JP4257026B2 - Process for selective production of triprenylphenol compounds and their use as pharmaceuticals - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、トリプレニルフェノール骨格を有する微生物代謝産物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トリプレニルフェノール骨格を有する微生物代謝産物のいくつかは重要な生理作用を持つ。例えば、Ｋ−７６は補体活性を阻害し、スタキボシンはエンドセリン拮抗作用を示し、ＳＭＴＰはプラスミノゲン活性化を促進する。これらのトリプレニルフェノールは糸状菌により、数多くの類似体と共に生産される。そのため、比較的収量が悪く、かつ精製に多くのクロマトグラフィー操作を要し、大量の標品を得ることが困難である。また、これらの化合物の、血栓症の治療と予防における使用は知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糸状菌によるトリプレニルフェノールの短時間での選択的生産方法を確立し、大量の精製標品を提供すること、およびこれらの化合物の薬剤としての使用である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物を選択的に生産するため、種々の生産糸状菌、培地組成、培養温度、培養時間、通気攪拌条件等を検討した結果、最適条件を選択し、本発明の完成に至った。
すなわち、好ましい生産菌としては、スタキボトリス属の糸状菌が選択された。特に好ましい生産菌はスタキボトリス・ミクロスポラＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。基本培地は、以下組成を示すＡ培地が好ましいが、本発明はこの組成の培地に限定されるものではない。Ａ培地：グルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇを１リットルの精製水に溶解し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に調整する。培地組成で最も重要な点は、生産する化合物に応じて適当なアミノ酸あるいはアミノアルコールを培地に添加することである。すなわち、一般式（Ｉ）で示される化合物においては、以下の一般式（ＩＶ）で示される化合物を、一般式（ＩＩ）で示される化合物においては、以下の一般式（Ｖ）で示される化合物を、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物においては、以下の一般式（ＶＩ）で示される化合物を添加する。ただし、一般式（Ｉ）

と一般式（ＩＶ）のＲは同一であり、一般式（ＩＩＩ）と一般式（ＶＩ）のｎは同一である。例えば、ＳＭＴＰ−６（一般式（Ｉ）でＲがトリプトファンの側鎖で選択される化合物）の選択的生産にはトリプトファンを、ＳＭＴＰ−７（一般式（ＩＩＩ）でｎ＝３で選択される化合物）の選択的生産にはオルニチンを添加する。アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加濃度は、０．５から２ｍｇ／ｍｌが望ましいが、本発明はこの濃度に限定されるものではない。アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加時期は、培養直後から培養３日目までが理想的である。培養５日目以降の添加では生産量は激減する。培養温度は２５℃が最適であるが、この温度に限定されるものではない。培養時間は、アミノ酸あるいはアミノアルコール添加後３から６日で充分な生産量が得られる。通気攪拌条件は、５００ｍｌ容の三角フラスコに１００ｍｌのＡ培地を入れ、適当なつ通気栓をした場合、１８０ｒｐｍの旋回培養で得られる条件が適当である。ジャーファーメンターを用いる場合、これに相当する条件が望ましい。
本発明の方法により、極めて多様なトリプレニルフェノール化合物の一群を生産できる。この化合物ライブラリーを利用して、有効なプラスミノゲン活性化促進作用を有する化合物を同定することが可能である。例えば、トリプトファン添加培養で生産されるＳＭＴＰ−６（一般式（Ｉ）でＲがの側鎖で選択される化合物）やオルニチン添加培養で生産されるＳＭＴＰ−７（一般式（ＩＩＩ）で、ｎ＝３で選択される化合物）は強いプラスミノゲン活性化促進作用を持つ。これらの化合物は血栓の溶解を促進し、血栓症の予防と治療に有用である。これらの化合物を血栓症の予防及び治療薬として用いる場合には、遊離形態、酸付加塩等の塩やそれらの任意の水和物を用いることができる。これら化合物を成分とする薬剤は投与形態は経口的あるいは非経口的に投与でき、経口投与に適する製剤の例としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤の例としては、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、貼付剤等を挙げることができる。これら化合物を成分とする薬剤の投与量は特に制限されないが、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。例えば静脈内投与の場合には、成人１日当り有効成分量として０．１から５ｍｇ／ｋｇの投与、経口投与の場合には、成人１日当り有効成分量として１から５０ｍｇ／ｋｇの投与が望ましい。投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明実施の最も望ましい形態の１つとしては、生産菌としてスタキボトリス・ミクロスポラＩＦＯ３００１８株を、１ｍｇ／ｍｌの適当なアミノ酸あるいはアミノアルコールを添加した１００ｍｌのＡ培地を含む５００ｍｌ容三角フラスコに接種して２５℃で４〜６日間培養することが挙げられる。このように培養した培養液中には、目的の構造のトリプレニルフェノールが１００μｇ／ｍｌ以上蓄積する。一方、従来の生産方法において問題となっていた類似物質の生産量は、その１０分の１から１００分の１以下であり、目的化合物の精製・単離は極めて容易となる。これらの化合物の中から選択される化合物は、プラスミノゲン活性化を促進し、血栓症の予防及び治療薬として使用できる。薬剤としての利用の一般的な形態の１つとしては経口投与が挙げられ、この場合、成人１日当り有効成分量として１０ｍｇ／ｋｇの投与が適当である。
【０００６】
【実施例】
以下に本発明の実施例を具体的に説明する。
【０００７】
実施例１：一般式（Ｉ）においてＲがトリプトファンの側鎖で選択される化合物ＳＭＴＰ−６の生産と単離
スタキボトリス・ミクロスポラＩＦＯ３００１８株を、１ｍｇ／ｍｌのトリプトファンを添加した１００ｍｌのＡ培地を含む５００ｍｌ容三角フラスコに接種して、２５℃で４日間培養した。この培養濾液中には、ＳＭＴＰ−６が８７５μｇ／ｍｌ蓄積した。培養濾液２．７リットルのｐＨを３に塩酸で調整後、メチルエチルケトン２．７リットルを加えＳＭＴＰ−６を抽出した。この溶媒抽出液を濃縮乾固して３．７２ｇの乾固物を得た。シリカゲルクロマトグラフィーでこの乾固物を精製して、ヘキサン−酢酸エチル（２：８）溶出画分に、５１４ｍｇの精製ＳＭＴＰ−６を得た。
【０００８】
実施例２：一般式（ＩＩＩ）においてｎ＝４で選択される化合物ＳＭＴＰ−８の生産と単離
スタキボトリス・ミクロスポラＩＦＯ３００１８株を、１ｍｇ／ｍｌのリジンを添加した１００ｍｌのＡ培地を含む５００ｍｌ容三角フラスコに接種して、２５℃で６日間培養した。この培養濾液中には、ＳＭＴＰ−７が２４０μｇ／ｍｌ蓄積した。培養濾液１．６リットルに酢酸エチル４リットルを加えＳＭＴＰ−８を抽出した。この溶媒抽出液を濃縮乾固して０．７５ｇの乾固物を得た。シリカゲルクロマトグラフィーでこの乾固物を精製して、酢酸エチル−メタノール（１００：０〜９０：１０）溶出画分に、１４３ｍｇの精製ＳＭＴＰ−８を得た。
【０００９】
【発明の効果】
本発明により、重要な生理活性を有する種々の構造を持つトリプレニルフェノール化合物の一群を、大量に選択的かつ簡便に生産することが可能となる。また、これらの化合物から血栓症の治療と予防に有効な化合物を選択し、それを薬剤として利用することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microbial metabolite having a triprenylphenol skeleton.
[0002]
[Prior art]
Some microbial metabolites that have a triprenylphenol skeleton have important physiological effects. For example, K-76 inhibits complement activity, stachybosine exhibits endothelin antagonism, and SMTP promotes plasminogen activation. These triprenyl phenols are produced by filamentous fungi with numerous analogs. Therefore, the yield is relatively poor, and many chromatographic operations are required for purification, and it is difficult to obtain a large amount of preparation. Also, the use of these compounds in the treatment and prevention of thrombosis is not known.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to establish a method for the selective production of triprenylphenol in a short time by filamentous fungi, to provide a large amount of purified preparation, and to use these compounds as drugs.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to selectively produce the compounds of the general formulas (I), (II) and (III) according to claim 1, various production filamentous fungi, medium composition, culture temperature, culture time, aeration stirring conditions, etc. are examined. As a result, the optimum condition was selected and the present invention was completed.
That is, a filamentous fungus belonging to the genus Stachybotrys was selected as a preferred production fungus. A particularly preferred production bacterium is Stachybotrys microspora IFO30018, but the present invention is not limited to this bacterium. The basic medium is preferably A medium having the following composition, but the present invention is not limited to the medium having this composition. A medium: Glucose 20 g, peptone 5 g, yeast extract 3 g, dipotassium phosphate 3 g, magnesium sulfate heptahydrate 1 g are dissolved in 1 liter of purified water, and the pH is adjusted to 5.5 with hydrochloric acid or sodium hydroxide. . The most important point in the medium composition is that an appropriate amino acid or amino alcohol is added to the medium depending on the compound to be produced. That is, in the compound represented by the general formula (I), the compound represented by the following general formula (IV), and in the compound represented by the general formula (II), the compound represented by the following general formula (V) In the compound represented by the general formula (III), a compound represented by the following general formula (VI) is added. However, the general formula (I)

And R in the general formula (IV) are the same, and n in the general formula (III) and the general formula (VI) are the same. For example, for selective production of SMTP-6 (a compound in which R is selected on the side chain of tryptophan in general formula (I)), tryptophan is selected for SMTP-7 (general formula (III) with n = 3) Ornithine is added to the selective production of the compound). The concentration of amino acid or amino alcohol added is preferably 0.5 to 2 mg / ml, but the present invention is not limited to this concentration. Ideally, the amino acid or amino alcohol should be added immediately after the cultivation until the third day of cultivation. Addition after the 5th day of culture drastically reduces production. The culture temperature is optimally 25 ° C, but is not limited to this temperature. The culture time is 3 to 6 days after addition of amino acid or amino alcohol, and a sufficient production amount can be obtained. The conditions for aeration and agitation are those obtained by swirling culture at 180 rpm when 100 ml of A medium is placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and a suitable aeration stopper is attached. When using a jar fermenter, the conditions corresponding to this are desirable.
By the process of the present invention, a very diverse group of triprenylphenol compounds can be produced. Using this compound library, it is possible to identify a compound having an effective plasminogen activation promoting action. For example, SMTP-6 produced by tryptophan-added culture (compound selected by R in the side chain of general formula (I)) or SMTP-7 produced by ornithine-added culture (general formula (III), n The compound selected by = 3) has a strong plasminogen activation promoting action. These compounds promote thrombus dissolution and are useful for the prevention and treatment of thrombosis. When these compounds are used as preventive and therapeutic agents for thrombosis, free forms, salts such as acid addition salts, and arbitrary hydrates thereof can be used. Drugs composed of these compounds can be administered orally or parenterally. Examples of preparations suitable for oral administration include tablets, capsules, powders, fine granules, granules, liquids or syrups, etc. Examples of preparations suitable for parenteral administration include injections, instillations, suppositories, inhalants, patches and the like. The dose of the drug containing these compounds as a component is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the administration form, age, weight, and symptoms. For example, in the case of intravenous administration, it is desirable to administer 0.1 to 5 mg / kg as the amount of active ingredient per day for adults, and in the case of oral administration, it is desirable to administer 1 to 50 mg / kg as the amount of active ingredient per day for adults. The administration period can be arbitrarily determined according to age and symptoms.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In one of the most desirable forms of the present invention, Stachybotrys microspora IFO30018 strain is inoculated as a producing bacterium into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of A medium supplemented with 1 mg / ml of an appropriate amino acid or amino alcohol. Examples include culturing at 25 ° C. for 4 to 6 days. In the culture medium cultured in this way, triprenylphenol having a target structure accumulates 100 μg / ml or more. On the other hand, the production amount of a similar substance, which has been a problem in the conventional production method, is 1/10 to 1/100 or less, and the purification and isolation of the target compound becomes extremely easy. Compounds selected from these compounds promote plasminogen activation and can be used as preventive and therapeutic agents for thrombosis. One common form of use as a drug is oral administration. In this case, administration of 10 mg / kg as an active ingredient amount per day for an adult is appropriate.
[0006]
【Example】
Examples of the present invention will be specifically described below.
[0007]
Example 1: Production and isolation of compound SMTP-6, wherein R is selected on the side chain of tryptophan in general formula (I), S. chytrospora IFO30018 strain containing 100 ml A medium supplemented with 1 mg / ml tryptophan A 500 ml Erlenmeyer flask was inoculated and cultured at 25 ° C. for 4 days. In this culture filtrate, SMTP-6 accumulated at 875 μg / ml. After adjusting the pH of 2.7 liters of the culture filtrate to 3 with hydrochloric acid, 2.7 liters of methyl ethyl ketone was added to extract SMTP-6. The solvent extract was concentrated to dryness to obtain 3.72 g of a dried product. The dried product was purified by silica gel chromatography to obtain 514 mg of purified SMTP-6 in a fraction eluted with hexane-ethyl acetate (2: 8).
[0008]
Example 2 Production and Isolation of Compound SMTP-8 Selected at n = 4 in General Formula (III): Stachybotrys microspora IFO30018 strain, 500 ml triangle containing 100 ml A medium supplemented with 1 mg / ml lysine The flask was inoculated and cultured at 25 ° C. for 6 days. In the culture filtrate, SMTP-7 accumulated at 240 μg / ml. SMTP-8 was extracted by adding 4 liters of ethyl acetate to 1.6 liters of the culture filtrate. The solvent extract was concentrated to dryness to obtain 0.75 g of a dried product. The dried product was purified by silica gel chromatography to obtain 143 mg of purified SMTP-8 in the fraction eluted with ethyl acetate-methanol (100: 0 to 90:10).
[0009]
【The invention's effect】
According to the present invention, a group of triprenylphenol compounds having various structures having important physiological activities can be selectively and easily produced in large quantities. In addition, a compound effective for the treatment and prevention of thrombosis can be selected from these compounds and used as a drug.

Claims (2)

スタキボトリス属の糸状菌の培養初期に培地にアミノ酸又はアミノアルコールを添加することを特徴とする、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物（ここで、Ｒはアミノ酸の側鎖を表し、ｎは１〜１０の整数を表す）の製造法。

A compound of the general formulas (I), (II) and (III), wherein an amino acid or an amino alcohol is added to the medium at the initial stage of cultivation of Staphylococcus filamentous fungi (where R represents the side chain of the amino acid) And n represents an integer of 1 to 10.

スタキボトリス属の糸状菌がスタキボトリス・ミクロスポラ ＩＦＯ３００１８である、請求項１に記載の製造法。 Stachybotrys fungi is Stachybotrys-Mikurosupora IFO30018, Process according to claim 1.