JP4182219B2 - リン酸化糖の分析方法及び定量方法 - Google Patents
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Description
からなる前駆体が脂質キャリアー中間体の上に合成され、まず小胞体(ER)で糖タンパク質の特定の配列(Asn-X-SerまたはThr)に転移される。次にプロセシング(グルコース残基と特定のマンノース残基の切断)を受け、マンノース8残基とN-アセチルグルコサミン2残基からなるM8ハイマンノース型糖鎖(Man8GlcNAc2)が合成される。このハイマンノ
ース型糖鎖を含有するタンパク質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受けるが、このゴルジ体での修飾は酵母と哺乳類で大きく異なっている(Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987))。
6位に付加してMan-6-P-1-GlcNAcとなったのち、このGlcNAc部分だけが除去されて、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に変換される場合、3)コア糖鎖から5分子のManが順次除去されてMan3GlcNAc2 となり、これと相前後してGlcNAc、ガラクトース(Gal)、N-アセチルノイラ
ミン酸、別名シアル酸(NeuNAc)などが順次付加して、多様な混成型および複合型糖鎖が混合物として生成する場合の3通りである[R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem., Vol. 54, p.631-664 (1985)]。哺乳類型糖鎖と一口に言っても構造は多岐にわたりそれらの構造が糖タンパク質の機能に大きく関わっていることが解っている。
および糖外鎖部分にマンノース-1-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成することがわかっている。この修飾は、動物細胞と異なり、酵母では液胞(動物細胞のリソソームに相当するオルガネラ)局在性糖蛋白質のsorting signalとしては機能しないことが報告されている。従って、酵母におけるこのリン酸化糖鎖の生理機能は不明のままである[Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915 (1987)]。
ムに局在する酵素群の多くは、生合成されゴルジ体に輸送されると、そのハイマンノース型糖鎖の非還元末端のマンノース残基の6位にリン酸基が付加、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質
に変換され、これがリソソーム酵素特異的な認識マーカーとなる。そしてその高親和性受容体であるマンノース-6-リン酸受容体(MPR)との結合を介して、他のタンパク質から選
別され、エンドソームへ運ばれ、酸性条件下でMPRから解離した後、さらにリソソームへ
と輸送される(von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 54, 167-193 (1984) )。マンノース-6-リン酸受容体(M6PR)との結合にはマンノース-6-リン酸を1本の糖鎖内に1分子以上含むことが必要である。
送がマンノース-6-リン酸受容体を介した系であるので、酵素補填療法に用いるリソソー
ム酵素はマンノース-6-リン酸受容体(MPR)との結合に必要なリソソーム移行シグナルであるマンノース-6-リン酸を含む糖鎖をもっていることが必要である。よってこれらのリ
ソソーム酵素の糖鎖へのマンノース-6-リン酸の付加がキーとなる。
法、トランスジェニックウサギの乳から得る方法が報告されているが、1)リン酸が付加した糖鎖を有するリソソーム酵素の含有量が低いためリソソームへの取り込み効率が悪い、2)生産性が低く、培養コストが高い。このため1)大量投与が必要で、2)抗原性も懸念される、3)治療コストがかかるなどの問題点がある。よってマンノース-6-リン酸
を糖鎖に含むリソソームへの取り込み活性の高い酵素が求められている。一つの解決策として、このような酵素のマンノース-6-リン酸含量を増加させることが考えられる。本発
明者らは既に、酵母を利用して、酵素補充療法に利用可能なマンノース-6-リン酸含量を
増加させた酵素の製造法について開示している(特開2002−369692号公報;特許文献1)。
いられてきた。この方法は、糖タンパク質を加水分解して得られた単糖を強アルカリ条件下で陰イオン交換カラムに供し、その構造で分離し、パルスアンペロメトリ原理により検出する方法である。
いといった問題があった。また、強アルカリ性の溶媒については特に、取り扱いに危険性があった。
(1) リン酸化糖と蛍光標識物質とを含む溶液中で、当該リン酸化糖と当該蛍光標識物
質とを結合させる工程と、上記溶液中に含まれる、上記蛍光標識物質が結合した上記リン酸化糖を検出する工程とを含むリン酸化糖の分析方法。
、分析対象のリン酸化糖を準備することを特徴とする(1)記載のリン酸化糖の分析方法。
泳動によってリン酸化糖と他の糖鎖とを分離することを特徴とする(1)記載のリン酸化糖
の分析方法。
する蛍光量によって溶液に含まれるリン酸化糖を定量することを特徴とする(1)記載のリ
ン酸化糖の分析方法。
アミノピリジンであることを特徴とする(1)記載のリン酸化糖の分析方法。
本発明は、例えば、タンパク質に結合したリン酸化糖を分析する際に適用することができる。また、本発明は、糖タンパク質を主成分とする医薬組成物において、当該糖タンパク質に含まれるリン酸化糖を評価する際に適用することもできる。
チン型、O-GlcNAc型、GPIアンカー型、プロテオグリカン型等の糖鎖を含む意味である。
元アミノ化反応によって、切断された糖鎖に含まれるリン酸化糖に対して共有結合することができる。なお、詳細を後述するが、キャピラリー電気泳動法によって単糖分析する際には、負電荷を有する蛍光標識物質が分離能に優れるため、8-アミノピレン-1, 3, 6-ト
リスルフォネートを蛍光標識物質として用いることが好ましい。
で分離が可能である。分離後、HPLCを用いた場合にはシステムに蛍光検出器を接続させるか、カラムより溶出される分離液を一定量ずつ回収し、蛍光測定を行なうことにより分析することが可能である。また、キャピラリー電気泳動を用いた場合にもまた、システムに蛍光検出器を接続させることにより迅速な分析が可能となる。その他の電気泳動法の場合には、分離に用いた器材(ゲル、濾紙、薄層クロマトグラフィーなど)に励起光を当て、蛍光を検出することによって分析することができる。
酸系緩衝液のpHが9.0未満である場合には、陰イオン交換カラムによってリン酸化糖を分
離できない場合がある。
6-トリスルフォネート(以下、APTSと称する)による蛍光標識
Man-6-Pは市販品をシグマ社より購入した。またAPTSによる標識用試薬のキットはベッ
クマン・コールター(株)より購入した。
効長 20 cm)のキャピラリーを用い、泳動条件としては、泳動電圧25 kV、温度: 25℃と
し、検出を励起波長:488 nm、蛍光波長:520 nmで測定した。泳動緩衝液は120 mMホウ酸バッファー(pH 10.2)を用いた。キャピラリー電気泳動による分離の結果を図1におけ
る上段に示した。14分付近に単一ピークが検出されたことから、APTS-Man-6-Pをキャピラリー電気泳動で分離できることが予想された。
ファターゼ処理を下記の様に行なった。30 Uのアルカリホスファターゼを5 mM MgCl2、50
mM Tris-HCl (pH9.0)に溶かしたAPTS-Man-6-Pに加え、37 ℃で30 minインキュベートし
た。65 ℃で30 minインキュベートして酵素を失活させた後、0.22 μmのフィルターを通
し、ろ液を20倍希釈して上記条件で解析した。その結果、アルカリホスファターゼ反応後のピークは6.6分付近に溶出された(図1下段)。この溶出時間はAPTSで標識されたマン
ノース(APTS-Man)のものと一致するため、14分付近に見られたピークはAPTS-Man-6-Pであることが確認できた。
の方法で行なった。その結果、50 pmol〜10 nmolの範囲でピーク面積と濃度に相関係数の二乗r2=0.999で相関性が見られた(図2)。
実施例2で使用する糖鎖試料として、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ラムノース(Rha)、マンノース(Man)、グルコース(Glc)、フコー
ス(Fuc)、ガラクトース(Gal)及びマンノース-6-リン酸(Man-6-P)を、各0.8 nmolとなるように混合した溶液を調整した。本例では、糖鎖試料を用いて実施例1に示した方法と同様にしてAPTSで標識を行ない、実施例1に示した方法と同様にして検出を行った。
ー電気泳動法でAPTS-Man-6-Pを、他の中性糖及びアミノ糖との溶出時間の差に基づいて分析することが可能であることを証明した。
本実施例では、リン酸化糖を他の糖鎖とを陰イオン交換カラムを用いて分離する際の条件を検討した。マンノース-6-リン酸は市販品をシグマ社より購入した。また2-アミノピ
リジン(以下、PAと称する)による標識用試薬のキットはTaKaRa-Bioより購入した。
トルエン50μLを加えて窒素ガス存在下で50 ℃、10 min乾燥させた。これを適当量の蒸留水に再溶解してカラムでの分析を行なった。
の溶媒を用い、0.3 mL/minの流速で分離を試みた。しかしMan-6-P-PAは1分前後の素通り
画分に溶出され、この条件では定量性を議論することが困難であると結論付けた。
TypeA (TaKaRa)、またはTSK-GEL SUGAR AXI (TOSOH; 4.6 mmφ×250 mm)を使って行なった。Man-PAは約70分で溶出されたが、Man-6-P-PAはこの条件では溶出されなかった。
すら溶出されなかった。1 Mホウ酸バッファー(pH 8.5)/アセトニトリル=9:1の溶媒を
用いた際には、Man-PAは53分の溶出時間であったが、やはりMan-6-P-PAは溶出されなかった。
そこでさらにpHを9.0としたところ、40分で溶出され、Man-6-P-PAの陰イオン交換カラム
での分離が可能となった(図4)。
性糖及びアミノ糖との同時分析
実施例4で使用する糖鎖試料として、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、マンノース(Man)、フコース(Fuc)、ガラクトース(Gal)及びマン
ノース-6-リン酸(Man-6-P)を、各10 nmolとなるように混合した溶液を調整した。次に、
調整した糖鎖試料をガラス製チューブ(TaKaRa-Bio社PAL-Station用)に減圧乾固後、実
施例3の方法と同様に蛍光標識を行なった。
分を 0.05 M KClを含んだ0.7 Mホウ酸バッファー(pH9.0)で分離した。
は、実施例1と同様に、これを分取してアルカリホスファターゼと反応させた後、再度同条件で泳動したところ、PA-Manの位置に溶出されたことからPA-Man-6-Pであることが証明された。以上の結果から、Man-6-Pを他の中性糖及びアミノ糖と同時に蛍光標識すること
ができ、且つ、陰イオン交換カラムでAPTS-Man-6-Pを、他の中性糖及びアミノ糖との溶出時間の差に基づいて分析することが可能であることを証明した。
は1 nmolとし、2-アミノピリジンで標識化を行なった。その結果を図6に示す。図6から分かるように、Man-6-Pの濃度を初期単糖量が0.1〜1 nmolの範囲でピーク面積と濃度に相関性が見られた。この結果から、蛍光標識物質で標識したリン酸化糖を陰イオン交換カラムによって分離するとともに定量できることが確認された。
Claims (6)
- リン酸化糖、リン酸化糖を除く他の中性糖及びアミノ糖を含む混合物と蛍光標識物質とを含む溶液中で、当該リン酸化糖、当該他の中性糖及びアミノ糖と当該蛍光標識物質とを結合させる工程と、
上記溶液中に含まれる、上記蛍光標識物質が結合した上記リン酸化糖を、上記蛍光標識物質が結合した上記他の中性糖及び上記アミノ糖から分離して検出する工程と
を含むリン酸化糖の分析方法。 - 糖タンパク質に結合している糖鎖を化学的或いは酵素的に切断し、得られた糖鎖に含まれるリン酸化糖を分析対象とすることを特徴とする請求項1記載のリン酸化糖の分析方法。
- 上記リン酸化糖を検出する工程では、陰イオン交換カラム又はキャピラリー電気泳動によって上記リン酸化糖と、上記他の中性糖及びアミノ糖とを分離することを特徴とする請求項1記載のリン酸化糖の分析方法。
- 上記リン酸化糖を検出する工程では、リン酸化糖に結合した蛍光標識物質に由来する蛍光量によって溶液に含まれるリン酸化糖を定量することを特徴とする請求項1記載のリン酸化糖の分析方法。
- 上記蛍光標識物質は、8-アミノピレン-1, 3, 6-トリスルフォネート及び/又は2-アミノピリジンであることを特徴とする請求項1記載のリン酸化糖の分析方法。
- 上記リン酸化糖を検出する工程では、0.1M以上の塩濃度でpH9.0以上のホウ酸系緩衝液
を使用することを特徴とする請求項1記載のリン酸化糖の分析方法。
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