JP4177662B2 - バイオセンサ - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、試料中に含まれる基質を迅速、かつ高精度に定量するためのバイオセンサに関する。
【０００２】
背景技術
スクロース、グルコースなど糖類の定量分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されている。しかし、これらの方法は、いずれも糖類に対する特異性があまり高くないので、精度が悪い。これらの方法のうち施光度計法によれば、操作は簡便ではあるが、操作時の温度の影響を大きく受ける。従って、施光度計法は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方法としては適切でない。
近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発されている。
【０００３】
以下に、試料中の基質の定量法の一例として、グルコースの定量法について説明する。
電気化学的なグルコースの定量法としては、酵素であるグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）と酸素電極あるいは過酸化水素電極とを使用する方法が一般に知られている（例えば、鈴木周一編「バイオセンサー」講談社）。
【０００４】
ＧＯＤは、酸素を電子伝達体として、基質であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。酸素の存在下で、ＧＯＤによる酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元される。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測するか、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加量を計測する。酸素の減少量および過酸化水素の増加量は、試料中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースを定量することができる。
【０００５】
上記方法では、酵素反応の特異性を利用することにより、精度良く試料中のグルコースを定量することができる。しかし、反応過程からも推測できるように、測定結果は試料に含まれる酸素濃度の影響を大きく受ける欠点があり、試料に酸素が存在しない場合は測定が不可能となる。
【０００６】
そこで、酸素を電子伝達体として用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用いる新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝達体の還元体を作用極上で酸化することにより、その酸化電流量から試料中に含まれるグルコース濃度が求められる。この際、対極上では、電子伝達体の酸化体が還元され、電子伝達体の還元体の生成する反応が進行する。このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わりに電子伝達体として用いることにより、既知量のＧＯＤとそれらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担持させて試薬層を形成することが可能となり、試料中の酸素濃度の影響を受けることなく、精度良くグルコースを定量することができる。また、酵素および電子伝達体を含有する試薬層を、乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させることもできるので、この技術に基づいた使い捨て型のグルコースセンサが近年多くの注目を集めている。その代表的な例が、特許第２５１７１５３号公報に示されるバイオセンサである。使い捨て型のグルコースセンサにおいては、測定器に着脱可能に接続されたセンサに、試料を導入するだけで、容易にグルコース濃度を測定器で測定することができる。
【０００７】
上記の様なグルコースセンサを用いた測定では、数μｌオーダーの試料量で試料中の基質濃度を容易に求めることが可能である。しかしながら、近年、１μｌ以下程度とさらに微量な試料での測定が可能なバイオセンサの開発が各方面において切望されている。従来の電気化学グルコースセンサでは、殆どの場合、一平面上に電極系が配置されている。そのため、試料が極微量の場合は、電極間の電荷移動、主にイオンの移動に対する抵抗が大きくなることにより、測定結果にバラツキが生じる場合があった。
【０００８】
そこで、作用極と対極が相互に対向する位置に配置されたバイオセンサが提案されている（特開平１１−３５２０９３号公報）。このタイプのセンサでは、作用極と対極が相互に対向する位置に配置されたことにより、作用極−対極間のイオン移動が円滑になる等の理由により、従来の一平面上に電極系が配置されたバイオセンサよりも、高精度、かつ高感度で、試料中に含まれるグルコース等の基質を定量することができる。
【０００９】
近年、測定に必要なサンプル量のさらなる微量化が求められていることから、さらに微量のサンプルにおいても測定可能となるように、バイオセンサのさらなる高感度化が切望されている。
本発明は、上記課題に鑑み、測定に必要なサンプル量が少なく、かつ高感度のバイオセンサを提供することを目的とする。
【００１０】
発明の開示
本発明のバイオセンサは、作用極を有する第１の絶縁性基板、前記作用極と対向させた対極を有する第２の絶縁性基板、少なくとも酸化還元酵素を含む試薬層、並びに第１および第２の絶縁性基板の間に形成された試料供給路を具備し、前記試料供給路内に前記作用極、対極および試薬層が露出し、かつ前記作用極と前記対極との距離が１５０μｍ以下であることを特徴とする。
【００１１】
ここで、対極の試料供給路に露出している部分の面積は、作用極の試料供給路に露出している部分の面積と同じかそれ以下であり、かつ前記作用極の直上に前記対極が位置することが好ましい。
作用極は、試料供給路に露出している部分の面積Ｓ1が０．０１〜２０ｍｍ2、より好ましくは０．１〜２．０ｍｍ2、対極の試料供給路に露出している部分の面積Ｓ2が０．００５〜２０ｍｍ2、より好ましくは０．０５〜２．０ｍｍ2であり、Ｓ2≦Ｓ1であることが好ましい。
ここで、第１および第２の基板の間にスペーサ部材を挟んだ構成が好ましい。
【００１２】
発明を実施するための最良の形態
上記のように、本発明のバイオセンサは、作用極を有する第１の絶縁性基板、前記作用極と対向させた対極を有する第２の絶縁性基板、少なくとも酸化還元酵素を含む試薬層、並びに第１および第２の絶縁性基板の間に形成された試料供給路を具備し、前記試料供給路内に前記作用極、対極および試薬層が露出し、かつ前記作用極と前記対極との距離が１５０μｍ以下である。作用極と対極との距離は、４０〜１５０μｍが好ましく、より好ましくは４０〜１００μｍである。
【００１３】
本発明によるバイオセンサは、前記試料供給路内に毛管作用により収容される試料液量は、１０ｎｌ〜５μｌであるのが好ましく、より好ましくは５０ｎｌ〜５００ｎｌである。
このようにすると、作用極と対極間の電荷移動が容易になるとともに、作用極上における酸化還元種の拡散層の広がりを抑制し、拡散層での酸化還元種の濃度勾配が高い状態で維持されることにより、センサ応答が増加する。
【００１４】
ここで、対極の試料供給路に露出している部分の面積Ｓ2が、作用極の試料供給路に露出している部分の面積Ｓ1と同じかそれ以下であり、かつ対極が作用極の直上に位置することが好ましい。ここで、対極が作用極の直上に位置するとは、作用極の垂直方向から見て、対極の全部が作用極に重なるように形成されていることを意味する。
【００１５】
一般に電気化学分野の測定系では、対極における反応が律速とならないように、対極の面積を作用極の面積よりも大きくする。しかし、本発明のバイオセンサでは、対極と作用極とが対向した位置に配置されているので、対極の面積を作用極の面積と同じかそれ以下にすると、対極の面積が作用極の面積よりも大きい場合と比較して、対極上の電流密度がより高くなる等の理由により、対極近傍における酸化還元種の濃度が高くなると考えられる。センサ応答は、対極近傍における酸化還元種の濃度に依存するため、結果として、基質を高感度に定量することが可能となる。また、対極の面積の減少に伴い、試料供給路の容積を低減することができるので、サンプル量の削減が可能となる。対極の面積は、作用極の面積よりも小さいことが好ましい。このようにすると、上記の効果がより顕著になる。
【００１６】
作用極が第１の絶縁性基板上に形成され、対極が第２の絶縁性基板上に形成されていることが好ましい。このようにすると、バイオセンサの製造工程が容易になる。
ここで、第１の基板と第２の基板とが、スペーサ部材を挟む構造であることが好ましい。このようにすると、基板への物理的圧力に対しての強度が増加するので、作用極と対極との接触による短絡を防止することができるとともに、電流応答への物理的圧力の影響を低減することができる。
【００１７】
本発明の第１および第２の基板としては、電気絶縁性を有し、保存および測定時に充分な剛性を有する材料であれば用いることができる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、飽和ポリエステル樹脂等の熱可塑性樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂があげられる。中でも、電極との密着性の点から、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。
【００１８】
スペーサ部材としては、電気絶縁性を有し、保存および測定時に充分な剛性を有する材料であれば用いることができる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、飽和ポリエステル樹脂等の熱可塑性樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂があげられる。
【００１９】
作用極としては、電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれば用いることができる。対極としては、パラジウム、金、白金、カーボン等の一般的に用いられる導電性材料であれば用いることができる。
【００２０】
酸化還元酵素としては、試料中に含まれる測定対象の基質に対応したものが用いられる。例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等があげられる。
【００２１】
本発明のバイオセンサは、試薬層に電子伝達体を含むことが好ましい。電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体等があげられる。また、酸素を電子伝達体とした場合にも電流応答が得られる。電子伝達体は、これらの一種または二種以上が使用される。
【００２２】
本発明のバイオセンサは、試薬層に親水性高分子を含むことが好ましい。親水性高分子としては、種々のものを用いることができる。例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその塩、ポリメタアクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸またはその塩の重合体があげられる。中でも、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して詳しく説明する。構造を表す図面においては、各要素の相対的な位置やサイズは必ずしも正確ではない。
【００２３】
実施の形態１
バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて説明する。
図１および図２を用いて、本実施の形態を説明する。図１は本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図であり、図２はその縦断面図である。
【００２４】
１１はポリエチレンテレフタレートからなる第１の電気絶縁性の基板を表す。この基板１１上には、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、作用極リード１２および電極の下地が形成され、ついで、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを電極の下地上に印刷して作用極１４が形成されている。この作用極１４は、作用極リード１２と接触している。基板１１上には、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層１６が形成されている。絶縁層１６は、作用極１４の外周部を覆っており、これにより作用極１４の露出部分の面積を一定に保っている。
【００２５】
次に、第２の電気絶縁性の基板２１の裏面に、銀ペーストを印刷して対極リード２３および電極の下地を形成し、次いで導電性カーボンペーストを前記電極の下地上に印刷して対極２５を形成し、さらに対極２５の露出部分の面積が作用極１４の露出部分の面積よりも大きくなるように、絶縁性ペーストを印刷して、絶縁層２７が形成されている。基板２１には、空気孔２９が形成されている。
【００２６】
酵素であるＧＯＤおよび電子伝達体のフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を基板１１の作用極１４上に滴下した後、乾燥して試薬層１０が形成される。さらに、試薬層１０上に、界面活性剤であるレシチンを含有する界面活性剤層２０が形成されている。
最後に、基板１１、基板２１、およびスペーサ部材１７を、図１中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着することにより、図２のようなグルコースセンサが組み立てられる。
【００２７】
基板１１と基板２１との間に挟み込むスペーサ部材１７は、スリット１８を有しており、このスリット１８は基板１１と２１との間に、試料供給路となる空間部を形成する。このスペーサ部材１７の厚みを、変化させることにより、試料供給路の高さ、すなわち作用極１４と対極２５との距離を変えることができる。
基板２１の空気孔２９は、前記の試料供給路に連通しているので、スリット１８の解放端に形成される試料供給口１９に試料を接触させれば、毛管現象により試料は容易に試料供給路内にある試薬層１０に達する。
【００２８】
実施の形態２
図３は、本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた斜視図である。本実施の形態では、対極２５ａを作用極１４と同様に四角形とし、その面積を作用極のそれと等しくした。その他は、実施の形態１と同様である。
【００２９】
実施の形態３
図４は、本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた斜視図であり、図５はその縦断面図である。
このグルコースセンサは、以下のような手順で作製される。
【００３０】
まず、両側に立ち上がり片３７、３７を有する電気絶縁性の基板３１上に、パラジウムをスパッタリングして、作用極３４およびそのリード３２を形成する。次に、基板３１上に絶縁性部材３６を貼付することにより、作用極３４および測定器に挿入するリード３２の端子部を規定する。一方、第２の電気絶縁性基板４１の内面に、同じくパラジウムをスパッタリングして対極４５、および対極リード４３を作製する。次に、基板４１の内面に絶縁性部材４７を貼付することにより、対極４５および測定器に挿入するリード４３の端子部を規定する。
【００３１】
次いで、基板３１に第２の基板を接合する。この時、作用極３４と対極４５は、基板３１と基板４１との間に形成される空間部を介して対向する位置に配置される。作用極と対極間の距離は、例えば１００μｍとする。試薬層３０および界面活性剤層４０は、実施の形態１と同様にして、電極３４を覆うように形成される。このようにして作製されるセンサは、電極３４および４５に近い方の端面が試料供給口３９となる。ここから供給される試料は、空気孔４９に連なる空間部の毛管作用により電極部に達する。
【００３２】
実施の形態４
図６は本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた斜視図であり、図７はその縦断面図である。
このグルコースセンサは、以下の手順で作製される。
【００３３】
電気絶縁性の第１の基板５１上に、パラジウムをスパッタリングして、作用極５４およびそのリード５２を形成する。次に、基板５１上に、絶縁性部材５６を貼付することにより、作用極５４、および測定器に挿入するリード５２の端子部を規定する。一方、外側に膨出した曲面部６８を有する第２の電気絶縁性基板６１の曲面部６８の内壁面に、パラジウムをスパッタリングして対極６５およびそのリード６３を形成する。曲面部６８の曲率を調節することにより、作用極５４と対極６５との距離を制御することができる。
【００３４】
次に、基板６１の内壁面に、絶縁性部材６７を貼付することにより、対極６５、および測定器に挿入する端子部を規定する。この時、対極６５の面積が作用極５４の面積と等しくなるようにする。対極６５の端子部は、基板６１の後端６１ａの裏面に露出している。曲面部６８の端部には、空気孔６９を有する。作用極５４上に試薬層５０を形成し、さらにこれを覆うように界面活性剤層６０を形成する。最後に、基板５１と基板６１を貼り合わせて、グルコースセンサを組み立てる。
【００３５】
実施例１
実施の形態１において、スペーサ部材１７の厚みを変えることにより、試料供給路の高さの異なる５種のセンサを作製した。作用極の面積は１．０ｍｍ2である。対極は、直径約３．６ｍｍの円形であるが、その直径がスペーサ部材１７のスリット１８の幅より大きいので、一部は試料供給路に露出しない。対極の試料供給路に露出する部分の面積は約５．３ｍｍ2である。
【００３６】
比較例として、同一基板上に作用極と対極を有するグルコースセンサを作製した。実施例１と同様に、試料供給路の高さの異なる５種のグルコースセンサを作製した。図８は比較例のセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図であり、図９はその縦断面図である。
【００３７】
ポリエチレンテレフタレートからなる電気絶縁性基板１０１上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、作用極リード１０２および対極リード１０３を形成し、次いで、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷して作用極１０４を形成した。この作用極１０４は、作用極リード１０２と接触している。さらに、この基板１０１上に、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層１０６を形成した。絶縁層１０６は、作用極１０４の外周部を覆っており、これにより作用極１０４の露出部分の面積を一定に保っている。次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを、対極リード１０３と接触するように基板１０１上に印刷して対極１０５を形成した。作用極１０４の面積は１．０ｍｍ2、対極１０５の試料供給路に露出する部分の面積は約４．３ｍｍ2である。
【００３８】
酵素のＧＯＤおよび電子伝達体のフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を作用極１０４および対極１０５上に滴下した後乾燥して試薬層１０７を形成し、その試薬層１０７上に、界面活性剤であるレシチンを含有する界面活性剤層１０９を形成した。これらの基板１０１、空気孔１１４を備えたカバー１１２、およびスリット１１１を有するスペーサ部材１１０を図８中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着した。
【００３９】
以上の実施例１および比較例のセンサを用いて、一定量のグルコースを含む水溶液のグルコース濃度の測定を行った。試料を試料供給口から試料供給路に供給し、一定時間経過後に、対極を基準にして作用極に５００ｍＶの電圧を印加した。この電圧印加により、作用極と対極との間に流れる電流値を測定したところ、試料中のグルコース濃度に比例した電流応答が観察された。
【００４０】
グルコースを１８０ｍｇ／ｄｌ含む溶液について、試料供給路の高さが異なる各グルコースセンサにより応答電流値を測定した。図１０は、実施例１のセンサによる試料供給路の高さと応答値（比）との関係を示したものである。応答値（比）は、試料供給路の高さの等しい比較例のセンサによる応答値を１００とした比で示している。
【００４１】
図１０からわかるように、試料供給路の高さを１５０μｍ以下にすると、実施例１の比較例に対する応答値（比）が急激に増加している。これは、作用極と対極が相互に対向し、作用極−対極間の距離が１５０μｍ以下であると、作用極での酸化還元種の拡散層の成長が抑制され、対極上の酸化還元種の濃度がセンサ応答に反映すること、および作用極−対極間の電荷移動等が良好となることによるものであると考えられる。
【００４２】
また、実施例１においては、測定に必要なサンプル量が約０．５〜３．０μｌであった。このように本発明によると、作用極−対極間の距離が限定されるため、測定に必要なサンプル量を削減することが可能となった。
【００４３】
実施例２
実施の形態２において、作用極および対極の面積をいずれも１．０ｍｍ2とした他は、実施例１と同様の方法にてバイオセンサを作製した。そして、グルコースを９０ｍｇ／ｄｌ含む溶液について、試料供給路の高さが異なる各グルコースセンサにより応答電流値を測定した。図１１は、実施例２のセンサによる試料供給路の高さ、すなわち作用極−対極間距離と応答値（比）との関係を示したものである。応答値（比）は、試料供給路の高さの等しい実施例１のセンサによる応答値を１００とした比で示している。
【００４４】
図１１からわかるように、試料供給路の高さを１５０μｍ以下にすると、実施例２のセンサの実施例１に対する応答値（比）が急激に増加している。これは、作用極と対極が相互に対向し、作用極−対極間の距離が１５０μｍ以下であると、作用極での酸化還元種の拡散層の成長が抑制され、対極上の酸化還元種の濃度がセンサ応答に反映すること、および作用極−対極間の電荷移動等が良好となることによるものであると考えられる。
【００４５】
一般の電気化学においては、対極における反応が律速になることを防ぐために、対極の面積は作用極の面積よりも大きくする。しかし、この系では、作用極と対極を対向に配置するため、対極上の電流密度が電流応答に反映される等の理由により、対極の面積が作用極の面積より大きい場合に比べて、高い応答電流が得られたと考えられる。
【００４６】
本実施例では、対極の面積が作用極と同等であるために、実施例１よりも空気孔２９の位置を試料供給口側に近づけている。したがって、測定に必要なサンプル量をさらに削減することが可能となる。
【００４７】
実施例３
本実施例では、対極面積を０．６４ｍｍ2とした他は、実施例２と同様にしてバイオセンサを作製した。そして、グルコースを９０ｍｇ／ｄｌ含む溶液について、試料供給路の高さが異なる各グルコースセンサにより応答電流値を測定した。図１２は、実施例３のセンサによる試料供給路の高さ（作用極−対極間距離）と応答値（比）との関係を示したものである。応答値（比）は、試料供給路の高さの等しい実施例１のセンサによる応答値を１００とした比で示している。
【００４８】
図１２からわかるように、作用極−対極間距離を１５０μｍ以下にすると、本実施例の実施例１に対する応答値（比）が急激に増加している。これは、実施例２で説明したものと同様の理由によるものと考えられる。
本実施例では、対極の面積が作用極よりも小さいために、実施例２よりも空気孔の位置を試料供給口側に近づけることができる。したがって、測定に必要なサンプル量を実施例２よりもさらに削減することが可能となる。
【００４９】
産業上の利用の可能性
以上のように本発明によれば、測定に必要なサンプル量が少なく、かつ高感度のバイオセンサを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図２】同グルコースセンサの縦断面図である。
【図３】 本発明の他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図４】 本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図５】 同グルコースセンサの縦断面図である。
【図６】 本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図７】 同グルコースセンサの縦断面図である。
【図８】 比較例のグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図９】 同グルコースセンサの縦断面図である。
【図１０】 本発明の実施例１のグルコースセンサの試料供給路高さと応答電流値（比）との関係を示すグラフである。
【図１１】 本発明の実施例２のグルコースセンサの作用極−対極間距離と応答電流値（比）との関係を示すグラフである。
【図１２】 本発明の実施例３のグルコースセンサの作用極−対極間距離と応答電流値（比）との関係を示すグラフである。
技術分野
本発明は、試料中に含まれる基質を迅速、かつ高精度に定量するためのバイオセンサに関する。
【０００２】
背景技術
スクロース、グルコースなど糖類の定量分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されている。しかし、これらの方法は、いずれも糖類に対する特異性があまり高くないので、精度が悪い。これらの方法のうち施光度計法によれば、操作は簡便ではあるが、操作時の温度の影響を大きく受ける。従って、施光度計法は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方法としては適切でない。
近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発されている。
【０００３】
以下に、試料中の基質の定量法の一例として、グルコースの定量法について説明する。
電気化学的なグルコースの定量法としては、酵素であるグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）と酸素電極あるいは過酸化水素電極とを使用する方法が一般に知られている（例えば、鈴木周一編「バイオセンサー」講談社）。
【０００４】
ＧＯＤは、酸素を電子伝達体として、基質であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。酸素の存在下で、ＧＯＤによる酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元される。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測するか、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加量を計測する。酸素の減少量および過酸化水素の増加量は、試料中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースを定量することができる。
【０００５】
上記方法では、酵素反応の特異性を利用することにより、精度良く試料中のグルコースを定量することができる。しかし、反応過程からも推測できるように、測定結果は試料に含まれる酸素濃度の影響を大きく受ける欠点があり、試料に酸素が存在しない場合は測定が不可能となる。
【０００６】
そこで、酸素を電子伝達体として用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用いる新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝達体の還元体を作用極上で酸化することにより、その酸化電流量から試料中に含まれるグルコース濃度が求められる。この際、対極上では、電子伝達体の酸化体が還元され、電子伝達体の還元体の生成する反応が進行する。このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わりに電子伝達体として用いることにより、既知量のＧＯＤとそれらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担持させて試薬層を形成することが可能となり、試料中の酸素濃度の影響を受けることなく、精度良くグルコースを定量することができる。また、酵素および電子伝達体を含有する試薬層を、乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させることもできるので、この技術に基づいた使い捨て型のグルコースセンサが近年多くの注目を集めている。その代表的な例が、特許第２５１７１５３号公報に示されるバイオセンサである。使い捨て型のグルコースセンサにおいては、測定器に着脱可能に接続されたセンサに、試料を導入するだけで、容易にグルコース濃度を測定器で測定することができる。
【０００７】
上記の様なグルコースセンサを用いた測定では、数μｌオーダーの試料量で試料中の基質濃度を容易に求めることが可能である。しかしながら、近年、１μｌ以下程度とさらに微量な試料での測定が可能なバイオセンサの開発が各方面において切望されている。従来の電気化学グルコースセンサでは、殆どの場合、一平面上に電極系が配置されている。そのため、試料が極微量の場合は、電極間の電荷移動、主にイオンの移動に対する抵抗が大きくなることにより、測定結果にバラツキが生じる場合があった。
【０００８】
そこで、作用極と対極が相互に対向する位置に配置されたバイオセンサが提案されている（特開平１１−３５２０９３号公報）。このタイプのセンサでは、作用極と対極が相互に対向する位置に配置されたことにより、作用極−対極間のイオン移動が円滑になる等の理由により、従来の一平面上に電極系が配置されたバイオセンサよりも、高精度、かつ高感度で、試料中に含まれるグルコース等の基質を定量することができる。
【０００９】
近年、測定に必要なサンプル量のさらなる微量化が求められていることから、さらに微量のサンプルにおいても測定可能となるように、バイオセンサのさらなる高感度化が切望されている。
本発明は、上記課題に鑑み、測定に必要なサンプル量が少なく、かつ高感度のバイオセンサを提供することを目的とする。
【００１０】
発明の開示
本発明のバイオセンサは、作用極を有する第１の絶縁性基板、前記作用極と対向させた対極を有する第２の絶縁性基板、少なくとも酸化還元酵素を含む試薬層、並びに第１および第２の絶縁性基板の間に形成された試料供給路を具備し、前記試料供給路内に前記作用極、対極および試薬層が露出し、かつ前記作用極と前記対極との距離が１５０μｍ以下であることを特徴とする。
【００１１】
ここで、対極の試料供給路に露出している部分の面積は、作用極の試料供給路に露出している部分の面積と同じかそれ以下であり、かつ前記作用極の直上に前記対極が位置することが好ましい。
作用極は、試料供給路に露出している部分の面積Ｓ1が０．０１〜２０ｍｍ2、より好ましくは０．１〜２．０ｍｍ2、対極の試料供給路に露出している部分の面積Ｓ2が０．００５〜２０ｍｍ2、より好ましくは０．０５〜２．０ｍｍ2であり、Ｓ2≦Ｓ1であることが好ましい。
ここで、第１および第２の基板の間にスペーサ部材を挟んだ構成が好ましい。
【００１２】
発明を実施するための最良の形態
上記のように、本発明のバイオセンサは、作用極を有する第１の絶縁性基板、前記作用極と対向させた対極を有する第２の絶縁性基板、少なくとも酸化還元酵素を含む試薬層、並びに第１および第２の絶縁性基板の間に形成された試料供給路を具備し、前記試料供給路内に前記作用極、対極および試薬層が露出し、かつ前記作用極と前記対極との距離が１５０μｍ以下である。作用極と対極との距離は、４０〜１５０μｍが好ましく、より好ましくは４０〜１００μｍである。
【００１３】
本発明によるバイオセンサは、前記試料供給路内に毛管作用により収容される試料液量は、１０ｎｌ〜５μｌであるのが好ましく、より好ましくは５０ｎｌ〜５００ｎｌである。
このようにすると、作用極と対極間の電荷移動が容易になるとともに、作用極上における酸化還元種の拡散層の広がりを抑制し、拡散層での酸化還元種の濃度勾配が高い状態で維持されることにより、センサ応答が増加する。
【００１４】
ここで、対極の試料供給路に露出している部分の面積Ｓ2が、作用極の試料供給路に露出している部分の面積Ｓ1と同じかそれ以下であり、かつ対極が作用極の直上に位置することが好ましい。ここで、対極が作用極の直上に位置するとは、作用極の垂直方向から見て、対極の全部が作用極に重なるように形成されていることを意味する。
【００１５】
一般に電気化学分野の測定系では、対極における反応が律速とならないように、対極の面積を作用極の面積よりも大きくする。しかし、本発明のバイオセンサでは、対極と作用極とが対向した位置に配置されているので、対極の面積を作用極の面積と同じかそれ以下にすると、対極の面積が作用極の面積よりも大きい場合と比較して、対極上の電流密度がより高くなる等の理由により、対極近傍における酸化還元種の濃度が高くなると考えられる。センサ応答は、対極近傍における酸化還元種の濃度に依存するため、結果として、基質を高感度に定量することが可能となる。また、対極の面積の減少に伴い、試料供給路の容積を低減することができるので、サンプル量の削減が可能となる。対極の面積は、作用極の面積よりも小さいことが好ましい。このようにすると、上記の効果がより顕著になる。
【００１６】
作用極が第１の絶縁性基板上に形成され、対極が第２の絶縁性基板上に形成されていることが好ましい。このようにすると、バイオセンサの製造工程が容易になる。
ここで、第１の基板と第２の基板とが、スペーサ部材を挟む構造であることが好ましい。このようにすると、基板への物理的圧力に対しての強度が増加するので、作用極と対極との接触による短絡を防止することができるとともに、電流応答への物理的圧力の影響を低減することができる。
【００１７】
本発明の第１および第２の基板としては、電気絶縁性を有し、保存および測定時に充分な剛性を有する材料であれば用いることができる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、飽和ポリエステル樹脂等の熱可塑性樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂があげられる。中でも、電極との密着性の点から、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。
【００１８】
スペーサ部材としては、電気絶縁性を有し、保存および測定時に充分な剛性を有する材料であれば用いることができる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、飽和ポリエステル樹脂等の熱可塑性樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂があげられる。
【００１９】
作用極としては、電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれば用いることができる。対極としては、パラジウム、金、白金、カーボン等の一般的に用いられる導電性材料であれば用いることができる。
【００２０】
酸化還元酵素としては、試料中に含まれる測定対象の基質に対応したものが用いられる。例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等があげられる。
【００２１】
本発明のバイオセンサは、試薬層に電子伝達体を含むことが好ましい。電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体等があげられる。また、酸素を電子伝達体とした場合にも電流応答が得られる。電子伝達体は、これらの一種または二種以上が使用される。
【００２２】
本発明のバイオセンサは、試薬層に親水性高分子を含むことが好ましい。親水性高分子としては、種々のものを用いることができる。例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその塩、ポリメタアクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸またはその塩の重合体があげられる。中でも、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して詳しく説明する。構造を表す図面においては、各要素の相対的な位置やサイズは必ずしも正確ではない。
【００２３】
実施の形態１
バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて説明する。
図１および図２を用いて、本実施の形態を説明する。図１は本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図であり、図２はその縦断面図である。
【００２４】
１１はポリエチレンテレフタレートからなる第１の電気絶縁性の基板を表す。この基板１１上には、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、作用極リード１２および電極の下地が形成され、ついで、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを電極の下地上に印刷して作用極１４が形成されている。この作用極１４は、作用極リード１２と接触している。基板１１上には、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層１６が形成されている。絶縁層１６は、作用極１４の外周部を覆っており、これにより作用極１４の露出部分の面積を一定に保っている。
【００２５】
次に、第２の電気絶縁性の基板２１の裏面に、銀ペーストを印刷して対極リード２３および電極の下地を形成し、次いで導電性カーボンペーストを前記電極の下地上に印刷して対極２５を形成し、さらに対極２５の露出部分の面積が作用極１４の露出部分の面積よりも大きくなるように、絶縁性ペーストを印刷して、絶縁層２７が形成されている。基板２１には、空気孔２９が形成されている。
【００２６】
酵素であるＧＯＤおよび電子伝達体のフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を基板１１の作用極１４上に滴下した後、乾燥して試薬層１０が形成される。さらに、試薬層１０上に、界面活性剤であるレシチンを含有する界面活性剤層２０が形成されている。
最後に、基板１１、基板２１、およびスペーサ部材１７を、図１中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着することにより、図２のようなグルコースセンサが組み立てられる。
【００２７】
基板１１と基板２１との間に挟み込むスペーサ部材１７は、スリット１８を有しており、このスリット１８は基板１１と２１との間に、試料供給路となる空間部を形成する。このスペーサ部材１７の厚みを、変化させることにより、試料供給路の高さ、すなわち作用極１４と対極２５との距離を変えることができる。
基板２１の空気孔２９は、前記の試料供給路に連通しているので、スリット１８の解放端に形成される試料供給口１９に試料を接触させれば、毛管現象により試料は容易に試料供給路内にある試薬層１０に達する。
【００２８】
実施の形態２
図３は、本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた斜視図である。本実施の形態では、対極２５ａを作用極１４と同様に四角形とし、その面積を作用極のそれと等しくした。その他は、実施の形態１と同様である。
【００２９】
実施の形態３
図４は、本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた斜視図であり、図５はその縦断面図である。
このグルコースセンサは、以下のような手順で作製される。
【００３０】
まず、両側に立ち上がり片３７、３７を有する電気絶縁性の基板３１上に、パラジウムをスパッタリングして、作用極３４およびそのリード３２を形成する。次に、基板３１上に絶縁性部材３６を貼付することにより、作用極３４および測定器に挿入するリード３２の端子部を規定する。一方、第２の電気絶縁性基板４１の内面に、同じくパラジウムをスパッタリングして対極４５、および対極リード４３を作製する。次に、基板４１の内面に絶縁性部材４７を貼付することにより、対極４５および測定器に挿入するリード４３の端子部を規定する。
【００３１】
次いで、基板３１に第２の基板を接合する。この時、作用極３４と対極４５は、基板３１と基板４１との間に形成される空間部を介して対向する位置に配置される。作用極と対極間の距離は、例えば１００μｍとする。試薬層３０および界面活性剤層４０は、実施の形態１と同様にして、電極３４を覆うように形成される。このようにして作製されるセンサは、電極３４および４５に近い方の端面が試料供給口３９となる。ここから供給される試料は、空気孔４９に連なる空間部の毛管作用により電極部に達する。
【００３２】
実施の形態４
図６は本実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた斜視図であり、図７はその縦断面図である。
このグルコースセンサは、以下の手順で作製される。
【００３３】
電気絶縁性の第１の基板５１上に、パラジウムをスパッタリングして、作用極５４およびそのリード５２を形成する。次に、基板５１上に、絶縁性部材５６を貼付することにより、作用極５４、および測定器に挿入するリード５２の端子部を規定する。一方、外側に膨出した曲面部６８を有する第２の電気絶縁性基板６１の曲面部６８の内壁面に、パラジウムをスパッタリングして対極６５およびそのリード６３を形成する。曲面部６８の曲率を調節することにより、作用極５４と対極６５との距離を制御することができる。
【００３４】
次に、基板６１の内壁面に、絶縁性部材６７を貼付することにより、対極６５、および測定器に挿入する端子部を規定する。この時、対極６５の面積が作用極５４の面積と等しくなるようにする。対極６５の端子部は、基板６１の後端６１ａの裏面に露出している。曲面部６８の端部には、空気孔６９を有する。作用極５４上に試薬層５０を形成し、さらにこれを覆うように界面活性剤層６０を形成する。最後に、基板５１と基板６１を貼り合わせて、グルコースセンサを組み立てる。
【００３５】
実施例１
実施の形態１において、スペーサ部材１７の厚みを変えることにより、試料供給路の高さの異なる５種のセンサを作製した。作用極の面積は１．０ｍｍ2である。対極は、直径約３．６ｍｍの円形であるが、その直径がスペーサ部材１７のスリット１８の幅より大きいので、一部は試料供給路に露出しない。対極の試料供給路に露出する部分の面積は約５．３ｍｍ2である。
【００３６】
比較例として、同一基板上に作用極と対極を有するグルコースセンサを作製した。実施例１と同様に、試料供給路の高さの異なる５種のグルコースセンサを作製した。図８は比較例のセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図であり、図９はその縦断面図である。
【００３７】
ポリエチレンテレフタレートからなる電気絶縁性基板１０１上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、作用極リード１０２および対極リード１０３を形成し、次いで、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷して作用極１０４を形成した。この作用極１０４は、作用極リード１０２と接触している。さらに、この基板１０１上に、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層１０６を形成した。絶縁層１０６は、作用極１０４の外周部を覆っており、これにより作用極１０４の露出部分の面積を一定に保っている。次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを、対極リード１０３と接触するように基板１０１上に印刷して対極１０５を形成した。作用極１０４の面積は１．０ｍｍ2、対極１０５の試料供給路に露出する部分の面積は約４．３ｍｍ2である。
【００３８】
酵素のＧＯＤおよび電子伝達体のフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を作用極１０４および対極１０５上に滴下した後乾燥して試薬層１０７を形成し、その試薬層１０７上に、界面活性剤であるレシチンを含有する界面活性剤層１０９を形成した。これらの基板１０１、空気孔１１４を備えたカバー１１２、およびスリット１１１を有するスペーサ部材１１０を図８中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着した。
【００３９】
以上の実施例１および比較例のセンサを用いて、一定量のグルコースを含む水溶液のグルコース濃度の測定を行った。試料を試料供給口から試料供給路に供給し、一定時間経過後に、対極を基準にして作用極に５００ｍＶの電圧を印加した。この電圧印加により、作用極と対極との間に流れる電流値を測定したところ、試料中のグルコース濃度に比例した電流応答が観察された。
【００４０】
グルコースを１８０ｍｇ／ｄｌ含む溶液について、試料供給路の高さが異なる各グルコースセンサにより応答電流値を測定した。図１０は、実施例１のセンサによる試料供給路の高さと応答値（比）との関係を示したものである。応答値（比）は、試料供給路の高さの等しい比較例のセンサによる応答値を１００とした比で示している。
【００４１】
図１０からわかるように、試料供給路の高さを１５０μｍ以下にすると、実施例１の比較例に対する応答値（比）が急激に増加している。これは、作用極と対極が相互に対向し、作用極−対極間の距離が１５０μｍ以下であると、作用極での酸化還元種の拡散層の成長が抑制され、対極上の酸化還元種の濃度がセンサ応答に反映すること、および作用極−対極間の電荷移動等が良好となることによるものであると考えられる。
【００４２】
また、実施例１においては、測定に必要なサンプル量が約０．５〜３．０μｌであった。このように本発明によると、作用極−対極間の距離が限定されるため、測定に必要なサンプル量を削減することが可能となった。
【００４３】
実施例２
実施の形態２において、作用極および対極の面積をいずれも１．０ｍｍ2とした他は、実施例１と同様の方法にてバイオセンサを作製した。そして、グルコースを９０ｍｇ／ｄｌ含む溶液について、試料供給路の高さが異なる各グルコースセンサにより応答電流値を測定した。図１１は、実施例２のセンサによる試料供給路の高さ、すなわち作用極−対極間距離と応答値（比）との関係を示したものである。応答値（比）は、試料供給路の高さの等しい実施例１のセンサによる応答値を１００とした比で示している。
【００４４】
図１１からわかるように、試料供給路の高さを１５０μｍ以下にすると、実施例２のセンサの実施例１に対する応答値（比）が急激に増加している。これは、作用極と対極が相互に対向し、作用極−対極間の距離が１５０μｍ以下であると、作用極での酸化還元種の拡散層の成長が抑制され、対極上の酸化還元種の濃度がセンサ応答に反映すること、および作用極−対極間の電荷移動等が良好となることによるものであると考えられる。
【００４５】
一般の電気化学においては、対極における反応が律速になることを防ぐために、対極の面積は作用極の面積よりも大きくする。しかし、この系では、作用極と対極を対向に配置するため、対極上の電流密度が電流応答に反映される等の理由により、対極の面積が作用極の面積より大きい場合に比べて、高い応答電流が得られたと考えられる。
【００４６】
本実施例では、対極の面積が作用極と同等であるために、実施例１よりも空気孔２９の位置を試料供給口側に近づけている。したがって、測定に必要なサンプル量をさらに削減することが可能となる。
【００４７】
実施例３
本実施例では、対極面積を０．６４ｍｍ2とした他は、実施例２と同様にしてバイオセンサを作製した。そして、グルコースを９０ｍｇ／ｄｌ含む溶液について、試料供給路の高さが異なる各グルコースセンサにより応答電流値を測定した。図１２は、実施例３のセンサによる試料供給路の高さ（作用極−対極間距離）と応答値（比）との関係を示したものである。応答値（比）は、試料供給路の高さの等しい実施例１のセンサによる応答値を１００とした比で示している。
【００４８】
図１２からわかるように、作用極−対極間距離を１５０μｍ以下にすると、本実施例の実施例１に対する応答値（比）が急激に増加している。これは、実施例２で説明したものと同様の理由によるものと考えられる。
本実施例では、対極の面積が作用極よりも小さいために、実施例２よりも空気孔の位置を試料供給口側に近づけることができる。したがって、測定に必要なサンプル量を実施例２よりもさらに削減することが可能となる。
【００４９】
産業上の利用の可能性
以上のように本発明によれば、測定に必要なサンプル量が少なく、かつ高感度のバイオセンサを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図２】同グルコースセンサの縦断面図である。
【図３】 本発明の他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図４】 本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図５】 同グルコースセンサの縦断面図である。
【図６】 本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図７】 同グルコースセンサの縦断面図である。
【図８】 比較例のグルコースセンサの試薬層および界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【図９】 同グルコースセンサの縦断面図である。
【図１０】 本発明の実施例１のグルコースセンサの試料供給路高さと応答電流値（比）との関係を示すグラフである。
【図１１】 本発明の実施例２のグルコースセンサの作用極−対極間距離と応答電流値（比）との関係を示すグラフである。
【図１２】 本発明の実施例３のグルコースセンサの作用極−対極間距離と応答電流値（比）との関係を示すグラフである。
Claims (4)
- 作用極を有する第１の絶縁性基板、前記作用極と対向させた対極を有する第２の絶縁性基板、少なくとも酸化還元酵素を含む試薬層、並びに第１および第２の絶縁性基板の間に形成された試料供給路を具備し、前記試料供給路内に前記作用極、対極および試薬層が露出し、かつ前記作用極と前記対極との距離が１５０μｍ以下であり、前記対極の試料供給路に露出している部分の面積が、前記作用極の試料供給路に露出している部分の面積より小さいことを特徴とするバイオセンサ。
- 前記作用極の試料供給路に露出している部分の面積が０．１〜２．０ｍｍ2であり、前記対極の試料供給路に露出している部分の面積が０．０５ｍｍ2以上２．０ｍｍ2未満の範囲である請求項１記載のバイオセンサ。
- 前記作用極と前記対極との距離が４０μｍ以上である請求項１記載のバイオセンサ。
- 第１および第２の絶縁性基板の間に、スリットを有するスペーサ部材が挿入され、前記スリットの部分に前記試料供給路が形成された請求項１記載のバイオセンサ。
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