JP4271663B2 - 固相に対する核酸の吸着 - Google Patents
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Description
〔1〕(a)カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程;
(b)該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程;
(c)工程(b)の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mより多くだけ増加する工程;
(d)工程(c)の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を固相に吸着するための方法;
〔2〕カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、上記〔1〕記載の方法;
〔3〕工程(a)の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素を含有することを特徴とする、上記〔1〕および〔2〕いずれか記載の方法;
〔4〕タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ(エスペラーゼ)、およびサブチリシンからなる群より選択されることを特徴とする、上記〔3〕記載の方法;
〔5〕工程(a)の溶解緩衝液が洗剤を含有することを特徴とする、上記〔1〕〜〔4〕いずれか記載の方法;
〔6〕工程(a)の溶解緩衝液中の洗剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton-X100、Tween 20、オクチルβ-D-グルコシド、Nonidet P40、CHAPSまたはSulphobetaine 14からなる群より選択されることを特徴とする、上記〔5〕記載の方法;
〔7〕固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、上記〔1〕〜〔6〕いずれか記載の方法;
〔8〕固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、上記〔1〕〜〔7〕いずれか記載の方法;
〔9〕(a)カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程;
(b)該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程;
(c)工程(b)の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mより多くだけ増加する工程;
(d)固相を提供し、工程(c)の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程;
(e)液相から該固相を分離する工程;
(f)工程(e)の固相を洗浄緩衝液で任意に洗浄する工程;
(g)該固相から核酸を溶出し、それにより核酸を単離する工程;
(h)工程(g)の核酸を溶出液から任意に沈殿させ、沈殿した核酸を単離する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を単離するための方法;
〔10〕カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、上記〔9〕記載の方法;
〔11〕工程(a)の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素および洗剤を含有することを特徴とする、上記〔9〕および〔10〕いずれか記載の方法;
〔12〕タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ(エスペラーゼ)、およびサブチリシンからなる群より選択され、
洗剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton-X100、Tween 20、オクチルβ-D-グルコシド、Nonidet P40、CHAPSおよびSulphobetaine 14からなる群より選択されることを特徴とする、上記〔11〕記載の方法;
〔13〕工程(b)の混合物が、生物学的サンプル、約2Mの濃度のチオシアン酸グアニジニウム、約25mMの濃度のTris塩、約10体積%の濃度のTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性が約3U/mlであり、混合物のpHが約6であることを特徴とする、上記〔12〕記載の方法;
〔14〕工程(b)の混合物が、生物学的サンプル、約2.7Mの濃度の塩酸グアニジニウム、約5mMの濃度の尿素、約5mMの濃度のTris塩、約9体積%の濃度のTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性が約3U/mlであり、混合物のpHが4.4と6.5との間であることを特徴とする、上記〔12〕記載の方法;
〔15〕工程(b)の混合物が、生物学的サンプル、約2.4Mの濃度の塩酸グアニジニウム、約1.6mMの濃度の尿素、約85mMの濃度のTris塩、約88mMの濃度のEDTA、約8mMの濃度のNaCl、約9体積%の濃度のTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性が約3U/mlであり、混合物のpHが4.4と6.5との間であることを特徴とする、上記〔12〕記載の方法;
〔16〕工程(b)の混合物が約20℃と約75℃の間の温度で10分〜30分間インキュベートされ、ここで混合物がかき混ぜられることを特徴とする、上記〔13〕記載の方法;
〔17〕固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、上記〔9〕〜〔16〕いずれか記載の方法;
〔18〕固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、上記〔9〕〜〔16〕いずれか記載の方法;ならびに
〔19〕生物学的サンプルが細菌細胞、真核生物細胞、ウイルスまたはその混合物を含有することを特徴とする、上記〔9〕〜〔18〕いずれか記載の方法
に関する。
本明細書で、用語「核酸」は、少なくとも1種の核酸を示すことが理解される。さらに、用語「核酸」は、核酸の混合物も示しうる。用語「固相」および「基材」は、水溶液中で実質的に不溶性であり、そして高イオン強度の水溶液中の核酸が、その物質が添加されるときに吸着しうる物質を示す。従って、例は、シリカ、ガラス、石英、ゼオライトまたはそれらの混合物のような多孔性または非多孔性無機質粒子である。さらに、用語「基材」は、シリカ、ガラス、石英、またはゼオライトで被覆された磁気的に誘導性の粒子を包含する。さらに、「粉末」または「粉末状」材料の形態での基材は、液体有機化合物のような液相または水溶液中に分散させたときに、懸濁液を生じる、微細に分割された材料に該当することが分かる。用語「粉末」または「粉末状」材料は、粉末状材料が凝集されたが、しかし、水溶液のような液相と組合わせた場合に、なお懸濁液を生じる錠剤を含むことを意図する。さらに、用語「高イオン強度」および「高濃度」は、約1Mに等しいか、またはそれより大きい濃度で溶解した塩から生じる水溶液中でのイオン強度または濃度を意味することが理解される。好ましいのは、1から10Mまでの濃度でのカオトロピック塩である。
NH4 +>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg2+>Ca2+>Ba2+>グアニジニウム
陰イオン:
PO4 3−>SO4 2−>HPO4 2−>酢酸イオン>クエン酸イオン>酒石酸イオン>Cl−>Br−>NO3 −>ClO3 −>ClO4 −>I−>SCN−
(A)カオトロピック剤の存在下でのプロテイナーゼKのインキュベーション
10μlの20mg/mlのプロテイナーゼKの保存溶液(Roche Diagnostics GmbH、Mannheimm、カタログ番号745723;4.5ml水中に溶解された90mg)を、50mM Tris-HCl(pH6.0)、1%DTT、20%Triton-X100およびxMチオシアン酸グアニジニウム(x=0、1、2、3、4、5、6)を含有するカオトロピック緩衝液と混合した。混合した直後、下に記載されるアッセイ(0分活性値)を使用して、混合物の第一のアリコート(10μl)の中でプロテイナーゼK活性を測定した。混合した15分後、下に記載されるアッセイ(15分活性値)を使用して、混合物の第二のアリコート(10μl)の中でプロテイナーゼK活性を測定した。
カオトロピック緩衝液(上(A)を参照)中10μlのプロテイナーゼKを、アッセイ緩衝液、すなわち、980μl 0.2Mトリエタノールアミン、0.05%(重量/体積)PEG6000、0.1M塩化カルシウム、および10μlの200mM基質溶液と混合した。基質は、Suc-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリドであった。アッセイ緩衝液を、キュベットに提供した。混合直後に、キュベットを、光度計に入れた。測定(吸収)を25℃で、15分かけて行った。アッセイ緩衝液中のプロテイナーゼKの活性を、405nmでの吸収における変化によって示されるとおり速度論から計算した。
(A)試薬
a)プロテイナーゼK保存溶液:組換え体プロテイナーゼK、PCR級、50U/ml
b)溶解緩衝液:4Mチオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20%Triton-X100、pH6.0
c)結合緩衝液:4Mチオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20%Triton-X100、pH6.0
d)インヒビター除去緩衝液:5M塩酸グアニジニウム、20mM Tris-HCl、38%エタノール、pH6.6
e)洗浄緩衝液:20mM NaCl、2mM Tris-HCl、80%エタノール、pH7.5
f)溶出緩衝液:50mM Tris-HCl、pH8.2
g)エタノール(100%)
1.15mlファルコンチューブに1,000μlのEDTA血液をピペット採取する
2.1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3.ローラー混合機で、室温で、15分間インキュベートし、かき混ぜる
4.スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
5.工程1.〜2.の混合物(約2,000μl)を、スピンカラムに移動する
6.1,900×gで、3分間、遠心分離する
7.1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
8.4,500×gで、2分間、遠心分離する
9.2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
10.4,500×gで、10分間、遠心分離する
11.フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
12.300μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液で溶出する
13.室温で、5分間、インキュベートする
14.4,500×gで、2分間、遠心分離する
15.260、280および320nmでの溶出液のOD測定
1.15mlファルコンチューブに125μlのプロテイナーゼKをピペット採取する
2.1,000μlのEDTA血液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3.1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
4.15分間、56℃で(例えば、熱混合機を使用することによって)インキュベートおよび振蘯し、かき混ぜる
5.スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
6.工程1.〜3.の混合物(約2,125μl)を、スピンカラムに移動する
7.1,900×gで、3分間、遠心分離する
8.1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
9.4,500×gで、2分間、遠心分離する
10.2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
11.4,500×gで、10分間、遠心分離する
12.フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
13.300μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液で溶出する
14.室温で、5分間、インキュベートする
15.4,500×gで、2分間、遠心分離する
16.260、280および320nmでの溶出液のOD測定
1.15mlファルコンチューブに125μlのプロテイナーゼKをピペット採取する
2.1,000μlのEDTA血液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3.1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
4.15分間、56℃で(例えば、熱混合機を使用することによって)インキュベートおよび振蘯し、かき混ぜる
5.1,000μlのエタノールを添加し、ゆっくりボルテックスする
6.スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
7.工程1.〜5.の混合物(約3,125μl)を、スピンカラムに移動する
8.1,900×gで、3分間、遠心分離する
9.1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
10.4,500×gで、2分間、遠心分離する
11.2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
12.4,500×gで、10分間、遠心分離する
13.フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
14.300μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液で溶出する
15.室温で、5分間、インキュベートする
16.4,500×gで、2分間、遠心分離する
17.260、280および320nmでの溶出液のOD測定
1.15mlファルコンチューブに125μlのプロテイナーゼKをピペット採取する
2.1,000μlのEDTA血液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3.1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
4.15分間、56℃で(例えば、熱混合機を使用することによって)インキュベートおよび振蘯し、かき混ぜる
5.1,000μlの結合緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
6.スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
7.工程1.〜5.の混合物(約3,125μl)を、スピンカラムに移動する
8.1,900×gで、3分間、遠心分離する
9.1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
10.4,500×gで、2分間、遠心分離する
11.2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
12.4,500×gで、10分間、遠心分離する
13.フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
14.300μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液で溶出する
15.室温で、5分間、インキュベートする
16.4,500×gで、2分間、遠心分離する
17.260、280および320nmでの溶出液のOD測定
(A)試薬
a)溶解緩衝液/結合緩衝液:カオトロピック(7M[溶解緩衝液]/4M[結合緩衝液]チオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20%Triton-X100、pH6.0)
b)インヒビター除去緩衝液(5MグアニジニウムHCl、20mM Tris-HCl、38%エタノール、pH6.6)
c)洗浄緩衝液(20mM NaCl、2mM Tris-HCl、80%エタノール、pH7.5)
d)溶出緩衝液(50mM Tris、pH8.1)
e)エタノール(無水)
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液(7M)を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物(約2,000μl;カオトロープ濃度3.5M)を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液(7M)を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。500μlの結合緩衝液(4M)を添加し、ボルテックスにより混合した。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物(約2,500μl;カオトロープ濃度4.5M)を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
(A)試薬
a)溶解緩衝液/結合緩衝液:カオトロピック(7M[溶解緩衝液]/5M[溶解緩衝液]/4M[結合緩衝液]チオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20%Triton-X100、pH6.0)
b)インヒビター除去緩衝液(5MグアニジニウムHCl、20mM Tris-HCl、38%エタノール、pH6.6)
c)洗浄緩衝液(20mM NaCl、2mM Tris-HCl、80%エタノール、pH7.5)
d)溶出緩衝液(50mM Tris、pH8.1)
e)エタノール(無水)
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液(7M)を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物(約2,000μl;カオトロープ濃度3.5M)を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液(5M)を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。500μlの結合緩衝液(4M)を添加し、ボルテックスにより混合した。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物(約2,500μl;カオトロープ濃度3.5M)を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱(70℃)した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
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Claims (14)
- (a)カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程;
(b)該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程;
(c)工程(b)の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mを超える多い量だけ増加させる工程;
(d)工程(c)の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を固相に吸着するための方法。 - カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 工程(a)の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素を含有することを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ(エスペラーゼ)、およびサブチリシンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 工程(a)の溶解緩衝液が洗剤を含有することを特徴とする、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、請求項1〜6いずれか記載の方法。
- (a)カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程;
(b)該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程;
(c)工程(b)の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mを超える多い量だけ増加させる工程;
(d)固相を提供し、工程(c)の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程;
(e)液相から該固相を分離する工程;
(f)工程(e)の固相を洗浄緩衝液で任意に洗浄する工程;
(g)該固相から核酸を溶出し、それにより核酸を単離する工程;
(h)工程(g)の核酸を溶出液から任意に沈殿させ、沈殿した核酸を単離する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を単離するための方法。 - カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 工程(a)の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素および洗剤を含有することを特徴とする、請求項8または9記載の方法。
- タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ(エスペラーゼ)、およびサブチリシンからなる群より選択され、
洗剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton(登録商標)-X100、Tween(登録商標)20、オクチルβ-D-グルコシド、Nonidet(登録商標)P40、CHAPSおよびSulphobetaine 14からなる群より選択されることを特徴とする、請求項10記載の方法。 - 固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、請求項8〜11いずれか記載の方法。
- 固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、請求項8〜11いずれか記載の方法。
- 生物学的サンプルが細菌細胞、真核生物細胞、ウイルスまたはその混合物を含有することを特徴とする、請求項8〜13いずれか記載の方法。
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