JP4204877B2 - 平滑筋異常収縮のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法に関し、特に体組織や体液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン（以下ＳＰＣと略称する）のレベルを測定して、平滑筋異常収縮の発症を高精度で判断し、これにより平滑筋異常収縮に基づく疾患の早期検出、予後予測、重篤度の測定、医学的治療に伴う平滑筋異常収縮の経過の評価方法、並びに平滑筋異常収縮に起因する疾患を予防するための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等に有効に適用される平滑筋異常収縮のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
平滑筋収縮には、細胞質カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度の上昇の程度に依存した強度で収縮が惹起される、Ｃａ２＋濃度依存性の正常な生理的平滑筋収縮が存在する一方で、かかる細胞質中のＣａ２＋濃度の上昇の程度以上の収縮またはＣａ２＋濃度に依存しない収縮、即ちＣａ２＋濃度非依存性収縮が存在する。
【０００３】
後者のＣａ２＋濃度非依存性収縮は、平滑筋異常収縮を意味し、かかる平滑筋異常収縮は、一部の血管収縮物質により平滑筋細胞膜のＧ蛋白質（ＧＴＰ結合性蛋白質）を介して平滑筋のＣａ２＋感受性が増強され、細胞質Ｃａ２＋濃度の上昇以上の収縮あるいはＣａ２＋非依存的な収縮が惹起されたものである。
詳細には、Ｃａ２＋非依存性の平滑筋異常収縮に関わる因子として、Ｒｈｏ−キナーゼが知られており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１２２５７−１２２６０，１９９７）、平滑筋異常収縮は、平滑筋細胞のＧ蛋白質の１つであるＲｈｏＡにより活性化されるＲｈｏ−キナーゼ（蛋白質リン酸化酵素）情報伝達系を介する、いわゆる病的な異常収縮である。
【０００４】
一方、平滑筋収縮による血流不全に起因する疾患としては、血管平滑筋に関しては、例えば脳血管攣縮（攣縮はスパズムとも称される）、冠血管攣縮、肺血管攣縮、手指血管攣縮、腸間膜動脈攣縮、高血圧症等が、また、眼血管に関しては、視野狭窄および暗黒視症等が知られている。
また、消化器平滑筋収縮に関しては、食道痙攣、胃痙攣、腸管運動亢進に基づく下痢または腹痛、痙攣性イレウスあるいは腹部アンギナ等が、また、呼吸器平滑筋収縮に関しては呼吸困難あるいは気管支喘息等の呼吸器疾患が知られている。
【０００５】
更に、子宮平滑筋収縮においては、切迫早産や流産が、膀胱平滑筋収縮に関しては尿失禁などの排尿障害が知られている。
これらの疾患の平滑筋収縮の一部には、病的な状態でのみ惹起される平滑筋異常収縮が含まれていると考えられている。
【０００６】
これらの疾患の診断や治療においては、臨床症状に加えてＸ線、ＣＴスキャナー、ＭＲＩ、エコーなどの医療機器での診断が主になされているが、平滑筋の異常収縮の強度を特異的マーカーを用いて、組織や体液（血液、髄液、尿、涙、唾液、汗、気道分泌液、喀痰、膣分泌液、羊水等）により簡易に測定し、早期発見や診断、予後の改善に利用することは行われていない。
【０００７】
近年、増加している疾患である動脈硬化も、平滑筋異常収縮との関連性が指摘されている疾患であり、動脈硬化が原因で惹起される心疾患や脳卒中は、癌を上回る死亡率を呈している。
動脈硬化は、高血清総コレステロール、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、ストレス、運動不足がリスク因子として知られているが、これらの因子中、高血清総コレステロールが動脈硬化による冠動脈疾患の主要なリスク因子と考えられている。
【０００８】
しかし、動脈硬化の原因であるプラークの形成と、動脈破裂は必ずしも血清総コレステロール値とは相関せず、動脈攣縮が急性冠動脈疾患と強く関連することから、動脈平滑筋異常収縮が動脈硬化と関連することが指摘されている（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ．３３：９−１６，１９９９）。
【０００９】
また、狭心症や心臓発作を発症した経験の在る患者の半数は、血清総コレステロールの値には問題がないと判断されている。
従って、従来の検査では血清総コレステロール値が問題でなければ、上記疾患リスクが潜在していても、早期発見や早期治療を受けることができない問題点が存在する。
【００１０】
一方、スタチン等の脂質低下薬は、血清総コレステロール値の低下を指標に将来の冠動脈疾患のリスク軽減を期待して治療がなされている。しかし、これら疾患の病態の一つと考えられる平滑筋異常収縮の強度を測定し、治療薬の選択や治療効果の判断等に利用することは行われていない。
【００１１】
また、スフィンゴ脂質は細胞移動、増殖、アポトーシス、分化、生存などにおける細胞内シグナル伝達分子として重要な役割を担っていることが知られている（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１０，１３８８−１３９７，１９９６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１０，３４−３８，１９９７）。
かかるスフィンゴ脂質の一つであるＳＰＣは血中にも存在し、疾患との関連性においては、心臓虚血および心臓低酸素症からなる心不全との関連性（特表２００２−５０４９９９）や心機能との関連性が報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５，１８９−１９７，２００１）。
しかし、これらの公知文献においてはＳＰＣとヒト平滑筋異常収縮との関連性や、平滑筋異常収縮に起因する疾患との関連性については具体的には記載されていない。
【００１２】
また、最近、Ｓｒｃファミリープロテインチロシンキナーゼの一つであるＦｙｎが、ＳＰＣ−Ｒｈｏ−キナーゼの下流側因子として平滑筋異常収縮に何らかの関連性があることが開示されている（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１，９５３−９６０，２００２）。
【００１３】
さらに、国民の健康や病気予防に対する関心が高まるにつれて、食品が有する疾患予防や改善等の効能への関心が広がっている。疾患の評価に替わるバイオマーカーによる食品機能の解明は、より効果的な疾患予防食品（機能性食品）の開発に繋がることが期待されている。
これまで、心疾患や脳疾患など循環器系疾患のリスク低減のための機能性食品に関するバイオマーカーとしては、血清総コレステロール値が利用されている。
【００１４】
しかし、血清総コレステロール値はリスク因子の一つであるが、循環器系疾患の臨床的事象を直接反映するリスク因子ではなく、疾患予防食品の開発に際しては、循環器系疾患の臨床的事象と直接関連したバイオマーカーが強く切望されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、血清総コレステロール値とは関係なく、体組織または体液中のＳＰＣのレベルを測定することによりＳＰＣの存在を明らかにし、これにより平滑筋異常収縮に起因する疾患例えば、循環器疾患、消化器疾患、呼吸器疾患、生殖器疾患および泌尿器疾患の早期判断、予後予測、再発の予測、重篤度の測定、更には平滑筋異常収縮に起因する疾患予防のための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等の優れたバイオマーカーとして利用することができる、信頼性が高くかつ簡便な、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を提供することである。
【００１６】
また本発明の他の目的は、冠動脈疾患や脳梗塞のリスクとして知られている血清総コレステロール値とＳＰＣとの関連性を明らかにし、血清総コレステロール値が高いヒトのみならず、血清総コレステロール値が正常のヒトに対しても、ＳＰＣがそれら疾患のリスクと成り得るかを検証し、ＳＰＣ測定の意義を明らかにし、このことにより、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、それら疾患の兆候を発症していないヒトに対して、疾患の早期発見が可能となり、早期治療・予防が実現できる、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を提供することである。
【００１７】
更には、本発明の他の目的は、平滑筋の異常収縮の強度を把握し、患者毎の異常収縮の強度に適した医薬品の選択や治療効果を測定する、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を提供することにある。このことにより、患者毎の平滑筋異常収縮の強度に応じて、効果的な医薬品を選択し、効果をモニターすることができるテーラーメイド医療を提供することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、従来の平滑筋異常収縮のための測定対象に代わる新しい測定対象であるＳＰＣを測定して上記平滑筋異常収縮のスクリーニングを高い精度で診断できる診断用キットに適用することができる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＳＰＣと平滑筋異常収縮との関連性を鋭意研究した結果、体組織または体液中に存在するＳＰＣの存在が、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、平滑筋異常収縮に深く関与していることを見出し、本発明に到達した。また、本発明者らは、ＳＰＣが冠動脈疾患のリスクと成り得ること、高脂血症治療薬の種類により、また個々の症例でＳＰＣによる平滑筋異常収縮の改善効果が異なること、くも膜下出血患者の脳髄液中にＳＰＣ濃度が高いという、これまでまったく知られていない知見に基づき、本発明に到達した。
【００２０】
本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、体組織または体液と内標準物質とを含む溶液を調製し、該溶液を、陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムを用いて固相抽出処理し、得られた溶出液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度を測定し、得られた該体組織または体液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリンのレベルより平滑筋異常収縮をスクリーニングするものであり、好適には、前記スクリーニング方法において、前記体組織または体液と内標準物質とを含む溶液は、体組織または体液と、内標準物質としての重水素化スフィンゴシルフォスフォリルコリンと、ｐＨ５の緩衝液及びメタノールからなる溶液であり、陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムを用いた前記固相抽出処理は、該陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムに、メタノール及びｐＨ５の緩衝液を通液してコンディショニングを行い、体組織または体液と内標準物質とを含む前記溶液を、前記陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラム固相にロードし、次いで順次、ｐＨ５の緩衝液、１：１容量で混合したメタノール／ｐＨ５の緩衝液、メタノールで洗浄した後、乾燥させて、アンモニア含有メタノールで溶出する処理であり、溶出液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度の前記測定は、該溶出液を濃縮乾固して再溶解し、該溶解液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度を測定するものであり、体組織または体液中のコレステロールのレベル値の高低に拘わらず、ＳＰＣのみのレベルを測定して平滑筋異常収縮を評価する。
【００２１】
好適には、上記本発明のスクリーニング方法において、平滑筋は、血管平滑筋、消化器平滑筋、呼吸器平滑筋、子宮平滑筋および膀胱平滑筋からなる群より選ばれる。
また、更に好適には、上記本発明のスクリーニング方法においては、測定されたＳＰＣのレベルが血清総コレステロール値に拘わらず、冠動脈疾患や脳梗塞の危険度を示す。
【００２２】
他の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、上記本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法におけるスフィンゴシルフォスフォリルコリンの代わりにＦｙｎのレベルを測定する。
【００２３】
診断キットは、体組織または体液中のＳＰＣのレベルを測定して平滑筋異常収縮を高精度で診断でき、また、他の診断キットは、前記診断キットにおけるスフィンゴシルフォスフォリルコリンの代わりにＦｙｎのレベルを測定して平滑筋異常収縮を診断する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明を好適例を用いて、以下に説明するが、これらに限定されるものではない。
本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、体組織または体液中のＳＰＣのレベルを測定するものである。
即ち、本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、ＳＰＣを測定することにより、平滑筋異常収縮、特にヒト平滑筋異常収縮による疾患の早期検出、予後予測、重篤度の測定、および治療に伴う平滑筋異常収縮経過の評価のための方法であり、また、ＳＰＣの存在および量が血清総コレステロール値に拘わらず、冠動脈疾患や脳梗塞のリスクを表示するための方法であり、さらには、ＳＰＣを測定することを特徴とするヒト平滑筋異常収縮に起因する疾患予防のための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標に利用できる方法である。
【００２５】
本発明が適用される平滑筋とは、平滑筋であれば臓器あるいは部位等に関わらず全てを含み、特に血管平滑筋、消化器平滑筋、呼吸器平滑筋、子宮平滑筋および膀胱平滑筋等が例示される。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法においては、体組織や体液を採取して、かかる体組織または体液中のＳＰＣを測定するものであり、具体的には、体組織としては、血管壁等の臓器組織や体細胞等が、また体液としては、血液、髄液、唾液、尿あるいは汗等が使用できるが、これらに限定されるものではなく、全ての体組織や体液を好適に使用することができる。
【００２７】
その測定方法は、好ましくはキットを用いて測定され、一般的には、酵素アッセイ、イムノアッセイ、分光法、質量分析法あるいは表面プラスモン共鳴などにより間接的あるいは直接的に測定することができる。
更には、ＳＰＣは細胞膜の成分であるｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎからＮ−脱アシル化により生成するため、ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ特異的Ｎ−脱アシル化酵素を用いて酵素的に測定することも可能である。
即ち、本発明においては、ＳＰＣが他のスフィンゴシンと識別されて特異的に測定できることが重要あり、そのことが可能であればいずれの方法を用いてもかまわない。
【００２８】
また、診断キットは、従来の平滑筋異常収縮のための測定対象であるコレステロールに代わる新しい測定対象であるＳＰＣを上記手段により測定して、具体的にはＳＰＣが他のスフィンゴシンと識別されて特異的に測定されて、上記平滑筋異常収縮のスクリーニングを実施できるものであり、極めて高い精度で平滑筋異常収縮が診断できるものである。
【００２９】
本発明においては、体液または体組織中のＳＰＣそれ自体のレベルを測定することにより、またはＳＰＣの存在を測定することにより、血清総コレステロール値が高いか否かに拘わらず、平滑筋異常収縮、例えば冠動脈疾患のリスクがあることを早期に診断できる。
【００３０】
本発明においては、血清総コレステロール値が正常値（２２０ｍｇ／ｄｌ以下）であっても、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮を発症したり、血清総コレステロール値が高値（２２０ｍｇ／ｄｌ以上）にも拘わらず、治療の種類によっては平滑筋異常収縮が発症されないことが後述する実施例により明らかとなり、従って冠動脈疾患のリスクを予測するためには、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣを個別に測定することのみで、平滑筋異常収縮のスクリーニングが精度良くできるものである。
また、ＳＰＣのレベルと平滑筋異常収縮との関係は、ＳＰＣのレベル量が高い値ほど平滑筋異常収縮との関係が深くなる。
【００３１】
従って、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣレベルを測定することにより、冠動脈疾患や脳梗塞のリスクを表示することができる。また、くも膜下出血患者は手術による止血後、ほとんどの症例において広範な脳血管の攣縮が起こり、致死的となることを予測、経過観察することも可能となる。
【００３２】
このように、体組織あるいは体液中に存在するＳＰＣは、平滑筋異常収縮に起因する疾患のバイオマーカーとして有効に機能し、ＳＰＣが循環器疾患の臨床的事象と直接関連するバイオマーカーとして機能できるものである。
【００３３】
従って、疾患に罹るか罹らないかを直接確認しなくとも、平滑筋収縮による疾患としての、例えば脳血管攣縮（攣縮はスパズムとも称される）、冠血管攣縮、肺血管攣縮、手指血管攣縮、腸間膜動脈攣縮、高血圧症等、視野狭窄および暗黒視症、食道痙攣、胃痙攣、腸管運動亢進に基づく下痢または腹痛、痙攣性イレウスあるいは腹部アンギナ、呼吸困難あるいは気管支喘息等の呼吸器疾患、切迫早産や流産、尿失禁などの排尿障害等の疾患の、早期検出、予後予測、重篤度の測定、および治療に伴う平滑筋異常収縮経過の評価のために使用することができる。
【００３４】
更には、ＳＰＣが、平滑筋異常収縮に起因する疾患の予防のための医薬品や食品機能の確認または評価の指標に利用することができ、医薬品や機能性食品開発において、開発期間を短縮すること及びコスト削減に貢献することが可能となる。
【００３５】
また、ＳＰＣと同様に平滑筋異常収縮のスクリーニング方法並びに診断キット、更には平滑筋異常収縮に起因する疾患の予防のための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等にＦｙｎを用いることも可能である。
【００３６】
（実施例）
以下に、本発明を実施例及び試験例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。
（実施例１）ＳＰＣと冠動脈疾患リスクとの関係
消化器癌手術の際、患者から摘出した胃腸及びこれらの周囲組織から腸間膜動脈を分離した。この分離した動脈血管の周辺組織および内皮を除去して、血管標本（幅１ｍｍ、長さ５ｍｍ）を採取した。
【００３７】
当該血管標本を、９５容量％Ｏ２−５容量％ＣＯ２混合ガスの通気下で、温度３７℃のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎａ＋ １３７．４ｍＭ、Ｋ＋ ５．９ｍＭ、Ｃａ２＋ １．２ｍＭ、Ｍｇ２＋ １．２ｍＭ、Ｃｌ− １４８．１ｍＭ、グルコース １１．５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １１．６ｍＭ（ｐＨ７．３））が充填されたマグヌス管に懸垂し、張力トランスジューサー（商品名 ＴＢ−６１２Ｔ；日本光電社製）を用いて等尺性張力を測定した。
【００３８】
まず、前記マグヌス管にＫ＋１１８ｍＭを添加して、血管標本に脱分極を起させ、これにより発生したＣａ２＋依存性の収縮時の張力を測定し、これを正常収縮とした。
【００３９】
一方、異常収縮の張力の測定は、前記マグヌス管に更にＳＰＣを３０μＭ添加して測定した張力を、異常収縮の張力とした。
当該異常収縮の張力値を、Ｋ＋１１８ｍＭを添加して測定した前記張力の大きさ（１００％）に対する相対値として、図１に表示した。
また、患者の血清総コレステロール値、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）コレステロール値およびＨＤＬ（高比重リポ蛋白）コレステロール値は術前において予め測定し、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮のかかる相対張力とこれらの関係を図１に表した。
【００４０】
その結果、図１に示すように、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力は、血清総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値と相関したが（図１ａ、ｂ）、ＨＤＬコレステロール値とは逆相関した（図１ｃ）。
従って、血清総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値が、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力に影響を及ぼしたことと考察される。
【００４１】
ここで、ＳＰＣによるヒト腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力と血清総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値の相関は、血清総コレステロール値と冠動脈疾患相対危険率（日本動脈硬化学会；Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ．９，１−２７，２００２）との相関として公知のＪ−カーブ（図１ｄ）の形状に類似するものである。
【００４２】
なお、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮と喫煙、糖尿病、高血圧のリスク因子との関連性は認められなかった。
従って、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮は、血清総コレステロールにより活性化されて、血管攣縮を誘引すると考えられ、ＳＰＣが冠動脈疾患の新たなリスク因子であることが明らかとなった。
【００４３】
個々の症例について観察すると、血清総コレステロール値が正常値（２２０ｍｇ／ｄｌ以下）の症例についても、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮の張力の値が高い値を示す症例や、血清総コレステロール値が高値（２２０ｍｇ／ｄｌ以上）にも拘わらず、平滑筋異常収縮の張力が低い症例（図１ａ）が観察される等、冠動脈疾患のリスクを予測するためには、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣを個別に測定することにより判断できることが明らかとなった。
【００４４】
（実施例２）高脂血症治療薬の選定並びに治療効果評価へのＳＰＣ測定の有用性消化器癌患者において、高脂血症治療薬（ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤）又はＥＰＡを投与して、投与前（それぞれ図２中の△、□）及び投与後（それぞれ図２中の▲、■）の腸管膜動脈に関し、実施例１と同様にして、ＳＰＣに依る平滑筋異常収縮の張力の大きさと血清総コレステロール値の関係を図２に示した。
ＳＰＣに依る異常収縮の大きさは、図１と同様に、Ｋ＋１１８ｍＭを添加して測定した張力（１００％）に対する相対値として図２に示した。
また、高脂血症治療薬（ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤）又はＥＰＡを投与しない非治療群のＳＰＣに依る平滑筋異常収縮の張力と血清総コレステロール値との関係も、図２に示す。
【００４５】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤を用いた場合においては、血清総コレステロール値が高値から正常値に低下したにも拘わらず、ＳＰＣに依る異常収縮の張力が残る症例が認められた。
また、ＥＰＡは、血清総コレステロール値が高値から大きく低下しないにも拘わらず（２６０ｍｇ／ｄｌから２３０ｍｇ／ｄｌへ）、ＳＰＣに依る平滑筋異常収縮は、血清総コレステロール値が正常値の症例の場合と、ほぼ同等の張力まで低下した。
【００４６】
これらの結果は、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣを測定することにより、平滑筋異常収縮が予想でき、医薬品の効果の個別評価、有効な医薬品を選定する評価の指標としてＳＰＣが利用できることを表すものである。
【００４７】
（実施例３）くも膜下出血患者のＳＰＣ濃度測定
くも膜下出血患者のＳＰＣを、以下のような手順で測定した。
（１）ＳＰＣ−ｄ ３ （ＳＰＣ 安定同位体標識体；化１）の合成
Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ｄｅ−ＳＭ）の合成Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ＳＭ：Ｓｉｇｍａ社製）０．４ｇをＤＭＳＯ２０ｍＬに溶解し、８０℃に加熱した。これにベンゼンチオールナトリウム塩のＤＭＳＯ溶液（０．４９ｇ／５ｍＬ）を窒素雰囲気下でシリンジにて滴下し，温度を８０℃に維持しながら加熱攪拌した。
【００４８】
１時間後、反応液を室温まで冷却し、これに水１００ｍＬおよび１Ｎ−塩酸を適量加えて、反応液をｐＨ２〜３程度になるように当該反応液を調整した。
この溶液をジクロロメタンにより抽出し、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾過して濾液を減圧濃縮した。
濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１９／１〜４／１）にて精製し、ｄｅ−ＳＭを薄ベージュ色の固体として、３００ｍｇ（収率；７５％）得た。
【００４９】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ−ｄ ３ （ＳＭ−ｄ ３ ）の合成
前記合成ｄｅ−ＳＭ２５０ｍｇをメタノール１８ｍＬに溶解し、これにシクロへキシルアミン３５．５ｍｇ加えて攪拌した。
攪拌して得られた溶液に、ヨウ化メチル−ｄ３（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２２０μＬをメタノール１０ｍＬに添加した溶液を室温にてシリンジ滴下した。室温にて１時間攪拌後、反応液にヨウ化メチル−ｄ３１１０μＬを追加し、攪拌を継続した。
【００５０】
２時間攪拌を保持し、その後減圧濃縮乾固した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１９／１〜９／１）にて精製し、ＳＭ−ｄ３を薄黄色固体として、２４０ｍｇ（収率９６％）得た。
【００５１】
Ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｄ ３ （ＳＰＣ−ｄ ３ ）の合成
前記で得られたＳＭ−ｄ３６５ｍｇを、１．５Ｎ−ＨＣｌ／ＭｅＯＨａｑ（塩酸１ｍＬをメタノール７ｍＬに添加して調製したもの）８ｍＬに溶解し、加熱還流した。３時間後、反応液を減圧濃縮してメタノールを留去した。
これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和した後、メタノール／クロロホルム混合液（容量比で１／２）により抽出を行った。
【００５２】
前記抽出により得られた水層に１Ｎ−ＮａＯＨを加え、ｐＨ１２〜１３に調整した後、再び上記メタノール／クロロホルム混合液で３回抽出して、得られた全ての有機層をあわせて、これを減圧濃縮した。
減圧濃縮により得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム〜クロロホルム／メタノール＝４／１）にて精製し、下記の化１で表されるＳＰＣ−ｄ３を白色固体として、１７．４ｍｇ（収率４５％）得た。
ただし、ＳＰＣ−ｄ３の安定同位元素標識体比のｄ３体とｄ０体の割合は、ｄ３体：ｄ０体が、９９．２：０．８であった。
【００５３】
【化１】
【００５４】
（２）ＳＰＣ測定装置および測定条件
ＳＰＣを測定するに際して用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）として、ＨＰ１１００システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製）を、またその分離カラムとして、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＨＧ−５（３５ｍｍ×２．０ｍｍｉ．ｄ．，野村化学製）を使用した。
【００５５】
また移動相として、溶離液Ａ：０．０１容量％のギ酸を含む５ｍＭのギ酸アンモニウム／メタノール／テトラヒドロフラン（５／２／３（ｖ／ｖ））と、溶離液Ｂ：０．０１容量％のギ酸を含む５ｍＭのギ酸アンモニウム／メタノール／テトラヒドロフラン（１／２／７（ｖ／ｖ））とを用いた。
【００５６】
溶離プログラムは、溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％の直線グラジエント（０−４分）、溶離液Ｂ１００％のｉｓｏｃｒａｔｉｃ（４−５分）、溶離液Ｂ１００％から溶離液Ａ１００％の直線グラジエント（５−５．１分）および溶離液Ａ１００％のｉｓｏｃｒａｔｉｃ（５．１−１１分）の順に行った。
ただし、これらの溶離液の流速を０．２ｍＬ／分とし、カラム温度を４０℃に保持した。
【００５７】
また、質量分析装置には、ターボイオンスプレーを装着した四重極質量分析計Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ３００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用い、ターボイオンスプレー法でのイオン化電圧、オリフィス電圧、フォーカシングリング電圧をそれぞれ３４００、２５、２２０Ｖとした。
測定には正イオンモードを使用し、ＭＲＭモード（モニタリングイオン：ＳＰＣｍ／ｚ ４６５．３（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ）−１８４．１（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ）、ＳＰＣ−ｄ３ ４６８．３−１８４．１）で測定を行った。
【００５８】
（３）検量線作成用検体調製
リン酸緩衝液１４０μＬに、ＳＰＣのメタノール溶液（１５０、７５、３０、１５、７．５、３および１．５ｎｇ／ｍＬ）１０μＬを加えて、最終濃度がそれぞれ１０、５、２、１、０．５、０．２および０．１ｎｇ／ｍＬになるように調製を行なった。
またブランク検体（０ｎｇ／ｍＬ）としては、ＳＰＣ溶液の代わりにメタノール１０μＬを加えて調製したものを使用した。
【００５９】
（４）検量線の作成
検量線は、得られたリン酸緩衝液中のＳＰＣ濃度をｘ、ＳＰＣのピーク面積（ＭＡ）と内標準物質のピーク面積（ＩＡ）との比（Ｉｎｔ．Ｒａｔｉｏ：Ｉｎｔ．Ｒａｔｉｏ＝ＭＡ／ＩＡ）をｙとし、このｙとｘとの関係を用いて、最小二乗法（重み １／ｙ）により、以下の検量線式を求めた。
ｙ＝ａｘ＋ｂ
但し、ｘ：ＳＰＣ濃度
ｙ：ピーク面積比
ａ：検量線の傾き
ｂ：ｙ軸切片
【００６０】
（５）固相抽出法およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる髄液中ＳＰＣ濃度の測定
髄液１ｍＬに、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍＬおよび内標準物質として５０ｎｇ／ｍＬ濃度のＳＰＣ−ｄ３（上記ＳＰＣ安定同位体標識体）のメタノール溶液１０μＬを加えた。
かかる溶液をボンドエルート Ｃｅｒｔｉｆｙ（ジーエルサイエンス製）を用いて、以下の手順に従い固相抽出処理を行った。
【００６１】
Ｃｅｒｔｉｆｙに、メタノール５ｍＬおよび１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬを順じ通液して、コンディショニングを行った。次いで、このように調製した溶液を、Ｃｅｒｔｉｆｙにロードし、これを１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬ、メタノール／１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）（１／１容量）の溶液５ｍＬ、およびメタノール３ｍＬで順次洗浄した。
【００６２】
前記洗浄後、１分間通風し、Ｃｅｒｔｉｆｙの担体を乾燥した後、１％濃度のアンモニア含有メタノール３ｍＬで溶出を実施して溶出液を得た。
得られた溶出液を窒素気流下（ＤＲＹ ＴＨＥＲＭＯ ＢＡＴＨ ＭＧ−２０００、ＥＹＥＬＡ製）で、濃縮乾固した。濃縮残渣をメタノール１００μＬに再溶解し、このうち２０μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供し、ＳＰＣ濃度の測定を行った。
なお全ての操作には、通常のシリコン処理を施した容器もしくは蛋白無吸着処理を施した容器（住友ベークライト株式会社製）を使用した。
【００６３】
くも膜下出血（ＳＡＨ）患者３例について、くも膜下出血発症後３〜４日および９日後の脳髄液中のＳＰＣ濃度を、上記方法により測定した。また、髄膜炎の疑いで髄液採取したが異常が認められなかった正常者の腰椎髄液についてもＳＰＣ濃度を、同様の方法により測定した。その結果を下記の表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１より、くも膜下出血患者のいずれの髄液中においても、ＳＰＣ濃度が高いことが明らかとなる一方、正常者の腰椎髄液からはＳＰＣが検出されなかった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法は、血清総コレステロール値とは関係なくＳＰＣが平滑筋異常収縮に基づく疾患の優れたバイオマーカーであり、かかるＳＰＣを測定することにより、平滑筋異常収縮に基づく疾患の発症を高精度で判断でき、平滑筋異常収縮に基づく疾患の早期検出、予後予測、重篤度の測定、医学的治療に伴う平滑筋異常収縮の経過の評価を高精度で行うことができるとともに、平滑筋異常収縮に起因する疾患を予防するための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等に有効に適用できることを可能とする、信頼性が高くかつ簡便な平滑筋異常収縮のスクリーニング方法である
【００６７】
また本発明スクリーニング方法は、血清総コレステロール値が高いヒトのみならず、血清総コレステロール値が正常のヒトに対しても、ＳＰＣがそれら疾患のリスクと成り得ることより、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、それら疾患の兆候を発症していないヒトに対して、疾患の早期発見が可能となり、早期治療・予防が実現できる、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法である。
【００６８】
さらには、本発明のスクリーニング方法は、平滑筋の異常収縮の強度を把握し、患者毎の異常収縮の強度に適した医薬品の選択や治療効果を測定でき、従って患者毎の平滑筋異常収縮の強度に応じて、効果的な医薬品を選択し、効果をモニターすることができるテーラーメイド医療を提供することを可能とするものである。
【００６９】
更に診断キットは、本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を簡便に適用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 （ａ）は、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力と血清総コレステロール値との関係、（ｂ）は、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力とＬＤＬコレステロール値との関係、（ｃ）は、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力とＨＤＬコレステロール／血清総コレステロール値との関係、（ｄ）は、血清総コレステロール値と冠動脈疾患相対危険率との関係を示す線図。
【図２】 高止血症治療薬またはＥＰＡの投与前後及び非治療の際の、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮の張力の大きさと血清総コレステロール値との関係の例示を示す線図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法に関し、特に体組織や体液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン（以下ＳＰＣと略称する）のレベルを測定して、平滑筋異常収縮の発症を高精度で判断し、これにより平滑筋異常収縮に基づく疾患の早期検出、予後予測、重篤度の測定、医学的治療に伴う平滑筋異常収縮の経過の評価方法、並びに平滑筋異常収縮に起因する疾患を予防するための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等に有効に適用される平滑筋異常収縮のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
平滑筋収縮には、細胞質カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度の上昇の程度に依存した強度で収縮が惹起される、Ｃａ２＋濃度依存性の正常な生理的平滑筋収縮が存在する一方で、かかる細胞質中のＣａ２＋濃度の上昇の程度以上の収縮またはＣａ２＋濃度に依存しない収縮、即ちＣａ２＋濃度非依存性収縮が存在する。
【０００３】
後者のＣａ２＋濃度非依存性収縮は、平滑筋異常収縮を意味し、かかる平滑筋異常収縮は、一部の血管収縮物質により平滑筋細胞膜のＧ蛋白質（ＧＴＰ結合性蛋白質）を介して平滑筋のＣａ２＋感受性が増強され、細胞質Ｃａ２＋濃度の上昇以上の収縮あるいはＣａ２＋非依存的な収縮が惹起されたものである。
詳細には、Ｃａ２＋非依存性の平滑筋異常収縮に関わる因子として、Ｒｈｏ−キナーゼが知られており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１２２５７−１２２６０，１９９７）、平滑筋異常収縮は、平滑筋細胞のＧ蛋白質の１つであるＲｈｏＡにより活性化されるＲｈｏ−キナーゼ（蛋白質リン酸化酵素）情報伝達系を介する、いわゆる病的な異常収縮である。
【０００４】
一方、平滑筋収縮による血流不全に起因する疾患としては、血管平滑筋に関しては、例えば脳血管攣縮（攣縮はスパズムとも称される）、冠血管攣縮、肺血管攣縮、手指血管攣縮、腸間膜動脈攣縮、高血圧症等が、また、眼血管に関しては、視野狭窄および暗黒視症等が知られている。
また、消化器平滑筋収縮に関しては、食道痙攣、胃痙攣、腸管運動亢進に基づく下痢または腹痛、痙攣性イレウスあるいは腹部アンギナ等が、また、呼吸器平滑筋収縮に関しては呼吸困難あるいは気管支喘息等の呼吸器疾患が知られている。
【０００５】
更に、子宮平滑筋収縮においては、切迫早産や流産が、膀胱平滑筋収縮に関しては尿失禁などの排尿障害が知られている。
これらの疾患の平滑筋収縮の一部には、病的な状態でのみ惹起される平滑筋異常収縮が含まれていると考えられている。
【０００６】
これらの疾患の診断や治療においては、臨床症状に加えてＸ線、ＣＴスキャナー、ＭＲＩ、エコーなどの医療機器での診断が主になされているが、平滑筋の異常収縮の強度を特異的マーカーを用いて、組織や体液（血液、髄液、尿、涙、唾液、汗、気道分泌液、喀痰、膣分泌液、羊水等）により簡易に測定し、早期発見や診断、予後の改善に利用することは行われていない。
【０００７】
近年、増加している疾患である動脈硬化も、平滑筋異常収縮との関連性が指摘されている疾患であり、動脈硬化が原因で惹起される心疾患や脳卒中は、癌を上回る死亡率を呈している。
動脈硬化は、高血清総コレステロール、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、ストレス、運動不足がリスク因子として知られているが、これらの因子中、高血清総コレステロールが動脈硬化による冠動脈疾患の主要なリスク因子と考えられている。
【０００８】
しかし、動脈硬化の原因であるプラークの形成と、動脈破裂は必ずしも血清総コレステロール値とは相関せず、動脈攣縮が急性冠動脈疾患と強く関連することから、動脈平滑筋異常収縮が動脈硬化と関連することが指摘されている（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ．３３：９−１６，１９９９）。
【０００９】
また、狭心症や心臓発作を発症した経験の在る患者の半数は、血清総コレステロールの値には問題がないと判断されている。
従って、従来の検査では血清総コレステロール値が問題でなければ、上記疾患リスクが潜在していても、早期発見や早期治療を受けることができない問題点が存在する。
【００１０】
一方、スタチン等の脂質低下薬は、血清総コレステロール値の低下を指標に将来の冠動脈疾患のリスク軽減を期待して治療がなされている。しかし、これら疾患の病態の一つと考えられる平滑筋異常収縮の強度を測定し、治療薬の選択や治療効果の判断等に利用することは行われていない。
【００１１】
また、スフィンゴ脂質は細胞移動、増殖、アポトーシス、分化、生存などにおける細胞内シグナル伝達分子として重要な役割を担っていることが知られている（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１０，１３８８−１３９７，１９９６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１０，３４−３８，１９９７）。
かかるスフィンゴ脂質の一つであるＳＰＣは血中にも存在し、疾患との関連性においては、心臓虚血および心臓低酸素症からなる心不全との関連性（特表２００２−５０４９９９）や心機能との関連性が報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５，１８９−１９７，２００１）。
しかし、これらの公知文献においてはＳＰＣとヒト平滑筋異常収縮との関連性や、平滑筋異常収縮に起因する疾患との関連性については具体的には記載されていない。
【００１２】
また、最近、Ｓｒｃファミリープロテインチロシンキナーゼの一つであるＦｙｎが、ＳＰＣ−Ｒｈｏ−キナーゼの下流側因子として平滑筋異常収縮に何らかの関連性があることが開示されている（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１，９５３−９６０，２００２）。
【００１３】
さらに、国民の健康や病気予防に対する関心が高まるにつれて、食品が有する疾患予防や改善等の効能への関心が広がっている。疾患の評価に替わるバイオマーカーによる食品機能の解明は、より効果的な疾患予防食品（機能性食品）の開発に繋がることが期待されている。
これまで、心疾患や脳疾患など循環器系疾患のリスク低減のための機能性食品に関するバイオマーカーとしては、血清総コレステロール値が利用されている。
【００１４】
しかし、血清総コレステロール値はリスク因子の一つであるが、循環器系疾患の臨床的事象を直接反映するリスク因子ではなく、疾患予防食品の開発に際しては、循環器系疾患の臨床的事象と直接関連したバイオマーカーが強く切望されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、血清総コレステロール値とは関係なく、体組織または体液中のＳＰＣのレベルを測定することによりＳＰＣの存在を明らかにし、これにより平滑筋異常収縮に起因する疾患例えば、循環器疾患、消化器疾患、呼吸器疾患、生殖器疾患および泌尿器疾患の早期判断、予後予測、再発の予測、重篤度の測定、更には平滑筋異常収縮に起因する疾患予防のための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等の優れたバイオマーカーとして利用することができる、信頼性が高くかつ簡便な、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を提供することである。
【００１６】
また本発明の他の目的は、冠動脈疾患や脳梗塞のリスクとして知られている血清総コレステロール値とＳＰＣとの関連性を明らかにし、血清総コレステロール値が高いヒトのみならず、血清総コレステロール値が正常のヒトに対しても、ＳＰＣがそれら疾患のリスクと成り得るかを検証し、ＳＰＣ測定の意義を明らかにし、このことにより、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、それら疾患の兆候を発症していないヒトに対して、疾患の早期発見が可能となり、早期治療・予防が実現できる、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を提供することである。
【００１７】
更には、本発明の他の目的は、平滑筋の異常収縮の強度を把握し、患者毎の異常収縮の強度に適した医薬品の選択や治療効果を測定する、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を提供することにある。このことにより、患者毎の平滑筋異常収縮の強度に応じて、効果的な医薬品を選択し、効果をモニターすることができるテーラーメイド医療を提供することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、従来の平滑筋異常収縮のための測定対象に代わる新しい測定対象であるＳＰＣを測定して上記平滑筋異常収縮のスクリーニングを高い精度で診断できる診断用キットに適用することができる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＳＰＣと平滑筋異常収縮との関連性を鋭意研究した結果、体組織または体液中に存在するＳＰＣの存在が、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、平滑筋異常収縮に深く関与していることを見出し、本発明に到達した。また、本発明者らは、ＳＰＣが冠動脈疾患のリスクと成り得ること、高脂血症治療薬の種類により、また個々の症例でＳＰＣによる平滑筋異常収縮の改善効果が異なること、くも膜下出血患者の脳髄液中にＳＰＣ濃度が高いという、これまでまったく知られていない知見に基づき、本発明に到達した。
【００２０】
本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、体組織または体液と内標準物質とを含む溶液を調製し、該溶液を、陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムを用いて固相抽出処理し、得られた溶出液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度を測定し、得られた該体組織または体液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリンのレベルより平滑筋異常収縮をスクリーニングするものであり、好適には、前記スクリーニング方法において、前記体組織または体液と内標準物質とを含む溶液は、体組織または体液と、内標準物質としての重水素化スフィンゴシルフォスフォリルコリンと、ｐＨ５の緩衝液及びメタノールからなる溶液であり、陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムを用いた前記固相抽出処理は、該陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムに、メタノール及びｐＨ５の緩衝液を通液してコンディショニングを行い、体組織または体液と内標準物質とを含む前記溶液を、前記陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラム固相にロードし、次いで順次、ｐＨ５の緩衝液、１：１容量で混合したメタノール／ｐＨ５の緩衝液、メタノールで洗浄した後、乾燥させて、アンモニア含有メタノールで溶出する処理であり、溶出液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度の前記測定は、該溶出液を濃縮乾固して再溶解し、該溶解液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度を測定するものであり、体組織または体液中のコレステロールのレベル値の高低に拘わらず、ＳＰＣのみのレベルを測定して平滑筋異常収縮を評価する。
【００２１】
好適には、上記本発明のスクリーニング方法において、平滑筋は、血管平滑筋、消化器平滑筋、呼吸器平滑筋、子宮平滑筋および膀胱平滑筋からなる群より選ばれる。
また、更に好適には、上記本発明のスクリーニング方法においては、測定されたＳＰＣのレベルが血清総コレステロール値に拘わらず、冠動脈疾患や脳梗塞の危険度を示す。
【００２２】
他の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、上記本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法におけるスフィンゴシルフォスフォリルコリンの代わりにＦｙｎのレベルを測定する。
【００２３】
診断キットは、体組織または体液中のＳＰＣのレベルを測定して平滑筋異常収縮を高精度で診断でき、また、他の診断キットは、前記診断キットにおけるスフィンゴシルフォスフォリルコリンの代わりにＦｙｎのレベルを測定して平滑筋異常収縮を診断する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明を好適例を用いて、以下に説明するが、これらに限定されるものではない。
本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、体組織または体液中のＳＰＣのレベルを測定するものである。
即ち、本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法は、ＳＰＣを測定することにより、平滑筋異常収縮、特にヒト平滑筋異常収縮による疾患の早期検出、予後予測、重篤度の測定、および治療に伴う平滑筋異常収縮経過の評価のための方法であり、また、ＳＰＣの存在および量が血清総コレステロール値に拘わらず、冠動脈疾患や脳梗塞のリスクを表示するための方法であり、さらには、ＳＰＣを測定することを特徴とするヒト平滑筋異常収縮に起因する疾患予防のための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標に利用できる方法である。
【００２５】
本発明が適用される平滑筋とは、平滑筋であれば臓器あるいは部位等に関わらず全てを含み、特に血管平滑筋、消化器平滑筋、呼吸器平滑筋、子宮平滑筋および膀胱平滑筋等が例示される。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法においては、体組織や体液を採取して、かかる体組織または体液中のＳＰＣを測定するものであり、具体的には、体組織としては、血管壁等の臓器組織や体細胞等が、また体液としては、血液、髄液、唾液、尿あるいは汗等が使用できるが、これらに限定されるものではなく、全ての体組織や体液を好適に使用することができる。
【００２７】
その測定方法は、好ましくはキットを用いて測定され、一般的には、酵素アッセイ、イムノアッセイ、分光法、質量分析法あるいは表面プラスモン共鳴などにより間接的あるいは直接的に測定することができる。
更には、ＳＰＣは細胞膜の成分であるｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎからＮ−脱アシル化により生成するため、ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ特異的Ｎ−脱アシル化酵素を用いて酵素的に測定することも可能である。
即ち、本発明においては、ＳＰＣが他のスフィンゴシンと識別されて特異的に測定できることが重要あり、そのことが可能であればいずれの方法を用いてもかまわない。
【００２８】
また、診断キットは、従来の平滑筋異常収縮のための測定対象であるコレステロールに代わる新しい測定対象であるＳＰＣを上記手段により測定して、具体的にはＳＰＣが他のスフィンゴシンと識別されて特異的に測定されて、上記平滑筋異常収縮のスクリーニングを実施できるものであり、極めて高い精度で平滑筋異常収縮が診断できるものである。
【００２９】
本発明においては、体液または体組織中のＳＰＣそれ自体のレベルを測定することにより、またはＳＰＣの存在を測定することにより、血清総コレステロール値が高いか否かに拘わらず、平滑筋異常収縮、例えば冠動脈疾患のリスクがあることを早期に診断できる。
【００３０】
本発明においては、血清総コレステロール値が正常値（２２０ｍｇ／ｄｌ以下）であっても、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮を発症したり、血清総コレステロール値が高値（２２０ｍｇ／ｄｌ以上）にも拘わらず、治療の種類によっては平滑筋異常収縮が発症されないことが後述する実施例により明らかとなり、従って冠動脈疾患のリスクを予測するためには、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣを個別に測定することのみで、平滑筋異常収縮のスクリーニングが精度良くできるものである。
また、ＳＰＣのレベルと平滑筋異常収縮との関係は、ＳＰＣのレベル量が高い値ほど平滑筋異常収縮との関係が深くなる。
【００３１】
従って、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣレベルを測定することにより、冠動脈疾患や脳梗塞のリスクを表示することができる。また、くも膜下出血患者は手術による止血後、ほとんどの症例において広範な脳血管の攣縮が起こり、致死的となることを予測、経過観察することも可能となる。
【００３２】
このように、体組織あるいは体液中に存在するＳＰＣは、平滑筋異常収縮に起因する疾患のバイオマーカーとして有効に機能し、ＳＰＣが循環器疾患の臨床的事象と直接関連するバイオマーカーとして機能できるものである。
【００３３】
従って、疾患に罹るか罹らないかを直接確認しなくとも、平滑筋収縮による疾患としての、例えば脳血管攣縮（攣縮はスパズムとも称される）、冠血管攣縮、肺血管攣縮、手指血管攣縮、腸間膜動脈攣縮、高血圧症等、視野狭窄および暗黒視症、食道痙攣、胃痙攣、腸管運動亢進に基づく下痢または腹痛、痙攣性イレウスあるいは腹部アンギナ、呼吸困難あるいは気管支喘息等の呼吸器疾患、切迫早産や流産、尿失禁などの排尿障害等の疾患の、早期検出、予後予測、重篤度の測定、および治療に伴う平滑筋異常収縮経過の評価のために使用することができる。
【００３４】
更には、ＳＰＣが、平滑筋異常収縮に起因する疾患の予防のための医薬品や食品機能の確認または評価の指標に利用することができ、医薬品や機能性食品開発において、開発期間を短縮すること及びコスト削減に貢献することが可能となる。
【００３５】
また、ＳＰＣと同様に平滑筋異常収縮のスクリーニング方法並びに診断キット、更には平滑筋異常収縮に起因する疾患の予防のための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等にＦｙｎを用いることも可能である。
【００３６】
（実施例）
以下に、本発明を実施例及び試験例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。
（実施例１）ＳＰＣと冠動脈疾患リスクとの関係
消化器癌手術の際、患者から摘出した胃腸及びこれらの周囲組織から腸間膜動脈を分離した。この分離した動脈血管の周辺組織および内皮を除去して、血管標本（幅１ｍｍ、長さ５ｍｍ）を採取した。
【００３７】
当該血管標本を、９５容量％Ｏ２−５容量％ＣＯ２混合ガスの通気下で、温度３７℃のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎａ＋ １３７．４ｍＭ、Ｋ＋ ５．９ｍＭ、Ｃａ２＋ １．２ｍＭ、Ｍｇ２＋ １．２ｍＭ、Ｃｌ− １４８．１ｍＭ、グルコース １１．５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １１．６ｍＭ（ｐＨ７．３））が充填されたマグヌス管に懸垂し、張力トランスジューサー（商品名 ＴＢ−６１２Ｔ；日本光電社製）を用いて等尺性張力を測定した。
【００３８】
まず、前記マグヌス管にＫ＋１１８ｍＭを添加して、血管標本に脱分極を起させ、これにより発生したＣａ２＋依存性の収縮時の張力を測定し、これを正常収縮とした。
【００３９】
一方、異常収縮の張力の測定は、前記マグヌス管に更にＳＰＣを３０μＭ添加して測定した張力を、異常収縮の張力とした。
当該異常収縮の張力値を、Ｋ＋１１８ｍＭを添加して測定した前記張力の大きさ（１００％）に対する相対値として、図１に表示した。
また、患者の血清総コレステロール値、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）コレステロール値およびＨＤＬ（高比重リポ蛋白）コレステロール値は術前において予め測定し、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮のかかる相対張力とこれらの関係を図１に表した。
【００４０】
その結果、図１に示すように、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力は、血清総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値と相関したが（図１ａ、ｂ）、ＨＤＬコレステロール値とは逆相関した（図１ｃ）。
従って、血清総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値が、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力に影響を及ぼしたことと考察される。
【００４１】
ここで、ＳＰＣによるヒト腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力と血清総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値の相関は、血清総コレステロール値と冠動脈疾患相対危険率（日本動脈硬化学会；Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ．９，１−２７，２００２）との相関として公知のＪ−カーブ（図１ｄ）の形状に類似するものである。
【００４２】
なお、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮と喫煙、糖尿病、高血圧のリスク因子との関連性は認められなかった。
従って、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮は、血清総コレステロールにより活性化されて、血管攣縮を誘引すると考えられ、ＳＰＣが冠動脈疾患の新たなリスク因子であることが明らかとなった。
【００４３】
個々の症例について観察すると、血清総コレステロール値が正常値（２２０ｍｇ／ｄｌ以下）の症例についても、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮の張力の値が高い値を示す症例や、血清総コレステロール値が高値（２２０ｍｇ／ｄｌ以上）にも拘わらず、平滑筋異常収縮の張力が低い症例（図１ａ）が観察される等、冠動脈疾患のリスクを予測するためには、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣを個別に測定することにより判断できることが明らかとなった。
【００４４】
（実施例２）高脂血症治療薬の選定並びに治療効果評価へのＳＰＣ測定の有用性消化器癌患者において、高脂血症治療薬（ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤）又はＥＰＡを投与して、投与前（それぞれ図２中の△、□）及び投与後（それぞれ図２中の▲、■）の腸管膜動脈に関し、実施例１と同様にして、ＳＰＣに依る平滑筋異常収縮の張力の大きさと血清総コレステロール値の関係を図２に示した。
ＳＰＣに依る異常収縮の大きさは、図１と同様に、Ｋ＋１１８ｍＭを添加して測定した張力（１００％）に対する相対値として図２に示した。
また、高脂血症治療薬（ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤）又はＥＰＡを投与しない非治療群のＳＰＣに依る平滑筋異常収縮の張力と血清総コレステロール値との関係も、図２に示す。
【００４５】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤を用いた場合においては、血清総コレステロール値が高値から正常値に低下したにも拘わらず、ＳＰＣに依る異常収縮の張力が残る症例が認められた。
また、ＥＰＡは、血清総コレステロール値が高値から大きく低下しないにも拘わらず（２６０ｍｇ／ｄｌから２３０ｍｇ／ｄｌへ）、ＳＰＣに依る平滑筋異常収縮は、血清総コレステロール値が正常値の症例の場合と、ほぼ同等の張力まで低下した。
【００４６】
これらの結果は、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、ＳＰＣを測定することにより、平滑筋異常収縮が予想でき、医薬品の効果の個別評価、有効な医薬品を選定する評価の指標としてＳＰＣが利用できることを表すものである。
【００４７】
（実施例３）くも膜下出血患者のＳＰＣ濃度測定
くも膜下出血患者のＳＰＣを、以下のような手順で測定した。
（１）ＳＰＣ−ｄ ３ （ＳＰＣ 安定同位体標識体；化１）の合成
Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ｄｅ−ＳＭ）の合成Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ＳＭ：Ｓｉｇｍａ社製）０．４ｇをＤＭＳＯ２０ｍＬに溶解し、８０℃に加熱した。これにベンゼンチオールナトリウム塩のＤＭＳＯ溶液（０．４９ｇ／５ｍＬ）を窒素雰囲気下でシリンジにて滴下し，温度を８０℃に維持しながら加熱攪拌した。
【００４８】
１時間後、反応液を室温まで冷却し、これに水１００ｍＬおよび１Ｎ−塩酸を適量加えて、反応液をｐＨ２〜３程度になるように当該反応液を調整した。
この溶液をジクロロメタンにより抽出し、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾過して濾液を減圧濃縮した。
濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１９／１〜４／１）にて精製し、ｄｅ−ＳＭを薄ベージュ色の固体として、３００ｍｇ（収率；７５％）得た。
【００４９】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ−ｄ ３ （ＳＭ−ｄ ３ ）の合成
前記合成ｄｅ−ＳＭ２５０ｍｇをメタノール１８ｍＬに溶解し、これにシクロへキシルアミン３５．５ｍｇ加えて攪拌した。
攪拌して得られた溶液に、ヨウ化メチル−ｄ３（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２２０μＬをメタノール１０ｍＬに添加した溶液を室温にてシリンジ滴下した。室温にて１時間攪拌後、反応液にヨウ化メチル−ｄ３１１０μＬを追加し、攪拌を継続した。
【００５０】
２時間攪拌を保持し、その後減圧濃縮乾固した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１９／１〜９／１）にて精製し、ＳＭ−ｄ３を薄黄色固体として、２４０ｍｇ（収率９６％）得た。
【００５１】
Ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｄ ３ （ＳＰＣ−ｄ ３ ）の合成
前記で得られたＳＭ−ｄ３６５ｍｇを、１．５Ｎ−ＨＣｌ／ＭｅＯＨａｑ（塩酸１ｍＬをメタノール７ｍＬに添加して調製したもの）８ｍＬに溶解し、加熱還流した。３時間後、反応液を減圧濃縮してメタノールを留去した。
これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和した後、メタノール／クロロホルム混合液（容量比で１／２）により抽出を行った。
【００５２】
前記抽出により得られた水層に１Ｎ−ＮａＯＨを加え、ｐＨ１２〜１３に調整した後、再び上記メタノール／クロロホルム混合液で３回抽出して、得られた全ての有機層をあわせて、これを減圧濃縮した。
減圧濃縮により得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム〜クロロホルム／メタノール＝４／１）にて精製し、下記の化１で表されるＳＰＣ−ｄ３を白色固体として、１７．４ｍｇ（収率４５％）得た。
ただし、ＳＰＣ−ｄ３の安定同位元素標識体比のｄ３体とｄ０体の割合は、ｄ３体：ｄ０体が、９９．２：０．８であった。
【００５３】
【化１】
（２）ＳＰＣ測定装置および測定条件
ＳＰＣを測定するに際して用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）として、ＨＰ１１００システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製）を、またその分離カラムとして、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＨＧ−５（３５ｍｍ×２．０ｍｍｉ．ｄ．，野村化学製）を使用した。
【００５５】
また移動相として、溶離液Ａ：０．０１容量％のギ酸を含む５ｍＭのギ酸アンモニウム／メタノール／テトラヒドロフラン（５／２／３（ｖ／ｖ））と、溶離液Ｂ：０．０１容量％のギ酸を含む５ｍＭのギ酸アンモニウム／メタノール／テトラヒドロフラン（１／２／７（ｖ／ｖ））とを用いた。
【００５６】
溶離プログラムは、溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％の直線グラジエント（０−４分）、溶離液Ｂ１００％のｉｓｏｃｒａｔｉｃ（４−５分）、溶離液Ｂ１００％から溶離液Ａ１００％の直線グラジエント（５−５．１分）および溶離液Ａ１００％のｉｓｏｃｒａｔｉｃ（５．１−１１分）の順に行った。
ただし、これらの溶離液の流速を０．２ｍＬ／分とし、カラム温度を４０℃に保持した。
【００５７】
また、質量分析装置には、ターボイオンスプレーを装着した四重極質量分析計Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ３００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用い、ターボイオンスプレー法でのイオン化電圧、オリフィス電圧、フォーカシングリング電圧をそれぞれ３４００、２５、２２０Ｖとした。
測定には正イオンモードを使用し、ＭＲＭモード（モニタリングイオン：ＳＰＣｍ／ｚ ４６５．３（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ）−１８４．１（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ）、ＳＰＣ−ｄ３ ４６８．３−１８４．１）で測定を行った。
【００５８】
（３）検量線作成用検体調製
リン酸緩衝液１４０μＬに、ＳＰＣのメタノール溶液（１５０、７５、３０、１５、７．５、３および１．５ｎｇ／ｍＬ）１０μＬを加えて、最終濃度がそれぞれ１０、５、２、１、０．５、０．２および０．１ｎｇ／ｍＬになるように調製を行なった。
またブランク検体（０ｎｇ／ｍＬ）としては、ＳＰＣ溶液の代わりにメタノール１０μＬを加えて調製したものを使用した。
【００５９】
（４）検量線の作成
検量線は、得られたリン酸緩衝液中のＳＰＣ濃度をｘ、ＳＰＣのピーク面積（ＭＡ）と内標準物質のピーク面積（ＩＡ）との比（Ｉｎｔ．Ｒａｔｉｏ：Ｉｎｔ．Ｒａｔｉｏ＝ＭＡ／ＩＡ）をｙとし、このｙとｘとの関係を用いて、最小二乗法（重み １／ｙ）により、以下の検量線式を求めた。
ｙ＝ａｘ＋ｂ
但し、ｘ：ＳＰＣ濃度
ｙ：ピーク面積比
ａ：検量線の傾き
ｂ：ｙ軸切片
【００６０】
（５）固相抽出法およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる髄液中ＳＰＣ濃度の測定
髄液１ｍＬに、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍＬおよび内標準物質として５０ｎｇ／ｍＬ濃度のＳＰＣ−ｄ３（上記ＳＰＣ安定同位体標識体）のメタノール溶液１０μＬを加えた。
かかる溶液をボンドエルート Ｃｅｒｔｉｆｙ（ジーエルサイエンス製）を用いて、以下の手順に従い固相抽出処理を行った。
【００６１】
Ｃｅｒｔｉｆｙに、メタノール５ｍＬおよび１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬを順じ通液して、コンディショニングを行った。次いで、このように調製した溶液を、Ｃｅｒｔｉｆｙにロードし、これを１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬ、メタノール／１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）（１／１容量）の溶液５ｍＬ、およびメタノール３ｍＬで順次洗浄した。
【００６２】
前記洗浄後、１分間通風し、Ｃｅｒｔｉｆｙの担体を乾燥した後、１％濃度のアンモニア含有メタノール３ｍＬで溶出を実施して溶出液を得た。
得られた溶出液を窒素気流下（ＤＲＹ ＴＨＥＲＭＯ ＢＡＴＨ ＭＧ−２０００、ＥＹＥＬＡ製）で、濃縮乾固した。濃縮残渣をメタノール１００μＬに再溶解し、このうち２０μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供し、ＳＰＣ濃度の測定を行った。
なお全ての操作には、通常のシリコン処理を施した容器もしくは蛋白無吸着処理を施した容器（住友ベークライト株式会社製）を使用した。
【００６３】
くも膜下出血（ＳＡＨ）患者３例について、くも膜下出血発症後３〜４日および９日後の脳髄液中のＳＰＣ濃度を、上記方法により測定した。また、髄膜炎の疑いで髄液採取したが異常が認められなかった正常者の腰椎髄液についてもＳＰＣ濃度を、同様の方法により測定した。その結果を下記の表１に示す。
【００６４】
【表１】
表１より、くも膜下出血患者のいずれの髄液中においても、ＳＰＣ濃度が高いことが明らかとなる一方、正常者の腰椎髄液からはＳＰＣが検出されなかった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法は、血清総コレステロール値とは関係なくＳＰＣが平滑筋異常収縮に基づく疾患の優れたバイオマーカーであり、かかるＳＰＣを測定することにより、平滑筋異常収縮に基づく疾患の発症を高精度で判断でき、平滑筋異常収縮に基づく疾患の早期検出、予後予測、重篤度の測定、医学的治療に伴う平滑筋異常収縮の経過の評価を高精度で行うことができるとともに、平滑筋異常収縮に起因する疾患を予防するための医薬品や食品機能の確認若しくは医薬品や食品評価の指標等に有効に適用できることを可能とする、信頼性が高くかつ簡便な平滑筋異常収縮のスクリーニング方法である
【００６７】
また本発明スクリーニング方法は、血清総コレステロール値が高いヒトのみならず、血清総コレステロール値が正常のヒトに対しても、ＳＰＣがそれら疾患のリスクと成り得ることより、血清総コレステロール値の高低に拘わらず、それら疾患の兆候を発症していないヒトに対して、疾患の早期発見が可能となり、早期治療・予防が実現できる、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法である。
【００６８】
さらには、本発明のスクリーニング方法は、平滑筋の異常収縮の強度を把握し、患者毎の異常収縮の強度に適した医薬品の選択や治療効果を測定でき、従って患者毎の平滑筋異常収縮の強度に応じて、効果的な医薬品を選択し、効果をモニターすることができるテーラーメイド医療を提供することを可能とするものである。
【００６９】
更に診断キットは、本発明の平滑筋異常収縮のスクリーニング方法を簡便に適用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 （ａ）は、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力と血清総コレステロール値との関係、（ｂ）は、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力とＬＤＬコレステロール値との関係、（ｃ）は、ＳＰＣによる腸管膜動脈の平滑筋異常収縮の張力とＨＤＬコレステロール／血清総コレステロール値との関係、（ｄ）は、血清総コレステロール値と冠動脈疾患相対危険率との関係を示す線図。
【図２】 高止血症治療薬またはＥＰＡの投与前後及び非治療の際の、ＳＰＣによる平滑筋異常収縮の張力の大きさと血清総コレステロール値との関係の例示を示す線図。
Claims (2)
- 体組織または体液と内標準物質とを含む溶液を調製し、該溶液を、陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムを用いて固相抽出処理し、得られた溶出液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度を測定することを特徴とする、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法。
- 請求項１記載スクリーニング方法において、前記体組織または体液と内標準物質とを含む溶液は、体組織または体液と、内標準物質としての重水素化スフィンゴシルフォスフォリルコリンと、ｐＨ５の緩衝液及びメタノールからなる溶液であり、陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムを用いた前記固相抽出処理は、該陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラムに、メタノール及びｐＨ５の緩衝液を通液してコンディショニングを行い、体組織または体液と内標準物質とを含む前記溶液を、前記陽イオン交換相と無極性相を有するミックスモードカラム固相にロードし、次いで順次、ｐＨ５の緩衝液、１：１容量で混合したメタノール／ｐＨ５の緩衝液、メタノールで洗浄した後、乾燥させて、アンモニア含有メタノールで溶出する処理であり、溶出液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度の前記測定は、該溶出液を濃縮乾固して再溶解し、該溶解液中のスフィンゴシルフォスフォリルコリン濃度を測定するものであることを特徴とする、平滑筋異常収縮のスクリーニング方法。
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