上記した形質転換体そのもの、該形質転換体の処理物、該処理物を精製処理して得られる酵素タンパク質などを利用することができる。また、組換えＤＮＡ法によらず通常の精製法により調製した場合には、上記した精製法により得られるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼをそのまま用いることができる。
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼとして形質転換体を利用する場合、上記の方法で得られる形質転換体の培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収した微生物の菌体を例示することができる。また、形質転換体の処理物としては、上記回収した微生物菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体処理物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。さらに、該処理物を精製処理して得られる酵素タンパク質としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
このようなＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応、あるいはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃのエピマー化は、例えば以下の条件で行うことができる。
すなわち、反応に使用するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは既に市販されており、この市販品を使用することができる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの濃度としては、たとえば１〜５０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、反応系に添加するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの濃度としては、たとえば０．００１〜１００ユニット／ｍｌの範囲から適宜設定すればよい。
上記反応は、トリス塩酸、リン酸カリウムなどの適当な緩衝液（ｐＨ７〜９、好ましくは７．５〜８．５）中、６０℃以下、好ましくは１５〜５０℃で１〜５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施することができる。
上記反応系には、必要に応じてマグネシウムを添加するのが好ましい。マグネシウムとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機酸のマグネシウム塩を使用することができ、その使用濃度としては５〜５０ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
生成したＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとの混合物から単離する必要がある場合には、糖ヌクレオチドの通常の精製法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する方法、また、塩析など）を単独で、あるいは適宜組み合わせて行えばよい。
また、本発明のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ供給系は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼから構成される。この供給系を、例えば糖転移酵素（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）単独あるいは糖転移酵素とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ再生系とを組み合わせた系とリンクさせることにより、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含有するオリゴ糖合成に利用することもできる（特開平７−７９７９２号公報参照）。
実施例
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの定量はＨＰＬＣ法により行った。すなわち、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として１ｍＭ テトラブチルアンモニウム、５０ｍＭ 酢酸マグネシウム溶液を用いた。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどは宝酒造（株）より入手した。
実施例１
（１）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子のクローニング
枯草菌１６８Ｍ（ＡＴＣＣ ２７３７０）の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（配列表の配列番号２及び３）を使用し、ＰＣＲ法により枯草菌ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）遺伝子を増幅した。
プライマー（Ａ）：５’−ＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＧＧ−３’
プライマー（Ｂ）：５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＣＧＣＡＣＴ−３’
ＰＣＲによるｇａｌＥ遺伝子の増幅は、反応液［１００μｌ中５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット］をＰｅｒｋｉｎ−ＥＬｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５７℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌（宝酒造より入手）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＥ−１を単離した。ｐＴｒｃ−ｇａｌＥ−１は、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に枯草菌ｇａｌＥ遺伝子のプロモーター及び構造遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼの調製
プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＥ−１を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収し、５０ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
このようにして得られた上清画分を酵素調製物とし、酵素調製物におけるＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌）の測定結果と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるエピメラーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
ｉ）ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ活性の測定と単位の算出法
２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−グルコースを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素調製物を添加して３７℃でインキュベーションすることで反応を行い、５分間煮沸することにより酵素を失活させる。ＨＰＬＣにより反応液中のＵＤＰ−ガラクトースを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−ガラクトースを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
ｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性の測定と単位の算出法
２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素調製物を添加して３７℃でインキュベーションすることで反応を行い、５分間煮沸することにより酵素を失活させる。ＨＰＬＣにより反応液中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
上記（２）で調製した酵素調製物に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム粉末を添加し、４℃、一晩の撹拌の後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により沈殿物を除去した。続いて得られた上清画分に８０％飽和になるように再度硫酸アンモニウム粉末を添加し、４℃、一夜の撹拌を行い、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）を行った。得られた沈殿画分を５ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液１リットルで２回の透析を行った。このようにして得られた試料を酵素調製液とし、以下（４）の合成反応に供した。なお、該酵素調製液におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性は４．３８ユニット／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。
（４）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成
１８０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液５００μｌに上記（３）で調製した酵素調製液を０．２１２ユニット添加し、３７℃で２１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、５０．３８ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが生成することが認められた。
産業上の利用可能性
従来報告されていた、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼを用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの調製方法は、動物組織または菌体内での当該酵素生産量が微少である等の理由で調製が困難であったことから、到底実用的な方法とはなり得なかった。
本発明者らは、胞子形成能を有する細菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼがＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースへの変換反応を有するほかに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応を触媒する活性を有していることを見出し、このような知見により、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへの変換反応が実用的に初めて利用可能になった。
【配列表】
Claims (18)
- エピメラーゼを用いてウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンをウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンに変換する方法において、エピメラーゼとして胞子形成能を有する細菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼを用いる、エピメラーゼを用いたウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンからウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンへの変換方法。
- 胞子形成能を有する細菌がバシラス属に属する細菌である、請求項１記載の方法。
- 胞子形成能を有する細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１記載の方法。
- ウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼが、枯草菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）を用いた組換えＤＮＡ手法で調製されたものである、請求項１記載の方法。
- ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンおよび胞子形成能を有する細菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼからなるウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンの供給系。
- 胞子形成能を有する細菌がバシラス属に属する細菌である、請求項５記載の供給系。
- 胞子形成能を有する細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項５記載の供給系。
- ウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼが枯草菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）を用いた組換えＤＮＡ手法で調製されたものである、請求項５記載の供給系。
- ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンにエピメラーゼを作用させてウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンを製造する方法であって、エピメラーゼとして胞子形成能を有する細菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼを用いるウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンの製造法。
- 胞子形成能を有する細菌がバシラス属に属する細菌である、請求項９記載の方法。
- 胞子形成能を有する細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項９記載の方法。
- ウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼが枯草菌由来のウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）を用いた組換えＤＮＡ手法で調製されたものである、請求項９記載の方法。
- エピメラーゼを用いてウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンをウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンに変換する方法において、エピメラーゼとして、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼを用いる、エピメラーゼを用いたウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンからウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンへの変換方法。
- エピメラーゼが、組換えＤＮＡ手法で調製されたものである、請求項１３記載の方法。
- ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン、および配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼからなる、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンの供給系。
- エピメラーゼが組換えＤＮＡ手法で調製されたものである、請求項１５記載の供給系。
- ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンにエピメラーゼを作用させてウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンを製造する方法であって、エピメラーゼとして、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエピメラーゼと同様の酵素活性を有するエピメラーゼを用いる、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルガラクトサミンの製造法。
- エピメラーゼが組換えＤＮＡ手法で調製されたものである、請求項１７記載の方法。
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