CA2262019A1 - Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible - Google Patents
Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cibleInfo
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Abstract
L'invention concerne un procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, selon lequel: on dispose au moins: de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques, de nucléotides; on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, selon lequel au moins un des nucléotides est un nucléotide préfonctionnalisé, différent des autres nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence, non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, pour obtenir un produit d'amplification préfonctionnalisé comprenant au moins undit nucléotide préfonctionnalisé. L'invention concerne aussi des nucléotides pour mettre en oeuvre ce procédé.
Claims (24)
1. Procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible présent dans un échantillon, selon lequel :
- on dispose au moins : de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques et de nucléotides, et - on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, caractérisé en ce que, parmi les nucléotides dont on dispose, au moins un nucléotide est un nucléotide préfonctionnalisé, différant des autres nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, et choisie parmi les fonctions chimiques organiques électrophiles ou nucléophiles, et en ce qu'en outre - on fait réagir, directement ou indirectement, le produit d'amplification préfonctionnalisé ainsi obtenu, avec un réactif comprenant une fonction anti-réactive de covalence, spécifique de la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé, et un groupe fonctionnel de marquage, ce dernier étant différent d'une protéine, pour obtenir un produit d'amplification fonctionnalisé
- on dispose au moins : de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques et de nucléotides, et - on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, caractérisé en ce que, parmi les nucléotides dont on dispose, au moins un nucléotide est un nucléotide préfonctionnalisé, différant des autres nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, et choisie parmi les fonctions chimiques organiques électrophiles ou nucléophiles, et en ce qu'en outre - on fait réagir, directement ou indirectement, le produit d'amplification préfonctionnalisé ainsi obtenu, avec un réactif comprenant une fonction anti-réactive de covalence, spécifique de la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé, et un groupe fonctionnel de marquage, ce dernier étant différent d'une protéine, pour obtenir un produit d'amplification fonctionnalisé
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le groupe fonctionnel de marquage du réactif est une molécule chimique fluorescente.
en ce que le groupe fonctionnel de marquage du réactif est une molécule chimique fluorescente.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le groupe fonctionnel de marquage du réactif est choisi parmi la fluorescéine et le dansyle.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la fonction chimique organique électrophile est choisie parmi les fonctions aldéhyde, ester activé, acide carboxylique, isothiocyanate, dérivés haloacyles et chlorure de sulfonyle.
en ce que la fonction chimique organique électrophile est choisie parmi les fonctions aldéhyde, ester activé, acide carboxylique, isothiocyanate, dérivés haloacyles et chlorure de sulfonyle.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la fonction chimique organique nucléophile est choisie parmi les fonctions amine, thiol, oxyamine, alkoxamine, hydrazine et hydrazide.
en ce que la fonction chimique organique nucléophile est choisie parmi les fonctions amine, thiol, oxyamine, alkoxamine, hydrazine et hydrazide.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé
en ce que la fonction réactive est la fonction méthoxyamine.
en ce que la fonction réactive est la fonction méthoxyamine.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé est greffée sur la base par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
en ce que la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé est greffée sur la base par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la fonction anti-réactive du réactif est choisie parmi (i) les fonctions chimiques organiques nucléophiles si la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé
est une fonction électrophile, et (ii) les fonctions chimiques organiques électrophiles si la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé est une fonction nucléophile.
en ce que la fonction anti-réactive du réactif est choisie parmi (i) les fonctions chimiques organiques nucléophiles si la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé
est une fonction électrophile, et (ii) les fonctions chimiques organiques électrophiles si la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé est une fonction nucléophile.
9. Procédé selon la revendication 3 et 8, caractérisé en ce que la fonction anti-réactive du réactif est la fonction aldéhyde.
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé
en ce que la fonction anti-réactive du réactif est greffée sur le groupe fonctionnel par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
en ce que la fonction anti-réactive du réactif est greffée sur le groupe fonctionnel par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
11. Procédé selon la revendication 7 et/ou 10, caractérisé en ce que le bras de couplage est choisi parmi les chaînes hydrocarbonées, saturées ou insaturées, éventuellement interrompues par des fonctions amine, amide et oxy.
12. Procédé selon la revendication 9 et 10, caractérisé en ce que la fonction aldéhyde est liée au groupe fonctionnel par le bras de couplage -NH-CS-NH-(CH2)3- et en ce que le groupe fonctionnel du réactif est la fluorescéine.
13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la séquence d'acide nucléique cible est une séquence d'ADN ou d'ARN et en ce que les activités enzymatiques comprennent les activités ADN polymérase ARN-et/ou ADN-dépendantes.
en ce que la séquence d'acide nucléique cible est une séquence d'ADN ou d'ARN et en ce que les activités enzymatiques comprennent les activités ADN polymérase ARN-et/ou ADN-dépendantes.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé
en ce que les activités enzymatiques comprennent en outre l'activité ribonuclease H et l'activité ARN polymérase ADN-dépendante.
en ce que les activités enzymatiques comprennent en outre l'activité ribonuclease H et l'activité ARN polymérase ADN-dépendante.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé
en ce que les activités enzymatiques ribonuclease H et ADN
polymérase sont apportées par une seule enzyme.
en ce que les activités enzymatiques ribonuclease H et ADN
polymérase sont apportées par une seule enzyme.
16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé
en ce que les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN
polymérase sont apportées chacune par une enzyme différente.
en ce que les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN
polymérase sont apportées chacune par une enzyme différente.
17. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la base du nucléotide préfonctionnalisé est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive nucléophile choisie parmi les fonctions -NH2, -O-NH2, alkoxamine, -SH, hydrazine et hydrazide.
en ce que la base du nucléotide préfonctionnalisé est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive nucléophile choisie parmi les fonctions -NH2, -O-NH2, alkoxamine, -SH, hydrazine et hydrazide.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé
en ce que la fonction réactive est la fonction -CH2-O-NH2.
en ce que la fonction réactive est la fonction -CH2-O-NH2.
19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé
en ce que la fonction réactive est la fonction -NH2.
en ce que la fonction réactive est la fonction -NH2.
20. Procédé selon l'une des revendications 17 à
19, caractérisé en ce que la fonction réactive est liée sur la fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi (-CH2-)n1, (O-CH2-)n1, dans lequel n1 est un entier compris entre 1 et 12 ; [-(CH2)2-O-(CH2)2-)n2, [-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-]n2, [-CH2-O-(CH2)2-]n2, dans lequel n2 est un entier compris entre 1 et 6, et -NH-CH2-O-(CH2)2-.
19, caractérisé en ce que la fonction réactive est liée sur la fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi (-CH2-)n1, (O-CH2-)n1, dans lequel n1 est un entier compris entre 1 et 12 ; [-(CH2)2-O-(CH2)2-)n2, [-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-]n2, [-CH2-O-(CH2)2-]n2, dans lequel n2 est un entier compris entre 1 et 6, et -NH-CH2-O-(CH2)2-.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé
en ce que le bras de couplage est choisi parmi -CH2-, (-CH2-)2, (-CH2-)3, (-CH2-)4, (-CH2-)6, -(CH2)2-O-(CH2)2-, (CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-, -NH-CH2-O-(CH2)2-.
en ce que le bras de couplage est choisi parmi -CH2-, (-CH2-)2, (-CH2-)3, (-CH2-)4, (-CH2-)6, -(CH2)2-O-(CH2)2-, (CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-, -NH-CH2-O-(CH2)2-.
22. Procédé selon les revendications 19 et 21, caractérisé en ce que le bras de couplage est (CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-.
23. Nucléotide préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, dont la base est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle de la base pyrimidique, au moins une fonction réactive consistant en une fonction alkoxyamine éventuellement liée par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
24. Nucléotide préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, dont la base nucléique est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle de la base pyrimidique, au moins une fonction réactive consistant en une fonction amine liée par l'intermédiaire du bras de couplage consistant en (CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-.
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