JP4142569B2 - Ointment - Google Patents

Ointment Download PDF

Info

Publication number
JP4142569B2
JP4142569B2 JP2003506922A JP2003506922A JP4142569B2 JP 4142569 B2 JP4142569 B2 JP 4142569B2 JP 2003506922 A JP2003506922 A JP 2003506922A JP 2003506922 A JP2003506922 A JP 2003506922A JP 4142569 B2 JP4142569 B2 JP 4142569B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
added
mmol
column
yield
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2003506922A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2003000278A1 (en
Inventor
基生 山▲崎▼
敏行 須澤
達也 村上
紀子 櫻井
Original Assignee
協和醗酵工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 協和醗酵工業株式会社 filed Critical 協和醗酵工業株式会社
Publication of JPWO2003000278A1 publication Critical patent/JPWO2003000278A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4142569B2 publication Critical patent/JP4142569B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Description

技術分野
本発明の目的は、化学的に修飾された生理活性ポリペプチドを含有する軟膏剤に関する。さらに、該軟膏剤の治療剤、化粧品、保湿剤としての使用に関する。
背景技術
生理活性を有するポリペプチド（以下、生理活性ポリペプチドという）は、特定の疾病に対する治療剤として有用であるが、血中に投与されると安定性が悪く、十分な薬理効果が期待できない場合が多い。例えば、分子量６０，０００程度以下のポリペプチドは血中に投与されても腎臓の糸球体より濾過され、大部分が尿中に***されるため、治療剤として用いられたとしても大きな治療効果が得られず、繰り返しの投与が必要になる場合が多い。また、他の生理活性ポリペプチドは血中に存在する加水分解酵素等によって分解され、生理活性を失うことがある。
外因性の生理活性ポリペプチドの場合には、その生理活性が疾患の治療に有効なことがあるが、そのような外因性の生理活性ポリペプチドや遺伝子組換えによって製造された生理活性ポリペプチド等は内因性の生理活性ポリペプチドと構造が異なるために、それが血中に投与された場合には免疫反応が誘発され、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用が引き起こされる場合もあることが知られている。さらに、生理活性ポリペプチドの中にはそれが治療剤として用いられる際に、溶解性が悪い等の物性が問題になることも多い。
生理活性ポリペプチドを治療剤として用いる際のこれらの問題を解決する方法の一つとして、１分子以上の不活性型ポリマー鎖を該ポリペプチドに化学的に結合させる方法が知られている。多くの場合、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類を該ポリペプチドに化学的に結合させることによって、該ポリペプチドに望ましい特性が付与されている。
例えば、ポリエチレングリコールで修飾されたスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）では血中の半減期が著しく延長され、作用の持続性が見出されている［ファーマシューティカル リサーチ コミュニケーション（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９巻、２８７頁（１９８７年）］。また、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のポリエチレングリコール修飾体も知られている［ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１５巻、８１４頁（１９９４年）］。その他にも、アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ウリカーゼ等の生理活性ポリペプチドのポリエチレングリコール修飾体の例がＧｉｌｌｉａｎ Ｅ．Ｆｒａｎｃｉｓらによってまとめられている［ファーマシューティカル バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３巻、スタビリティー オブ プロテイン ファーマシューティカルズ パートＢ（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＰａｒｔＢ）、２３５頁（１９９２年）、プレナムプレス、ニューヨーク（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］。
生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで修飾することによって得られる効果としては、熱安定性が高まること［生物物理、３８巻、２０８頁（１９９８年）］、有機溶媒に可溶となること［バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．）、１２２巻、８４５頁（１９８４年）］等も知られている。
一方、ペプチドや蛋白質とポリアルキレングリコールとの結合方法も知られている。ポリアルキレングリコールの末端にカルボン酸の活性エステル、マレイミド基、カーボネート基、塩化シアヌル、アルデヒド基、エポキシド基等を導入してポリペプチドのアミノ基やチオール基に結合する方法が知られている［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］。これらの技術の中には、ポリペプチドまたは蛋白質の特定のアミノ酸残基に特異的にポリエチレングリコールを結合し、該ポリペプチドまたは蛋白質の生理活性を損なわずに血中安定性を向上させた例も含まれる。ポリペプチド中のアミノ酸残基特異的なポリエチレングリコール修飾の例としては、成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）のカルボキシ末端にノルロイシンのスペーサーを介してポリエチレングリコールを結合した例［ジャーナル オブ ペプチド リサーチ（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．）、４９巻、５２７頁（１９９７年）］、インターロイキン−２のＮ末端から３番目のアミノ酸の代わりに遺伝子組換えによってシステインを導入し、この部位に特異的にポリエチレングリコールを結合した例［バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、８巻、３４３頁（１９９０年）］等が知られている。
前記のように、ポリアルキレングリコールによる化学修飾生理活性ポリペプチドでは、一般に静脈内投与や皮下投与によって血中持続性、安定性の向上が得られることが知られているが、その一方でポリアルキレングリコールによる化学修飾生理活性ポリペプチドが注射剤以外の投与形態に利用できる性質を有しているかは未だ十分に解明されていない。
一方、局所治療剤としては、軟膏剤、点眼剤、経鼻剤、経肺剤、点耳剤、座剤、クリーム剤、ローション剤、リニメント剤、バップ剤、バンソウ膏等が知られている。例えば、軟膏剤として生理活性ポリペプチド類を利用した例として、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）およびＳＯＤによる火傷の治療［バイオロジカル アンド ファーマシューティカル ブレタン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、１６（１１）巻、１１４６頁（１９９３年）］が知られている。
また、臨床において、インターフェロン類を局所治療剤としての軟膏剤として利用することが試みられている。即ち、帯状ほう疹、***ヘルペス、角膜ヘルペス、伝染性軟疣腫、水痘、口内炎等のウイルス性の皮膚疾患や、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生由来の緑内障等の眼疾患、皮膚の腫瘍や疣に対してインターフェロン類の軟膏剤が有用であることが知られている。具体的には、インターフェロン−αによる単純ヘルペス−１型ウイルスの治療［ダーマトロジー（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）、１８４（１）巻、４０頁（１９９２年）、アクタ ビロロジカ（Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ）、３９（３）巻、１２５頁（１９９５年）］、白血球インターフェロンによる潰瘍治療［インターナショナル ジャーナル オブ クリニカル ファーマコロジー、セラピー アンド トキシコロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、１９（１０）巻、４５０頁（１９８１年）］等が知られている。また、特定の血管新生による視力障害の治療剤において、インターフェロン類等の軟膏剤の利用も試みられている［特開平９−２５５５５５、日本眼科学会雑誌、９９巻、５７１頁（１９９５年）］。
これらの治療方法では病巣部位への直接の効果が得られ、著しい治療効果が認められてはいるものの、生理活性ポリペプチドを含有するこれらの局所治療剤中での生理活性ポリペプチドの安定性に関しては、何ら知見が得られていない。
我々は軟膏剤中における活性成分としての生理活性ポリペプチドの安定化について鋭意検討した結果、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで化学修飾することにより、生理活性ポリペプチドが格段に安定化され、高い生理活性が維持されることを見出した。
発明の開示
本発明の目的は、生理活性ポリペプチドに比べて軟膏中での安定性に優れた生理活性ポリペプチド誘導体を含有する軟膏剤を提供することにある。
本発明者は前記の目的を達成するために、インターフェロンに代表される生理活性ポリペプチドを化学的に修飾、例えばポリアルキレングリコール類で修飾したところ、当該ポリエチレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドは該生理活性を維持し、未修飾の生理活性ポリペプチドに比べて軟膏中での安定性に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は化学的に修飾された生理活性ポリペプチド（以下、化学修飾ポリペプチドということもある）を含有する軟膏剤に関する。
また、本発明は、上記の化学的に修飾された生理活性ポリペプチドを含有する化粧用軟膏剤および保湿用軟膏剤に関する。
さらに本発明は、軟膏剤、化粧用軟膏剤または保湿用軟膏剤の製造のための化学的に修飾された生理活性ポリペプチドの使用に関する。
また、本発明は、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコール類で修飾することを特徴とする該生理活性ポリペプチドの軟膏剤中での安定化方法に関する。さらに本発明は、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコール類で修飾することを特徴とする該生理活性ポリペプチドの軟膏剤中での活性を維持する方法に関する。
さらに本発明は、化学的に修飾された生理活性ポリペプチドと軟膏基剤等を含有する組成物に関する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
化学的に修飾された生理活性ポリペプチドとしては、例えば少なくとも１個のポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドがあげられる。
生理活性ポリペプチドは、生理活性または薬理活性を有するポリペプチドであればいかなるポリペプチドでもよい。例えば、アスパラギナーゼ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、グルタミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）、ウリカーゼ（Ｕｒｉｃａｓｅ）、スーパーオキサイドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｉｎ）、ストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、プラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ）、アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、インターロイキン１〜１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１〜１８）、インターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）、インターフェロン−β（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、インターフェロン−ω（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ω）、インターフェロン−τ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−τ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）、血小板増加因子（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、クローソ蛋白質（Ｋｌｏｔｈｏ）、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、繊維芽細胞増殖因子１〜１９（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ１〜１９）、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ１）、オステオジェニックプロテイン１（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ１）、幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）、アミリン（Ａｍｙｌｉｎ）、パラサイロイドホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、プラスミノーゲン活性化因子類（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、形質転換成長因子類（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、グルカゴン様ペプチド類（Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、ナトリウム利尿ペプチド類（Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、プラスミノーゲン（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アンジオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、抗体もしくはそのフラグメント、融合抗体等の生理活性を有するポリペプチドおよびそれらのアミノ酸置換体、アミノ酸欠失体、糖鎖付加体、糖鎖欠失体、部分ペプチド等をあげることができる。より好ましい生理活性ポリペプチドとしては、インターフェロン−β、インターフェロン−α、インターフェロン−γ等のインターフェロン類、スーパーオキサイドディスムターゼ活性を有する生理活性ポリペプチドがあげられる。
これらの生理活性ポリペプチドは動物臓器や組織から抽出する方法でも得られるが、通常のペプチド合成法、あるいは遺伝子組換え法で調製することによっても得ることができる。さらに、市販の生理活性ポリペプチドも用いることができる。化学修飾に使用する生理活性ポリペプチドとしては粗精製物を用いることもできるし、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、抽出等の精製法により化学修飾に適した純度に精製したものを用いることもできる。
これらの生理活性ポリペプチドはリン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液中、水もしくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の適当な有機溶媒中、またはこれらの有機溶媒と水との混合溶媒中で調製され、また化学修飾反応に用いられる。
化学的に修飾された生理活性ポリペプチドは、本発明の目的を達成できるものであればいかなるものでもよく、例えばポリエチレングリコールもしくはその誘導体、ポリプロピレングリコールもしくはその誘導体、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体もしくはその誘導体等のポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドが好ましい。ポリアルキレングリコール類としては直鎖型の構造のもの、２本以上のポリアルキレングリコールが結合した分岐型の構造のものを用いることができ、平均分子量が約１，０００〜１，０００，０００のものが好ましく、平均分子量が５００〜１０００，０００のものがより好ましい。
ポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるし、既知の方法に準じて調製することもできる。ポリアルキレングリコール類の調製方法としては、Ｓａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙの総説［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に示された方法またはそれに準じた方法を用いることができる。
ポリアルキレングリコール類と生理活性ポリペプチドとの反応は、ポリアルキレングリコール類を生理活性ポリペプチド１モルあたり１〜１０００モル程度、より好ましくは１〜５０モル程度用いて反応させることによって行われる。ポリアルキレングリコール類の生理活性ポリペプチドへの修飾の度合いは生理活性ポリペプチドに対するポリアルキレングリコール類のモル比、反応温度、ｐＨ、反応時間等を調節することによって、任意に選択することができる。また、反応に使用する溶媒は反応を妨害しないものであればいずれでもよく、例えばりん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン等、あらゆるものから選択することができる。反応温度、反応時間、ｐＨ等の反応条件は生理活性ポリペプチドの活性が損なわれない条件であればいずれでもよく、例えば反応温度は０〜５０℃、反応時間は１０分〜１００時間、ｐＨは４〜１０が好ましい。
ポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドの精製は常法に従って、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過等により行うことができる。合成または精製された生理活性ポリペプチド、あるいはポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドが当該ポリペプチドの構造を有するものであることの確認は、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびアミノ酸組成のアミノ酸分析計による分析により、またアミノ酸配列を気相プロテインシーケンサーによりエドマン分解して得られたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相ＨＰＬＣ分析すること等により行うことができる。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、インターフェロン、インターロイキン等の遊離システイン残基を有する天然型または遺伝子組み換え型の生理活性ポリペプチドはポリアルキレングリコール類で部位特異的に修飾することもできる。
本発明の好ましい１つの態様では、化学的に修飾された生理活性ポリペプチドが、特開平１１−３１０６００に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、ＷＯ９９／５５３７７に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、ＷＯ００／２３１１４に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、特表昭６２−５０３１７１、ＷＯ８７／０００５６、ＵＳ４７６６１０６、ＵＳ４９１７８８８もしくはＵＳ４８６３７２７に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、または特開平６−１９２３００もしくはＥＰ５９３８６８Ａ１に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチドである。
本発明の別の好ましい１つの態様では、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、平面構造以外の環状構造を含有する基に２本の１本鎖ポリアルキレングリコール類が結合し、かつ生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類である。
中でも、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、式（Ｉ）

Figure 0004142569
｛式中、Ｌは平面構造以外の環状構造を含有する３〜５分岐が可能な基を表し、ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または
（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、
ｎは任意の正の整数を表し、
ｑは１〜３の整数を表し、
Ｒ１は水素原子、低級アルキルまたは低級アルカノイルを表し、
Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表し、
Ｘ１は結合、Ｏ、Ｓ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは１〜８の整数を表す）、（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記ｔａと同義である）、ＮＲ３（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキルを表す）、Ｒ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５［式中、Ｒ４は結合、アルキレンまたはＯ（ＣＨ２）ｔｃ（式中、ｔｃは前記ｔａと同義である）を表し、Ｒ５は結合、アルキレンまたはＯＲ５ａ（式中、Ｒ５ａは結合またはアルキレンを表す）を表す］、Ｒ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７［式中、Ｒ６は結合、アルキレンまたはＲ６ａＯ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ５ａと同義である）を表し、Ｒ７は結合、アルキレンまたは（ＣＨ２）ｔｄＯ（式中、ｔｄは前記ｔａと同義である）を表す］、Ｒ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記Ｒ５ａと同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記Ｒ５ａと同義である）を表し、
Ｘ２は結合、Ｏまたは（ＣＨ２）ｔｅＯ（式中、ｔｅは前記ｔａと同義である）を表し、
Ｘ３は結合またはアルキレンを表し、２つのＲ１−Ｍｎ−Ｘ１および１つ〜３つのＸ２−Ｘ３−Ｒ２はそれぞれ同一でも異なっていてもよい｝で表される分岐型ポリアルキレングリコール類であるのが好ましい。
式（Ｉ）において、ｑが１である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましく、さらにｎが１０〜１００，０００であり、ｒおよびｓならびにｒａおよびｓａが同一または異なって、１〜１００，０００である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
式（Ｉ）において、Ｒ２が水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィドまたはアジドである分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
また、式（Ｉ）においては、Ｌが式（ＩＩ）
Figure 0004142569
［式中、Ｒ１０は（ＣＨ２）ｕ（式中、ｕは１〜１０の整数を表す）またはＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｕａ（式中、ｕａは０〜８の整数を表す）を表し、
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同一または異なって、水素原子、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミルを表し、
ＷはＯ、Ｓ、ＣＨ２またはＮＲ１４（式中、Ｒ１４は水素原子または低級アルキルを表す）を表す］で表される化合物から水素原子を３〜５個除いた基である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。中でも、ＷがＣＨ２であり、かつｕが４である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
本発明の好ましいさらに別の態様では、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、１本鎖ポリアルキレングリコール類が３本以上結合し、かつ、生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類である。
中でも、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、式（Ｉｘ）
Figure 0004142569
［式中、Ｌｘは４以上分岐が可能な基を表し、
ＭｘはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓｘ（式中、ｒｘおよびｓｘは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または
（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａｘ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａｘ（式中、ｒａｘおよびｓａｘはそれぞれ前記ｒｘおよびｓｘと同義である）を表し、
ｎｘは任意の正の整数を表し、ｍｘは３以上の整数を表し、ｑｘは１〜３の整数を表し、
Ｒ１ｘは水素原子、低級アルキルまたは低級アルカノイルを表し、
Ｒ２ｘはポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表し、
Ｘ１ｘは結合、Ｏ、Ｓ、アルキレン、（ＯＣＨ２）ｔａｘ（式中、ｔａｘは１〜８の整数を表す）、（ＣＨ２）ｔｂｘＯ（式中、ｔｂｘは前記ｔａｘと同義である）、ＮＲ３ｘ（式中、Ｒ３ｘは水素原子または低級アルキルを表す）、Ｒ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘ［式中、Ｒ４ｘは結合、アルキレンまたはＯ（ＣＨ２）ｔｃｘ（式中、ｔｃｘは前記ｔａｘと同義である）を表し、Ｒ５ｘは結合、アルキレンまたはＯＲ５ａｘ（式中、Ｒ５ａｘは結合またはアルキレンを表す）を表す］、Ｒ６ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７ｘ［式中、Ｒ６ｘは結合、アルキレンまたはＲ６ａｘＯ（式中、Ｒ６ａｘは前記Ｒ５ａｘと同義である）を表し、
Ｒ７ｘは結合、アルキレンまたは（ＣＨ２）ｔｄｘＯ（式中、ｔｄｘは前記ｔａｘと同義である）を表す］、Ｒ８ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８ｘは前記Ｒ５ａｘと同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９ｘ（式中、Ｒ９ｘは前記Ｒ５ａｘと同義である）を表し、
Ｘ２ｘは結合、Ｏまたは（ＣＨ２）ｔｅｘＯ（式中、ｔｅｘは前記ｔａｘと同義である）を表し、
Ｘ３ｘは結合またはアルキレンを表し、
３つ以上のＲ１ｘ−（Ｍｘ）ｎｘ−Ｘ１ｘはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ２ｘ−Ｘ３ｘ−Ｒ２ｘが２または３個存在する場合（ｑｘが２または３である場合）には、それらは同一でも異なっていてもよい｝で表わされる分岐型ポリアルキレングリコール類であるのが好ましい。
式（Ｉｘ）において、ｑｘが１である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましく、またｍｘが３または４である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。さらに、ｎｘが１０〜１００，０００であり、ｒｘおよびｓｘならびにｒａｘおよびｓａｘが同一または異なって、１〜１００，０００である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
式（Ｉｘ）において，Ｒ２ｘが水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィドまたはアジドである分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
また、上記の分岐型ポリアルキレングリコール類の中で、分子量が５００〜１，０００，０００である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
式（Ｉｘ）において、Ｌｘがトリシンから水素原子４個以上を除いた基、シキミ酸から水素原子４個以上を除いた基、キナ酸から水素原子４個以上を除いた基、エリスリトールから水素原子４個以上を除いた基、ペンタエリスリトールから水素原子４個以上を除いた基およびグルコースから水素原子４個以上を除いた基から選ばれる基である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
以下、式（Ｉ）および式（Ｉｘ）で表される化合物をそれぞれ化合物（Ｉ）および化合物（Ｉｘ）という。他の式番号の化合物についても同様である。
式（Ｉ）の各基の定義において、低級アルキルおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分は、直鎖状または分岐状の炭素数１〜８の、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を包含する。アルキレンは、炭素数１〜８の、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン等を包含する。
式（Ｉ）において、ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓはそれぞれ前記と同義である）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記と同義である）である場合、ｒおよびｓ並びにｒａおよびｓａは、好ましくは１〜１００，０００であり、さらに好ましくは１〜１，０００である。
式（Ｉ）において、ｎは任意の正の整数を表し、好ましくは１０〜１００，０００であり、さらに好ましくは１００〜１，０００である。
式（Ｉ）において、Ｍｎで表されるポリアルキレングリコール部分の平均分子量は、約１，０００〜１，０００，０００が好ましく、５，０００〜１００，０００がさらに好ましい。Ｍｎが−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−である場合、原料となるポリエチレングリコール類はＭｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）で表される分子量分布が１．１以下の単分散のものが望ましく、平均分子量３０，０００以下であれば市販のものを用いることができる。例えば、平均分子量が２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００等のモノメトキシポリエチレングリコールが利用できる。
式（Ｉ）において開示される、平面構造以外の環状構造を含有する基に２本の１本鎖ポリアルキレングリコール類が結合し、かつ生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類、式（Ｉ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００であることが望ましい。
式（Ｉ）において、ｑは１〜３の整数を表し、好ましくは１である。
式（Ｉ）において、Ｌは平面構造以外の環状構造を含有する３〜５分岐が可能な基であり、環状構造上の置換基として、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミル等を有していてもよい。ここで、低級アルキルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、置換低級アルキルにおける置換基としては、水酸基、アミノ、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイル、低級アルキルカルバモイルオキシ等があげられる。低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイルおよび低級アルキルカルバモイルオキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。Ｌとしては、例えば、シクロヘキサン類、シクロヘキセン類、単糖類等から水素原子３〜５個除いた基があげられる。上記シクロヘキサン類、シクロヘキセン類、単糖類の具体例としては、シクロヘキサントリカルボン酸、シクロヘキサントリオール、１，３，５−トリメチル−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Ｋｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ）、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジアミノシクロヘキサン、２，４，１０−トリオキサアダマンタン、イノシトール、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄ，Ｌ−ソルビトール、リボース、エリスリトール等およびそれらの立体異性体があげられる。
Ｌ部分の構造の構築は市販品の化合物をそのまま利用するか、一般の有機合成法によってポリアルキレングリコール類の結合に適した形に誘導体化して利用するか、あるいは官能基の保護を行った後に利用して行うことができる［日本化学会編、実験化学講座 第４版（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］。
上記で例示した以外のシクロヘキサン類は、例えば木檜ら［大有機化学、第６巻、１８３頁（１９５８年）、朝倉書店］またはＧ．Ｅ．ＭｃＣａｓｌａｎｄとＥ．Ｃｌｉｄｅ Ｈｏｒｓｗｉｌｌ［ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、７６巻、２３７３頁（１９５４年）］の方法等に従って合成することができる。
また、例えば、ベンゼン環を有する化合物をＳ．ＩｓｏｄａとＨ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉの方法［ケミカル アンド ファーマシューティカル ブルチン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）、２８（８）巻、２３３７頁（１９８０年）］、Ｋ．ＰｒａｓａｄとＯ．Ｒｅｐｉｃの方法［テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２５（２３）巻、２４３５頁（１９８４年）］等で平面構造以外の環状構造を有する３〜５分岐が可能な化合物に変換してＬ部分の構造の構築を行うこともできる。
化合物（Ｉ）において、Ｘ１を介したポリアルキレングリコール類とＬとの結合は通常の有機合成法で知られている反応を容易に組み合わせて行うことができる［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９−２３頁（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善］。
式（Ｉ）において、Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表す。
すなわち、上記反応性を有する基としては、ポリペプチド中の、リジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン等の各側鎖、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基のいずれかと反応性を有する基が包含され、例えば水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィド、アジド等があげられる。
上記の各基の定義において、低級アルコキシカルボニルオキシ、ハロゲン化低級アルキル、低級アルカノイルオキシおよび低級アルカノイルオキシカルボニルの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アリールオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルオキシおよびアリールジスルフィドのアリール部分としては、炭素数６〜１４の、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル等があげられる。アロイルオキシカルボニルのアロイル部分としては、炭素数７〜１３の、例えばベンゾイル、ナフトイル、フタロイル等があげられる。ハロゲン化カルボニルおよびハロゲン化低級アルキルのハロゲン部分としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。
置換低級アルコキシカルボニルオキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば、水酸基、カルボキシ、ハロゲン等があげられる。ここで、ハロゲンは、前記と同義である。
置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば水酸基、カルボキシ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル等があげられる。ここで、ハロゲンおよび低級アルキルは、それぞれ前記と同義である。
Ｒ２で表される基は、Ｌ部分の構造を構築する原料に含まれていてもよいし、該原料化合物中の必要な官能基をあらかじめ適当な保護基［プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］で保護し、Ｘ１を介してポリアルキレングリコール類をＬに結合して分岐させた後に脱保護、さらには必要により変換して形成してもよい。さらにポリアルキレングリコール類をＸ１を介してＬから分岐させた後に、通常の有機合成法によってＬに必要によりＸ２またはＸ３を介して前記Ｒ２を導入することもできる。
より具体的には、例えば以下の製造法で本発明の式（Ｉ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類を製造することができるが、製造法はこれらに限定されるものではない。
製造法１：化合物（Ｉ）においてＸ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ、または（ＣＨ２）ｔｂＯである化合物の製造
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは前記と同義である）、または（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記と同義である）である化合物（Ｉａ）は、例えば以下の方法により製造することができる。
水酸基を２個所以上有する環状ポリオール類（以下、本明細書において環状ポリオール類というときは、環状構造上の置換基として水酸基以外に、ヒドロキシ低級アルキル等を有する化合物も包含する）を、無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、ポリアルキレングリコールまたはそのモノアルキルエーテルもしくはモノカルボン酸エステル（以下、これらをまとめてポリアルキレングリコール類Ａという）のハロゲン化物もしくはトシル化物を１〜３モル相当加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて、２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物が得られる。
環状ポリオール類はシクロヘキサントリオール、キナ酸、シキミ酸、グルコース、ソルビトール、リボース、エリスリトール等の市販の化合物、または市販の化合物から導かれる化合物から選ばれる。市販の化合物から導かれる化合物としては、例えば、シクロヘキサントリカルボン酸やＫｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ等から選ばれる環状ポリカルボン酸を通常の有機合成法［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９〜２１巻（１９９２年）、丸善］に従って適当な還元剤で還元することによって得られる環状ポリオール類があげられる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
環状ポリオール類中の水酸基の配置は何れでもよく、反応に不必要な官能基を文献［プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリーアンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］に記載の方法によって適当に保護、あるいは誘導体化してから、反応に使用することができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物はＳａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙの総括［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に開示された各種の方法で容易に製造することができる。結合に使用するポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物としては分子量分布が均一であれば（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）いかなる平均分子量のものも用いられる。
得られた２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物はそのままの純度、あるいはイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で任意の純度の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類に精製、単離して、次のステップに用いることができる。ここまでの工程で、化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）のいくつかが得られる。
一方、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類とポリアルキレングリコール類Ａを使用することによっても目的の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を調製することができる。この場合、１〜３モル相当のポリアルキレングリコール類ＡをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１モル相当の環状ポリハライド類または環状ポリトシル類を加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて目的物が得られる。
環状ポリハライド類は市販の化合物であるか、前記環状ポリオール類をハロゲン化合物に変換［日本化学会編、実験化学講座、第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］して得られる。環状ポリトシル類は環状ポリオール類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、カリウムナフタレン等の適当な塩基の存在下、水酸基当たり１〜３モル相当のハロゲン化トシルを加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させることで得ることができる。
次に、得られた２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物または精製化合物に、Ｒ２を導入する。Ｒ２としては、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に結合した後、環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に残存している官能基をそのまま利用するか、あるいはあらかじめ環状ポリオール類に結合している官能基を保護しておき、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合後、官能基の保護基を除去して得られる基を利用してもよい。この場合、前記環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類中の１個所以上の水酸基、または他の官能基を適当な保護基で保護した後、前記と同様の方法で残りの水酸基、ハロゲンまたはトシル基部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を導入し、２本のポリアルキレングリコールが結合した化合物を合成し、保護基を除去した官能基をそのまま利用するか、あるいは該官能基の少なくとも一つを後述する方法に従ってＲ２に変換する。ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合する前、もしくは結合した後に環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に存在する官能基としては、水酸基の他に、カルボキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、ホルミル、カルボニル等がある。適当な官能基の保護基としては水酸基の場合、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリル、ジフェニルｔｅｒｔ−ブチルシリル、トリメチルシリル、トリフェニルシリル、トシル、テトラヒドロピラニル等があげられ、アミノの場合、メチル、エチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｎ−フタルイミド、アセチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等があげられ、カルボキシの場合、ベンジル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、９−フルオレニルメチル、メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、シンナモイル、アリル、ニトロフェニル等があげられ、ホルミルの場合、ジメチルアセタール、ジエチルアセタール、ジベンジルアセタール、１，３−ジオキサニル等があげられる［プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）］。
あらかじめ存在する官能基をそのまま、または保護、脱保護してＲ２として利用でき、Ｌ部分の構造を構築する原料となる環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類の具体例としては、シキミ酸、キナ酸、Ｋｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ等があげられる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｌを含む化合物に新たに置換基Ｒ２を導入して得られる化合物の場合、例えば以下の製造方法で容易に製造を行うことができる。
製造法１−１
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がカルボキシである式（Ｉａａ）
Figure 0004142569
（式中、Ｘ１ａは結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ、または（ＣＨ２）ｔｂＯを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がカルバモイルである式（Ｉａｂ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がシアノである式（Ｉａｃ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は例えば以下のように合成することができる。
化合物（Ｉａａ）、化合物（Ｉａｂ）および化合物（Ｉａｃ）は、環状ポリオール類を用いて、例えば製造法１に従って得られる化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２として水酸基を有する化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を水、塩化メチレン、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中、触媒量または１〜２０％の塩基存在下、１〜３０モル相当のアクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル等と、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させて得ることができる。塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等があげられる。
また、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モル相当のα−ハロゲン化酢酸エステルと、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させた後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、γ−アミノ酪酸、グリシン、β−アラニン等のアミノ酸またはその誘導体と反応させることによっても得られる。
また、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を前記同様の塩基存在下、無水コハク酸、無水グルタル酸等の酸無水物と反応させることによっても化合物（Ｉａａ）を製造することができる。
また、化合物（Ｉａａ）は、例えば環状ポリハライド類を用いて製造法１に従って、化合物（Ｉａ）のうちＲ２がハロゲン化低級アルキルである化合物（Ｉａｉ）を製造した後、ヒドロキシカルボン酸エステル、マロン酸エステル、γ−アミノ酪酸のエステル体、β−アラニンのエステル体、グリシンのエステル体等をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、化合物（Ｉａｉ）を加え、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応を行った後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば前記環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類の一個所以上の水酸基またはハロゲンを、あらかじめカルボン酸あるいはカルボン酸の保護体を含む残基で置換し、これを用いて製造法１で示した方法で環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類の残りの２個所の水酸基またはハロゲンをポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物で置換することで得ることもできる。この場合、カルボン酸またはカルボン酸の保護体を含む残基の導入は、前記と同様にして行うことができる。カルボン酸を保護した場合には、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類に導入した後に脱保護して遊離カルボン酸を生成させる。
カルボン酸に変換された化合物は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で、任意の純度で精製、単離することができる。
製造法１−２
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がアミノである式（Ｉａｄ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１−１で得られる化合物（Ｉａｃ）に適当な還元剤を作用させて得られる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物に５当量〜過剰量のエチレンジアミン、プロピレンジアミン等のジアミン類を適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
さらに、製造法１−１で示したのと同様に、化合物（Ｉａｄ）は、例えば化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、１当量〜過剰量のエチレンジアミンやプロピレンジアミン等のジアミン類と適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のアミノまたはアミノの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がマレイミドである式（Ｉａｅ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＯｓｋａｒ Ｋｅｌｌｅｒらの方法［ヘルベチカ キミカ アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、５８巻、５３１頁（１９７５年）］またはＴｉｍｏｔｈｙ Ｐ．Ｋｏｇａｎらの方法［シンセティック コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎ．）、２２巻、２４１７頁（１９９２年）］に従い、化合物（Ｉａｄ）とＮ−アルコキシカルボニルマレイミドとを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させることで得ることができる。Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミドとしてはＮ−エトキシカルボニルマレイミドやＮ−メトキシカルボニルマレイミドを用いることができる。
また、化合物（Ｉａｅ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のマレイミドを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｄ）、化合物（Ｉａｅ）およびそれらの合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−３
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がホルミルである式（Ｉａｆ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａ）のうちＲ２としてヒドロキシメチルを有する化合物（Ｉａｇ）を適当な酸化剤で酸化することで得られる。酸化剤としては塩化クロム酸ピリジニウム、クロム酸、銀イオン、ジメチルスルホキシド等があげられる。また、化合物（Ｉａａ）を前記と同様に適当な還元剤で還元することによっても得ることができる。
また、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）、化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物にアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール、ハロゲン化エチルアセタール、ハロゲン化メチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
同様にして、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を用い、製造法１−１で示した方法に準じて水酸基を活性化し、続いてアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
また、化合物（Ｉａｆ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のアルデヒド、あるいはアルデヒドの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法でも得られる。
化合物（Ｉａｆ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−４
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化カルボニルである式（Ｉａｈ）
Figure 0004142569
（式中、Ｚ１はハロゲンを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２がカルボキシである化合物（Ｉａａ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。
ハロゲン化カルボニルにおけるハロゲンは前記ハロゲンと同義である。
製造法１−５
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化低級アルキルである式（Ｉａｉ）
Figure 0004142569
（式中、Ｚ２はハロゲン化低級アルキルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化低級アルキルにおけるハロゲンおよび低級アルキル部分はそれぞれ前記と同義である。
また、化合物（Ｉａｉ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）またはＲ２がアミノである化合物（Ｉａｄ）に、前記同様適当な塩基存在下、５当量〜過剰量のジブロモエタンやジブロモプロパン等のジハロゲン化アルキル類を反応させることによっても得られる。
さらに、化合物（Ｉａｉ）は、例えば前記製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のハロゲン化低級アルキルを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｉ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−６
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソシアナートである式（Ｉａｋ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば、化合物（Ｉａｄ）をトルエン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、ホスゲンまたは塩化オキサリルと０〜１５０℃で１〜２４時間反応させるか、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応させた後に室温で分解させて得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソチオシアナートである化合物（Ｉａｐ）はホスゲンの代わりにチオホスゲンを用いる以外は上記の方法に従って製造することができる。
製造法１−７
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルである式（Ｉａｌ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ２ａはスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、通常のエステル合成方法に従って製造することができる。例えば、化合物（Ｉａａ）１モルに対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、置換もしくは非置換のヒドロキシアリール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシフタルイミド１〜１０モルを、１〜１０モルのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤存在下、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中、−２０〜１００℃で１〜２４時間反応させることによって目的物を得ることができる。より詳しくは、Ａ．Ｆｒａｄｅｔら［ポリマー ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、４巻、２０５頁（１９８１年）］、またはＫ．Ｇｅｃｋｅｌｅｒら［ポリマー ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、１巻、６９１頁（１９７９年）］によるポリアルキレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法、カルボキシメチルポリアルキレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造方法等に準じて得ることができる。
ここで、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルは前記と同義である。アリールは前記と同義であり、置換アリールの置換基は、置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基と同義である。
製造法１−８
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がビニルスルホニルである式（Ｉａｍ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば化合物（Ｉａｊ）を用いてＭａｒｇｈｅｒｉｔａ Ｍｏｒｐｕｒｇｏらの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、７巻、３６３頁（１９９６年）］で製造することができる。
製造法１−９
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである式（Ｉａｎ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ２ｂは置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＴａｌｉａ ＭｉｒｏｎとＭｅｉｒ Ｗｉｌｃｈｅｋの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に準じて、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）と過剰量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、エチルクロロホルメート等とをジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等の塩基存在下で反応させることで得られる。
また、化合物（Ｉａｎ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上の置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法で得ることもできる。
化合物（Ｉａｎ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
ここで、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシはそれぞれ前記と同義である。
製造法２：Ｘ１がＳである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＳである化合物（Ｉｂ）は、例えば製造法１と同様に、環状ポリオール類を環状ポリハライド類に変換した化合物［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］または市販の環状ポリハライド類と、ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
また、化合物（Ｉｂ）は、前記の工程とは逆に、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリチオール類と反応させることによっても得ることができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体は市販のものを用いるか、Ｓａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってまとめられた方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］で調製できる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法２−１
化合物（Ｉｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、Ｘ１が−Ｓ−である化合物を製造法２に従って製造した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法３：Ｘ１がＮＲ３である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＮＲ３（式中、Ｒ３は前記と同義である）である化合物（Ｉｃ）は、例えば製造法１と同様に、環状ポリオール類を環状ポリアミン類に変換した化合物または市販の環状ポリアミン類と、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
化合物（Ｉｃ）は、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を環状ポリハライド類と反応させることによっても得ることができる。
また、化合物（Ｉｃ）は環状ポリアルデヒド類１当量と、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体１〜１０当量とをメタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、水、緩衝液等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、−２０〜１００℃で１〜１００当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下で反応させることによっても得ることができる。
さらに、化合物（Ｉｃ）は、環状ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体を用いても製造することができる。
前記環状ポリアルデヒド類としては市販の化合物をそのまま用いるか、環状ポリアルコール類を酸化して用いるか、あるいは環状ポリカルボン酸類を還元して用いればよい。また、ポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体としては市販の化合物を利用できるし、また、ポリアルキレングリコール類Ａの末端のアルコールを酸化して用いることもできる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法３−１
化合物（Ｉｃ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｃ）を製造法３に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて製造することができる。
製造法４：Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５またはＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄａ）は、例えばシクロヘキサントリカルボン酸やＫｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ等から選ばれる環状ポリカルボン酸化合物をペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］に従い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中に溶解または懸濁し、次いで１〜３０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール等のアルコール体と、１〜３０当量のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩等の縮合剤を加え、さらに１〜３当量のポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を加えて反応させることによって得ることができる。反応は無水条件下、−２０℃〜１００℃で、１時間〜１０日間攪拌することによって行われる。
また、環状ポリカルボン酸分子中の１個以上のカルボキシをメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル等の適当な保護基で保護した後、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を残りの２個のカルボキシに前記の方法で導入し、続いてカルボキシの保護基を通常の脱保護法で除去することによって、Ｒ２がカルボキシである２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体を高純度に含む反応液を得ることもできる。この場合、カルボン酸の保護基の導入や該保護基の除去には通常のペプチドの合成法で用いられる方法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］を利用できる。環状ポリカルボン酸類中のカルボキシの配置は、立体配置を含めて何れでもよく、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体としては分子量分布が均一（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）であればいかなる平均分子量のものを用いてもよい。
また、化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄｂ）は、前記工程とは逆に、環状ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体の活性エステル、あるいはポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体とを反応させる方法でも得ることができる。ポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体はポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で、１〜２４時間加熱することによって得ることができる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法４−１
化合物（Ｉｄａ）および化合物（Ｉｄｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｄａ）または化合物（Ｉｄｂ）を製造法４に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法５：Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−ＯまたはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記と同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記と同義である）である化合物（Ｉｅ）は、例えばポリアルキレングリコール類Ａと環状ポリカルボン酸類、あるいはポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体と環状ポリオール類の組合わせを用いて、脱水縮合により得ることができる。脱水縮合の方法としては通常のエステル合成で用いられるような、酸または塩基触媒下に脱水する方法か、あるいはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ピリジン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤で対応するアルコール体とカルボン酸を縮合する方法等を利用することができる。さらに、上記工程において酸ハロゲン化物と、対応するアルコール体を反応させることによっても目的物を合成できる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法５−１
化合物（Ｉｅ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｅ）を製造法５に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法６：Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨまたはＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（式中、Ｒ６ａは前記と同義である）である化合物（Ｉｆａ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
市販の環状ポリアミン類、または前記製造法を組み合わせて環状ポリオール類より調製した環状ポリアミン類にポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体を１〜３モル過剰に反応させて、化合物（Ｉｆａ）を含む粗生成物が得られる。なお、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体は、Ｔａｌｉａ Ｍｉｒｏｎらの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に従って製造することができる。また、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、イミダゾリルカルボニルオキシ誘導体等を利用することができる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ４は前記と同義である）である化合物（Ｉｆｂ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
化合物（Ｉｆｂ）は環状ポリオール類のカーボネート誘導体とポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体とを上記と同様に反応させることによって得ることができる。
他の製造法に準じて官能基の保護、脱保護を組み合わせることによって、化合物（Ｉｆａ）または化合物（Ｉｆｂ）を選択的に生成させることもできる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法６−１
化合物（Ｉｆ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｆ）を製造法６に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて調製することができる。
Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して１本鎖化合物を取得し、同様の反応で前記と同一または異なるＲ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して、２本鎖の化合物を取得することもできる。例えば、製造法１〜６に示した方法のうちいずれかの反応を利用してＬ中の１個所の官能基にポリアルキレングリコール類を結合させ、１本鎖化合物を得る。生成する１本鎖化合物の割合は、反応に使用するポリアルキレングリコール類と、Ｌ部分の構造を構築する原料の比を変えることで調節することができ、１本鎖化合物を主成分にすることも可能である。得られた１本鎖化合物はそのままの純度で、あるいは製造法１に示した方法に準じて任意の純度に、あるいは高純度に精製して次のステップに使用することができる。
このようにして得られた１本鎖化合物と、前記と同一または異なるポリアルキレングリコール類を製造法１〜６に示したいずれかの方法に準じて結合して、２本鎖化合物が調製できる。なお、２本目のポリアルキレングリコール類は１本鎖化合物を取得した反応と同様の反応に付すこともできるが、異なる反応に付し異なる結合様式を有するように調製してもよい。例えば、水酸基、アミノ、カルボキシ等の複数の官能基を有する化合物をＬ部分の構造を構築する原料に使用する場合、製造法１に示した方法でＸ１がＯである１本鎖化合物をまず取得し、次いで製造法４に示した方法で２本目のポリアルキレングリコール類をＸ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５となるように反応させることができる。以上のように製造法１〜６の組合わせで２つのポリアルキレングリコール類が同一または異なる結合様式でＬに結合した２本鎖化合物を得ることができる。さらに、使用するポリアルキレングリコール類は１本目と２本目の分子量が異なっていてもよく、各々のポリアルキレングリコール類をＬに結合させる反応で異なる平均分子量のポリアルキレングリコール類を使用することで容易に目的物が得られる。
また、Ｌにポリアルキレングリコール類を導入する反応において、Ｌ中の１個所以上の官能基（例えば製造法１の場合、１個所以上の水酸基）を残し、他の官能基を適当な保護基で保護してから、ポリアルキレングリコール類と反応、結合させ、その後、保護基を除去することも可能である。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類は、上記製造法で具体的に示された化合物以外であっても、上記製造法に準じて得ることができる。
なお、先にも述べたとおり、製造法１〜６の各工程において、原料に用いるポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるが、Ｓａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙ［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］によってまとめられた各種の方法等によって容易に製造することも可能である。
式（Ｉｘ）の各基の定義において、低級アルキルおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分は、直鎖状または分岐状の炭素数１〜８の、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を包含する。アルキレンは、炭素数１〜８の、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン等を包含する。
式（Ｉｘ）において、ＭｘはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓｘ（式中、ｒｘおよびｓｘは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａｘ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａｘ（式中、ｒａｘおよびｓａｘはそれぞれ前記ｒｘおよびｓｘと同義である）を表し、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓｘ（式中、ｒｘおよびｓｘはそれぞれ前記と同義である）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａｘ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａｘ（式中、ｒａｘおよびｓａｘはそれぞれ前記と同義である）である場合、ｒｘおよびｓｘならびにｒａｘおよびｓａｘは、好ましくは１〜１００，０００であり、さらに好ましくは１〜１，０００である。
式（Ｉｘ）において、ｎｘは任意の正の整数を表し、好ましくは１０〜１００，０００であり、さらに好ましくは１００〜１，０００である。
式（Ｉｘ）において開示される、１本鎖ポリアルキレングリコール類が３本以上結合し、かつ、生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類、（Ｍｘ）ｎｘで表されるポリアルキレングリコール部分の平均分子量は、約１，０００〜１，０００，０００が好ましく、５，０００〜１００，０００がさらに好ましい。（Ｍｘ）ｎｘが−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎｘ−である場合、原料となるポリエチレングリコール類はＭｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）で表される分子量分布が１．１以下の単分散のものが望ましく、平均分子量３０，０００以下であれば市販のものを用いることができる。例えば、平均分子量が２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００等のモノメトキシポリエチレングリコールが利用できる。
式（Ｉｘ）において、ｑｘは１〜３の整数を表し、好ましくは１である。
式（Ｉｘ）において、ｍｘは３以上の整数を表し、好ましくは３〜４である。
式（Ｉｘ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００の範囲にあることが好ましい。
式（Ｉｘ）において、Ｌｘは４以上分岐が可能な基であり、Ｌｘ上の置換基として、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミル等を有していてもよい。ここで、低級アルキルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、置換低級アルキルにおける置換基としては、水酸基、アミノ、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイル、低級アルキルカルバモイルオキシ等があげられる。低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイルおよび低級アルキルカルバモイルオキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。
Ｌｘで表わされる４以上分岐が可能な基としては、Ｘ２ｘ−Ｘ３ｘを介してポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基に変換可能な基、あるいは該反応性を有する基を結合でき、Ｘ１ｘを介して１本鎖ポリアルキレングリコール類を３分子以上分岐させることができればいかなる基を用いてもよい。Ｌｘとしては、例えばポリオール類、ポリカルボン酸等で、分子量１，０００以下の化合物から水素原子４個以上を除いた基があげられる。ポリオール類の具体例としては、グルコース、Ｄ，Ｌ−ソルビトール、リボース、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ）、イノシトール、コール酸、３，４，５−トリヒドロキシベンゾイックアシッド（３，４，５−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、２，４，６−トリヒドロキシベンゾイックアシッド、３，４，５−トリヒドロキシベンズアルデヒド、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ ａｃｉｄ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子化合物およびそれらの立体異性体等があげられ、ポリカルボン酸の具体例としては、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸、ピロメリト酸、ジエチレントリアミンペンタアセティックアシッド、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸、クエン酸、γ−カルボキシグルタミン酸等の低分子化合物およびそれらの立体異性体等があげられる。
Ｌｘとして好ましい基としては、トリシンから水素原子４個以上を除いた基、シキミ酸から水素原子４個以上を除いた基、キナ酸から水素原子４個以上を除いた基、エリスリトールから水素原子４個以上を除いた基、ペンタエリスリトールから水素原子４個以上を除いた基およびグルコースから水素原子４個以上を除いた基等があげられる。
Ｌｘ部分の構造の構築は、例えば市販品の化合物をそのまま利用するか、一般の有機合成法によってポリアルキレングリコール類の結合に適した形に誘導体化して利用するか、あるいは官能基の保護を行った後に利用して行うことができる［日本化学会編、実験化学講座 第４版（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］。
上記で例示した以外のシクロヘキサン類は、例えば木檜ら［大有機化学、第６巻、１８３頁（１９５８年）、朝倉書店］またはＧ．Ｅ．ＭｃＣａｓｌａｎｄとＥ．Ｃｌｉｄｅ Ｈｏｒｓｗｉｌｌ［ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、７６巻、２３７３頁（１９５４年）］の方法等に従って合成することができる。
式（Ｉｘ）において、Ｘ１ｘを介したポリアルキレングリコール類とＬｘとの結合は通常の有機合成法で知られている反応を容易に組み合わせて行うことができる［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９−２３頁（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善］。
式（Ｉｘ）において、Ｒ２ｘはポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表す。
すなわち、上記反応性を有する基としては、ポリペプチド中の、リジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン等の各側鎖、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基のいずれかと反応性を有する基が包含され、例えば水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィド、アジド等があげられる。
上記の各基の定義において、低級アルコキシカルボニルオキシ、ハロゲン化低級アルキル、低級アルカノイルオキシおよび低級アルカノイルオキシカルボニルの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アリールオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルオキシおよびアリールジスルフィドのアリール部分としては、炭素数６〜１４の、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル等があげられる。アロイルオキシカルボニルのアロイル部分としては、炭素数７〜１３の、例えばベンゾイル、ナフトイル、フタロイル等があげられる。ハロゲン化カルボニルおよびハロゲン化低級アルキルのハロゲン部分としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。
置換低級アルコキシカルボニルオキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば、水酸基、カルボキシ、ハロゲン等があげられる。ここで、ハロゲンは、前記と同義である。
置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば水酸基、カルボキシ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル等があげられる。ここで、ハロゲンおよび低級アルキルは、それぞれ前記と同義である。
Ｒ２ｘで表される基は、Ｌｘ部分の構造を構築する原料に含まれていてもよいし、該原料化合物中の必要な官能基をあらかじめ適当な保護基［プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］で保護し、Ｘ１ｘを介してポリアルキレングリコール類をＬｘに結合して分岐させた後に脱保護、さらには必要により変換して形成してもよい。さらにポリアルキレングリコール類をＸ１ｘを介してＬｘから分岐させた後に、通常の有機合成法によってＬｘに必要によりＸ２ｘまたはＸ３ｘを介して前記Ｒ２ｘを導入することもできる。
より具体的には、例えば以下の製造法で本発明における分岐型ポリアルキレングリコール類を製造することができるが、製造法は、これらに限定されるものではない。
製造法１ｘ：Ｘ１ｘが結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａｘ、または（ＣＨ２）ｔｂｘＯである化合物の製造
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘが結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａｘ（式中、ｔａｘは前記と同義である）、または（ＣＨ２）ｔｂｘＯ（式中、ｔｂｘは前記と同義である）である化合物（Ｉａｘ）は、例えば以下の方法により製造することができる。
水酸基を３個所以上有するポリオール類を、無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、ポリアルキレングリコールまたはそのモノアルキルエーテルもしくはモノカルボン酸エステル（以下、これらをまとめてポリアルキレングリコール類Ａｘという）のハロゲン化物もしくはトシル化物を３モル以上加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて、３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物が得られる。
ポリオール類はキナ酸、グルコース、ソルビトール、リボース、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリシン、イノシトール等の市販の化合物、または市販の化合物から導かれる化合物等から選ばれる。市販の化合物から導かれる化合物としては、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸（１，２，４，５−ｂｅｎｚｅｎｅｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｃ ａｃｉｄ）等から選ばれるポリカルボン酸を通常の有機合成法［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９〜２１巻（１９９２年）、丸善］に従って適当な還元剤で還元することによって得られるポリオール類等があげられる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
ポリオール類中の水酸基の配置は何れでもよく、反応に不必要な官能基を文献［プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］に記載の方法によって適当に保護、あるいは誘導体化してから、反応に使用することができる。
ポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物およびトシル化物はＳａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙの総括［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に開示された各種の方法で容易に製造することができる。結合に使用するポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物およびトシル化物としては分子量分布が均一であれば（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）いかなる平均分子量のものも用いられる。
得られた３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物はそのままの純度、あるいはイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で３本鎖、４本鎖、５本鎖、またはそれ以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を分岐数に応じて任意の純度に精製、単離して、次のステップに用いることができる。ここまでの工程で、化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊｘ）のいくつかが得られる。
一方、ポリハライド類またはポリトシル類とポリアルキレングリコール類Ａｘを使用することによっても目的の３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を調製することができる。この場合、３モル相当以上のポリアルキレングリコール類ＡｘをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１モルのポリアルキレングリコール類Ａｘあたり１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１モル相当のポリハライド類またはポリトシル類を加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて目的物が得られる。
ポリハライド類は市販の化合物であるか、前記ポリオール類をハロゲン化合物に変換［日本化学会編、実験化学講座、第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］して得られる。ポリトシル類はポリオール類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、水酸基当たり１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、カリウムナフタレン等の適当な塩基の存在下、水酸基当たり１〜３モル相当のハロゲン化トシルを加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させることで得ることができる。
次に、得られた３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物または精製化合物に、Ｒ２ｘを導入する。Ｒ２ｘとしては、ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に結合した後、ポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に残存している官能基をそのまま利用するか、あるいはあらかじめポリオール類に結合している官能基を保護しておき、ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合後、官能基の保護基を除去して得られる基を利用してもよい。この場合、前記ポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類中の１個所以上の水酸基、または他の官能基を適当な保護基で保護した後、前記と同様の方法で残りの水酸基、ハロゲンまたはトシル基部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を導入し、３本以上のポリアルキレングリコールが結合した化合物を合成し、保護基を除去した官能基をそのまま利用するか、あるいは該官能基の少なくとも一つを後述する方法に従ってＲ２ｘに変換する。ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合する前、もしくは結合した後にポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に存在する官能基としては、水酸基の他に、カルボキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、ホルミル、カルボニル等がある。適当な官能基の保護基としては水酸基の場合、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリル、ジフェニルｔｅｒｔ−ブチルシリル、トリメチルシリル、トリフェニルシリル、トシル、テトラヒドロピラニル等があげられ、アミノの場合、メチル、エチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｎ−フタルイミド、アセチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等があげられ、カルボキシの場合、ベンジル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、９−フルオレニルメチル、メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、シンナモイル、アリル、ニトロフェニル等があげられ、ホルミルの場合、ジメチルアセタール、ジエチルアセタール、ジベンジルアセタール、１，３−ジオキサニル等があげられる［プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）］。
あらかじめ存在する官能基をそのまま、または保護、脱保護してＲ２ｘとして利用でき、Ｌｘ部分の構造を構築する原料となるポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類の具体例としては、シキミ酸、キナ酸、３，４，５−トリヒドロキシベンゾイックアシッド、コール酸またはこれらのハライド、トシル化物等があげられる。
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｌｘを含む化合物に新たに置換基Ｒ２ｘを導入して得られる化合物の場合、例えば以下の製造方法で容易に製造を行うことができる。
製造法１ｘ−１
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシである式（Ｉａａｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｘ１ａｘは結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａｘ、または（ＣＨ２）ｔｂｘＯを表し、Ｒ１ｘＬｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２ｘがカルバモイルである式（Ｉａｂｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２ｘがシアノである式（Ｉａｃｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は例えば以下のように合成することができる。
化合物（Ｉａａｘ）、化合物（Ｉａｂｘ）および化合物（Ｉａｃｘ）は、ポリオール類を用いて、例えば製造法１ｘに従って得られる化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘとして水酸基を有する化合物（Ｉａｊｘ）を含む反応混合物または精製化合物を水、塩化メチレン、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中、触媒量または１〜２０％の塩基存在下、１〜３０モル相当のアクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル等と、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させて得ることができる。塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等があげられる。また、化合物（Ｉａａｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）を含む反応混合物または精製化合物を無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モル相当のα−ハロゲン化酢酸エステルと、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させた後、加水分解して得ることもできる。さらに、化合物（Ｉａａｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、γ−アミノ酪酸、グリシン、β−アラニン等のアミノ酸またはその誘導体と反応させることによっても得られる。
また、製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）を前記同様の塩基存在下、無水コハク酸、無水グルタル酸等の酸無水物と反応させることによっても化合物（Ｉａａｘ）を製造することができる。
また、化合物（Ｉａａｘ）は、例えばポリハライド類を用いて製造法１ｘに従って、化合物（Ｉａｘ）のうちＲ２ｘがハロゲン化低級アルキルである化合物（Ｉａｉｘ）を製造した後、ヒドロキシカルボン酸エステル、マロン酸エステル、γ−アミノ酪酸のエステル体、β−アラニンのエステル体、グリシンのエステル体等をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、化合物（Ｉａｉｘ）を加え、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応を行った後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａｘ）は、例えば前記ポリオール類もしくはポリハライド類の一個所以上の水酸基またはハロゲンを、あらかじめカルボン酸あるいはカルボン酸の保護体を含む残基で置換し、これを用いて製造法１で示した方法でポリオール類もしくはポリハライド類の残りの３個所以上の水酸基またはハロゲンをポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物で置換することで得ることもできる。この場合、カルボン酸またはカルボン酸の保護体を含む残基の導入は、前記と同様にして行うことができる。カルボン酸を保護した場合には、ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリオール類もしくはポリハライド類に導入した後に脱保護して遊離カルボン酸を生成させる。
カルボン酸に変換された化合物は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で、任意の純度で精製、単離することができる。
製造法１ｘ−２
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがアミノである式（Ｉａｄｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１ｘ−１で得られる化合物（Ｉａｃｘ）に適当な還元剤を作用させて得られる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
また、化合物（Ｉａｄｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｉｘ）または化合物（Ｉａｉｘ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物に５当量〜過剰量のエチレンジアミン、プロピレンジアミン等のジアミン類を適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
さらに、製造法１ｘ−１で示したのと同様に、化合物（Ｉａｄｘ）は、例えば化合物（Ｉａｊｘ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、１当量〜過剰量のエチレンジアミンやプロピレンジアミン等のジアミン類と適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
また、化合物（Ｉａｄｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のアミノまたはアミノの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがマレイミドである式（Ｉａｅｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＯｓｋａｒ Ｋｅｌｌｅｒらの方法［ヘルベチカ キミカ アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、５８巻、５３１頁（１９７５年）］またはＴｉｍｏｔｈｙ Ｐ．Ｋｏｇａｎらの方法［シンセティック コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎ．）、２２巻、２４１７頁（１９９２年）］に従い、化合物（Ｉａｄｘ）とＮ−アルコキシカルボニルマレイミドとを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させることで得ることができる。Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミドとしてはＮ−エトキシカルボニルマレイミドやＮ−メトキシカルボニルマレイミドを用いることができる。
また、化合物（Ｉａｅｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のマレイミドを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｄｘ）、化合物（Ｉａｅｘ）およびそれらの合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１ｘ−３
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがホルミルである式（Ｉａｆｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｘ）のうちＲ２ｘとしてヒドロキシメチルを有する化合物（Ｉａｇｘ）を適当な酸化剤で酸化することで得られる。酸化剤としては塩化クロム酸ピリジニウム、クロム酸、銀イオン、ジメチルスルホキシド等があげられる。また、化合物（Ｉａａｘ）を前記と同様に適当な還元剤で還元することによっても得ることができる。
また、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）、化合物（Ｉａｉｘ）または化合物（Ｉａｉｘ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物にアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール、ハロゲン化エチルアセタール、ハロゲン化メチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
同様にして、製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）を用い、製造法１ｘ−１で示した方法に準じて水酸基を活性化し、続いてアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
また、化合物（Ｉａｆｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のアルデヒド、あるいはアルデヒドの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法でも得られる。
化合物（Ｉａｆｘ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１ｘ−４
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがハロゲン化カルボニルである式（Ｉａｈｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｚ１ｘはハロゲンを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２ｘがカルボキシである化合物（Ｉａａｘ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化カルボニルにおけるハロゲンは前記ハロゲンと同義である。
製造法１ｘ−５
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがハロゲン化低級アルキルである式（Ｉａｉｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｚ２ｘはハロゲン化低級アルキルを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２ｘが水酸基である化合物（Ｉａｊｘ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化低級アルキルにおけるハロゲンおよび低級アルキル部分はそれぞれ前記と同義である。
また、化合物（Ｉａｉｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）またはＲ２ｘがアミノである化合物（Ｉａｄｘ）に、前記同様適当な塩基存在下、５当量〜過剰量のジブロモエタンやジブロモプロパン等のジハロゲン化アルキル類を反応させることによっても得られる。
さらに、化合物（Ｉａｉｘ）は、例えば前記製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のハロゲン化低級アルキルを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｉｘ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１ｘ−６
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがイソシアナートである式（Ｉａｋｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば、化合物（Ｉａｄｘ）をトルエン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、ホスゲンまたは塩化オキサリルと０〜１５０℃で１〜２４時間反応させるか、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応させた後に室温で分解させて得られる。
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがイソチオシアナート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）である化合物（Ｉａｐｘ）はホスゲンの代わりにチオホスゲンを用いる以外は上記の方法に従って製造することができる。
製造法１ｘ−７
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルである式（Ｉａｌｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ２ａｘはスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、通常のエステル合成方法に従って製造することができる。例えば、化合物（Ｉａａｘ）１モルに対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、置換もしくは非置換の水酸化アリール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシフタルイミド１〜１０モルを、１〜１０モルのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤存在下、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中、−２０〜１００℃で１〜２４時間反応させることによって目的物を得ることができる。より詳しくは、Ａ．Ｆｒａｄｅｔら［ポリマーブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、４巻、２０５頁（１９８１年）］、またはＫ．Ｇｅｃｋｅｌｅｒら［ポリマー ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、１巻、６９１頁（１９７９年）］によるポリアルキレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法、カルボキシメチルポリアルキレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造方法等に準じて得ることができる。
ここで、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルは前記と同義である。水酸化アリールのアリール部分はアリールオキシカルボニルのアリール部分と同義であり、置換水酸化アリールの置換基は、置換アリールオキシカルボニルの置換基と同義である。
製造法１ｘ−８
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがビニルスルホニルである式（Ｉａｍｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば化合物（Ｉａｊｘ）を用いてＭａｒｇｈｅｒｉｔａ Ｍｏｒｐｕｒｇｏらの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、７巻、３６３頁（１９９６年）］で製造することができる。
製造法１ｘ−９
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘが置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである式（Ｉａｎｘ）
Figure 0004142569
（式中、Ｒ２ｂｘは置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＴａｌｉａ ＭｉｒｏｎとＭｅｉｒ Ｗｉｌｃｈｅｋの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に準じて、Ｒ２ｘが水酸基である化合物（Ｉａｊｘ）と過剰量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、エチルクロロホルメート等とをジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等の塩基存在下で反応させることで得られる。
また、化合物（Ｉａｎｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上の置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法で得ることもできる。
化合物（Ｉａｎｘ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
ここで、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシはそれぞれ前記と同義である。
製造法２ｘ：Ｘ１ｘがＳである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＳである化合物（Ｉｂｘ）は、例えば製造法１ｘと同様に、ポリオール類をポリハライド類に変換した化合物［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］または市販のポリハライド類と、ポリアルキレングリコール類Ａｘのチオール誘導体とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
また、化合物（Ｉｂｘ）は、前記の工程とは逆に、ポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリチオール類と反応させることによっても得ることができる。
ポリアルキレングリコール類Ａｘのチオール誘導体は市販のものを用いるか、Ｓａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってまとめられた方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］で調製できる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１ｘに準じる。
製造法２ｘ−１
化合物（Ｉｂｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、Ｘ１ｘが−Ｓ−である化合物を製造法２ｘに従って製造した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法３ｘ：Ｘ１ｘがＮＲ３ｘである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＮＲ３ｘ（式中、Ｒ３ｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｃｘ）は、例えば製造法１ｘと同様に、ポリオール類をポリアミン類に変換した化合物または市販のポリアミン類と、ポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物もしくはトシル化物とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
化合物（Ｉｃｘ）は、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体をポリハライド類と反応させることによっても得ることができる。
また、化合物（Ｉｃｘ）はポリアルデヒド類１当量と、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体（該ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体は、ポリアルデヒド類の１つのホルミル基あたり１〜３０当量存在させる）とを、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、水、緩衝液等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、−２０〜１００℃でシアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤（該還元剤は、ポリアルデヒド類の１つのホルミル基あたり１〜３０当量用いる）の存在下で反応させることによっても得ることができる。
さらに、化合物（Ｉｃｘ）は、ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａｘのアルデヒド誘導体を用いても製造することができる。
前記ポリアルデヒド類としては市販の化合物をそのまま用いるか、ポリアルコール類を酸化して用いるか、あるいはポリカルボン酸類を還元して用いればよい。また、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアルデヒド誘導体としては市販の化合物を利用できるし、また、ポリアルキレングリコール類Ａｘの末端のアルコールを酸化して用いることもできる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１ｘに準じる。
製造法３ｘ−１
化合物（Ｉｃｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｃｘ）を製造法３ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて製造することができる。
製造法４ｘ：Ｘ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘまたはＲ６ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７ｘである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘ（式中、Ｒ４ｘおよびＲ５ｘはそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄａｘ）は、例えばγ−カルボキシグルタミン酸、クエン酸、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸等から選ばれるポリカルボン酸化合物をペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］に従い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中に溶解または懸濁し、次いでポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール等のアルコール体と、ポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩等の縮合剤を加え、さらにポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体を加えて反応させることによって得ることができる。反応は無水条件下、−２０℃〜１００℃で、１時間〜１０日間攪拌することによって行われる。
また、ポリカルボン酸分子中の１個以上のカルボキシをメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル等の適当な保護基で保護した後、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体を残りのカルボキシに前記の方法で導入し、続いてカルボキシの保護基を通常の脱保護法で除去することによって、Ｒ２ｘがカルボキシである３本鎖以上の分岐型ポリエチレングリコール誘導体を高純度に含む反応液を得ることもできる。この場合、カルボン酸の保護基の導入や該保護基の除去には通常のペプチドの合成法で用いられる方法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］を利用できる。ポリカルボン酸類中のカルボキシの配置は、立体配置を含めて何れでもよく、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体としては分子量分布が均一（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）であればいかなる平均分子量のものを用いてもよい。
また、化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ６ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７ｘ（式中、Ｒ６ｘおよびＲ７ｘはそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄｂｘ）は、前記工程とは逆に、ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａｘのカルボン酸誘導体の活性エステル、あるいはポリアルキレングリコール類Ａｘの酸ハライド誘導体とを反応させる方法でも得ることができる。ポリアルキレングリコール類Ａｘの酸ハライド誘導体はポリアルキレングリコール類Ａｘのカルボン酸誘導体をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で、１〜２４時間加熱することによって得ることができる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法４ｘ−１
化合物（Ｉｄａｘ）および化合物（Ｉｄｂｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｄａｘ）または化合物（Ｉｄｂｘ）を製造法４ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法５ｘ：Ｘ１ｘがＲ８ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯまたはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９ｘである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ８ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８ｘは前記と同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９ｘ（式中、Ｒ９ｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｅｘ）は、例えばポリアルキレングリコール類Ａｘとポリカルボン酸類、あるいはポリアルキレングリコール類Ａｘのカルボン酸誘導体とポリオール類の組合わせを用いて、脱水縮合により得ることができる。脱水縮合の方法としては通常のエステル合成で用いられるような、酸または塩基触媒下に脱水する方法か、あるいはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ピリジン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤で対応するアルコール体とカルボン酸を縮合する方法等を利用することができる。さらに、上記工程において酸ハロゲン化物と、対応するアルコール体を反応させることによっても目的物を合成できる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法５ｘ−１
化合物（Ｉｅｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｅｘ）を製造法５ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法６ｘ：Ｘ１ｘがＲ６ａｘ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨまたはＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ６ａｘ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（式中、Ｒ６ａｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｆａｘ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
市販のポリアミン類、または前記製造法を組み合わせてポリオール類より調製したポリアミン類にポリアルキレングリコール類Ａｘのカーボネート誘導体を３モル以上反応させて、化合物（Ｉｆａｘ）を含む粗生成物が得られる。なお、ポリアルキレングリコール類Ａｘのカーボネート誘導体は、Ｔａｌｉａ Ｍｉｒｏｎらの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に従って製造することができる。また、ポリアルキレングリコール類Ａｘのカーボネート誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、イミダゾリルカルボニルオキシ誘導体等を利用することができる。
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ４ｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｆｂｘ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
化合物（Ｉｆｂｘ）はポリオール類のカーボネート誘導体とポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体とを上記と同様に反応させることによって得ることができる。
他の製造法に準じて官能基の保護、脱保護を組み合わせることによって、化合物（Ｉｆａｘ）または化合物（Ｉｆｂｘ）を選択的に生成させることもできる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法６ｘ−１
化合物（Ｉｆｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｆｘ）を製造法６ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて調製することができる。
Ｒ１ｘ−（Ｍｘ）ｎｘ−Ｘ１ｘをＬｘに結合して１本鎖化合物あるいは２本鎖化合物を取得し、同様の反応で前記と同一または異なるＲ１ｘ−（Ｍｘ）ｎｘ−Ｘ１ｘをＬｘに結合して、３本鎖以上の化合物を取得することもできる。例えば、製造法１ｘ〜製造法６ｘに示した方法のうちいずれかの反応を利用してＬｘ中の１個所あるいは２個所の官能基にポリアルキレングリコール類を結合させ、１本鎖あるいは２本鎖化合物を得る。生成する１本鎖あるいは２本鎖化合物の割合は、反応に使用するポリアルキレングリコール類と、Ｌｘ部分の構造を構築する原料の比を変えることで調節することができ、１本鎖あるいは２本鎖化合物を主成分にすることも可能である。得られた１本鎖あるいは２本鎖化合物はそのままの純度で、あるいは製造法１ｘに示した方法に準じてポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度に、あるいは高純度に精製して次のステップに使用することができる。
このようにして得られた１本鎖あるいは２本鎖化合物と、前記と同一または異なるポリアルキレングリコール類を製造法１ｘ〜製造法６ｘに示したいずれかの方法に準じて結合して、３本鎖以上の化合物が調製できる。なお、３本目以上のポリアルキレングリコール類は１本鎖あるいは２本鎖化合物を取得した反応と同様の反応に付すこともできるが、異なる反応に付し異なる結合様式を有するように調製してもよい。例えば、水酸基、アミノ、カルボキシ等の複数の官能基を有する化合物をＬｘ部分の構造を構築する原料に使用する場合、製造法１ｘに示した方法でＸ１ｘがＯである１本鎖あるいは２本鎖化合物をまず取得し、次いで製造法４ｘに示した方法で３本目以上のポリアルキレングリコール類をＸ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘとなるように反応させることができる。以上のように製造法１ｘ〜６ｘの組合わせで複数のポリアルキレングリコール類が同一または異なる結合様式でＬｘに結合した３本鎖以上の化合物を得ることができる。さらに、使用するポリアルキレングリコール類は各反応の段階で分子量が異なっていてもよく、各々のポリアルキレングリコール類をＬｘに結合させる反応で異なる平均分子量のポリアルキレングリコール類を使用することで容易に目的物が得られる。
また、Ｌｘにポリアルキレングリコール類を導入する反応において、Ｌｘ中の１個所以上の官能基（例えば製造法１ｘの場合、１個所以上の水酸基）を残し、他の官能基を適当な保護基で保護してから、ポリアルキレングリコール類と反応、結合させ、その後、保護基を除去することも可能である。
本発明のポリアルキレングリコール類は、上記製造法で具体的に示された化合物以外であっても、上記製造法に準じて得ることができる。
なお、先にも述べたとおり、製造法１ｘ〜６ｘの各工程において、原料に用いるポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるが、Ｓａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙによってまとめられた各種の方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等によって容易に製造することも可能である。
得られたポリアルキレングリコール類はシリカゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、再結晶、抽出等の方法によって、ポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度の分岐型ポリアルキレングリコール類に精製することができる。
得られた分岐型ポリアルキレングリコール類は前記生理活性ポリペプチドのアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基に直接、あるいはスペーサーを介して結合させることができる。
スペーサーとしてはアミノ酸やペプチドが好ましいが、ポリアルキレングリコール類を結合することができればそれ以外であってもよい。アミノ酸としてはリジン、システイン等の天然アミノ酸等を用いることができ、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ホモシステイン等を用いることもできる。より好ましくは、システインがあげられる。ペプチドとしては、アミノ酸残基２〜１０からなるものが好ましい。アミノ酸、ペプチド以外のスペーサーとしては、グリセロール、エチレングリコール、糖等があげあれれる。ここで、糖としては、グルコース、ガラクトース、ソルボース、ガラクトサミン、ラクトース等の単糖類や二糖類等があげられる。
これらのスペーサーは、生理活性ポリペプチド分子中のリジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等の残基の側鎖とアミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等を介して結合するか、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基とアミド結合やエステル結合するかペプチドのＮ末端アミノ基とアミド結合する。これらの結合は、通常のペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］や遺伝子組換法を用いて行うことができる。
この場合、生理活性ポリペプチドを合成するのと同時にＣ末端カルボキシル基にスペーサーとなるアミノ酸、ペプチド等を導入することが望ましいが、生理活性ポリペプチドを合成した後にスペーサーを結合してもよい。また、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基等を化学合成的に活性化してスペーサーに結合することもできる。また、ポリアルキレングリコール類を予め結合したスペーサーを前記の方法で生理活性ポリペプチドに結合することもできる。
本発明で使用される抗体は、公知の手段［アンティボディーズ ア ラボラトリー マニュアル、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８年）］を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
本発明で使用される抗体として、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片等があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体等があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であればいかなるものも用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のＣＤＲのアミノ酸配列をヒトの抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の適切な位置に移植した抗体を意味する。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片、相補性決定領域を含むペプチド等があげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖとも称す）は、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬとしては、本発明のモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも称す）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［プロテイン エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、７巻、６９７頁（１９９４年）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のジスルフィド安定化抗体に含まれるＶＨあるいはＶＬとしてはモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
本発明で使用される化学修飾ポリペプチドとしては、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドが好ましく、この化学修飾ポリペプチドを含有する医薬も好ましい。また、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドを含有する医薬としては、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドを含有する多発性硬化症治療薬、肝炎治療薬、血管新生が関与する疾患の治療薬、悪性腫瘍治療薬、眼疾患治療薬、皮膚疾患治療薬等があげられるが、好ましいのは多発性硬化症治療薬である。
本発明の化学修飾ポリペプチドを含有する軟膏剤は、通常の軟膏剤調製法によって製造することができる。例えば、軟膏基剤としては水溶性薬剤の軟膏が調製可能なマクロゴール、ソルベース等の親水性基剤、親水軟膏、親水ワセリン、親水プラスチベース、精製ラノリン等の乳剤性基剤、ベントナイト、ビーガム、澱粉糊、アルギン酸ナトリウム等の無脂肪性基剤等を用いることができ、これらの軟膏基剤に化学修飾ポリペプチド水溶液、懸濁液、またはこれらの凍結乾燥粉末を０．００００００１〜１０％の重量比で混合し、文献［「薬剤学」（瀬崎ら）、平成４年発行、廣川書店］等に示された通常の軟膏剤の調製方法に従って練合することで調製される。これらの剤形には通常用いられる緩衝剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、酸化防止剤等の慣用の添加剤を添加して用いることもできる。
投与方法としては経皮的に、あるいは経粘膜的に本発明の軟膏剤を塗布する方法か、または他の許容される方法が可能であり、投与に適する組成物を用いることができる。また軟膏剤中の化学修飾ポリペプチドの配合量は疾患の種類、患者の状態等の条件によって異なるが、化学修飾ポリペプチド中の生理活性ポリペプチドが、軟膏剤１ｇ中に０．００００００１％〜１０％（重量比）で含まれていることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。実施例中の略号は特に断らない限り、それぞれ以下のことを意味する。なお、本明細書において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告［ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１３８巻、９頁（１９８４年）］に従った。
ＨＰＬＣ：Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ
ＦＡＢ ＭＳ：Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂｅｒｅｄ Ｍａｓｓ
ＵＶ：Ｕｌｔｒａ Ｖｉｏｌｅｔ
ＲＩ：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ
ＮＭＲ：Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）
ｍＰＥＧ：モノメトキシポリエチレングリコール（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）
ＩＦＮ：インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｈＩＦＮ：ヒトインターフェロン（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｒｈＩＦＮ：組換えヒトインターフェロン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）
ｒｈＧ−ＣＳＦ：組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）
ＳＯＤ：スーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ｂＳＯＤ：ウシスーパーオキサイドディスムターゼ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ｈＳＯＤ：ヒトスーパーオキサイドディスムターゼ（ｈｕｍａｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ＤＳＣ：Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）
ＴＥＡ：トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）
Ｔｓ：ｐ−トルエンスルホニル（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）
ＴｓＣｌ：ｐ−塩化スルホニルトルエン（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）
ＬＡＨ：水素化アルミニウムリチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＣＤＩ：Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（Ｎ，Ｎ’−ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ）
実施例１ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）
構造：
Figure 0004142569
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール二水和物（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）（Ｆｌｕｋａ社製）４２０．５ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ３．２ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン気流中、アセトニトリル２０ｍｌに溶解し、ＴＥＡ２．１ｍｌ（１２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、クロロホルムおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えて抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）シクロヘキサン［ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｔｒｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ］３５７ｍｇ（０．６４ｍｍｏｌ）を得た（収率：２５．７％）。
次に、モノメトキシポリエチレングリコールプロピルアミン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）（ｍＰＥＧ−ＮＨ２）［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、および上記のｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）シクロヘキサンを塩化メチレン１２．５ｍｌに溶解し、ＴＥＡ２８μｌを加え、室温で２時間攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、残渣を４７２ｍｇ取得した（収率９４．４％）。そのうち、３７２ｍｇを逆相ＨＰＬＣで精製した。カラムにはＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔ（３０ｍｍ×２５０ｍｍ）（東ソー）を用い、０．１％ＴＦＡ水溶液を移動相として、１０ｍｌ／分の流量で流し、０〜９０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させた。平均分子量１０，０００の目的の画分３０ｍｌを回収し、減圧下アセトニトリルを除去し、クロロホルムで抽出した。これをジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を濾取し減圧乾燥して目的物１２１．７ｍｇを得た（回収率３２．７％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．７ｍｌ／分
検出：ＲＩ
分離カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）（東ソー）
カラム温度：室温
保持時間：１２．２分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６１（ｓ，８ｎＨ），３．４１（ｓ，６Ｈ），４．６９（ｂｒ，４Ｈ），１．７７（ｂｒｍ，４Ｈ），５．３０（ｂｒ，２Ｈ），０．８−３．４（ｍ，９Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ）
実施例２ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）
構造：
Figure 0004142569
８４．０ｍｇ（０．３８８ｍｍｏｌ）のｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（Ｆｌｕｋａ社製）をＤＭＦ５０ｍｌに溶解し、２７０．２ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔおよび１．０４ｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰを加えて０℃で３０分間攪拌した。５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）のモノメトキシポリエチレングリコールプロピルアミン［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］、続いて２１９．７μｌ（１．９ｍｍｏｌ）のＮＭＭを加え、一昼夜攪拌した。１ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を回収し、目的の化合物を含む粗生成物を３．７８ｇ（収率７５．６％）取得した。次に、３００ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。水に溶解した粗生成物をカラムに添加し、さらに水６００ｍｌでカラムを洗浄した後、０．６〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。その後、目的物の画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧下除去して目的物を６１０．４ｍｇ（収率６５．２％）取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．０分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．５６（ｍ，３Ｈ），２．１−２．５（ｍ，６Ｈ），１．７７（ｍ，４Ｈ），２．１−２．３（ｂｒ，４Ｈ），３．３８（ｂｒ，４Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３６（ｓ，６Ｈ），６．４６（ｔ，Ｊ＝５．２３Ｈｚ，２Ｈ）
実施例３ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）
構造：
Figure 0004142569
ｍＰＥＧ［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５０ｇ（１０ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのトルエンに溶解し、脱水還流した。ＴＥＡ３．５ｍｌ（２５ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間かけて、臭化チオニル（１．５５ｍｌ）をあらかじめトルエン（１３．６ｍｌ）に溶解した溶液を滴下した。１時間還流した後、セライトを用いて濾過し、４時間室温で静置した。次に５０℃に加熱して活性炭を５ｇ加えた。セライトを用いて活性炭を除去し、４℃で１昼夜静置した。翌日、上清を除去した後、残渣を６０℃のエタノール２５０ｍｌへ溶解した。そこへ３ｇの活性炭を加え、セライトを用いて活性炭を除去した後、４℃で一昼夜静置した。翌日、残渣を冷エタノールとジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した後、臭素化したｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−Ｂｒ）を３２．８７ｇ（収率６５．７４％）取得した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール二水和物（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）１．３２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を十分乾燥後、無水ＤＭＦ２５ｍｌに溶解し、アルゴン気流中、水素化ナトリウム０．４８ｇ（１１ｍｍｏｌ）へ滴下し、３０分間攪拌した。そこへＤＭＦ２５ｍｌに溶解した上記のｍＰＥＧ−Ｂｒ１０ｇ（２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、沈殿を減圧下乾燥した。次に、乾燥した粉末を適量の水に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解し、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥してｍＰＥＧがシクロヘキサントリオール（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ）に１分子結合した１本鎖型粗生成物を７．５ｇ（収率７５．０％）取得した。
得られた粗生成物５ｇにトルエン５０ｍｌを加え、一昼夜脱水還流を行った。また、ｍＰＥＧ−Ｂｒ５．５ｇ（１．１ｍｍｏｌ）をトルエン５０ｍｌに溶解し、１６０℃で一昼夜脱水還流を行った。次に、上記粗生成物のトルエン溶液に水素化ナトリウム１４４ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した後、ｍＰＥＧ−Ｂｒのトルエン溶液を滴下し、一昼夜脱水還流を行った後、濾過して不溶物を除去し、減圧下乾燥した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下除去し、残渣に塩化メチレン少量を加えて溶解した後、ジエチルエーテルに滴下した。生成した白色沈殿を減圧乾燥し、目的の化合物を含む粗生成物を７．７３ｇ（収率７３．６％）取得した。
粗生成物１．５ｇを８％水酸化カリウム水溶液に溶解した後、アクリルアミド１５０ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で７時間攪拌した。さらにアクリルアミド１５０ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４日間攪拌した。反応液を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾別し、減圧乾燥して粗目的物１．０１７ｇ（６７．８％）を得た。
６０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に添加し、０．４〜１．４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。目的物を含む画分をクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧除去し、目的物を５２ｍｇ取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．５９（ｔ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，２Ｈ），０．８−３．４（ｍ，９Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例４ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）
構造：
Figure 0004142569
ｍＰＥＧ［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］４００ｇ（８０ｍｍｏｌ）をトルエン１Ｌおよび塩化メチレン５００ｍｌの混合溶媒に溶解した。ＴｓＣｌ５０ｇ、次いでＴＥＡ４６．４ｍｌを加え、室温で８時間攪拌した。次にＴｓＣｌ５０ｇを添加し、１６時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を少量のクロロホルムに溶解して、ジエチルエーテル中に滴下した。生成した白色沈殿を回収し、減圧下で乾燥してトシルエステル化ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＴｓ）３４４ｇを得た（収率８６．０％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．４５（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，４ｎＨ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）
ｍＰＥＧ−ＯＴｓ３４４ｇをＤＭＦ１Ｌに溶解後、ヨウ化ナトリウム５４ｇを加え、８０〜９０℃で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。残渣を１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液１．５Ｌに溶解し、しばらく攪拌した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を減圧除去し、ヨウ素化したｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−１）３１４ｇを得た（収率７８．５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．２７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｓ，４ｎＨ）
４０ｇのｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Ｆｌｕｋａ社製）をｎ−プロパノール１Ｌおよび濃硫酸２０ｍｌに溶解し、室温で７２時間攪拌した。その後、反応液に適当量の酢酸エチルを添加し、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸ｎ−プロピルエステル（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｎｐｒｏｐｙｌ ｅｓｔｅｒ）７２．４ｇ（収率：定量的）を得た。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．９４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，９Ｈ），１．６５（ｍ，６Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．５６，２．２５，２．４０（各々ｍ，計９Ｈ）
１．１９ｇのＬＡＨを５０ｍｌのジエチルエーテルに溶解後、アルゴン雰囲気下、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸ｎ−プロピルエステル３．２ｇのジエチルエーテル溶液１２．５ｍｌを滴下した。さらに攪拌しながら４１時間還流した。次いで、水２．５ｍｌを滴下し、そのまま１５分間攪拌した。さらにエタノール５ｍｌを滴下し、室温で３時間攪拌した。反応液を濾過し、不溶物を沸騰エタノールで抽出した。このエタノール溶液を先程の濾液と合わせ、溶媒を減圧下除去した。得られた残渣を沸騰１，４−ジオキサンで抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）１．５０ｇ（収率９１．７％）を得た。
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋１７５
理論値：Ｃ９Ｈ１８Ｏ３＝１７４
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．２１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，６Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，３Ｈ），０．４３，１．４０，１．７５（各々ｍ，計９Ｈ）
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール２．５ｇ（１４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ１０ｍｌに溶解し、０℃、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム２．２８ｇ（４６．２ｍｍｏｌ）へ滴下し、３０分間攪拌した。そこへＤＭＦ５０ｍｌに溶解した４０ｇ（８ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ−１を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧下乾燥させた。次に、乾燥させた上記の沈殿を適量の水に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して、ｍＰＥＧがｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールに２分子結合した２本鎖型粗生成物３３．０ｇ（８３．０％）を得た。
この粗生成物１４．０ｇを８％水酸化カリウム水溶液に溶解した後、アクリルアミド１．１８ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で７時間攪拌した。さらにアクリルアミド１．１８ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４日間攪拌した。反応液を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗生成物１０．２ｇ（７３％）を得た。この粗生成物を１０００ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて精製した。溶出は０．４〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で行った。目的物を含む画分をクロロホルムで抽出し、クロロホルム層から減圧下溶媒除去し、残渣をジエチルエーテルで沈殿させて目的物を５００ｍｇ得た。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），０．８５，１．２６（各々ｍ，計９Ｈ）
実施例５ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＵ）
構造：
Figure 0004142569
実施例４と同様にして、ｍＰＥＧがシクロヘキサントリメタノールに２分子結合した２本鎖粗生成物を取得した。この粗生成物２．７ｇを実施例１に示したＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラムを用いた逆相ＨＰＬＣで精製し、２本鎖ＰＥＧ誘導体のみを含む画分を回収した。この画分から減圧下、アセトニトリルを除去し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥し２２７ｍｇの２本鎖ＰＥＧ誘導体を得た（粗生成物からの収率８．４％）。２本鎖ＰＥＧ誘導体２０ｍｇ（２μｍｏｌ）を減圧乾燥し、１．２ｍｇ（１０μｍｏｌ）のＤＭＡＰおよび２．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）のＤＳＣを加え、塩化メチレンを１ｍｌ添加してアルゴン気流中室温で６時間攪拌した。反応液を濾過し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。生成した沈殿を回収し、減圧乾燥して、目的物を１５ｍｇ得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．５−２．０（ｍ，９Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ），３．６１（ｓ，８ｎＨ），３．４１（ｓ，６Ｈ）
実施例６ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＱＮＡ（２ＵＡ）、５ＱＮＡ（３ＵＡ）、５ＱＮＡ（４ＵＡ）
構造：
Figure 0004142569
式中、化合物５ＱＮＡ（２ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち２つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの２つが水素原子である。化合物５ＱＮＡ（３ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち３つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの１つが水素原子である。化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の全てがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−である）
３ｍｇの（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−（−）キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を乾燥ＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１７μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。さらに３４４ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）を添加し、室温で１時間攪拌した。１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物３０６ｍｇ（８８％）を得た。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例２と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して以下の化合物を得た。
化合物５ＱＮＡ（２ＵＡ）の収量は３６ｍｇ（収率１０．５％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１２．４分であった。化合物５ＱＮＡ（３ＵＡ）の収量は２４ｍｇ（収率１０．２％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１１．７分であった。化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）の収量は１７ｍｇ（収率５．４％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１１．１分であった。なおゲル濾過ＨＰＬＣはＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．７−４．８（ｍ，３Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈまたは９Ｈまたは１２Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨまたは１２ｎＨまたは１６ｎＨ）
実施例７ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキセン誘導体の合成
略号：５ＳＫＡ（２ＵＡ）、５ＳＫＡ（３ＵＡ）
構造：
Figure 0004142569
式中、化合物５ＳＫＡ（２ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３のうち２つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの１つが水素原子である。化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３の全てがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−である）
３．２ｍｇのシキミ酸を乾燥ＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１５μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。さらに３００ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）を添加し、室温で１時間攪拌した。１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物２７０ｍｇ（８９％）を得た。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例２と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して目的化合物を得た。
化合物５ＳＫＡ（２ＵＡ）の収量は４ｍｇ（収率１．３％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１２．４分であった。化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）の収量は１８ｍｇ（収率６．０％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１１．７分であった。なおゲル濾過ＨＰＬＣはＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．６−５．１（ｍ，４Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈまたは９Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨまたは１２ｎＨ）
実施例８ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＲａ）
構造：
Figure 0004142569
実施例４と同様にして合成したｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール５０ｍｇを脱水ＤＭＦ０．５ｍｌに溶解した後、水素化ナトリウム１７ｍｇを添加し、０℃で１５分間攪拌した。３−ブロモプロピオンアルデヒドジメチルアセタール４７μｌを添加し、室温で１６時間攪拌した。シリカゲルカラムで精製し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールの１位にプロピオンアルデヒドジメチルアセタール（ｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｌ）が結合した化合物を１５ｍｇ得た（収率３８％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６２（ｍ，９Ｈ），１．５４−１．８８（ｍ，９Ｈ），１．８３（ｑ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，４Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｔ，Ｊ＝５．７０Ｈｚ，１Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋２７７
理論値：Ｃ１４Ｈ２８Ｏ５＝２７６
得られた化合物１５ｍｇを脱水ＤＭＦ１ｍｌに溶解し、３１μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。５９８ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）を添加し、室温で２時間攪拌した。溶液を１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。得られた白色固体５７８ｍｇを実施例１と同様な逆相ＨＰＬＣで精製し、３８３ｍｇを得た。このうち１００ｍｇを７０％酢酸水溶液に溶解し、４０℃で１６時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応液を中和し、クロロホルムで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下反応液を濃縮した。ジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。逆相ＨＰＬＣで再度精製し、目的物を３９ｍｇ得た（収率４１％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），９．７９（ｔ，Ｊ＝１．５６Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ）
実施例９ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＭ）
構造：
Figure 0004142569
実施例４と同様にして合成したｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール１００ｍｇおよびＤＳＣ７３５ｍｇを約１０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、ＤＭＡＰ２１０ｍｇを加えて室温で５時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、塩化メチレンおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を適量加え抽出した。有機層を減圧乾燥し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシメチル）シクロヘキサン［ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｔｒｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ］を３３３ｍｇ得た（収率９７％）。
ＦＡＢ−ＭＳ：５９８（Ｍ＋Ｈ）＋
得られた化合物３０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）とｍＰＥＧ−ＮＨ２［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、ＴＥＡ２０μｌを加え、室温で２時間攪拌した。続いて、プロピレンジアミン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ）４２μｌ（０．５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ製）を加え、室温でさらに２時間攪拌した。反応液を濾過し濾液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して４３０ｍｇの粉末を得た（収率８６％）。
得られた粉末４２５ｍｇを水２００ｍｌに溶解し、２０ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、２本鎖ＰＥＧを含む目的画分よりクロロホルムで抽出し、得られた有機層をジエチルエーテルに滴下し、精製した沈殿を減圧乾燥した。得られた沈殿６２．５ｍｇ（６．２５μｍｏｌ）を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液０．５ｍｌに溶解し、氷冷下、エトキシカルボニルマレイミド２．１ｍｇを加えて１０分間攪拌した。続いて水１．５ｍｌを加え室温で１５分間攪拌し、クロロホルムで３回抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去し２５ｍｇの目的化合物を得た（収率４０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６３−０．７５（ｍ，３Ｈ），１．７５−１．７８（ｍ，１２Ｈ），３．１−３．３（ｍ，１２Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），５．２０（ｂｒ，３Ｈ），６．７３（ｓ，２Ｈ）
実施例１０ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）
構造：
Figure 0004142569
実施例４と同様にして合成したｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール１００ｍｇを脱水ＤＭＳＯ２３ｍｌに溶解した後、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウムのｔｅｒｔ−ブタノール溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）９５８ｍｌを添加し、室温で１時間攪拌した。ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを添加し、９０℃で１６時間攪拌した。室温まで放冷した後、シリカゲルカラムで精製し、１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）を２２ｍｇ得た（収率１３％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６０（ｍ，９Ｈ），１．５５−１．９０（ｍ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），３．３６（ｄ，Ｊ＝６．４２Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝６．１５Ｈｚ，４Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋２８９
理論値：Ｃ１５Ｈ２８Ｏ５＝２８８
上記で得られた化合物２２ｍｇをアルゴン雰囲気下、脱水ピリジン２００μｌに溶解し、そこへ塩化トシル（２３ｍｇ）を溶解した脱水ピリジン２００μｌを添加した。０℃で３時間攪拌した後、水を２０μｌ添加し、さらにその後１００μｌ添加した。反応液を氷冷したクロロホルムで抽出し、氷冷した１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の順で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、シリカゲルカラムで精製することにより、１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−３−Ｏ，５−Ｏ−ジトシル−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−３−Ｏ，５−Ｏ−ｄｉｔｏｓｙｌ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）を２２ｍｇ得た（収率４８％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．２６（ｍ，９Ｈ），１．７５（ｍ，９Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），２．４６（ｓ，６Ｈ），３．２９（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｍ，４Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．１０Ｈｚ，２Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ＋２Ｈ）＋５４１
理論値：Ｃ２９Ｈ４０Ｏ９Ｓ２＝５９６
１．４ｇのｍＰＥＧ（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）を脱水トルエン２ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム２６ｍｇへ滴下し、３０分間攪拌した。そこへ脱水トルエン５００μｌに溶解した７６ｍｇの１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−３−Ｏ，５−Ｏ−ジトシル−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールを滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。得られた白色固体１．２ｇを１２０ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラムで実施例２と同様に精製し、目的物を１５４ｍｇを得た（収率１１％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），０．５８（ｍ，９Ｈ），１．７２−１．９３（ｍ，９Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例１１ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−トリアジン誘導体の合成
略号：ＰＥＧ２Ｃｌ
構造：
Figure 0004142569
平均分子量５，０００のｍＰＥＧ［日本油脂（株）社製］２．０ｇ、酸化亜鉛４４４ｍｇ、乾燥ベンゼン１０ｍｌをナスフラスコに入れ、オイルバスで９０〜９５℃に加熱し、初留４ｍｌを除去した。さらに、５時間還流し、室温まで冷却後、塩化シアヌル３６ｍｇ、モレキュラーシーブス４Ａ１ｇを加え、３日間脱水還流した。反応液を冷却後、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を回収し、減圧乾燥した。得られた白色粉末１ｇをγ−アミノ酪酸３０ｍｇを含む０．１ｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ１０．０）１０ｍｌに溶解し、４℃で３日間反応した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ１〜２に調整した後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を濃縮し、ジエチルエーテルに滴下して生成した沈殿９３０ｍｇを回収した。これを９３０ｍｌの水に溶解し、８０ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を回収し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ１〜２に調整した後、適当量のクロロホルムで抽出し、減圧濃縮した。濃縮液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥し、目的物を６１８ｍｇ得た（収率６２％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様に分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９２Ｈｚ），１．９５（ｍ，２Ｈ），５．６６（ｂｒｔ，Ｊ＝６．３３Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｂｒｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｂｒｓ，８ｎＨ）
実施例１２ ６ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−トリアジン誘導体の合成
略号：ＰＥＧ２Ｍａｌ
構造：
Figure 0004142569
２．０ｍｌの１，３−ジアミノプロパン（２０当量、２４ｍｍｏｌ）を０．１ｍｏｌ／ｌのほう酸緩衝液（ｐＨ１０）６００ｍｌに溶解し、実施例１１で調製した化合物６ｇを加えて一昼夜攪拌した。２ｍｏｌ／ｌの塩酸を加えてｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下除去し、残渣に塩化メチレン少量を加えて溶解した後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥して２，４−ビス［メトキシポリ（エチレングリコール）］−６−Ｎ−（３−アミノプロピル）アミノ−ｓ−トリアジン｛２，４−Ｂｉｓ［ｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］−６−Ｎ−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ｝を４．４８ｇ得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ），４．４４（ｂｒｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．４９（ｂｒｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．１３Ｈｚ，），６．０２（ｂｒｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７４Ｈｚ），２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４７Ｈｚ），１．７１（ｍ，２Ｈ）
６７６ｍｇ（８ｍｍｏｌ）のマレイミドを酢酸エチル４０ｍｌに溶解し、氷冷下、Ｎ−メチルモルホリン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）を８７８μｌ（８ｍｍｏｌ）加え、続いてエトキシカルボニルクロリド（ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）９４６μｌ（９．６ｍｍｏｌ、１．２当量）加えて、３０分間攪拌した。反応液を濾過し、濾液を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、酢酸エチル−ジエチルエーテル系で再結晶してＮ−エトキシカルボニルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）を６５４ｍｇ得た（収率５５．６％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．８２（ｓ，２Ｈ），４．４２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．００Ｈｚ），１．４２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０９Ｈｚ）
上記で合成した２，４−ビス［メトキシポリ（エチレングリコール）］−６−Ｎ−（３−アミノプロピル）アミノ−ｓ−トリアジン｛２，４−Ｂｉｓ［ｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］−６−Ｎ−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ｝４．４８ｇ（０．４４８ｍｍｏｌ）を氷冷下、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液４５ｍｌに溶解し、Ｎ−エトキシカルボニルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）１５１．５ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ）を加えて０℃で１０分間攪拌した。水を１８０ｍｌ加え、さらに室温で１５分間攪拌した。クロロホルムで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解し、ジエチルエーテルに滴下した。生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して目的物｛２，４−ビス［メトキシポリ（エチレングリコール）］−６−Ｎ−（３−マレイミドプロピル）アミノ−ｓ−トリアジン［２，４−Ｂｉｓ［ｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］−６−Ｎ−（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ］｝を３．９ｇ得た（収率８６．７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６６（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ），６．７３（ｓ，２Ｈ），４．４６（ｂｒｍ，４Ｈ），５．７６（ｂｒｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７４Ｈｚ），２．６１（ｂｒｔ，２Ｈ），１．８５（ｍ，２Ｈ）
実施例１３ ５ＫＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−オルニチン誘導体の合成
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）
構造：
Figure 0004142569
１０ｇ（２ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ（平均分子量５，０００、日本油脂（株）製）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、ＤＳＣ２．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ１．２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を２００ｍｌのジエチルエーテル中に滴下し、沈殿させた。白色沈殿を濾取して減圧乾燥し、ｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅを８．６ｇ（収率８６．０％）得た。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６７（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ）
次に、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｉｎｅ）塩酸塩３３７．２ｍｇ（ナカライテスク製）を７５ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）１０ｎｌに溶解し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ１．０ｇを少しずつ加えて溶解した。１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を加えながら溶液のｐＨを７．８に維持し、室温で一昼夜攪拌した。１ｍｏｌ／ｌの塩酸でｐＨ３に調整した後、クロロホルムで抽出した。有機層から減圧下溶媒除去し、残渣を少量の塩化メチレンに溶解してジエチルエーテル中で沈殿させた。白色沈殿を濾取し、ｍＰＥＧが１分子結合したオルニチンを７６０．２ｍｇ得た（収率７６．０％）。これを、塩化メチレンに溶解し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ７６０．２ｍｇ加え、さらにＴＥＡ２１．２μｌを加えてアルゴン気流中、室温で一昼夜攪拌した。不溶物を濾別後、減圧下、溶媒を除去し、水５０ｍｌを加えて１ｍｏｌ／ｌ塩酸でｐＨ３に調整した。クロロホルムで抽出し減圧濃縮した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解してジエチルエーテル中に滴下し、生成した白色沈殿を濾取し１．２１ｇを得た（収率７９．６％）。６０ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的物を４１６ｍｇ取得した（収率３４．４％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．２１（ｂｒ，１Ｈ），５．５７（ｂｒ，１Ｈ），４．１−４．４（ｂｒｍ，４Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ），１．５−２．０（ｍ，６Ｈ）
実施例１４ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−オルニチン誘導体の合成
略号：５ＯＲＮ（２ＲａＡ）
構造：
Figure 0004142569
オルニチン（Ｏｒｎｉｔｉｎｅ）塩酸塩２４ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）（ナカライテスク製）をメタノール１０ｍｌに懸濁し、ＰＥＧ−アルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量５，０００）１．５ｇ（０．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で攪拌した。ソディウムシアノボロヒドリド（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）８９．５ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜攪拌した。さらにソディウムシアノボロヒドリド（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）４４．８ｍｇ（０．７ｍｍｏｌ）を追加し、攪拌した。その後、適量の水を加え、減圧下メタノールを除去した後、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去し、１．２５ｇの粗生成物を得た（収率８３．０％）。
次に、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（１２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて精製し、目的物１６５ｍｇを取得した（収率１３．３％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．６−２．１（ｍ，４Ｈ），３．０−３．３（ｍ，６Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），４．６８（ｂｒ，１Ｈ），４．７２（ｂｒ，１Ｈ）
実施例１５ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ジアミノプロピオン酸誘導体の合成
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）
構造：
Figure 0004142569
１０ｇ（２ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ（平均分子量５，０００、日本油脂（株）製）を塩化メチレンに溶解し、ＤＳＣ２．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ１．２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌した。不溶物を濾別し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。白色沈殿を濾取して減圧乾燥し、ｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅを８．６ｇ（収率８６．０％）得た。
次に、２，３−ジアミノプロピオン酸塩酸塩（２，３−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）２８１．１ｍｇ（２ｍｍｏｌ）（ナカライテスク製）を７５ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）１０ｍｌに溶解し、１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ１．０ｇを少しずつ加えて溶解した。１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加えながら溶液をｐＨ８．５に維持し、室温で一昼夜攪拌した。１ｍｏｌ／ｌ塩酸でｐＨ３に調整した後、クロロホルムで抽出した。有機層から減圧下溶媒除去し、ｍＰＥＧが１分子結合した２，３−ジアミノプロピオン酸を７３０．０ｍｇ得た（収率７３．０％）。これを、塩化メチレンに溶解し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ７３０．０ｍｇ加え、さらにＴＥＡ２０．４μｌを加えてアルゴン気流中、室温で一昼夜攪拌した。不溶物を濾別後、減圧下、溶媒を除去し、残渣を１．１８ｇを得た（収率８０．８％）。６０ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的物を５０７ｍｇ（収率４２．９％）取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．１分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．００（ｂｒ，１Ｈ），５．７０（ｂｒ，１Ｈ），４．１〜４．４（ｂｒｍ，４Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例１６ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−トリシン誘導体の合成
略号：５ＴＲＣ（３ＵＡ）
構造：
Figure 0004142569
０．５ｍｇ（２．８μｍｏｌ）のトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）（Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ、ナカライテスク社）と５０ｍｇ（１．０μｍｏｌ）のｍＰＥＧ−ＮＣＯ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量５，０００、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）をアルゴン気流下０．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、１．４μｌ（１．０μｍｏｌ）のＴＥＡを加え、さらに少量の塩化銅を加え、室温で攪拌した。さらに、２５ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯおよび１μｌのＴＥＡを追加して攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を５０ｍｌ加えた後、５０ｍｌのクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去し、粗生成物１５ｍｇを取得した（収率２０％）。次に、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）カラムで精製し、目的物を６．０ｍｇ取得した（収率８．０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ）（東ソー）を用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１１．５分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈ）、３．６４（ｓ，１２ｎＨ）、４．１０（ｓ，６Ｈ）、５．４３（ｂｒ，３Ｈ）
実施例１７ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）
構造：
Figure 0004142569
ペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをアルゴン気流中ＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ７７８ｍｇを加え、一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ２）５．０ｇをＤＭＦ１０ｍｌに溶解し、前述した反応混合物１．２５ｍｌを加え、室温で攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ１０）１００ｍｌにγ−アミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ ａｃｉｄ）２．６ｇを溶解した溶液を氷冷し、ここに反応液を注いだ。反応終了後、塩酸でｐＨを酸性に調整し、クロロホルムで抽出し、残渣を４．２ｇ得た（８４．６％）。残渣３．８ｇを１０００ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的物を２５４ｍｇ得た（収率６．７％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．４４（ｂｒｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ），５．２５（ｂｒ，１Ｈ），４．０９（ｂｒｓ，８Ｈ），３．６５（ｓ，１２ｎＨ），３．２９（ｓ，９Ｈ），３．２６（ｍ，８Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．８０（ｂｒｍ，２Ｈ），１．７７（ｍ，６Ｈ）
実施例１８ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＭ）
構造：
Figure 0004142569
ペンタエリスリトール１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ７７８ｍｇを加えてアルゴン気流中で一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ２）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物０．２５ｍｌを加え、室温で反応させた。続いて１８７μｌのプロピレンジアミンを加えて反応後、ジエチルエーテルを加えた。白色沈殿を回収し、減圧乾燥して残渣９７５ｍｇを得た（収率９７．５％）。この残渣を１００ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、白色粉末１１０ｍｇを得た（収率１１．３％）。
次に、この白色粉末１００ｍｇを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、０℃でエトキシカルボニルマレイミド２．３ｍｇを加え、さらに０℃で１０分間攪拌した。水を加え室温で１５分間攪拌後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を減圧濃縮後、ジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を減圧乾燥し、目的物３５ｍｇを得た（収率３５％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．３分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．７３（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｂｒ，３Ｈ），４．０８（ｂｒｓ，８Ｈ），３．６４（ｓ，１２ｎＨ），３．３６（ｓ，９Ｈ），３．２５（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｍ，８Ｈ）
実施例１９ ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）
構造：
Figure 0004142569
ペンタエリスリトール１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ６８１ｍｇを加えて、アルゴン気流中で攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物２８６μｌを加え、室温で反応した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を回収して減圧乾燥し、残渣を１ｇ得た（収率１００％）。続いて残渣をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、東ソー）を用いて精製し、白色粉末を１６５ｍｇ得た（収率１６．５％）。
次に、この白色粉末８０ｍｇを塩化メチレンに溶解し、ＤＳＣ４．１ｍｇ、ＤＭＡＰ２．１ｍｇを加え、アルゴン気流中室温で攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、目的物を６３ｍｇ得た（収率７８．８％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１０．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．４９（ｂｒ，３Ｈ），４．１１（ｂｒｓ，８Ｈ），３．６４（ｓ，１２ｎＨ），３．３８（ｓ，９Ｈ），３．２５（ｍ，６Ｈ），２．８７（ｓ，４Ｈ），１．７８（ｍ，８Ｈ）
実施例２０ ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＲａ）
構造：
Figure 0004142569
ペンタエリスリトール１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ６８１ｍｇを加えてアルゴン気流中で攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物２８６μｌを加え、室温で反応した。応液をジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を回収して減圧乾燥し、残渣を９５０ｍｇ得た（収率９５％）。続いて残渣をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、東ソー）を用いて精製し、白色粉末を３００ｍｇ得た（収率３１．６％）。
次に、この白色粉末３００ｍｇを塩化メチレンに溶解し、ＤＳＣ１５．４ｍｇ、ＤＭＡＰ７．３ｍｇを加え、アルゴン気流中室温で攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥した。塩化メチレン１ｍｌを加えて溶解し、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｉｅｔｈｙｌａｅｔａ）３．５μｌを加え、室温で攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、残渣を２５０ｍｇ得た（収率８３．３％）。
残渣１００ｍｇを１０％ＴＦＡを含む塩化メチレンに溶解し、０℃で１時間静置後、ジエチルエーテルに滴下して白色沈殿を減圧乾燥し、４０ｍｇの目的物を得た（収率４０．０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１０．６分
実施例２１ ３〜４本鎖分岐型ポリエチレングリコール−糖誘導体の合成
略号：５ＳＵＧ（３ＵＡ）、５ＳＵＧ（４ＵＡ）
構造：
Figure 0004142569
（式中、化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち３つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの１つが水素原子である。化合物５ＳＵＧ（４ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の全てがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−である）
５．１８ｇのα−Ｄ−グルコースペンタアセテートをＤＭＦ８０ｍｌに溶解し、２．３７ｇのヒドラジンアセテートを添加し、室温で１．５時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出後、酢酸エチル層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶液を減圧濃縮して、α−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４，６−テトラアセテート（α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ−２，３，４，６−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）を４．０ｇ得た（収率８７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｍ，１Ｈ），５．０９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）
８５０ｍｇの上記化合物を塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、０℃にて４．８ｍｌのトリクロロアセトニトリル、３６５ｍｌのＤＢＵ（１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ）を添加した。溶液を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、α−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４，６−テトラアセテート１−（２，２，２−トリクロロエタンイミデート）（α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ−２，３，４，６−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ−１−（２，２，２−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｉｍｉｄａｔｅ））を６３５ｍｇ得た（収率５３％）
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．５７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ），６．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），８．７１（ｓ，１Ｈ）
６９３ｍｇの上記化合物と１０９μｌのグリコール酸メチルを塩化メチレンに溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で攪拌した。反応液を冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルと脱水塩化メチレンの混合溶液（２：１）１６３μｌを添加し、一昼夜攪拌した。７７μｌのトリエチルアミンを添加し、セライトで濾過した。溶液を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］酢酸メチルエステル［（２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒを１６２ｍｇ得た（収率２７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：２．０１（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．０５（ｍ，１Ｈ），５．０９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），５．２５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ）
１６２ｍｇの上記化合物をメタノール１ｍｌに溶解し、アンバーリストを添加した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２８％）９．４μｌを添加し、室温で攪拌した。反応液をセライトで濾過し、濾液を減圧下濃縮して［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］酢酸メチルエステル［（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒを８０ｍｇ得た（収率８２％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：３．３９（ｓ，２Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），３．６９（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ）４．４４（ｍ，１Ｈ）
２ｍｇの上記化合物をＤＭＦ１００μｌに溶解し、７μｌのトリエチルアミン、少量のＣｕＣｌを添加した。２４０ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯを添加し、攪拌した。溶液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を回収し、減圧乾燥した。得られた白色固体２００ｍｇを１ｍｏｌ／Ｌ炭酸カリウム水溶液に溶解し、室温で４時間攪拌した。反応液にクロロホルムおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加し、クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧乾燥し、白色固体１９５ｍｇを得た。２０ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、下記に示す化合物を得た。
化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）の収量は６ｍｇ（収率５．０％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１０．８分であった。化合物５ＳＵＧ（４ＵＡ）の収量は１２ｍｇ（収率７．６％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１０．４分であった。なおゲル濾過ＨＰＬＣはＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈまたは１２Ｈ），３．６４（ｔ，１２ｎＨまたは１６ｎＨ），４．１〜５．６（ｍ，７Ｈ）
実施例２２ １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール誘導体の合成
略号：１０ＳＣＭ
構造：
Figure 0004142569
Ｓ．ＺａｌｉｐｓｋｙとＧ．Ｂａｒａｎｙの方法［ジャーナル オブ バイオアクティブ アンド コンパチブル ポリマーズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）５巻、２２７頁（１９９０年）］に準じて以下の方法で製造した。
ｍＰＥＧ［モノメトキシポリエチレングリコール、平均分子量１０，０００、日本油脂（株）社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＶＦＭ−３０１０Ｍ］１０ｇを乾燥トルエン５０ｍｌに溶解し、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウム１．１２ｇを加え蒸留し、初めの留分３０ｍｌを除去した。アルゴン気流中、５０℃に冷却後、α−ブロモ酢酸エチル１．１ｍｌを加え、一昼夜攪拌を続けた。反応混合物を５００ｍｌのジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾過により回収し、減圧下乾燥した。続いて、得られた乾燥粉末９．２ｇを１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１５０ｍｌに溶解し、室温で１時間攪拌した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１６０ｍｌを加え、クロロホルム５００ｍｌで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、１０ｍｌまで減圧濃縮した後、３００ｍｌのジエチルエーテル中に滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して目的化合物を白色粉末として７．５ｇ得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），４．１５（ｓ，２Ｈ）
実施例２３ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．３ｍｇ／ｍｌの参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β１．２ｍｌに、実施例１で取得した化合物１５ｍｇ（蛋白質１モル当たり２０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分１４．５ｍｌを回収し、水１４．５ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．２４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．４ｍｌを回収した（収率２１．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜５分子結合体のバンドを確認した。
＜電気泳動条件＞
ゲル：ＰＡＧＥＬ ＳＰＧ ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＦＡＳＴ ＳＴＡＩＮＴＭ
分子量マーカー：Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
分離カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ×２本連結）（東ソー社製）
保持時間：４０．３分（１〜４分子結合体）
実施例２４ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例２の化合物１００ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）を、１．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．７ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中０℃で３０分間攪拌した。その後３時間室温で攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例２の化合物のＮＨＳエステルを６５．０ｍｇ得た（収率６５．０％）。
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液１．２８ｍｌ（１．０６７ｍｇ／ｍｌ）へ、上記ＮＨＳエステルを１７ｍｇ（蛋白質１モルに対して２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分２４ｍｌを回収し、水２４ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．４９ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．５ｍｌを回収した（収率４４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを２本用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
Figure 0004142569
実施例２５ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例３の化合物２０ｍｇを塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ１．１５ｍｇおよびＤＣＣ２．０６ｍｇを加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥して実施例３の化合物のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率７２．５％）。
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液０．７８ｍｌ（０．９３７ｍｇ／ｍｌ）に、上記ＮＨＳエステルを９．１ｍｇ（蛋白質１モルに対して２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分８．５ｍｌを回収し、水８．５ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．０６７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分０．５ｍｌを回収した（収率４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
保持時間：３５．９分（１〜３分子結合体）
実施例２６ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中ＮＨＳ１６．８ｍｇ（１４６．０μｍｏｌ）およびＤＣＣ３０．１ｍｇ（１４５．９μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥して実施例４の化合物のＮＨＳエステルを２６０．０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
続いて、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．２２ｍｇ／ｍｌ）に上記ＮＨＳエステルを１４．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、０．２〜１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．１９４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分３．７５ｍｌを回収した（収率４９．７％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜２分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例２７ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１３の化合物１００ｍｇ（１０μｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍｌに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ３．５ｍｇ（３０μｍｏｌ）とＤＣＣ６．２ｍｇ（３０μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。反応液を濾過し、不溶物を除去した後、濾液をジエチルエーテル中に滴下して沈殿させた。沈殿を減圧乾燥して実施例１３の化合物のＮＨＳエステルを６５ｍｇ得た（収率６５％）。
次に、エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．０ｍｇ／ｍｌ）へ、上記で活性化した修飾剤を１２ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。
反応液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で実施例２３と同様に精製し、０．１１３ｍｇ／ｍｌの目的物を４．４ｍｌ得た（収率４１．４％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
Figure 0004142569
実施例２８ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＯＲＮ（２ＲａＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１４の化合物１００ｍｇ（１０μｍｏｌ）を１ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．７ｍｇ（５０μｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．３ｍｇ（５０μｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中氷冷下３０分、続いて室温で２時間攪拌した。反応液を濾過し不溶物を除去した後、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。沈殿を減圧乾燥して実施例１４の化合物のＮＨＳエステル５８ｍｇ（収率５８％）を得た。
次に、エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製したｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、上記のＮＨＳエステルを１４．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、反応した。反応液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．１２ｍｇ／ｍｌの目的物を３．５ｍｌ得た（収率３５．０％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
Figure 0004142569
実施例２９ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１５の化合物１００ｍｇ（１０μｍｏｌ）を１ｍｌの塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中ＮＨＳ５７．５ｍｇ（５０μｍｏｌ）およびＤＣＣ１０．３ｍｇ（５０μｍｏｌ）を加え０℃で３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下した。沈殿を減圧下乾燥して、実施例１５の化合物のＮＨＳエステルを７１ｍｇ（収率７１％）得た。
次に、エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製したｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．１ｍｇ／ｍｌ）へ、上記のＮＨＳエステルを１３．２ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、反応した。反応液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．１２ｍｇ／ｍｌの目的物を３．５ｍｌ得た（収率３１．８％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを２本用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
Figure 0004142569
実施例３０ ６ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：ＰＥＧ２Ｍａｌ−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウム、尿素、マンニトールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した２．４４ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β溶液０．６２ｍｌに、実施例１２で得た化合物（平均分子量１２，０００）２．７ｍｇ（蛋白質１モルあたり３モル）を加え、反応した。次に、反応液０．３８ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム（カラムサイズ２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈｉａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でゲル濾過精製し、０．１７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．５ｍｌを回収した（収率１６．９％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして測定した。
保持時間：４４．４分
実施例３１ ２０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：２０Ｍａｌ−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウム、尿素、マンニトールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した１．７２ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β溶液０．４２ｍｌに、ｍＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（平均分子量２０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）２．１ｍｇ（蛋白質１モルあたり３モル）を加え、反応した。次に、反応液０．３８ｍｌを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００カラム（カラムサイズ２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でゲル濾過精製し、０．１０ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．５ｍｌを回収した（収率２２．７％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様に分析した。
保持時間：４０．０分
実施例３２ ５ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５Ｍａｌ−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウム、尿素、マンニトールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した１．７ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β溶液０．４２ｍｌに、ｍＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）０．５５ｍｇ（蛋白質１モルあたり３モル）を加え、反応した。次に、反応液０．３８ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラム（カラムサイズ２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でゲル濾過精製し、会合体および未反応のｒｈＩＦＮ−βを除いた目的画分４．５ｍｌを回収した。さらに、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（カラムサイズ１ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製し、０．０８２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１ｍｌを回収した（収率１１．３％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして測定した。
保持時間：４６．２分
実施例３３ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＴＲＣ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１６の化合物５ｍｇ（０．３３μｍｏｌ）に塩化メチレンで調製した１．５ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ溶液５０μｌ（０．６６μｍｏｌ）、１．４ｍｇ／ｍｌのＤＣＣ溶液１００μｌ（０．６６μｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中、氷冷下３０分間室温で２時間攪拌した。ジエチルエーテルを加えて生成した沈殿を減圧下乾燥してＮＨＳエステルを３．５ｍｇ（収率７０％）得た。
次に、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１５０μｌ（０．９ｍｇ／ｍｌ）へ、上記のＮＨＳエステルを３３．４ｍｇ（蛋白質１モルに対して３４モル）加え、４℃で一昼夜静置して反応した。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．０９１ｍｇ／ｍｌの目的物を０．４０ｍｌ得た（収率２７．０％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様に分析した。
保持時間：４２．０分（１分子結合体）
４４．１分（２分子結合体）
実施例３４ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。ジエチルエーテルに滴下して生成した白色沈殿を減圧乾燥し、上記化合物のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
次に、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１００μｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、上記で得られたＮＨＳエステルを８．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１００モル）加え、４℃で一昼夜静置して反応した。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．６ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、４７μｇ／ｍｌの目的物を８０μｌ得た（収率３．３％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムを２本用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
保持時間：４１．７分（１分子結合体）
実施例３５ ５ｋＤａ ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液０．５ｍｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１９で得られた化合物５ＰＥＴ（３ＵＵ）を４．５ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液０．５ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．８ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．６７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３６ｍｌを得た（収率４０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例３６ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１７の化合物５ＰＥＴ（３ＵＡ）２５４ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）を、２．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．９ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．５ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中０℃で１時間、室温で２時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥して実施例１７の化合物のＮＨＳエステルを１３２．８ｍｇ得た（収率５２．３％）。
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．０ｍｌ（１．１６ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１７の化合物のＮＨＳエステルを１３ｍｇ（蛋白質１モルに対して１５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．１４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１．０ｍｌを得た（収率１２％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４３．８分（１分子結合体）
４１．２分（２分子結合体）
実施例３７ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール（従来型試薬）修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．３ｍｌ（０．９７ｍｇ／ｍｌ）へ、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（平均分子量１０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）を８．３ｍｇ（蛋白質１モルに対して１２．５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３６ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液２．７ｍｌを得た（収率７６．７％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例３８ ２０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：２０ＳＰＡ−ｒｈＩＦＮ−β
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β１．３ｍｌに、ｍＰＥＧ−プロピオン酸のＮＨＳエステル（平均分子量２０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）７．９ｍｇ（蛋白質１モル当たり６モル）を加え、一昼夜４℃で静置して反応を行った。次に、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、０．５２ｍｇ／ｍｌの反応液２．１ｍｌを得た。この内、１．９ｍｌをＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム２ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製し、０．１８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分４．９ｍｌを回収した（収率６６．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
Figure 0004142569
実施例３９ ５ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＳＰＡ−ｒｈＩＦＮ−β
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した０．８ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β１．３ｍｌに、ｍＰＥＧ−プロピオン酸のＮＨＳエステル（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）１．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり６モル）を加え、一昼夜４℃で静置して反応を行なった。次に、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、０．４０ｍｇ／ｍｌの反応液２．１ｍｌを得た。この内、１．９ｍｌをＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製し、０．１５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分４．２ｍｌを回収した（収率６０．１％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様に分析した。
Figure 0004142569
実施例４０ １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：１０ＳＣＭ−ｒｈＩＦＮ−β
実施例２２の化合物１．０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ２１．８ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ３９．０ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥して実施例２２の化合物のＮＨＳエステルを５０６．８ｍｇ得た（収率５０．７％）。
続いて、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液３．０ｍｌ（０．８１ｍｇ／ｍｌ）に上記のＮＨＳエステルを１６．２ｍｇ加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて脱塩した。ゲル濾過で得られた画分４．５ｍｌをＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．２２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分４．０ｍｌを回収した（収率３６．２％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜３分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例４１ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾天然型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−天然型ｈＩＦＮ−β
天然型ｈＩＦＮ−β１０μｇ（ＳＴＲＡＴＨＭＡＮＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧＭＢＨ）を等張りん酸緩衝液２００μｌに溶解し、実施例２６で得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステルを１．５ｍｇ（蛋白質１モルに対して３００モル）加え、２０℃で一昼夜反応した。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液に緩衝液交換した。次いで、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．０２１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．１９ｍｌ得た（収率３９．９％）。
実施例４２ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−１７Ｓｅｒ ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．６）で調製した１７Ｓｅｒ ｒｈＩＦＮ−β（Ｃｈｉｒｏｎ社製）の溶液０．１ｍｌ（１．０ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例２６と同様にして得られた実施例４の化合物（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ））のＮＨＳエステル１．３ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．２５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈｉａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、３９μｇの目的物を含む画分０．７５ｍｌを回収した（収率３９％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜３分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４１．３分（１〜３分子結合体）
実施例４３ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−１７Ｓｅｒ ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１７Ｓｅｒ ｒｈＩＦＮ−β（Ｃｈｉｒｏｎ社製）の溶液０．０５ｍｌ（２．１ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例３６で得られる実施例１７の化合物（５ＰＥＴ（３ＵＡ））のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、２７．８μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３０ｍｌを得た（収率７．９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例４４ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−αの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌに、実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１．５ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液８０μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これを、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、８０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率４０．０％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
Figure 0004142569
実施例４５ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−αの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した０．９５ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌに、実施例２６で得られる５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル１．５ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液０．１ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これを、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、５０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．６ｍｌを得た（収率３１．６％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
Figure 0004142569
実施例４６ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロンαの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α溶液［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌへ、実施例３６で得られる実施例１７の化合物（５ＰＥＴ（３ＵＡ））のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．５３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液６５μｌを得た（収率３４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例４７ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−γ
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例２で得られるｒｈＩＦＮ−γ（０．１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌに、実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２００モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例４８ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−γ
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例２で得られるｒｈＩＦＮ−γ（０．８ｍｇ／ｍｌ）０．８ｍｌに、実施例２６で得られる５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル１０．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例４９ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．２ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに実施例１の化合物１．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、そのうち９００μｌを同緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、４０２μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液３６０μｌを得た（収率５０．３％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５０ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに５．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）の実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を希釈し、そのうち９００μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、１７９μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液５００μｌを得た（収率２５．８％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５１ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに６．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）の実施例２５で得られる５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）のＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を希釈し、そのうち９００μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、３３５μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４５０μｌを得た（収率４４．２％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５２ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ１６．８ｍｇ（１４６．０μｍｏｌ）、ＤＣＣ３０．１ｍｇ（１４５．９μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下した。沈殿を回収し、減圧乾燥して化合物４のＮＨＳエステルを２６０．０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１．２５ｍｌ（４．０ｍｇ／ｍｌ）に上記のＮＨＳエステルを２６．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液１．０ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．５ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム５．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．８６ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．７ｍｌを取得した（収率３２．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５３ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに、実施例５の化合物１．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例５４ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー形成刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例１０の化合物１００ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）を１．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ３．５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ６．２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中０℃で９０分間、その後室温で２時間攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例１０の化合物のＮＨＳエステルを５６．５ｍｇ得た（収率５６．５％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体２１０μｌに４．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）の上記ＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、続いてＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分を９６５μｌ得た（収率３９．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５５ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー形成刺激因子誘導体の調製
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＲａ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに、実施例８で得られた化合物５．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり５０モル）を添加し、１２０ｍｍｏｌ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウム１０μｌを加え、室温で一昼夜反応させた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
実施例５６ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．７ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに、実施例２７記載の方法で実施例１３の化合物を活性化して得られる化合物２ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、０．８ｍｌを回収した。次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、３７０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４００μｌを得た（収率２５．９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５７ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＯＲＮ（２ＲａＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに２．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）の活性化ＰＥＧ誘導体（実施例１４の化合物を実施例２８記載の方法で活性化した化合物）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、０．８ｍｌを回収した。次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、７１μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４２０μｌを得た（収率１９．９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５８ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．７ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに２．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）の活性化ＰＥＧ誘導体（実施例１５の化合物を実施例２９記載の方法で活性化した化合物）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、０．８ｍｌを回収した。次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、６７μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液３５０μｌを得た（収率１６．０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例５９ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下して生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．７ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに上記のＮＨＳエステル３．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．７ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を濃縮し、０．４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１６５μｌを取得した（収率３６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６０ ５ｋＤａ４本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＱＮＡ（４ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例６の化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）６９ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を５００μｌの塩化メチレンに溶解し、１．８ｍｇのＤＳＣと０．５６ｍｇのＤＭＡＰを加え、室温で６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例６の化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）のＮＨＳエステルを４４ｍｇ得た（収率６３％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ８）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに上記のＮＨＳエステル５．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４０．８分（１分子結合体）
実施例６１ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．１ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．５ｍｌに、実施例１９で得られた化合物１２．２ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．７５ｍｌを得た（収率５８．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６２ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．０５ｍｌに、実施例３６で得られる実施例１７の化合物のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３０ｍｌを得た（収率５６．７％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６３ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＳＵＧ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ導体
実施例２１で調製した化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）１００ｍｇ（６．７μｍｏｌ）に２．３ｍｇのＮＨＳと４．１ｍｇのＤＣＣを加え、氷冷下１ｍｌの塩化メチレンに溶解し、氷冷下１時間、室温で１．５時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例２１の化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）のＮＨＳエステルを７６．６ｍｇ得た（収率７６．６％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．１ｍｌに、上記活性化した化合物（実施例２１の化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル）１０．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して３５モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．２８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３９ｍｌを得た（収率２７．８％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６４ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＲａ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２．３５ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．６ｍｌに、実施例２０の化合物５６．３ｍｇ（蛋白質１モルに対して５０モル）および１２０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したソディウムシアノボロヒドリド（ＮａＢＨ３ＣＮ）１０μｌを加え、４℃で一昼夜反応した。反応液を塩酸で酸性にして反応を停止し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．２４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５５ｍｌを得た（収率８．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４１．２分（１分子結合体）
実施例６５ １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：１０ＳＣＭ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体２．５ｍｌに２１．３ｍｇ（蛋白質１モル当たり４モル）の実施例２２の化合物のＮＨＳエステル（実施例４０で調製）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、４．０ｍｌを回収した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１０．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、２．０ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液８６０μｌを得た（収率３４．４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６６ ２０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：２０ＳＰＡ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．６）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体９９５ｍｌに１９．１ｇ（蛋白質１モル当たり４．５モル）の活性化ＰＥＧ誘導体（Ｍ−ＳＰＡ−２０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量２０，０００）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。次いで、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム２０００ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し精製した。目的画分４０００ｍｌを濃縮し、１１．２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液３２０ｍｌを得た（収率９０．４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６７ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．５ｍｌに、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（平均分子量１０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）を１０．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．０５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率２６．３％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６８ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４のｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．９ｍｌに、実施例２６で得られる５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル２８．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１５当量）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
反応液０．８ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．５ｍｌを回収した。これをＳＰ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム５．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１．０ｍｌを得た（収率３３．０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例６９ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．２ｍｌに、実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１０．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５当量）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
反応液０．２ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．０ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３ｍｌを得た（収率２６．８％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
Figure 0004142569
実施例７０ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．４ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４で得られたｒｈＧ−ＣＳＦ１４０μｌに、上記活性化したＮＨＳエステル１２．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を濃縮し、１．１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１１０μｌを取得した（収率１９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４０〜４５分（１〜３分子結合体）
実施例７１ ５ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４．４ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４のｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．５ｍｌに、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）１１．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．７８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率４０．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４４．２分（１分子結合体）
４１．８分（２分子結合体）
実施例７２ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｂＳＯＤ
実施例２の化合物３０ｍｇ（３μｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍｌに溶解し、ＮＨＳ１．７ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ３．１ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分間攪拌した。その後３時間室温で攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例２の化合物のＮＨＳエステルを２１ｍｇ得た（収率７０％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例７３ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ
実施例３の化合物２０ｍｇを実施例２５と同様の条件で活性化し、実施例３の化合物のＮＨＳエステルを１３ｍｇ得た（収率６５％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例７４ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｂＳＯＤ
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに実施例１で得た化合物の水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例７５ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を実施例２６記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例４の化合物のＮＨＳエステルを２６０ｍｇ得た。
（収率５３．４％）
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例７６ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの精製
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ（精製品）
実施例４の化合物３６０ｍｇ（３６．０μｍｏｌ）を実施例２６記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例４の化合物のＮＨＳエステルを１８１．９ｍｇ得た（収率５０．５％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）２．２ｍｌに上記の実施例４の化合物のＮＨＳエステル３３．９ｍｇ（蛋白質１モルあたり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。次に、この反応液を４．３ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。未修飾ＳＯＤの含まれない目的画分を濃縮し３．７３ｍｇ／ｍｌの溶液を２００μｌ得た（収率１７．２％）。さらにＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加えて活性を回復した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例７７ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの調製
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）−ｂＳＯＤ
実施例１３の化合物２０ｍｇを実施例２７記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例１３の化合物のＮＨＳエステルを１６．０ｍｇ得た（収率８０．０％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型−ＳＯＤ溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌへ、上記の活性化したＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜５分子結合体のバンドを確認した。なお、未修飾のＳＯＤは検出されなかった。
実施例７８ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの調製
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）−ｂＳＯＤ
実施例１５の化合物２０ｍｇを実施例２９記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例１５の化合物のＮＨＳエステルを１２．０ｍｇ得た（収率６０．０％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型−ＳＯＤ溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌへ、上記のＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜５分子結合体のバンドを確認した。なお、未修飾のＳＯＤは検出されなかった。
実施例７９ １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：１０ＳＣＭ−ｂＳＯＤ（精製品）
ウシＣｕ，Ｚｎ型−ＳＯＤ溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）、和光純薬製）１．０ｍｌに実施例２２の化合物のＮＨＳエステル（実施例４０で調製）１８．８ｍｇ（蛋白質１モルあたり１５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。
次に、この反応液を２．０ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、未修飾ｂＳＯＤを含まない目的画分を濃縮し、５．９ｍｇ／ｍｌの溶液を１２０μｌ得た（収率３５．４％）。さらにＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加えて活性を回復した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例８０ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｈＳＯＤ
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を実施例２６記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例４の化合物のＮＨＳエステルを２６０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
ヒトＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（１．９ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例８１ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＭ）−ｈＳＯＤ（精製品）
実施例９の化合物３．１３ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）をヒトＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液［２．６３ｍｇ／ｍｌ、りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）、ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製］０．６ｍｌに加えて４℃で一昼夜静置して反応した。
次に、２０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。未反応のＳＯＤを含まない修飾体の画分を回収し、０．５ｍｌまで濃縮した。この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的画分を濃縮した。さらに、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を含む溶液各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加え、ＳＯＤの活性を回復した。０．２５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液を１８０μｌ取得した（収率４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
実施例８２ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＭ）−ｈＳＯＤ（精製品）
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したＣｕ，Ｚｎ型ｈＳＯＤ溶液（ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製）０．５ｍｌ（１．３４ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１８で得られる化合物３．１ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．６２ｍｌを得た（収率３０．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４１．１分（１分子結合体）
実施例８３ ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ＫＭ−８７１
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２．６ｍｇ／ｍｌに調製したＫＭ−８７１水溶液０．５ｍｌ（特開平５−３０４９８９に従って調製）に、実施例４で得られた化合物のＮＨＳエステルを１．０ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液０．５ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．２ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．５９ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３８ｍｌを得た（収率１７．１％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例８４ ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ＫＭ−８７１
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１．１ｍｇ／ｍｌに調製したＫＭ−８７１溶液１．０ｍｌ（特開平５−３０４９８９に従って調製）に、実施例３６で得られる５ＰＥＴ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル０．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して５モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液１．０ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．５２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４３０μｌを得た（収率２０．４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
試験例１ 化学修飾インターフェロン−βの抗ウイルス活性
実施例２３〜実施例４３で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−βおよび化学修飾天然型ｈＩＦＮ−β、未修飾ｒｈＩＦＮ−β、ならびに未修飾天然型ｈＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を下記のニュートラルレッド（ＮＲ）取り込み法で調べた。
＜ＮＲ取り込み法＞
小長谷らの方法［蛋白質核酸酵素（別冊）、３５５頁（１９８１年）］を参考に抗ウイルス活性を測定した。
すなわち、滅菌したトランスファープレートに５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加イーグルＭＥＭ培地を添加した。次に、ＩＦＮ国内標準品［α（ミドリ十字）およびβ（東レ）］溶液を各々５０μｌずつウェルに分注し、２倍ずつの段階希釈を行った。一方、所定の濃度に培地で調製した化学修飾ＩＦＮまたは未修飾ＩＦＮ溶液も同様に５０μｌずつウェルに分注した。これらの溶液を、所定の細胞数のヒト羊膜由来の株化細胞（ＦＬ細胞）を入れた９６穴プレートにトランスし、数秒間攪拌した。３７℃で一昼夜、ＣＯ２インキュベーターで培養し、抗ウイルス状態を作った。
次に、培養液を除去した後、ウイルス溶液を添加し、３７℃で２日間、ＣＯ２インキュベーターで培養してウイルスを感染させた。ＩＦＮにより細胞の抗ウイルス状態が変化し、細胞変性が起こった。続いて、培養液を除去し、ＮＲ溶液を添加した。３７℃で１時間ＣＯ２インキュベーターに放置し、ＮＲ溶液を除去した。等張りん酸緩衝液でウェルを洗浄し、抽出液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸−３０％エタノール）を添加し、２〜３分間攪拌した。
ＮＲにより生き残った細胞を染色し、抽出後、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、定量曲線をプロットした。定量曲線より算出した未修飾ＩＦＮの活性を１００％としたときの化学修飾ＩＦＮの相対活性を算出した。
各ＩＦＮ−βの比活性を第１表、第２表および第３表に示す。
Figure 0004142569
Figure 0004142569
Figure 0004142569
以上の結果より、本発明で使用される化学的に修飾されたＩＦＮ−βはいずれも抗ウイルス活性を保持していることが確認された。
試験例２ 化学修飾インターフェロン−αの抗ウイルス活性
実施例４４から実施例４６で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−α、および未修飾ｒｈＩＦＮ−αの抗ウイルス活性を試験例１に示したＮＲ取り込み法で調べた。
各ＩＦＮ−αを濃度１μｇ／ｍｌで作用させたときには、化学修飾された各ＩＦＮ−α（実施例４４の５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−α、実施例４５の５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−α、実施例４６の５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−α）では、抗ウイルス活性が完全に保持されていた（未修飾ｒｈＩＦＮ−αと同等の活性を有していた）。
試験例３ 化学修飾スーパーオキサイドディスムターゼの酵素活性
実施例７２〜実施例８２で調製した化学的に修飾されたＳＯＤの酵素活性をＭｃｃｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．とＦｒｉｄｏｖｉｃｈｉ，Ｉのキサンチン−キサンチンオキシダーゼ−シトクロムＣ系［ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４４巻、６０４９頁（１９６９年）］で測定した。ＳＯＤ活性１ユニット（Ｕ）とは、ｐＨ７．８、３０℃下で、シトクロムＣの還元速度を５０％阻害するＳＯＤの酵素量を示し、以下の式で算出した。
Figure 0004142569
化学的に修飾されたウシＳＯＤ、および化学的に修飾されたヒトＳＯＤの酵素活性を各々第４表、第５表に示す。
ＳＯＤ ５０Ｕ／ｍｌ＝０．０００２５６ｍｇ（３９００Ｕ／ｍｇの場合）
ΔＡ／分：測定値
Figure 0004142569
Figure 0004142569
本発明で使用される化学修飾ヒトＳＯＤは酵素活性を維持していることが確認された。
試験例４ 化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
実施例４９〜実施例７１の化合物、未修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体および未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦのマウス白血病細胞ＮＦＳ６０［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、６６８７頁（１９８５年）］に対する増殖促進活性を、浅野らの方法［薬理と治療、１９巻、２７６７頁（１９９１年）］に従って測定した。
実施例４９〜実施例６３および実施例６６の化合物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた場合には、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体（１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた）と同等のＮＦＳ６０細胞増殖促進活性が認められた（未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体と同等の活性を保持していた）。
実施例６８〜実施例７０の化合物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた場合には、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた）と同等のＮＦＳ６０細胞増殖促進活性が認められた（未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦと同等の活性を保持していた）。
本発明で使用される化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体および化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦはいずれもＮＦＳ６０細胞に対する増殖促進作用を維持していることが確認された。
試験例５ 化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性
実施例８４で調製した化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性をＫｅｎｙａ．Ｓらの方法［キャンサー イミュノロジー アンド イミュノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、３６巻、３７３頁（１９９３年）］に基づいて測定した。
化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３結合活性を第６表に示す。
活性は、未修飾の抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性を１００％としたときの相対活性で示した。
Figure 0004142569
本発明で使用される化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体ではＧＤ３への結合活性が残存していることを確認された。
試験例６ 化学修飾組換え型ヒトインターフェロン−βのマクロゴール軟膏剤中での安定化効果
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように実施例２６のポリエチレングリコール修飾ｒｈＩＦＮ−β（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β）溶液、未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液、または未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液に２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量２０，０００）を添加した溶液を各々調製した。次に、各々の溶液１００μｌをマクロゴール軟膏基剤（東豊薬品（株）製）０．９ｇに添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して室温に保存した。軟膏剤調製直後および２４時間後にサンプリングし、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて軟膏剤を溶解し、抗ウイルス活性を測定した。
軟膏剤調製直後の活性を１００％としたときの２４時間後の活性を第７表に示す。
未修飾ｒｈＩＦＮ−β、および未修飾ｒｈＩＦＮ−βにｍＰＥＧを添加したものでは活性の低下が確認されたが、化学的に修飾されたｒｈＩＦＮ−β溶液では活性は維持されていた。
Figure 0004142569
試験例７ 化学修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの親水軟膏剤中での安定化効果
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように実施例２６のポリエチレングリコール修飾ｒｈＩＦＮ−β（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β）溶液、または未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液に２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量２０，０００）を添加した溶液を各々調製した。次に、各々の溶液１００μｌを親水軟膏（岩城製薬（株）製）０．９ｇに添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して３７℃に保存した。各々の軟膏剤を経時的にサンプリングし、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて軟膏剤を懸濁した。この懸濁溶液中のｒｈＩＦＮ−βの含有量を各々ＥＬＩＳＡの検量線から算出した。
結果を図１に示す。化学的に修飾されたｒｈＩＦＮ−βと未修飾のｒｈＩＦＮ−βの濃度はいずれも徐々に低下したが、未修飾ｒｈＩＦＮ−βに比較し、化学的に修飾されたｒｈＩＦＮ−βでは残存率が高値を示した。
試験例８ 化学修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼのマクロゴール軟膏剤中での安定化効果
２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて、３．７３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ（精製品）溶液（実施例７６で調製）、未修飾ｂＳＯＤ溶液、または未修飾ｂＳＯＤ溶液とｍＰＥＧを混合したものを各々５０μｌずつ、マクロゴール軟膏基剤４５０ｍｇへ加え、均一な軟膏剤を調製した。経時的に５０ｍｇずつ採取し、２００μｌの等張りん酸緩衝液を加え、その一部を用いて活性測定した。
軟膏剤調製直後のｂＳＯＤ活性を１００％として、経時的な活性の変化を図２に示す。軟膏剤では何れも時間と共に活性が低下したが、ＰＥＧ修飾体の５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤのみで長期間高い活性が維持された。
試験例９ 化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマクロゴール軟膏剤中での安定化効果
マクロゴール軟膏基剤（東豊薬品（株）製）０．９ｇに酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した実施例６６の誘導体（２０ＳＰＡ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体）溶液、同濃度の未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液、または同濃度のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に１２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量２０，０００、日本油脂（株）社製）を添加した溶液を各々１００μｌ添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して室温に保存した。経時的に各チューブをサンプリングし、１５０ｍｍｏｌ／塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液を加えて軟膏剤を溶解した。この溶液の上清を実施例２３の条件で電気泳動により分析し、蛋白質のバンドの変化を観察した。
図３及び図４に示すように、化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では７２時間後もバンドの変化は観察されなかったのに対し、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では軟膏剤調製後２４時間で次第にバンドが薄くなり、７２時間でほぼ完全に消失した。
以上の結果はマクロゴール軟膏剤中では化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は安定に存在しているが、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は次第に変性し沈殿したことを示唆している。
試験例１０ 化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での安定化効果
親水軟膏（岩城製薬（株）製）０．９ｇに酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した実施例６６の誘導体（２０ＳＰＡ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体）溶液、または同濃度の未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液を各々１００μｌ添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して３７℃に保存した。経時的に各チューブをサンプリングし、１５０ｍｍｏｌ／塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液を加えて軟膏剤を懸濁した。この懸濁溶液を均一になるように懸濁し、１５，０００回転で２０分間遠心分離した。水相（下層）を回収し実施例２３と同様の条件で電気泳動により分析した。
図５および図６に３７℃で保存した軟膏剤の経時変化を示す。
化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では２４時間後もバンドの変化は観察されなかったのに対し、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では軟膏剤調製直後から次第にバンドが薄くなり、２時間でほぼ完全に消失した。
図７および図８は、室温で保存した軟膏剤の経時変化を示す。
化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では３０日後もバンドの著しい変化は観察されなかったのに対し、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では次第にバンドが薄くなり、３０日後ほぼ完全に消失した。未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に単にｍＰＥＧを添加した溶液（１２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量：２００００）と６ｍｇ／ｍｌの未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含有した酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１００μｌ）で調製した軟膏剤でもバンドの消失は抑制されなかった。
以上の結果は親水軟膏剤中では化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は安定に存在しているが、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は軟膏剤を保存中に次第に変性したことを示唆している。
参考例１ 組換え型ヒトインターフェロン−β（未修飾ｒｈＩＦＮ−β）の製造 ｒｈＩＦＮ−βは水上ら［バイオテクノロジー レター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ）、第８巻、６０５頁（１９８６年）］、および久我ら［現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人］の方法に従って製造した。
ｒｈＩＦＮ−βをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭＧ−１を保有する大腸菌Ｋ−１２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−βの生産には２リッタージャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して数日間２０℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液から凍結融解法［ＤＮＡ、２巻、２６５頁（１９８３年）］で抽出液を調製した。さらに、菌体残渣から特開昭６１−６９７９９に開示された方法に従ってｒｈＩＦＮ−βを得た。
参考例２ 組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
ｒｈＩＦＮ−γは前記ｒｈＩＦＮ−βの製造法に準じ、伊藤ら［医科分子生物学、３５５頁（１９８７年）、南江堂］、および久我ら（現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人）の方法に従って製造した。
ｒｈＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＹＰ１０を保有する大腸菌ｐＧＫＡ２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−γの生産には２リッタージャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して１〜２日間３７℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ ２００、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
さらに、菌体残渣に尿素や塩酸グアニジン等の強力な蛋白質変性剤を加えてｒｈＩＦＮ−γを溶解した後に、マーストンらの方法［バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、２巻、８００頁（１９８４年）］に準じ、ｒｈＩＦＮ−γを抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例３ 組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体の調製
配列番号３に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、特公平７−９６５５８に記載の方法により取得した。
上記のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＣｆＢＤ２８ ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７９）をＬＧ培地（バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース１ｇを水１Ｌに溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．０とする）で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４０．６％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、塩化ナトリウム０．５％、カザミノ酸０．５％、ＭｇＳＯ４１ｍｍｏｌ／Ｌ、ビタミンＢ１４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌに摂取し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ ２００、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
菌体残渣からマーストンらの方法［バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、第２巻、８００頁（１９８４年）］に準じ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例４ 組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
配列番号３に示したアミノ酸配列を有するｒｈＧ−ＣＳＦを参考例３に記載した方法に準じて調製した。
産業上の利用可能性
本発明により、生理活性ポリペプチドに比べて、軟膏剤中での安定性に優れた化学的に修飾された生理活性ポリペプチドを含有する軟膏剤が提供される。
【配列表】
Figure 0004142569
Figure 0004142569
Figure 0004142569

【図面の簡単な説明】
図１は化学修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの親水軟膏剤中での安定化効果を示す。図１において、符号（−◆−、−■−）は各々下記の意味を表す。
−◆−：未修飾ｒｈＩＦＮ−βにおけるｒｈＩＦＮ−βの残存量の変化
−■−：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−βにおけるｒｈＩＦＮ−βの残存量の変化
図２は化学的に修飾されたウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼのマクロゴール軟膏剤中での安定化効果を示す。図２において符号（−△−、−〇−、−□−、−●−）は各々下記の意味を表す。
−△−：化学的に修飾されたｂＳＯＤ（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ）を含有するマクロゴール軟膏剤
−○−：ｂＳＯＤにマクロゴールを混合した軟膏剤
−□−：ｂＳＯＤとｍＰＥＧを混合したものにマクロゴールを混合した軟膏剤 −●−：ｂＳＯＤ水溶液
図３は組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマクロゴール軟膏剤中での安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図３において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１時間後
▲５▼：室温１日後
▲６▼：室温２日後
▲７▼：室温３日後
▲８▼：室温７日後
図４は化学的に修飾された組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマクロゴール軟膏剤中での安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図４において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：化学修飾Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１時間後
▲５▼：室温１日後
▲６▼：室温２日後
▲７▼：室温３日後
▲８▼：室温７日後
図５は組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での３７℃における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図５において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼、▲９▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：３７℃３０分後
▲５▼：３７℃１時間後
▲６▼：３７℃２時間後
▲７▼：３７℃４時間後
▲８▼：３７℃８時間後
▲９▼：３７℃２４時間後
図６は化学的に修飾された組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での３７℃における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図６において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼、▲９▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：化学修飾Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：３７℃３０分後
▲５▼：３７℃１時間後
▲６▼：３７℃２時間後
▲７▼：３７℃４時間後
▲８▼：３７℃８時間後
▲９▼：３７℃２４時間後
図７は組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での室温における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図７において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１０日後
▲５▼：室温２０日後
▲６▼：室温３０日後
図８は化学的に修飾された組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での室温における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図８において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：化学修飾Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１０日後
▲５▼：室温２０日後
▲６▼：室温３０日後 Technical field
The object of the present invention relates to an ointment containing a chemically modified physiologically active polypeptide. Further, the present invention relates to the use of the ointment as a therapeutic agent, a cosmetic product, and a moisturizing agent.
Background art
Polypeptides having physiological activity (hereinafter referred to as physiologically active polypeptides) are useful as therapeutic agents for specific diseases, but when administered into blood, stability is poor and sufficient pharmacological effects may not be expected. Many. For example, a polypeptide having a molecular weight of about 60,000 or less is filtered from the glomeruli of the kidney even when administered into the blood, and most of it is excreted in the urine, so that even if it is used as a therapeutic agent, it has a great therapeutic effect. In many cases, repeated administration is necessary. In addition, other physiologically active polypeptides may be degraded by a hydrolase present in the blood and lose their physiological activity.
In the case of an exogenous physiologically active polypeptide, the physiological activity may be effective in treating a disease. Such an exogenous physiologically active polypeptide, a physiologically active polypeptide produced by gene recombination, etc. Is known to have a structure different from that of endogenous physiologically active polypeptide, so that when it is administered into the blood, it induces an immune response and may cause serious side effects such as anaphylactic shock. ing. Furthermore, some physiologically active polypeptides often have problems such as poor solubility when used as therapeutic agents.
As one method for solving these problems when using a biologically active polypeptide as a therapeutic agent, a method of chemically binding one or more molecules of an inactive polymer chain to the polypeptide is known. In many cases, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol are chemically conjugated to the polypeptide to impart desirable properties to the polypeptide.
For example, superoxide dismutase (SOD) modified with polyethylene glycol has a significantly prolonged half-life in blood and has a sustained action [Pharmaceutical Research Communication (Pharm. Research Commun.), 19]. Volume, 287 (1987)]. In addition, a polyethylene glycol modified form of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is also known [Journal of Biochemistry, 115, 814 (1994)]. In addition, examples of modified polyethylene glycols of physiologically active polypeptides such as asparaginase, glutaminase, adenosine deaminase, uricase and the like are described in Gillian E., et al. Summarized by Francis et al. (Pharmaceutical Biotechnology, Volume 3, Stability of Protein Pharmaceuticals, Part B (Stamp of of Pharmaceutical Pharmaceuticals, Part B), p. 235, 1992 Prepress, Num. (Plenum Press, New York)].
The effects obtained by modifying a physiologically active polypeptide with polyalkylene glycol include increased thermal stability [Biophysics, 38, 208 (1998)], and solubility in organic solvents [Bio Chemical and Biophysical Research Communications (BBRC), Vol. 122, 845 (1984)] and the like are also known.
On the other hand, a method for binding a peptide or protein to a polyalkylene glycol is also known. A method is known in which an active ester of a carboxylic acid, a maleimide group, a carbonate group, a cyanuric chloride, an aldehyde group, an epoxide group, or the like is introduced at the terminal of a polyalkylene glycol and bonded to an amino group or thiol group of a polypeptide [Bio Conjugate Chemistry (Bioconjugate Chem.), 6, 150 (1995)]. Among these techniques, there is an example in which polyethylene glycol is specifically bound to a specific amino acid residue of a polypeptide or protein to improve blood stability without impairing the physiological activity of the polypeptide or protein. included. Examples of polyethylene glycol modification specific to amino acid residues in a polypeptide include an example in which polyethylene glycol is bonded to the carboxy terminus of a growth hormone-releasing factor via a norleucine spacer [Journal of Peptide Research. (J. Peptide Res.), 49, 527 (1997)], cysteine was introduced by genetic recombination instead of the third amino acid from the N-terminus of interleukin-2, and polyethylene was specifically introduced into this site. Examples in which glycol is bound [Biotechnology (BIO / TECHNOLOGY), 8, 343 (1990)] are known.
As described above, it is known that chemically modified physiologically active polypeptides with polyalkylene glycol generally improve blood persistence and stability by intravenous administration or subcutaneous administration. It has not yet been elucidated whether the chemically modified bioactive polypeptide by glycol has a property that can be used for administration forms other than injections.
On the other hand, as topical therapeutic agents, ointments, eye drops, nasal preparations, pulmonary preparations, ear drops, suppositories, creams, lotions, liniments, bop preparations, banso salons and the like are known. For example, as an example of using physiologically active polypeptides as an ointment, treatment of burns with epidermal growth factor (EGF) and SOD [Biological & Pharmaceutical Bulletin, 16 (11 ), 1146 (1993)].
In clinical practice, attempts have been made to use interferons as ointments as local therapeutic agents. Viral skin diseases such as herpes zoster, cold sores, corneal herpes, contagious variola, varicella, stomatitis, macular degeneration, diabetic retinopathy, central retinal vein occlusion, angiogenesis-derived glaucoma Interferon ointments are known to be useful for eye diseases such as skin tumors and wrinkles. Specifically, treatment of herpes simplex-1 virus with interferon-α [Dermatology, 184 (1), 40 (1992), Acta Virology, 39 (3), 125 (1995)], treatment of ulcers with leukocyte interferon [International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy & Toxiology], 19 (10), vol. It has been known. In addition, an ointment such as an interferon has been used as a therapeutic agent for visual impairment caused by angiogenesis [Japanese Patent Laid-Open No. 9-255555, Journal of the Japanese Ophthalmological Society, Vol. 99, page 571 (1995)].
Although these treatment methods have a direct effect on the lesion site and a significant therapeutic effect has been observed, regarding the stability of the bioactive polypeptide in these local therapeutic agents containing the bioactive polypeptide. No knowledge has been obtained.
As a result of intensive studies on the stabilization of bioactive polypeptides as active ingredients in ointments, the bioactive polypeptides are significantly stabilized by chemically modifying the bioactive polypeptides with polyalkylene glycol. It was found that physiological activity is maintained.
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide an ointment containing a bioactive polypeptide derivative that is superior in stability in an ointment compared to a bioactive polypeptide.
In order to achieve the above object, the present inventors chemically modified a physiologically active polypeptide represented by interferon, for example, modified with a polyalkylene glycol, and the physiologically active polypeptide modified with the polyethylene glycol. Has found that the bioactivity is maintained and is superior in stability in an ointment compared to an unmodified bioactive polypeptide, and the present invention has been completed.
That is, the present invention relates to an ointment containing a chemically modified physiologically active polypeptide (hereinafter sometimes referred to as a chemically modified polypeptide).
The present invention also relates to a cosmetic ointment and a moisturizing ointment containing the chemically modified physiologically active polypeptide.
The invention further relates to the use of chemically modified physiologically active polypeptides for the production of ointments, cosmetic ointments or moisturizing ointments.
The present invention also relates to a method for stabilizing a physiologically active polypeptide in an ointment, wherein the physiologically active polypeptide is modified with polyalkylene glycols. Furthermore, the present invention relates to a method for maintaining the activity of the physiologically active polypeptide in an ointment, which comprises modifying the physiologically active polypeptide with polyalkylene glycols.
Furthermore, the present invention relates to a composition comprising a chemically modified physiologically active polypeptide, an ointment base and the like.
The present invention is described in detail below.
Examples of chemically modified physiologically active polypeptides include physiologically active polypeptides chemically modified with at least one polyalkylene glycol.
The physiologically active polypeptide may be any polypeptide as long as it has a physiological activity or a pharmacological activity. For example, asparaginase, glutaminase, arginase, uricase, superoxide dismutase, lactoferrin (P), streptokinase (P), streptokinase (A) Deaminase, Interleukins 1-18 (Interleukins 1-18), Interferon-α (Interferon-α), Interferon-β (Interferon-β), Interferon-γ (Interferon-γ), Interferon-ω (Interferer) n-ω), interferon-τ (Interferon-τ), granulocyte-colony stimulating factor, erythropoietin, tumor necrosis factor (Tumor Necrosis Factor), platelet increase factor (B) (Klotho), leptin (Leptin), fibroblast growth factor 1-19 (Fibroblast Growth Factor 1-19), midkine (Calcinein), calcitonin (Epidmal Growth Factor), glucagon (G) Insulin-like growth factor 1 (Insulin- ikc Growth Factor 1), Osteogenic Protein 1 (Stem Cell Factor), Stem Cell Factor, Amylin, Parathyroid Hormone, Plasminogen Activating Factors (Plasminogen activators) Endothelial cell growth factor (Vascular Endothelial Growth Factor), transforming growth factor (Transforming Growth Factor), glucagon-like peptide (Glucagon Like Peptide), natriuretic peptide (Natruritic Peptide) gen), angiopoietin, angiostatin, endostatin, hepatocyte growth factor, antibody or fragment thereof, a polypeptide having a physiological activity and amino acid substitution thereof Body, amino acid deletion body, sugar chain addition body, sugar chain deletion body, partial peptide, etc. can be mention | raise | lifted. More preferable physiologically active polypeptides include interferons such as interferon-β, interferon-α, and interferon-γ, and physiologically active polypeptides having superoxide dismutase activity.
These physiologically active polypeptides can be obtained by extraction from animal organs or tissues, but can also be obtained by preparing them by ordinary peptide synthesis methods or gene recombination methods. Furthermore, commercially available physiologically active polypeptides can also be used. The biologically active polypeptide used for the chemical modification can be a crude product, or can be chemically modified by a purification method such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, or extraction. What was refine | purified to suitable purity can also be used.
These physiologically active polypeptides can be used in a buffer solution such as phosphate buffer, borate buffer, acetate buffer, citrate buffer, etc., in water or in a suitable organic material such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dioxane, tetrahydrofuran, etc. It is prepared in a solvent or a mixed solvent of these organic solvents and water, and used for a chemical modification reaction.
The chemically modified physiologically active polypeptide is not particularly limited as long as it can achieve the object of the present invention. For example, polyethylene glycol or its derivative, polypropylene glycol or its derivative, polyethylene glycol-polypropylene glycol copolymer or Bioactive polypeptides chemically modified with polyalkylene glycols such as derivatives thereof are preferred. As the polyalkylene glycols, those having a linear structure and those having a branched structure in which two or more polyalkylene glycols are bonded can be used, and the average molecular weight is about 1,000 to 1,000,000. Those having an average molecular weight of 500 to 1,000,000 are more preferred.
Polyalkylene glycols can be commercially available, or can be prepared according to known methods. As a method for preparing polyalkylene glycols, it is possible to use a method shown in a review by Samuel Zalipsky [Bioconjugate Chem., Vol. 6, p. 150 (1995)] or a similar method. it can.
The reaction between the polyalkylene glycol and the physiologically active polypeptide is carried out by reacting the polyalkylene glycol with about 1 to 1000 mol, more preferably about 1 to 50 mol per mol of the physiologically active polypeptide. The degree of modification of the polyalkylene glycol to the bioactive polypeptide can be arbitrarily selected by adjusting the molar ratio of the polyalkylene glycol to the bioactive polypeptide, reaction temperature, pH, reaction time, and the like. Any solvent may be used as long as it does not interfere with the reaction. For example, phosphate buffer, borate buffer, Tris-HCl buffer, sodium bicarbonate aqueous solution, sodium acetate buffer, N, N- Any of dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, methanol, acetonitrile, dioxane and the like can be selected. The reaction conditions such as reaction temperature, reaction time, and pH may be any conditions as long as the activity of the physiologically active polypeptide is not impaired. For example, the reaction temperature is 0 to 50 ° C., the reaction time is 10 minutes to 100 hours, and the pH is 4-10 are preferred.
Purification of a physiologically active polypeptide chemically modified with polyalkylene glycols can be performed by gel filtration, ion exchange chromatography, reversed-phase high performance liquid chromatography, affinity chromatography, ultrafiltration, etc. according to a conventional method. . Confirmation that a bioactive polypeptide synthesized or purified, or a bioactive polypeptide chemically modified with polyalkylene glycols has the structure of the polypeptide can be confirmed by mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR) ) And an amino acid analyzer of the amino acid composition, and a reverse phase HPLC analysis of phenylthiohydantoin (PTH) amino acid obtained by Edman degradation of the amino acid sequence by a gas phase protein sequencer.
A natural or genetically modified physiologically active polypeptide having a free cysteine residue such as granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), erythropoietin, interferon, interleukin, etc. may be modified site-specifically with polyalkylene glycols. it can.
In a preferred embodiment of the present invention, the chemically modified physiologically active polypeptide is modified with polyethylene glycol as described in JP-A-11-310600, and polyethylene glycol as described in WO99 / 55377. Physiologically active polypeptide modified with polyethylene glycol as described in WO00 / 23114, physiologically active polypeptide modified with polyethylene glycol as described in JP 62-503171, WO87 / 00056, US4766106, US4917888 or US4863727 An active polypeptide or a physiologically active polypeptide modified with polyethylene glycol described in JP-A-6-192300 or EP593868A1.
In another preferred embodiment of the present invention, two single-chain polyalkylene glycols are bonded to a group containing a cyclic structure other than a planar structure in a polyalkylene glycol that chemically modifies a physiologically active polypeptide. And a branched polyalkylene glycol having a group reactive with an amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group in a physiologically active polypeptide, or a group convertible to the reactive group It is.
Among them, polyalkylene glycols that chemically modify physiologically active polypeptides are represented by the formula (I)
Figure 0004142569
{Wherein L represents a group capable of 3 to 5 branching containing a cyclic structure other than a planar structure, and M is OCH2CH2, OCH2CH2CH2, OCH (CH3) CH2, (OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s(Wherein, r and s are the same or different and represent any positive integer) or
(OCH2CH2)ra-[OCH (CH3) CH2]sa(Wherein, ra and sa are the same as r and s, respectively)
n represents any positive integer;
q represents an integer of 1 to 3,
R1Represents a hydrogen atom, lower alkyl or lower alkanoyl,
R2Represents a group reactive with an amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group in the polypeptide, or a group convertible to the reactive group,
X1Is a bond, O, S, alkylene, O (CH2)ta(Wherein ta represents an integer of 1 to 8), (CH2)tbO (wherein tb has the same meaning as ta), NR3(Wherein R3Represents a hydrogen atom or lower alkyl), R4-NH-C (= O) -R5[Wherein R4Is a bond, alkylene or O (CH2)tc(Wherein tc has the same meaning as the above-mentioned ta), R5Is a bond, alkylene or OR5a(Wherein R5aRepresents a bond or alkylene)], R6-C (= O) -NH-R7[Wherein R6Is a bond, alkylene or R6aO (wherein R6aIs R5aWhich is synonymous with R)7Is a bond, alkylene or (CH2)tdO (wherein td is as defined above for ta), R8-C (= O) -O (wherein R8Is R5aOr O—C (═O) —R9(Wherein R9Is R5aIs synonymous with
X2Is a bond, O or (CH2)teO (wherein te is synonymous with the above-mentioned ta),
X3Represents a bond or alkylene, and two R1-Mn-X1And 1 to 3 X2-X3-R2Are preferably the same or different from each other}, and are preferably branched polyalkylene glycols.
In formula (I), branched polyalkylene glycols wherein q is 1 are preferred, n is 10 to 100,000, r and s and ra and sa are the same or different, and 1 to 100,000. Certain branched polyalkylene glycols are preferred.
In formula (I), R2Is hydroxyl, carboxy, formyl, amino, vinylsulfonyl, mercapto, cyano, carbamoyl, carbonyl halide, halogenated lower alkyl, isocyanate, isothiocyanate, oxiranyl, lower alkanoyloxy, maleimide, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted Aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimidooxycarbonyl, imidazolylcarbonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy, tresyl, lower alkanoyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted A branched polyalkylene group which is an aroyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryl disulfide or azide Call are preferred.
In formula (I), L represents formula (II)
Figure 0004142569
[Wherein R10Is (CH2)u(Wherein u represents an integer of 1 to 10) or CH = CH- (CH2)ua(Wherein ua represents an integer of 0 to 8),
R11, R12And R13Are the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted lower alkyl, lower alkoxy, amino, carboxy, cyano or formyl;
W is O, S, CH2Or NR14(Wherein R14Represents a hydrogen atom or lower alkyl)], and branched polyalkylene glycols which are groups obtained by removing 3 to 5 hydrogen atoms from the compound represented by Among them, W is CH2And branched polyalkylene glycols wherein u is 4 are preferred.
In still another preferred embodiment of the present invention, the polyalkylene glycol that chemically modifies the physiologically active polypeptide has three or more single-chain polyalkylene glycols bonded thereto, and the amino acid side in the physiologically active polypeptide. These are branched polyalkylene glycols in which a group reactive with a chain, an N-terminal amino group or a C-terminal carboxyl group, or a group that can be converted to the reactive group is bonded.
Among them, polyalkylene glycols that chemically modify physiologically active polypeptides are represented by the formula (Ix)
Figure 0004142569
[Wherein Lx represents a group capable of branching 4 or more,
Mx is OCH2CH2, OCH2CH2CH2, OCH (CH3) CH2, (OCH2CH2)rx-(OCH2CH2CH2)sx(Wherein rx and sx are the same or different and represent any positive integer) or
(OCH2CH2)rax-[OCH (CH3) CH2]sax(Wherein, rax and sax have the same meanings as rx and sx, respectively)
nx represents an arbitrary positive integer, mx represents an integer of 3 or more, qx represents an integer of 1 to 3,
R1xRepresents a hydrogen atom, lower alkyl or lower alkanoyl,
R2xRepresents a group reactive with an amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group in the polypeptide, or a group convertible to the reactive group,
X1xIs a bond, O, S, alkylene, (OCH2)tax(Wherein tax represents an integer of 1 to 8), (CH2)tbxO (wherein tbx has the same meaning as tax), NR3x(Wherein R3xRepresents a hydrogen atom or lower alkyl), R4x-NH-C (= O) -R5x[Wherein R4xIs a bond, alkylene or O (CH2)tcx(Wherein tcx has the same meaning as tax), and R5xIs a bond, alkylene or OR5ax(Wherein R5axRepresents a bond or alkylene)], R6x-C (= O) -NH-R7x[Wherein R6xIs a bond, alkylene or R6axO (wherein R6axIs R5axIs synonymous with
R7xIs a bond, alkylene or (CH2)tdxO (wherein tdx has the same meaning as tax)], R8x-C (= O) -O (wherein R8xIs R5axOr O—C (═O) —R9x(Wherein R9xIs R5axIs synonymous with
X2xIs a bond, O or (CH2)texO (wherein tex has the same meaning as the tax),
X3xRepresents a bond or alkylene;
3 or more R1x-(Mx)nx-X1xMay be the same or different, X2x-X3x-R2xWhen 2 or 3 are present (when qx is 2 or 3), they may be the same or different}, it is preferable that they are branched polyalkylene glycols.
In the formula (Ix), a branched polyalkylene glycol having qx of 1 is preferable, and a branched polyalkylene glycol having mx of 3 or 4 is preferable. Furthermore, branched polyalkylene glycols in which nx is 10 to 100,000 and rx and sx and rax and sax are the same or different and are 1 to 100,000 are preferable.
In the formula (Ix), R2xIs hydroxyl, carboxy, formyl, amino, vinylsulfonyl, mercapto, cyano, carbamoyl, carbonyl halide, halogenated lower alkyl, isocyanate, isothiocyanate, oxiranyl, lower alkanoyloxy, maleimide, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted Aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimidooxycarbonyl, imidazolylcarbonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy, tresyl, lower alkanoyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted A branched polyalkylene group which is an aroyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryl disulfide or azide Call are preferred.
Of the branched polyalkylene glycols, branched polyalkylene glycols having a molecular weight of 500 to 1,000,000 are preferred.
In the formula (Ix), Lx is a group in which 4 or more hydrogen atoms are removed from tricine, a group in which 4 or more hydrogen atoms are removed from shikimic acid, a group in which 4 or more hydrogen atoms are removed from quinic acid, a hydrogen atom from erythritol Branched polyalkylene glycols which are groups selected from groups other than 4 or more, groups obtained by removing 4 or more hydrogen atoms from pentaerythritol, and groups obtained by removing 4 or more hydrogen atoms from glucose are preferable.
Hereinafter, the compounds represented by Formula (I) and Formula (Ix) are referred to as Compound (I) and Compound (Ix), respectively. The same applies to the compounds of other formula numbers.
In the definition of each group of formula (I), lower alkyl and lower alkyl part of lower alkanoyl are linear or branched C 1-8 having, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl. , Isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, heptyl, octyl and the like. Alkylene includes, for example, methylene, ethylene, n-propylene, isopropylene, n-butylene, isobutylene, sec-butylene, tert-butylene, pentylene, neopentylene, hexylene, heptylene, octylene and the like having 1 to 8 carbon atoms.
In the formula (I), M is OCH2CH2, OCH2CH2CH2, OCH (CH3) CH2, (OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s(Wherein r and s are the same or different and represent any positive integer) or (OCH2CH2)ra-[OCH (CH3) CH2]sa(Wherein, ra and sa have the same meanings as r and s, respectively), and (OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s(Wherein r and s are as defined above) or (OCH2CH2)ra-[OCH (CH3) CH2]sa(Wherein ra and sa are each as defined above), r and s and ra and sa are preferably 1 to 100,000, more preferably 1 to 1,000.
In the formula (I), n represents an arbitrary positive integer, preferably 10 to 100,000, and more preferably 100 to 1,000.
In formula (I), MnThe average molecular weight of the polyalkylene glycol moiety represented by is preferably about 1,000 to 1,000,000, more preferably 5,000 to 100,000. MnIs-(OCH2CH2)nIn the case of-, the polyethylene glycol as the raw material is preferably monodispersed with a molecular weight distribution represented by Mw (weight average molecular weight) / Mn (number average molecular weight) of 1.1 or less, and an average molecular weight of 30,000 or less. If so, a commercially available product can be used. For example, monomethoxypolyethylene glycol having an average molecular weight of 2,000, 5,000, 10,000, 12,000, 20,000 or the like can be used.
Two single-chain polyalkylene glycols are bonded to a group containing a cyclic structure other than the planar structure disclosed in formula (I), and the amino acid side chain, N-terminal amino group in the physiologically active polypeptide or The molecular weight of the branched polyalkylene glycols represented by the formula (I) in which the group having reactivity with the C-terminal carboxyl group or a group that can be converted to the reactive group is bonded, 500 to 1,000,000 is desirable.
In the formula (I), q represents an integer of 1 to 3, and is preferably 1.
In the formula (I), L is a group capable of 3 to 5 branching containing a cyclic structure other than a planar structure, and as a substituent on the cyclic structure, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted lower alkyl, lower alkoxy, amino , Carboxy, cyano, formyl and the like. Here, the lower alkyl part of lower alkyl and lower alkoxy has the same meaning as the lower alkyl, and examples of the substituent in the substituted lower alkyl include a hydroxyl group, amino, lower alkanoyloxy, lower alkanoylamino, lower alkoxy, lower alkoxyalkoxy, Lower alkanoyl, lower alkoxycarbonyl, lower alkylcarbamoyl, lower alkylcarbamoyloxy and the like can be mentioned. The lower alkyl part of lower alkanoyloxy, lower alkanoylamino, lower alkoxy, lower alkoxyalkoxy, lower alkanoyl, lower alkoxycarbonyl, lower alkylcarbamoyl and lower alkylcarbamoyloxy has the same meaning as the lower alkyl. Examples of L include groups in which 3 to 5 hydrogen atoms have been removed from cyclohexanes, cyclohexenes, monosaccharides and the like. Specific examples of the cyclohexanes, cyclohexenes, and monosaccharides include cyclohexanetricarboxylic acid, cyclohexanetriol, 1,3,5-trimethyl-1,3,5-cyclohexanetricarboxylic acid (Kemp's triacid), and quinic acid (Quinic). acid), diaminocyclohexane, 2,4,10-trioxaadamantane, inositol, shikimic acid, D, L-sorbitol, ribose, erythritol, and the stereoisomers thereof.
For the construction of the L portion structure, a commercially available compound is used as it is, or it is derivatized into a form suitable for bonding of polyalkylene glycols by a general organic synthesis method, or after functional group protection. [Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th Edition (1992), Organic Synthesis IV, Maruzen, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition, John Wiley and Sons, Inc. (John Wiley & Sons, Inc.) (1991), etc.].
Examples of cyclohexanes other than those exemplified above include Kiso et al. [Dai Organic Chemistry, Vol. 6, 183 (1958), Asakura Shoten] or G. E. McCasland and E.M. It can be synthesized according to the method of Clide Horswill [Journal of American Chemical Society, Vol. 76, 2373 (1954)].
In addition, for example, a compound having a benzene ring is obtained from S.A. Isoda and H.C. Yamaguchi's method [Chem. Pharm. Bull., 28 (8), 2337 (1980)], K. et al. Prasad and O.I. Repic's method [Tetrahedron Letters, Vol. 25 (23), p. 2435 (1984)], etc. is converted into a compound having a cyclic structure other than the planar structure and capable of 3 to 5 branching. A structure can also be constructed.
In compound (I), X1The bond between polyalkylene glycols and L via the above can be carried out by easily combining reactions known in ordinary organic synthesis methods [Edited by Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th edition, pages 19-23] (1992), Organic Synthesis IV, Maruzen].
In formula (I), R2Represents a group reactive with an amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group in a polypeptide, or a group convertible to the reactive group.
That is, the reactive groups include lysine, cysteine, arginine, histidine, serine, threonine, tryptophan, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, and other side chains, N-terminal amino group, and C-terminal carboxyl in the polypeptide. Groups reactive with any of the groups are included, such as hydroxyl, carboxy, formyl, amino, vinylsulfonyl, mercapto, cyano, carbamoyl, carbonyl halide, halogenated lower alkyl, isocyanate, isothiocyanate, oxiranyl, lower Alkanoyloxy, maleimide, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimidooxycarbonyl, imidazolylcarbonyl, substituted Or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy, tresyl, lower alkanoyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted aroyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryl disulfide, azide, etc. .
In the definitions of the above groups, the lower alkyl moiety of lower alkoxycarbonyloxy, halogenated lower alkyl, lower alkanoyloxy and lower alkanoyloxycarbonyl has the same meaning as the lower alkyl. The aryl moiety of aryloxycarbonyl, aryloxycarbonyloxy and aryl disulfide includes, for example, phenyl, naphthyl, biphenyl, anthryl and the like having 6 to 14 carbon atoms. Examples of the aroyl moiety of aroyloxycarbonyl include 7 to 13 carbon atoms such as benzoyl, naphthoyl, and phthaloyl. Examples of the halogen moiety of carbonyl halide and halogenated lower alkyl include fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms.
Examples of the substituent in the substituted lower alkoxycarbonyloxy are the same or different and have 1 to 3 substituents such as a hydroxyl group, carboxy, halogen and the like. Here, halogen is as defined above.
Substituents in substituted aryloxycarbonyl, substituted aryloxycarbonyloxy, substituted aryl disulfide and substituted aroyloxycarbonyl are the same or different and have 1 to 3 substituents such as hydroxyl group, carboxy, halogen, cyano, lower alkyl, etc. can give. Here, halogen and lower alkyl are as defined above.
R2May be contained in a raw material for constructing the structure of the L portion, and a necessary functional group in the raw material compound may be converted to an appropriate protecting group [PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS), 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc. (1991), etc.]1The polyalkylene glycols may be bonded to L via a branch and then branched, followed by deprotection, and further conversion if necessary. Furthermore, polyalkylene glycols are converted to X1After branching from L via L2Or X3Through R2Can also be introduced.
More specifically, for example, the branched polyalkylene glycols represented by the formula (I) of the present invention can be produced by the following production method, but the production method is not limited thereto.
Production Method 1: X in Compound (I)1Is a bond, O, alkylene, O (CH2)taOr (CH2)tbProduction of compounds that are O
Of compounds (I), X1Is a bond, O, alkylene, O (CH2)ta(Wherein ta is as defined above) or (CH2)tbCompound (Ia) which is O (wherein tb is as defined above) can be produced, for example, by the following method.
Cyclic polyols having two or more hydroxyl groups (hereinafter referred to as cyclic polyols in this specification includes compounds having hydroxy lower alkyl in addition to hydroxyl groups as substituents on the cyclic structure) in an anhydrous state. Dissolve or suspend in an appropriate solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, acetonitrile, pyridine, etc., and 1-30 mol of an appropriate base such as sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine, etc. In the presence of 1 to 3 moles of halide or tosylate of polyalkylene glycol or a monoalkyl ether or monocarboxylic acid ester thereof (hereinafter collectively referred to as polyalkylene glycols A). 1 hour to 10 ° C By between reaction mixture comprising double-stranded branched polyalkylene glycol is obtained.
Cyclic polyols are selected from commercially available compounds such as cyclohexanetriol, quinic acid, shikimic acid, glucose, sorbitol, ribose, erythritol, or compounds derived from commercially available compounds. As a compound derived from a commercially available compound, for example, a cyclic polycarboxylic acid selected from cyclohexanetricarboxylic acid, Kemp's triacid and the like is synthesized by a conventional organic synthesis method [edited by Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th edition, 19-21]. (1992), Maruzen], and cyclic polyols obtained by reduction with an appropriate reducing agent. Examples of the reducing agent include lithium aluminum hydride, sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, hydrogen and the like.
Arrangement of the hydroxyl group in the cyclic polyol may be any, and functional groups unnecessary for the reaction are described in the literature [PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 2nd edition, John Wiley & Sons Incorporated (JOHN WILEY]. & SONS, INC.) (1991) etc.], and can be used in the reaction after appropriate protection or derivatization.
The halide and tosylate of polyalkylene glycols A are easily produced by various methods disclosed in the summary of Samuel Zalipsky [Bioconjugate Chem., 6, 150 (1995)]. be able to. As the halide and tosylate of polyalkylene glycol A used for bonding, those having any average molecular weight can be used as long as the molecular weight distribution is uniform (preferably, Mw / Mn is 1.1 or less).
The resulting mixture containing the double-stranded branched polyalkylene glycols is of pure purity or of any purity by known methods such as ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, two-phase partitioning, recrystallization, etc. It can be purified and isolated into the following double-stranded branched polyalkylene glycol and used in the next step. In the steps so far, among the compounds (Ia), R2Some of the compounds (Iaj) in which is a hydroxyl group are obtained.
On the other hand, the target double-chain branched polyalkylene glycols can also be prepared by using cyclic polyhalides or cyclic polytosyls and polyalkylene glycols A. In this case, 1 to 3 moles of polyalkylene glycol A is dissolved or suspended in a suitable solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, and 1 to 30 moles of sodium hydride, zinc oxide. In the presence of a suitable base such as sodium hydroxide or triethylamine, 1 mol of cyclic polyhalide or cyclic polytosyl is added and reacted at −20 to 150 ° C. for 1 hour to 10 days to obtain the desired product.
The cyclic polyhalides are commercially available compounds, or can be obtained by converting the cyclic polyols into halogen compounds [edited by Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th edition, Volume 19 (1992), Maruzen]. Cyclic polytosyl is prepared by dissolving or suspending cyclic polyols in a suitable solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, acetonitrile, pyridine, etc., and 1-30 mol of sodium hydride, zinc oxide, hydroxylated. In the presence of a suitable base such as sodium, triethylamine, potassium naphthalene, etc., it can be obtained by adding 1 to 3 moles of tosyl halide per hydroxyl group and reacting at −20 to 150 ° C. for 1 hour to several days.
Next, the mixture or purified compound containing the obtained double-chain branched polyalkylene glycol is added to R2Is introduced. R2The functional group remaining in the cyclic polyols, cyclic polyhalides or cyclic polytosyl after the polyalkylene glycol A or its halide or tosylate is bonded to the cyclic polyol, cyclic polyhalide or cyclic polytosyl The functional group bonded to the cyclic polyols is protected in advance, and after the polyalkylene glycol A or its halide or tosylate is bonded, the protective group of the functional group is removed. The group which may be used may be used. In this case, after protecting one or more hydroxyl groups or other functional groups in the cyclic polyols, cyclic polyhalides or cyclic polytosyls with an appropriate protective group, the remaining hydroxyl groups, halogens or A polyalkylene glycol A or a halide or tosylate thereof is introduced into the tosyl group, and a compound in which two polyalkylene glycols are bonded is synthesized and the functional group from which the protecting group is removed is used as it is, or the functional group R at least one of the groups according to the method described below2Convert to The functional groups present in the cyclic polyols, cyclic polyhalides, or cyclic polytosyls before or after bonding the polyalkylene glycols A or their halides or tosylates include carboxy, amino, halogen, in addition to hydroxyl groups. , Cyano, formyl, carbonyl and the like. In the case of a hydroxyl group, suitable functional group protecting groups are benzyl, tert-butyl, acetyl, benzyloxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl, dimethyl tert-butylsilyl, diphenyl tert-butylsilyl, trimethylsilyl, triphenylsilyl, tosyl, tetrahydro Examples of amino include methyl, ethyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl, N-phthalimide, acetyl, tert-butyloxycarbonyl, and the like. In the case of benzyl, methyl, ethyl, tert-butyl, 9-fluorenylmethyl, methoxyethoxymethyl, 2,2,2-trichloroethyl, 2- (trimethylsilyl) ethyl, cinna In the case of formyl, examples include dimethyl acetal, diethyl acetal, dibenzyl acetal, 1,3-dioxanyl, etc. [Protective Groups in Organic Synthesis, No. 2 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc. (1991)].
Pre-existing functional groups as they are, or protection and deprotection to remove R2Specific examples of cyclic polyols, cyclic polyhalides or cyclic polytosyl which can be used as a raw material for constructing the structure of the L moiety include shikimic acid, quinic acid, Kemp's triacid and the like.
Among compounds (I), a compound containing L is newly substituted with a substituent R2In the case of a compound obtained by introducing, it can be easily produced, for example, by the following production method.
Production method 1-1
Among compounds (Ia), R2Wherein I is carboxy (Iaa)
Figure 0004142569
(Where X1aIs a bond, O, alkylene, O (CH2)taOr (CH2)tbRepresents O and R1, L, M, n, q, X2And X3Are each as defined above,
R2Wherein I is carbamoyl (Iab)
Figure 0004142569
(Wherein R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are each as defined above,
R2Where I is cyano (Iac)
Figure 0004142569
(Wherein R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are as defined above, for example, and can be synthesized as follows.
Compound (Iaa), Compound (Iab), and Compound (Iac) are cyclic polyols, for example, among compounds (Ia) obtained according to Production Method 1, R2A reaction mixture containing a compound having a hydroxyl group (Iaj) or a purified compound in an appropriate solvent such as water, methylene chloride, toluene, tetrahydrofuran, etc. in the presence of a catalytic amount or 1 to 20% of a base in an acrylic equivalent of 1 to 30 mol It can be obtained by reacting with acid, acrylamide, acrylonitrile and the like at -20 to 150 ° C for 1 hour to several days. Examples of the base include potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium hydride and the like.
Compound (Iaa) is prepared by dissolving, for example, a reaction mixture containing compound (Iaj) obtained in Production Method 1 or a purified compound in an appropriate solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene or tetrahydrofuran in an anhydrous state. Or suspended in the presence of a suitable base such as 1 to 50 moles of sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine, and the like, with an α-halogenated acetate equivalent to 1 to 50 moles at -20 to 150 ° C It can also be obtained by hydrolysis after reacting for 1 hour to several days.
Compound (Iaa) is prepared by, for example, dissolving or suspending compound (Iaj) obtained by Production Method 1 in an appropriate solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, etc. An activator such as 1-50 moles of succinimidyl carbonate, p-nitrophenyl chloroformate, carbonyldiimidazole in the presence of a suitable base such as sodium chloride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine; It can also be obtained by reacting at 20 to 100 ° C. for 1 hour to 10 days and then reacting with an amino acid such as γ-aminobutyric acid, glycine, β-alanine or a derivative thereof.
Alternatively, compound (Iaa) can also be produced by reacting compound (Iaj) obtained by Production Method 1 with an acid anhydride such as succinic anhydride or glutaric anhydride in the presence of the same base as described above.
In addition, compound (Iaa) can be prepared from R among compounds (Ia) according to production method 1 using, for example, cyclic polyhalides.2After the compound (Iai) in which is a halogenated lower alkyl is produced, a hydroxycarboxylic acid ester, a malonic acid ester, a γ-aminobutyric acid ester, a β-alanine ester, a glycine ester, etc. are converted into N, N- Compound (Iai) dissolved or suspended in a suitable solvent such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, etc., and in the presence of 1-50 moles of a suitable base such as sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine And after reacting at −20 to 150 ° C. for 1 hour to several days, it can also be obtained by hydrolysis.
Further, the compound (Iaa) can be produced by, for example, substituting one or more hydroxyl groups or halogens of the cyclic polyols or cyclic polyhalides with a residue containing a carboxylic acid or a carboxylic acid protector in advance. It can also be obtained by substituting the remaining two hydroxyl groups or halogens of the cyclic polyols or cyclic polyhalides with polyalkylene glycols A or their halides or tosylates by the method shown in 1. In this case, the introduction of a carboxylic acid or a residue containing a carboxylic acid protector can be carried out in the same manner as described above. When the carboxylic acid is protected, the polyalkylene glycol A or its halide or tosylate is introduced into the cyclic polyol or cyclic polyhalide and then deprotected to produce a free carboxylic acid.
The compound converted into the carboxylic acid can be purified and isolated with an arbitrary purity by a known method such as anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, two-phase partitioning, recrystallization and the like.
Production method 1-2
Among compounds (Ia), R2Wherein I is amino (Iad)
Figure 0004142569
(Wherein R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Can be obtained by, for example, reacting a compound (Iac) obtained in Production Method 1-1 with an appropriate reducing agent. Examples of the reducing agent include lithium aluminum hydride, sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, hydrogen and the like.
Compound (Iad) is, for example, compound (Iai) obtained by Production Method 1 or a compound in which the halogen moiety in compound (Iai) is substituted with a tosyl group, such as 5 equivalents to an excess of diamines such as ethylenediamine and propylenediamine. Can also be obtained by reacting in the presence of a suitable base.
Further, similarly to the production method 1-1, the compound (Iad) is prepared by dissolving or suspending the compound (Iaj) in an appropriate solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran or the like. 1-50 moles of sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine, etc. in the presence of a suitable base, 1-50 moles of succinimidyl carbonate, p-nitrophenyl chloroformate, carbonyldiimidazole, etc. By reacting with an activator at -20 to 100 ° C. for 1 hour to 10 days and then reacting with 1 equivalent to an excess of diamines such as ethylenediamine and propylenediamine in the presence of a suitable base. Can also be obtained.
Compound (Iad) is prepared by introducing one or more amino or amino protectors into a compound such as cyclic polyols used for forming L in advance, for example, according to the method shown in Production Method 1. Can be obtained by substituting polyalkylene glycol A or its halide or tosylate at two positions with the remaining hydroxyl group or halogen moiety of the compound.
Among compounds (Ia), R2Wherein I is maleimide (Iae)
Figure 0004142569
(Wherein R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are each as defined above), for example, by the method of Oskar Keller et al. [Helv. Chim. Acta, 58, 531 (1975)] or Timothy P. et al. According to the method of Kogan et al. [Synthetic Commun., 22, 2417 (1992)], the compound (Iad) is reacted with N-alkoxycarbonylmaleimide in a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate. Can do. As N-alkoxycarbonylmaleimide, N-ethoxycarbonylmaleimide and N-methoxycarbonylmaleimide can be used.
In addition, compound (Iae) is prepared by introducing one or more maleimides into a compound such as cyclic polyols used for forming L in advance according to the method shown in production method 1, for example. It can also be obtained by a method in which the remaining hydroxyl group or halogen moiety is substituted with two polyalkylene glycols A or a halide or tosylate thereof.
Compound (Iad), compound (Iae), and synthetic intermediates thereof can be isolated and purified in any purity by the same method as described above.
Production method 1-3
Among compounds (Ia), R2Where I is formyl (Iaf)
Figure 0004142569
(Wherein R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are the same as defined above), for example, among compounds (Ia) obtained by Production Method 1, R2It can be obtained by oxidizing a compound (Iag) having hydroxymethyl as a suitable oxidizing agent. Examples of the oxidizing agent include pyridinium chlorochromate, chromic acid, silver ion, and dimethyl sulfoxide. It can also be obtained by reducing compound (Iaa) with an appropriate reducing agent as described above.
In addition, for example, compound (Iaj), compound (Iai) or compound (Iai) obtained by Production Method 1 is substituted with aminoethyl acetal, hydroxyethyl acetal, halogenated ethyl acetal, halogen in which the halogen moiety is substituted with a tosyl group. Formyl can also be introduced by binding methyl acetal or the like and then removing the acetal.
Similarly, using the compound (Iaj) obtained in Production Method 1, the hydroxyl group is activated in accordance with the method shown in Production Method 1-1, followed by binding of aminoethyl acetal, hydroxyethyl acetal, etc., and then acetal. Formyl can also be introduced by removing.
Compound (Iaf) is prepared by introducing one or more aldehydes or a protected form of aldehydes into a compound such as cyclic polyols used for forming L in advance, for example, according to the method shown in Production Method 1. Using this, the remaining hydroxyl group or halogen moiety of the compound can be obtained by substituting the polyalkylene glycol A or its halide or tosylate at two sites.
Compound (Iaf) and synthetic intermediates thereof can be isolated and purified in any purity by the same method as described above.
Production method 1-4
Among compounds (Ia), R2Is a carbonyl halide (Iah)
Figure 0004142569
(Where Z1Represents halogen and R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are as defined above, for example, R2Compound (Iaa) in which is carboxy in a suitable mixed solvent such as thionyl halide or thionyl halide and toluene or dimethylformamide in the presence of a suitable catalyst such as pyridine or triethylamine at 0 to 150 ° C. for 1 to 24 hours Obtained by heating.
The halogen in the carbonyl halide is as defined above.
Production method 1-5
Among compounds (Ia), R2Wherein I is a halogenated lower alkyl (Iai)
Figure 0004142569
(Where Z2Represents a halogenated lower alkyl, R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are as defined above, for example, R2Compound (Iaj) in which is a hydroxyl group in a suitable solvent such as thionyl halide or thionyl halide and toluene or dimethylformamide in the presence of a suitable catalyst such as pyridine or triethylamine for 1 to 24 hours. Obtained by heating. The halogen and the lower alkyl moiety in the halogenated lower alkyl are as defined above.
Compound (Iai) is, for example, compound (Iaj) or R obtained by Production Method 1.2It can also be obtained by reacting a compound (Iad) wherein is an amino with a dihalogenated alkyl such as dibromoethane or dibromopropane in the presence of a suitable base as described above.
Further, compound (Iai) is prepared by introducing one or more halogenated lower alkyls into a compound such as cyclic polyols used in advance to form L in accordance with, for example, the method shown in production method 1 above. It can also be obtained by a method in which the remaining hydroxyl group or halogen portion of the compound is substituted with two polyalkylene glycols A or a halide or tosylate thereof.
Compound (Iai) and synthetic intermediates thereof can be isolated and purified as having an arbitrary purity by the same method as described above.
Production method 1-6
Among compounds (Ia), R2Is an isocyanate (Iak)
Figure 0004142569
(Wherein R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are each as defined above), for example, the compound (Iad) is reacted with phosgene or oxalyl chloride at 0 to 150 ° C. for 1 to 24 hours in a suitable solvent such as toluene, tetrahydrofuran or methylene chloride. Or after reacting with N, N′-carbonyldiimidazole, it is obtained by decomposition at room temperature.
Among compounds (Ia), R2Compound (Iap) in which is isothiocyanate can be produced according to the above method except that thiophosgene is used instead of phosgene.
Production method 1-7
Among compounds (Ia), R2Wherein succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl or phthalimidooxycarbonyl (Ial)
Figure 0004142569
(Wherein R2aRepresents succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl or phthalimidooxycarbonyl, R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are each as defined above, and can be produced according to a conventional ester synthesis method. For example, 1 to 10 moles of N, N′— is substituted with 1 to 10 moles of N-hydroxysuccinimide, substituted or unsubstituted hydroxyaryl, N-hydroxybenzotriazole or N-hydroxyphthalimide for 1 mole of compound (Iaa). The desired product can be obtained by reacting at −20 to 100 ° C. for 1 to 24 hours in a suitable solvent such as dimethylformamide, methylene chloride, dimethylsulfoxide in the presence of a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide. More specifically, Fradet et al. [Polymer Bullin, Vol. 4, 205 (1981)], or Geckeler et al. [Polymer Bullin, Vol. 1, p. 691 (1979)], a method for introducing a carboxyl group into the terminal of polyalkylene glycol, a method for producing N-hydroxysuccinimide ester of carboxymethyl polyalkylene glycol Etc. can be obtained according to the above.
Here, the substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl has the same meaning as described above. Aryl is as defined above, and the substituent of substituted aryl is as defined for the substituent in substituted aryloxycarbonyl, substituted aryloxycarbonyloxy, substituted aryl disulfide and substituted aroyloxycarbonyl.
Production method 1-8
Among compounds (Ia), R2Wherein I is vinylsulfonyl (Iam)
Figure 0004142569
(Wherein R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are each as defined above), for example, by the method of Marghera Morpurgo et al. Using compound (Iaj) [Bioconjugate Chem., 7, 363 (1996)]. Can be manufactured.
Production method 1-9
Among compounds (Ia), R2A compound of formula (Ian) in which is substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy
Figure 0004142569
(Wherein R2bRepresents substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy, R1, L, M, n, q, X1a, X2And X3Are each as defined above), for example, according to the method of Talia Milon and Meir Wilchek [Bioconjugate Chem., 4, 568 (1993)]2Can be obtained by reacting a compound (Iaj) in which is a hydroxyl group with an excess amount of p-nitrophenyl chloroformate, ethyl chloroformate or the like in the presence of a base such as dimethylaminopyridine or triethylamine.
In addition, compound (Ian) may be substituted with one or more substituted or unsubstituted alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted compounds such as cyclic polyols used for forming L in advance according to the method shown in production method 1, for example. It can also be obtained by introducing an unsubstituted aryloxycarbonyloxy and substituting the remaining hydroxyl group or halogen moiety of the compound with two polyalkylene glycols A or a halide or tosylate thereof.
Compound (Ian) and synthetic intermediates thereof can be isolated and purified in any purity by the same method as described above.
Here, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy has the same meaning as described above.
Production method 2: X1A compound wherein S is S
Of compounds (I), X1Compound (Ib) in which S is S is, for example, a compound obtained by converting a cyclic polyol into a cyclic polyhalide as in Production Method 1 [Edited by the Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th edition, Volume 19 (1992), Maruzen Or a commercially available cyclic polyhalide and a thiol derivative of polyalkylene glycol A in an appropriate solvent in the presence of an appropriate base.
Compound (Ib) can also be obtained by reacting the halide or tosylate of polyalkylene glycols A with cyclic polythiols, contrary to the above step.
The thiol derivative of polyalkylene glycol A can be a commercially available product, or can be prepared by the method summarized by Samuel Zalipsky et al. [Bioconjugate Chem., 6, 150 (1995)].
The reaction conditions and purification conditions in each step are the same as in Production Method 1.
Production method 2-1
Among compounds (Ib), R2Is carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound that is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is represented by X1Can be obtained in combination with the methods described in Production Method 1-1 to Production Method 1-9.
Production method 3: X1Is NR3Is a compound
Of compounds (I), X1Is NR3(Wherein R3Compound (Ic) is a compound obtained by converting a cyclic polyol to a cyclic polyamine or a commercially available cyclic polyamine and a halide of a polyalkylene glycol A, for example, as in Production Method 1. Alternatively, it can be obtained by reacting a tosylated product in a suitable solvent in the presence of a suitable base.
Compound (Ic) can also be obtained by reacting an amino derivative of polyalkylene glycols A with cyclic polyhalides.
In addition, compound (Ic) is an appropriate solvent such as methanol, ethanol, dimethylformamide, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, water, buffer solution, etc., with 1 equivalent of cyclic polyaldehyde and 1-10 equivalents of amino derivative of polyalkylene glycol A It can also be obtained by dissolving or suspending in a solution and reacting at −20 to 100 ° C. in the presence of 1 to 100 equivalents of a reducing agent such as sodium cyanoborohydride or sodium borohydride.
Furthermore, compound (Ic) can also be produced using cyclic polyamines and aldehyde derivatives of polyalkylene glycols A.
As the cyclic polyaldehyde, a commercially available compound may be used as it is, or a cyclic polyalcohol may be used after being oxidized, or a cyclic polycarboxylic acid may be used after reduction. Further, as the aldehyde derivative of polyalkylene glycol A, a commercially available compound can be used, and the terminal alcohol of polyalkylene glycol A can be oxidized and used.
The reaction conditions and purification conditions in each step are the same as in Production Method 1.
Production method 3-1
Among compounds (Ic), R2Is carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing compound (Ic) according to production method 3, followed by production method 1-1 to production. It can be produced by combining the methods described in Method 1-9.
Production method 4: X1Is R4-NH-C (= O) -R5Or R6-C (= O) -NH-R7Is a compound
Of compounds (I), X1Is R4-NH-C (= O) -R5(Wherein R4And R5Compound (Ida), each having the same meaning as described above, is obtained by subjecting a cyclic polycarboxylic acid compound selected from, for example, cyclohexanetricarboxylic acid and Kemp's triacid to a peptide synthesis method [Izumiya et al., Peptide synthesis basics and experiments (1985). Year), Maruzen] and dissolved or suspended in a suitable solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, and then 1-30 equivalents of N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, N-hydroxybenzotriazole, Add an alcohol such as p-nitrophenol and 1-30 equivalents of a condensing agent such as N, N′-dicyclohexylcarbodiimide, benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, Equivalent polyalkylene grease It can be obtained by reacting the addition of amino derivatives of Lumpur class A. The reaction is carried out by stirring at -20 ° C to 100 ° C for 1 hour to 10 days under anhydrous conditions.
Further, after protecting one or more carboxy in the cyclic polycarboxylic acid molecule with an appropriate protecting group such as methyl, ethyl, benzyl, tert-butyl, etc., the amino derivative of polyalkylene glycol A is converted into the remaining two carboxys. By subsequent removal of the carboxy protecting group by conventional deprotection methods.2It is also possible to obtain a reaction liquid containing a double-chain branched polyethylene glycol derivative having a high purity. In this case, for the introduction of the protecting group of carboxylic acid and the removal of the protecting group, a method used in the usual peptide synthesis method [Izumiya et al., Peptide synthesis basics and experiment (1985), Maruzen] can be used. The arrangement of carboxy in the cyclic polycarboxylic acids may be any including the steric configuration, and the amino derivative of the polyalkylene glycols A has a uniform molecular weight distribution (preferably, Mw / Mn is 1.1 or less). Any average molecular weight may be used.
Further, among the compounds (I), X1Is R6-C (= O) -NH-R7(Wherein R6And R7Compound (Idb), each having the same meaning as described above, is an active ester of a carboxylic acid derivative of cyclic polyamines and polyalkylene glycols A, or an acid halide derivative of polyalkylene glycols A, contrary to the above step. It can also be obtained by a method of reacting with. The acid halide derivative of polyalkylene glycol A is a carboxylic acid derivative of polyalkylene glycol A in a suitable mixed solvent such as thionyl halide or thionyl halide and toluene, dimethylformamide, in the presence of a suitable catalyst such as pyridine or triethylamine. And can be obtained by heating at 0 to 150 ° C. for 1 to 24 hours.
The reaction conditions and purification conditions in each step are in accordance with the methods described in the conventional production methods.
Production method 4-1
Of the compounds (Ida) and (Idb), R2Is carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing compound (Ida) or compound (Idb) according to production method 4, It can be obtained by combining the methods described in 1-1 to production method 1-9.
Production method 5: X1Is R8-C (= O) -O or OC (= O) -R9Is a compound
Of compounds (I), X1Is R8-C (= O) -O (wherein R8Is as defined above) or O—C (═O) —R9(Wherein R9The compound (Ie) is a dehydration condensation using, for example, a polyalkylene glycol A and a cyclic polycarboxylic acid, or a combination of a polyalkylene glycol A carboxylic acid derivative and a cyclic polyol. Can be obtained. As a dehydration condensation method, a method of dehydration using an acid or base catalyst as used in usual ester synthesis, or N, N in a suitable solvent such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, pyridine, methylene chloride, etc. A method of condensing a corresponding alcohol and a carboxylic acid with a condensing agent such as' -dicyclohexylcarbodiimide can be used. Furthermore, the target product can also be synthesized by reacting an acid halide with the corresponding alcohol in the above step.
The reaction conditions and purification conditions in each step are the same as those described in the conventional production methods.
Production method 5-1
Among compounds (Ie), R2Is carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing Compound (Ie) according to Production Method 5, and then Production Method 1-1 to Production It can be obtained by combining the methods described in Method 1-9.
Production method 6: X1Is R6a-O-C (= O) -NH or R4Compound that is —NH—C (═O) —O
Of compounds (I), X1Is R6a—O—C (═O) —NH where R6aIs the same as defined above, for example, compound (Ifa) can be produced as follows.
Crude product containing compound (Ifa) by reacting commercially available cyclic polyamines or cyclic polyamines prepared from cyclic polyols by combining the above-mentioned production methods with a carbonate derivative of polyalkylene glycols A in an excess of 1 to 3 mol. Things are obtained. The carbonate derivative of polyalkylene glycols A can be produced according to the method of Talia Milon et al. [Bioconjugate Chem., Vol. 4, 568 (1993)]. Further, as the carbonate derivative of polyalkylene glycols A, N-hydroxysuccinimidyl carbonate, p-nitrophenyl carbonate, imidazolylcarbonyloxy derivative and the like can be used.
Of compounds (I), X1Is R4—NH—C (═O) —O (wherein R4Is the same as defined above) (Ifb) can be produced, for example, as follows.
Compound (Ifb) can be obtained by reacting a carbonate derivative of cyclic polyols and an amino derivative of polyalkylene glycols A in the same manner as described above.
Compound (Ifa) or compound (Ifb) can also be selectively produced by combining functional group protection and deprotection according to other production methods.
The reaction conditions and purification conditions in each step are in accordance with the methods described in the conventional production methods.
Production method 6-1
Among compounds (If), R2Is carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing Compound (If) according to Production Method 6, and then Production Method 1-1 to Production It can be prepared by combining the methods described in Methods 1-9.
R1-Mn-X1Is bonded to L to obtain a single-stranded compound, and the same or different R1-Mn-X1Can be bound to L to obtain a double-stranded compound. For example, the polyalkylene glycol is bonded to one functional group in L using any of the reactions shown in the production methods 1 to 6 to obtain a single-chain compound. The ratio of the single-chain compound to be produced can be adjusted by changing the ratio of the polyalkylene glycol used in the reaction and the raw material for constructing the structure of the L moiety, and the single-chain compound is the main component. Is also possible. The obtained single-stranded compound can be used in the next step with the purity as it is, or after purifying to any purity according to the method shown in Production Method 1 or with a high purity.
A double-stranded compound can be prepared by binding the thus obtained single-stranded compound and the same or different polyalkylene glycols as described above according to any one of the production methods 1 to 6. The second polyalkylene glycol can be subjected to a reaction similar to the reaction for obtaining the single-chain compound, but may be prepared to have a different bonding mode by being subjected to a different reaction. For example, when a compound having a plurality of functional groups such as hydroxyl, amino, carboxy, etc. is used as a raw material for constructing the structure of the L moiety,1First, a single-chain compound in which is O is obtained, and then the second polyalkylene glycol is converted to X by the method shown in Production Method 4.1Is R4-NH-C (= O) -R5It can be made to react so that. As described above, a double-stranded compound in which two polyalkylene glycols are bonded to L in the same or different bonding modes can be obtained by the combination of production methods 1 to 6. Furthermore, the polyalkylene glycols used may have different molecular weights for the first and second molecules, and it is easy to use polyalkylene glycols having different average molecular weights in the reaction of bonding each polyalkylene glycol to L. The desired product is obtained.
In addition, in the reaction of introducing polyalkylene glycols into L, one or more functional groups in L (for example, in the case of production method 1, one or more hydroxyl groups) are left, and other functional groups are replaced with appropriate protecting groups. After protecting, it is also possible to react and bond with polyalkylene glycols, and then remove the protecting group.
The branched polyalkylene glycols of the present invention can be obtained according to the above production method, even if they are other than the compounds specifically shown in the above production method.
In addition, as described above, in each step of production methods 1 to 6, a commercially available polyalkylene glycol can be used, but Samuel Zalipsky [Bioconjugate Chem. 6, 150 (1995)] and can be easily manufactured by various methods.
In the definition of each group of the formula (Ix), the lower alkyl part of lower alkyl and lower alkanoyl is linear or branched having 1 to 8 carbon atoms such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl. , Isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, heptyl, octyl and the like. Alkylene includes, for example, methylene, ethylene, n-propylene, isopropylene, n-butylene, isobutylene, sec-butylene, tert-butylene, pentylene, neopentylene, hexylene, heptylene, octylene and the like having 1 to 8 carbon atoms.
In the formula (Ix), Mx is OCH2CH2, OCH2CH2CH2, OCH (CH3) CH2, (OCH2CH2)rx-(OCH2CH2CH2)sx(Wherein rx and sx are the same or different and represent any positive integer) or (OCH2CH2)rax-[OCH (CH3) CH2]sax(Wherein, rax and sax have the same meanings as rx and sx, respectively), and (OCH2CH2)rx-(OCH2CH2CH2)sx(Wherein rx and sx are as defined above) or (OCH2CH2)rax-[OCH (CH3) CH2]sax(Wherein, rax and sax are as defined above), rx and sx and rax and sax are preferably 1 to 100,000, more preferably 1 to 1,000.
In the formula (Ix), nx represents an arbitrary positive integer, preferably 10 to 100,000, and more preferably 100 to 1,000.
A group having three or more single-chain polyalkylene glycols disclosed in formula (Ix) bonded thereto and having reactivity with an amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group in a physiologically active polypeptide Or a branched polyalkylene glycol having a convertible group bonded to the reactive group, (Mx)nxThe average molecular weight of the polyalkylene glycol moiety represented by is preferably about 1,000 to 1,000,000, more preferably 5,000 to 100,000. (Mx)nxIs-(OCH2CH2)nxIn the case of-, the polyethylene glycol as the raw material is preferably monodispersed with a molecular weight distribution represented by Mw (weight average molecular weight) / Mn (number average molecular weight) of 1.1 or less, and an average molecular weight of 30,000 or less. If so, a commercially available product can be used. For example, monomethoxypolyethylene glycol having an average molecular weight of 2,000, 5,000, 10,000, 12,000, 20,000 or the like can be used.
In the formula (Ix), qx represents an integer of 1 to 3, and is preferably 1.
In the formula (Ix), mx represents an integer of 3 or more, preferably 3-4.
The molecular weight of the branched polyalkylene glycol represented by the formula (Ix) is preferably in the range of 500 to 1,000,000.
In the formula (Ix), Lx is a group capable of branching 4 or more, and has a hydroxyl group, substituted or unsubstituted lower alkyl, lower alkoxy, amino, carboxy, cyano, formyl, or the like as a substituent on Lx. May be. Here, the lower alkyl part of lower alkyl and lower alkoxy has the same meaning as the lower alkyl, and examples of the substituent in the substituted lower alkyl include a hydroxyl group, amino, lower alkanoyloxy, lower alkanoylamino, lower alkoxy, lower alkoxyalkoxy, Lower alkanoyl, lower alkoxycarbonyl, lower alkylcarbamoyl, lower alkylcarbamoyloxy and the like can be mentioned. The lower alkyl part of lower alkanoyloxy, lower alkanoylamino, lower alkoxy, lower alkoxyalkoxy, lower alkanoyl, lower alkoxycarbonyl, lower alkylcarbamoyl and lower alkylcarbamoyloxy has the same meaning as the lower alkyl.
Examples of the group capable of 4 or more branches represented by Lx include X2x-X3xA group that can be converted to a group reactive with an amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group in the polypeptide, or a group having the reactivity,1xAny group may be used as long as three or more molecules of the single-chain polyalkylene glycol can be branched via the intermediate. Examples of Lx include groups obtained by removing 4 or more hydrogen atoms from a compound having a molecular weight of 1,000 or less, such as polyols and polycarboxylic acids. Specific examples of polyols include glucose, D, L-sorbitol, ribose, erythritol, pentaerythritol, tricine, N- [Tris (hydroxymethyl) glycine), inositol, cholic acid, 3,4,5- Trihydroxybenzoic acid (3,4,5-Trihydroxybenzoic acid, Gallic acid), 2,4,6-trihydroxybenzoic acid, 3,4,5-trihydroxybenzaldehyde, quinic acid, shikimic acid (Shikimic acid), low molecular compounds such as tris (hydroxymethyl) aminomethane and their stereoisomers, etc. Specific examples of polycarboxylic acids include 1,4, , 8-naphthalenetetracarboxylic acid, pyromellitic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, 1,2,3,4-butanetetracarboxylic acid, citric acid, γ-carboxyglutamic acid and other low molecular compounds and their stereoisomers can give.
Preferred groups for Lx are groups in which 4 or more hydrogen atoms have been removed from tricine, groups in which 4 or more hydrogen atoms have been removed from shikimic acid, groups in which 4 or more hydrogen atoms have been removed from quinic acid, and hydrogen atoms 4 from erythritol. A group in which 4 or more hydrogen atoms are removed from pentaerythritol, a group in which 4 or more hydrogen atoms are removed from glucose, and the like.
For the construction of the structure of the Lx part, for example, a commercially available compound is used as it is, or it is derivatized into a form suitable for bonding of polyalkylene glycols by a general organic synthesis method, or a functional group is protected. [The Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course 4th Edition (1992), Organic Synthesis IV, Maruzen, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd] Edition, John Wiley & Sons, Inc. (1991), etc.].
Examples of cyclohexanes other than those exemplified above include Kiso et al. [Dai Organic Chemistry, Vol. 6, 183 (1958), Asakura Shoten] or G. E. McCasland and E.M. It can be synthesized according to the method of Clide Horswill [Journal of American Chemical Society, Vol. 76, 2373 (1954)].
In the formula (Ix), X1xThe bond between polyalkylene glycols and Lx via the above can be carried out by easily combining reactions known in ordinary organic synthesis methods [edited by the Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th edition, pages 19-23] (1992), Organic Synthesis IV, Maruzen].
In the formula (Ix), R2xRepresents a group reactive with an amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group in a polypeptide, or a group convertible to the reactive group.
That is, the reactive groups include lysine, cysteine, arginine, histidine, serine, threonine, tryptophan, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, and other side chains, N-terminal amino group, and C-terminal carboxyl in the polypeptide. Groups reactive with any of the groups are included, such as hydroxyl, carboxy, formyl, amino, vinylsulfonyl, mercapto, cyano, carbamoyl, carbonyl halide, halogenated lower alkyl, isocyanate, isothiocyanate, oxiranyl, lower Alkanoyloxy, maleimide, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimidooxycarbonyl, imidazolylcarbonyl, substituted Or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy, tresyl, lower alkanoyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted aroyloxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryl disulfide, azide, etc. .
In the definitions of the above groups, the lower alkyl moiety of lower alkoxycarbonyloxy, halogenated lower alkyl, lower alkanoyloxy and lower alkanoyloxycarbonyl has the same meaning as the lower alkyl. The aryl moiety of aryloxycarbonyl, aryloxycarbonyloxy and aryl disulfide includes, for example, phenyl, naphthyl, biphenyl, anthryl and the like having 6 to 14 carbon atoms. Examples of the aroyl moiety of aroyloxycarbonyl include 7 to 13 carbon atoms such as benzoyl, naphthoyl, and phthaloyl. Examples of the halogen moiety of carbonyl halide and halogenated lower alkyl include fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms.
Examples of the substituent in the substituted lower alkoxycarbonyloxy are the same or different and have 1 to 3 substituents such as a hydroxyl group, carboxy, halogen and the like. Here, halogen is as defined above.
Substituents in substituted aryloxycarbonyl, substituted aryloxycarbonyloxy, substituted aryl disulfide and substituted aroyloxycarbonyl are the same or different and have 1 to 3 substituents such as hydroxyl group, carboxy, halogen, cyano, lower alkyl, etc. can give. Here, halogen and lower alkyl are as defined above.
R2xMay be contained in a raw material for constructing the structure of the Lx moiety, and a necessary functional group in the raw material compound may be converted to an appropriate protecting group [PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS), 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc. (1991), etc.]1xThe polyalkylene glycols may be bonded to Lx via a branch and then branched, followed by deprotection and, if necessary, conversion. Furthermore, polyalkylene glycols are converted to X1xAfter branching from Lx via the2xOr X3xThrough R2xCan also be introduced.
More specifically, for example, the branched polyalkylene glycols in the present invention can be produced by the following production method, but the production method is not limited thereto.
Manufacturing method 1x: X1xIs a bond, O, alkylene, O (CH2)taxOr (CH2)tbxProduction of compounds that are O
Of compounds (Ix), X1xIs a bond, O, alkylene, O (CH2)tax(Wherein tax is as defined above) or (CH2)tbxCompound (Iax) which is O (wherein tbx is as defined above) can be produced, for example, by the following method.
Polyols having three or more hydroxyl groups are dissolved or suspended in an appropriate solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, acetonitrile, pyridine under anhydrous conditions, and 1 to 30 moles of sodium hydride, Halide or tosylate of polyalkylene glycol or its monoalkyl ether or monocarboxylic acid ester (hereinafter collectively referred to as polyalkylene glycols Ax) in the presence of a suitable base such as zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine 3 mol or more is added, and it is made to react at -20-150 degreeC for 1 hour-10 days, and the mixture containing 3 or more chain | strand type branched polyalkylene glycols is obtained.
The polyols are selected from commercially available compounds such as quinic acid, glucose, sorbitol, ribose, erythritol, pentaerythritol, tricine, inositol, or compounds derived from commercially available compounds. Examples of the compounds derived from commercially available compounds include ethylenediaminetetraacetic acid, 1,2,4,5-benzenetetracarboxylic acid (1,2,4,5-benzenetetracarboxylic acid), γ-carboxyglutamic acid (γ -Reducing a polycarboxylic acid selected from, for example, carboxyglutamic acid) with an appropriate reducing agent according to a conventional organic synthesis method [edited by the Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry, 4th edition, 19-21 (1992), Maruzen]. The polyols obtained by the above. Examples of the reducing agent include lithium aluminum hydride, sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, hydrogen and the like.
The arrangement of hydroxyl groups in the polyols may be any, and functional groups that are unnecessary for the reaction are described in the literature [PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 2nd edition, John Wylley & Sons Incorporated (JOHN WILEY & (SONS, INC.) (1991), etc.] can be appropriately protected or derivatized before use in the reaction.
Halides and tosylates of polyalkylene glycols Ax are easily produced by various methods disclosed in the summary of Samuel Zalipsky [Bioconjugate Chem., 6, 150 (1995)]. be able to. As the halide and tosylate of the polyalkylene glycol Ax used for bonding, those having any average molecular weight can be used as long as the molecular weight distribution is uniform (preferably, Mw / Mn is 1.1 or less).
The resulting mixture containing the branched polyalkylene glycols having three or more chains is prepared as it is or by known methods such as ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, two-phase partitioning, and recrystallization. Main chain, four chain, five chain, or higher branched polyalkylene glycols can be purified and isolated to any purity according to the number of branches and used in the next step. In the steps so far, among the compounds (Iax), R2Some of the compounds (Iajx) in which is a hydroxyl group are obtained.
On the other hand, by using polyhalides or polytosyls and polyalkylene glycols Ax, the desired branched polyalkylene glycols having three or more chains can be prepared. In this case, 3 mol or more of polyalkylene glycol Ax is dissolved or suspended in a suitable solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, etc., and 1-30 per mol of polyalkylene glycol Ax. In the presence of a suitable base such as 1 mol of sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine, 1 mol equivalent of polyhalide or polytosyl is added and reacted at −20 to 150 ° C. for 1 hour to 10 days. The target product is obtained.
The polyhalides are commercially available compounds, or can be obtained by converting the polyols to halogen compounds [edited by Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th edition, Volume 19 (1992), Maruzen]. Polytosyl is prepared by dissolving or suspending polyols in a suitable solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, acetonitrile, pyridine, etc., and 1 to 30 moles of sodium hydride, zinc oxide, hydroxylation per hydroxyl group. In the presence of a suitable base such as sodium, triethylamine, potassium naphthalene, etc., it can be obtained by adding 1 to 3 moles of tosyl halide per hydroxyl group and reacting at −20 to 150 ° C. for 1 hour to several days.
Next, the obtained mixture or purified compound containing a branched polyalkylene glycol having three or more chains is added to R2xIs introduced. R2xAs follows, after a polyalkylene glycol Ax or a halide or tosylate thereof is bonded to a polyol, polyhalide or polytosyl, the functional group remaining in the polyol, polyhalide or polytosyl is used as it is, Alternatively, the functional group bonded to the polyols may be protected in advance, and the group obtained by removing the protective group of the functional group after binding the polyalkylene glycol Ax or its halide or tosylate may be used. Good. In this case, after protecting one or more hydroxyl groups or other functional groups in the polyols, polyhalides or polytosyls with an appropriate protecting group, the remaining hydroxyl group, halogen or tosyl group moiety is prepared in the same manner as described above. A polyalkylene glycol Ax or a halide or tosylate thereof is introduced to synthesize a compound in which three or more polyalkylene glycols are bonded, and the functional group from which the protecting group is removed is used as it is, or the functional group R at least one according to the method described below2xConvert to The functional groups present in the polyols, polyhalides or polytosyls before or after bonding the polyalkylene glycols Ax or the halides or tosylates thereof include carboxy, amino, halogen, cyano, There are formyl, carbonyl and the like. In the case of a hydroxyl group, suitable functional group protecting groups are benzyl, tert-butyl, acetyl, benzyloxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl, dimethyl tert-butylsilyl, diphenyl tert-butylsilyl, trimethylsilyl, triphenylsilyl, tosyl, tetrahydro Examples of amino include methyl, ethyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl, N-phthalimide, acetyl, tert-butyloxycarbonyl, and the like. In the case of benzyl, methyl, ethyl, tert-butyl, 9-fluorenylmethyl, methoxyethoxymethyl, 2,2,2-trichloroethyl, 2- (trimethylsilyl) ethyl, cinna In the case of formyl, examples include dimethyl acetal, diethyl acetal, dibenzyl acetal, 1,3-dioxanyl, etc. [Protective Groups in Organic Synthesis, No. 2 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc. (1991)].
Pre-existing functional groups as they are, or protection and deprotection to remove R2xSpecific examples of polyols, polyhalides, or polytosyl that can be used as a raw material for constructing the structure of the Lx moiety include shikimic acid, quinic acid, 3,4,5-trihydroxybenzoic acid, cholic acid, and these Halides, tosylated compounds, and the like.
Among the compounds (Ix), a compound containing Lx is newly substituted with a substituent R2xIn the case of a compound obtained by introducing, it can be easily produced, for example, by the following production method.
Production method 1x-1
Of the compounds (Iax), R2xWherein I is carboxy (Iaax)
Figure 0004142569
(Where X1axIs a bond, O, alkylene, O (CH2)taxOr (CH2)tbxRepresents O and R1xLx, Mx, nx, mx, qx, X2xAnd X3xAre each as defined above,
R2xWherein carbamoyl is the formula (Iabx)
Figure 0004142569
(Wherein R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre each as defined above,
R2xWherein I is cyano (Iacx)
Figure 0004142569
(Wherein R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre as defined above, for example, and can be synthesized as follows.
Compound (Iaax), Compound (Iabx), and Compound (Iacx) are polyols, for example, among compounds (Iax) obtained according to production method 1x, R2xA reaction mixture containing a compound having a hydroxyl group (Iajx) or a purified compound in an appropriate solvent such as water, methylene chloride, toluene, tetrahydrofuran, etc. in the presence of a catalytic amount or 1 to 20% of a base in an acrylic equivalent of 1 to 30 mol. It can be obtained by reacting with acid, acrylamide, acrylonitrile and the like at -20 to 150 ° C for 1 hour to several days. Examples of the base include potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium hydride and the like. In addition, compound (Iaax) is prepared by dissolving a reaction mixture or purified compound containing compound (Iajx) obtained by production method 1x in an appropriate solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran or the like in an anhydrous state. Or suspended in the presence of a suitable base such as 1 to 50 moles of sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine, and the like, with an α-halogenated acetate equivalent to 1 to 50 moles at −20 to 150 ° C. It can also be obtained by hydrolysis after reacting for 1 hour to several days. Further, for example, compound (Iaax) is obtained by dissolving or suspending compound (Iajx) obtained by production method 1x in an appropriate solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, etc. An activator such as 1-50 moles of succinimidyl carbonate, p-nitrophenyl chloroformate, carbonyldiimidazole in the presence of a suitable base such as sodium chloride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine; It can also be obtained by reacting at 20 to 100 ° C. for 1 hour to 10 days and then reacting with an amino acid such as γ-aminobutyric acid, glycine, β-alanine or a derivative thereof.
The compound (Iaax) can also be produced by reacting the compound (Iajx) obtained by the production method 1x with an acid anhydride such as succinic anhydride or glutaric anhydride in the presence of the same base as described above.
In addition, compound (Iaax) can be prepared by reacting R of compound (Iax) according to production method 1x using polyhalides, for example.2xAfter the compound (Iaix) in which is a halogenated lower alkyl is produced, hydroxycarboxylic acid ester, malonic acid ester, γ-aminobutyric acid ester, β-alanine ester, glycine ester, etc. are converted to N, N- Compound (Iaix) dissolved or suspended in a suitable solvent such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, tetrahydrofuran, etc., and in the presence of 1-50 moles of a suitable base such as sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine And after reacting at −20 to 150 ° C. for 1 hour to several days, it can also be obtained by hydrolysis.
Further, the compound (Iaax) is prepared by, for example, substituting one or more hydroxyl groups or halogens of the above-mentioned polyols or polyhalides with a residue containing a carboxylic acid or a carboxylic acid protector in advance, and using this in the production method 1. It can also be obtained by replacing the remaining three or more hydroxyl groups or halogens of the polyols or polyhalides with polyalkylene glycols Ax or a halide or tosylate thereof in the manner shown. In this case, the introduction of a carboxylic acid or a residue containing a carboxylic acid protector can be carried out in the same manner as described above. When the carboxylic acid is protected, the polyalkylene glycol Ax or its halide or tosylate is introduced into the polyol or polyhalide and then deprotected to produce a free carboxylic acid.
The compound converted into the carboxylic acid can be purified and isolated with an arbitrary purity by a known method such as anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, two-phase partitioning, recrystallization and the like.
Production method 1x-2
Of the compounds (Iax), R2xWherein I is amino (Iadx)
Figure 0004142569
(Wherein R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xCan be obtained by, for example, reacting a compound (Iacx) obtained by Production Method 1x-1 with an appropriate reducing agent. Examples of the reducing agent include lithium aluminum hydride, sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, hydrogen and the like.
Compound (Iadx) is, for example, compound (Iaix) obtained by production method 1x or a compound in which the halogen moiety in compound (Iaix) is substituted with a tosyl group in an amount of 5 equivalents to excess diamines such as ethylenediamine and propylenediamine. Can also be obtained by reacting in the presence of a suitable base.
Further, similarly to the production method 1x-1, compound (Iadx) is prepared by dissolving or suspending compound (Iajx) in a suitable solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, toluene, tetrahydrofuran or the like. 1-50 moles of sodium hydride, zinc oxide, sodium hydroxide, triethylamine, etc. in the presence of a suitable base, 1-50 moles of succinimidyl carbonate, p-nitrophenyl chloroformate, carbonyldiimidazole, etc. By reacting with an activator at -20 to 100 ° C. for 1 hour to 10 days and then reacting with 1 equivalent to an excess of diamines such as ethylenediamine and propylenediamine in the presence of a suitable base. Can also be obtained.
In addition, the compound (Iadx) is prepared by introducing one or more amino or amino protectors into a compound such as polyols used in advance to form Lx according to the method shown in the production method 1x, for example. It can also be obtained by a method in which the remaining hydroxyl group or halogen portion of the compound is substituted with three or more polyalkylene glycols Ax or a halide or tosylate thereof.
Of the compounds (Iax), R2xIs a maleimide (Iaex)
Figure 0004142569
(Wherein R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre each as defined above), for example, by the method of Oskar Keller et al. [Helv. Chim. Acta, 58, 531 (1975)] or Timothy P. et al. According to the method of Kogan et al. [Synthetic Commun., 22, 2417 (1992)], the compound (Iadx) is reacted with N-alkoxycarbonylmaleimide in a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate. Can do. As N-alkoxycarbonylmaleimide, N-ethoxycarbonylmaleimide and N-methoxycarbonylmaleimide can be used.
In addition, compound (Iaex) is prepared by introducing one or more maleimides into a compound such as polyols used in advance for forming Lx in accordance with the method shown in production method 1x, for example. It can also be obtained by a method in which the remaining hydroxyl group or halogen moiety is substituted with three or more polyalkylene glycols Ax or a halide or tosylate thereof.
Compound (Iadx), compound (Iaex), and synthetic intermediates thereof can be isolated and purified as having an arbitrary purity according to the number of branches of polyalkylene glycols in the same manner as described above.
Production method 1x-3
Of the compounds (Iax), R2xIs a formyl (Iafx)
Figure 0004142569
(Wherein R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre the same as defined above), for example, among compounds (Iax) obtained by the production method 1x, R2xIt can be obtained by oxidizing a compound (Iagx) having hydroxymethyl as a suitable oxidizing agent. Examples of the oxidizing agent include pyridinium chlorochromate, chromic acid, silver ion, and dimethyl sulfoxide. It can also be obtained by reducing the compound (Iaax) with an appropriate reducing agent as described above.
Further, for example, compound (Iajx), compound (Iaix), or compound (Iaix) obtained by Production Method 1x is substituted with aminoethyl acetal, hydroxyethyl acetal, halogenated ethyl acetal, halogen in which the halogen moiety is substituted with a tosyl group. Formyl can also be introduced by binding methyl acetal or the like and then removing the acetal.
Similarly, using the compound (Iajx) obtained by the production method 1x, the hydroxyl group is activated according to the method shown in the production method 1x-1, and then aminoethyl acetal, hydroxyethyl acetal, etc. are bonded, and then the acetal. Formyl can also be introduced by removing.
In addition, compound (Iafx) is prepared by introducing one or more aldehydes or aldehyde protectors into a compound such as polyols used in advance to form Lx according to the method shown in production method 1x, for example. Can be obtained by substituting three or more polyalkylene glycols Ax or a halide or tosylate thereof with the remaining hydroxyl group or halogen moiety of the compound.
Compound (Iafx) and its synthetic intermediate can be isolated and purified as having an arbitrary purity according to the number of branches of polyalkylene glycols in the same manner as described above.
Production method 1x-4
Of the compounds (Iax), R2xIs a carbonyl halide (Iahx)
Figure 0004142569
(Where Z1xRepresents halogen and R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre as defined above, for example, R2xIs a carboxy compound (Iaax) in a suitable mixed solvent such as thionyl halide or thionyl halide and toluene or dimethylformamide in the presence of a suitable catalyst such as pyridine or triethylamine for 1 to 24 hours. Obtained by heating. The halogen in the carbonyl halide is as defined above.
Manufacturing method 1x-5
Of the compounds (Iax), R2xWherein I is a halogenated lower alkyl (Iaix)
Figure 0004142569
(Where Z2xRepresents a halogenated lower alkyl, R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre as defined above, for example, R2xCompound (Iajx) in which is a hydroxyl group in a suitable mixed solvent such as thionyl halide or thionyl halide and toluene or dimethylformamide in the presence of a suitable catalyst such as pyridine or triethylamine for 1 to 24 hours. Obtained by heating. The halogen and the lower alkyl moiety in the halogenated lower alkyl are as defined above.
Compound (Iaix) is, for example, compound (Iajx) or R obtained by production method 1x2xIt can also be obtained by reacting a compound (Iadx) wherein is an amino with a dihalogenated alkyl such as dibromoethane or dibromopropane in the presence of a suitable base as described above.
Further, compound (Iaix) is prepared by introducing one or more halogenated lower alkyls into a compound such as polyols used in advance to form Lx, for example, in accordance with the method shown in the above production method 1x. Thus, the remaining hydroxyl group or halogen part of the compound can also be obtained by a method of substituting three or more polyalkylene glycols Ax or a halide or tosylate thereof.
Compound (Iaix) and its synthetic intermediate can be isolated and purified as having an arbitrary purity according to the number of branches of polyalkylene glycols in the same manner as described above.
Manufacturing method 1x-6
Of the compounds (Iax), R2xIs an isocyanate (Iakx)
Figure 0004142569
(Wherein R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre each as defined above), for example, the compound (Iadx) is reacted with phosgene or oxalyl chloride at 0 to 150 ° C. for 1 to 24 hours in a suitable solvent such as toluene, tetrahydrofuran or methylene chloride. Or after reacting with N, N′-carbonyldiimidazole, it is obtained by decomposition at room temperature.
Of the compounds (Iax), R2xCompound (Iapx) in which is isothiocyanate (—N═C═S) can be produced according to the above method except that thiophosgene is used instead of phosgene.
Manufacturing method 1x-7
Of the compounds (Iax), R2xWherein succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl or phthalimidooxycarbonyl (Ialx)
Figure 0004142569
(Wherein R2axRepresents succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl or phthalimidooxycarbonyl, R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre each as defined above, and can be produced according to a conventional ester synthesis method. For example, 1 to 10 moles of N, N ′ is substituted with 1 to 10 moles of N-hydroxysuccinimide, substituted or unsubstituted aryl hydroxide, N-hydroxybenzotriazole or N-hydroxyphthalimide for 1 mole of compound (Iaax). -The desired product can be obtained by reacting in a suitable solvent such as dimethylformamide, methylene chloride, dimethyl sulfoxide and the like at -20 to 100 ° C for 1 to 24 hours in the presence of a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide. More specifically, Fradet et al. [Polymer Bullin (4), 205 (1981)], or Geckeler et al. [Polymer Bullin, Vol. 1, p. 691 (1979)], a method for introducing a carboxyl group into the terminal of polyalkylene glycol, a method for producing N-hydroxysuccinimide ester of carboxymethyl polyalkylene glycol Etc. can be obtained according to the above.
Here, the substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl has the same meaning as described above. The aryl moiety of the aryl hydroxide is synonymous with the aryl moiety of the aryloxycarbonyl, and the substituent of the substituted aryl hydroxide is synonymous with the substituent of the substituted aryloxycarbonyl.
Manufacturing method 1x-8
Of the compounds (Iax), R2xWherein I is vinylsulfonyl (Iamx)
Figure 0004142569
(Wherein R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre each as defined above), for example, by the method of Marghera Morpurgo et al. Using the compound (Iajx) [Bioconjugate Chem., 7, 363 (1996)]. Can be manufactured.
Manufacturing method 1x-9
Of the compounds (Iax), R2xWherein I is a substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy (Ianx)
Figure 0004142569
(Wherein R2bxRepresents substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy, R1x, Lx, Mx, nx, mx, qx, X1ax, X2xAnd X3xAre each as defined above), for example, according to the method of Talia Milon and Meir Wilchek [Bioconjugate Chem., 4, 568 (1993)]2xCan be obtained by reacting a compound (Iajx) in which is a hydroxyl group with an excess amount of p-nitrophenyl chloroformate, ethyl chloroformate or the like in the presence of a base such as dimethylaminopyridine or triethylamine.
In addition, the compound (Ianx) is a compound such as a polyol used for forming Lx in advance according to the method shown in the production method 1x, for example, at one or more substituted or unsubstituted alkoxycarbonyloxy or substituted or non-substituted compounds. It can also be obtained by introducing substituted aryloxycarbonyloxy and substituting three or more polyalkylene glycols Ax or a halide or tosylate thereof with the remaining hydroxyl group or halogen moiety of the compound.
Compound (Ianx) and its synthetic intermediate can be isolated and purified as having an arbitrary purity according to the number of branches of polyalkylene glycols in the same manner as described above.
Here, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy has the same meaning as described above.
Manufacturing method 2x: X1xA compound wherein S is S
Of compounds (Ix), X1xThe compound (Ibx) in which S is S is, for example, a compound obtained by converting a polyol into a polyhalide, as in production method 1x [Edited by the Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course, 4th edition, Volume 19 (1992), Maruzen] or It can be obtained by reacting commercially available polyhalides with thiol derivatives of polyalkylene glycols Ax in a suitable solvent in the presence of a suitable base.
Compound (Ibx) can also be obtained by reacting a halide or tosylate of polyalkylene glycols Ax with polythiols, contrary to the above step.
The thiol derivatives of the polyalkylene glycols Ax are commercially available, or can be prepared by the method summarized by Samuel Zalipsky et al. [Bioconjugate Chem., 6, 150 (1995)].
The reaction conditions and purification conditions in each step are in accordance with production method 1x.
Production method 2x-1
Of the compounds (Ibx), R2xIs carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimidooxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound that is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is represented by X1xCan be obtained in combination with the methods described in Production Method 1x-1 to Production Method 1x-9.
Manufacturing method 3x: X1xIs NR3xIs a compound
Of compounds (Ix), X1xIs NR3x(Wherein R3xThe compound (Icx) is a compound obtained by converting a polyol into a polyamine or a commercially available polyamine and a halide or tosylate of a polyalkylene glycol Ax, as in, for example, the production method 1x Can be obtained by reacting in a suitable solvent in the presence of a suitable base.
Compound (Icx) can also be obtained by reacting an amino derivative of polyalkylene glycols Ax with polyhalides.
Compound (Icx) is 1 equivalent of polyaldehyde and an amino derivative of polyalkylene glycol Ax (the amino derivative of polyalkylene glycol Ax is present in an amount of 1 to 30 equivalents per formyl group of polyaldehyde) Is dissolved or suspended in a suitable solvent such as methanol, ethanol, dimethylformamide, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, water, or a buffer solution, and a reducing agent such as sodium cyanoborohydride or sodium borohydride at -20 to 100 ° C. (The reducing agent can be obtained by reacting in the presence of 1 to 30 equivalents per formyl group of polyaldehydes).
Furthermore, the compound (Icx) can also be produced using aldehyde derivatives of polyamines and polyalkylene glycols Ax.
As the polyaldehyde, a commercially available compound may be used as it is, a polyalcohol is used after being oxidized, or a polycarboxylic acid is used after being reduced. In addition, as the aldehyde derivative of the polyalkylene glycol Ax, a commercially available compound can be used, and the terminal alcohol of the polyalkylene glycol Ax can be oxidized and used.
The reaction conditions and purification conditions in each step are in accordance with production method 1x.
Production method 3x-1
Of the compounds (Icx), R2xIs carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing compound (Icx) according to production method 3x, and then production method 1x-1 to production method 1x-1 It can be produced by combining the methods described in Method 1x-9.
Manufacturing method 4x: X1xIs R4x-NH-C (= O) -R5xOr R6x-C (= O) -NH-R7xIs a compound
Of compounds (Ix), X1xIs R4x-NH-C (= O) -R5x(Wherein R4xAnd R5xAre compounds having the same meanings as described above, for example, a compound (Idax) is a peptide synthesis method using a polycarboxylic acid compound selected from, for example, γ-carboxyglutamic acid, citric acid, 1,2,3,4-butanetetracarboxylic acid, etc. [ In accordance with Izumiya et al., Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments (1985), Maruzen], dissolved or suspended in a suitable solvent such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, and then one carboxyl group in the polycarboxylic acid compound 1-30 equivalents of N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, N-hydroxybenzotriazole, p-nitrophenol, and other alcohols, and 1-30 equivalents of N, per carboxyl group in the polycarboxylic acid compound N'-dicyclohexylcarbodiimide, benzotriazole- -Addition of a condensing agent such as yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, and addition of 1 to 30 equivalents of an amino derivative of polyalkylene glycols Ax per carboxyl group in the polycarboxylic acid compound, and reaction. Can be obtained by: The reaction is carried out by stirring at -20 ° C to 100 ° C for 1 hour to 10 days under anhydrous conditions.
In addition, after protecting one or more carboxy in the polycarboxylic acid molecule with a suitable protecting group such as methyl, ethyl, benzyl, tert-butyl, etc., the amino derivative of the polyalkylene glycol Ax is converted into the remaining carboxy as described above. By subsequent removal of the carboxy protecting group by conventional deprotection methods.2xIt is also possible to obtain a reaction solution containing a branched polyethylene glycol derivative having three or more chains in which is carboxy with high purity. In this case, for the introduction of the protecting group of carboxylic acid and the removal of the protecting group, a method used in the usual peptide synthesis method [Izumiya et al., Peptide synthesis basics and experiment (1985), Maruzen] can be used. The arrangement of carboxy in the polycarboxylic acid may be any including the steric configuration, and any amino derivative of the polyalkylene glycol Ax may have any uniform molecular weight distribution (preferably, Mw / Mn is 1.1 or less). An average molecular weight may be used.
Further, among compounds (Ix), X1xIs R6x-C (= O) -NH-R7x(Wherein R6xAnd R7xIs a compound (Idbx), each having the same meaning as described above, and an active ester of a carboxylic acid derivative of a polyamine and a polyalkylene glycol Ax, or an acid halide derivative of a polyalkylene glycol Ax, It can also be obtained by a method of reacting. The acid halide derivative of polyalkylene glycol Ax is a carboxylic acid derivative of polyalkylene glycol Ax in a suitable mixed solvent such as thionyl halide or thionyl halide and toluene or dimethylformamide in the presence of a suitable catalyst such as pyridine or triethylamine. And can be obtained by heating at 0 to 150 ° C. for 1 to 24 hours.
The reaction conditions and purification conditions in each step are in accordance with the methods described in the conventional production methods.
Manufacturing method 4x-1
Of the compounds (Idax) and (Idbx), R2xIs carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing compound (Idax) or compound (Idbx) according to production method 4x, It can be obtained by combining the methods described in 1x-1 to production method 1x-9.
Manufacturing method 5x: X1xIs R8x-C (= O) -O or OC (= O) -R9xIs a compound
Of compounds (Ix), X1xIs R8x-C (= O) -O (wherein R8xIs as defined above) or O—C (═O) —R9x(Wherein R9xIs obtained by dehydration condensation using, for example, a combination of a polyalkylene glycol Ax and a polycarboxylic acid, or a combination of a carboxylic acid derivative of a polyalkylene glycol Ax and a polyol. be able to. As a dehydration condensation method, a method of dehydration using an acid or base catalyst as used in usual ester synthesis, or N, N in a suitable solvent such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, pyridine, methylene chloride, etc. A method of condensing a corresponding alcohol and a carboxylic acid with a condensing agent such as' -dicyclohexylcarbodiimide can be used. Furthermore, the target product can also be synthesized by reacting an acid halide with the corresponding alcohol in the above step.
The reaction conditions and purification conditions in each step are in accordance with the methods described in the conventional production methods.
Manufacturing method 5x-1
Of the compounds (Iex), R2xIs carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing Compound (Iex) according to Production Method 5x, and then Production Method 1x-1 to Production 1x-1 It can be obtained by combining the methods described in Method 1x-9.
Manufacturing method 6x: X1xIs R6ax-O-C (= O) -NH or R4xCompound that is —NH—C (═O) —O
Of compounds (Ix), X1xIs R6ax—O—C (═O) —NH where R6axIs the same as defined above, and the compound (Ifax) can be produced, for example, as follows.
A commercially available polyamine or a polyamine prepared from a polyol by a combination of the above production methods is reacted with 3 mol or more of a carbonate derivative of polyalkylene glycol Ax to obtain a crude product containing the compound (Ifax). In addition, the carbonate derivative of polyalkylene glycols Ax can be produced according to the method of Talia Milon et al. [Bioconjugate Chem., Volume 4, 568 (1993)]. Further, as the carbonate derivative of the polyalkylene glycol Ax, N-hydroxysuccinimidyl carbonate, p-nitrophenyl carbonate, imidazolylcarbonyloxy derivative and the like can be used.
Of compounds (Ix), X1xIs R4x—NH—C (═O) —O (wherein R4xIs the same as defined above, for example, (Ifbx) can be produced as follows.
The compound (Ifbx) can be obtained by reacting a carbonate derivative of a polyol and an amino derivative of a polyalkylene glycol Ax in the same manner as described above.
The compound (Ifax) or the compound (Ifbx) can also be selectively produced by combining functional group protection and deprotection according to other production methods.
The reaction conditions and purification conditions in each step are in accordance with the methods described in the conventional production methods.
Manufacturing method 6x-1
Of the compounds (Ifx), R2xIs carboxy, carbamoyl, cyano, amino, maleimide, formyl, carbonyl halide, lower alkyl halide, isocyanate, isothiocyanate, succinimideoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl, benzotriazolyloxycarbonyl, phthalimide A compound which is oxycarbonyl, vinylsulfonyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyloxy or substituted or unsubstituted aryloxycarbonyloxy is prepared by synthesizing compound (Ifx) according to production method 6x, and then production method 1x-1 to production method 1x-1 It can be prepared by combining the methods described in Method 1x-9.
R1x-(Mx)nx-X1xIs bound to Lx to obtain a single-stranded compound or a double-stranded compound, and the same or different R1x-(Mx)nx-X1xCan be bound to Lx to obtain a compound having three or more chains. For example, a polyalkylene glycol is bonded to one or two functional groups in Lx by using any one of the methods shown in production method 1x to production method 6x, and single-stranded or double-stranded A compound is obtained. The ratio of the single-stranded or double-stranded compound to be produced can be adjusted by changing the ratio of the polyalkylene glycol used in the reaction and the raw material for constructing the Lx moiety structure. It is also possible to use a chain compound as a main component. The obtained single-stranded or double-stranded compound is purified as it is, or purified to any purity or high purity according to the number of branches of the polyalkylene glycols according to the method shown in Production Method 1x. Can be used for the next step.
The single-stranded or double-stranded compound thus obtained and the same or different polyalkylene glycols as described above are combined according to any one of the production methods 1x to 6x to produce 3 More than chain compounds can be prepared. The third or more polyalkylene glycols can be subjected to the same reaction as that for obtaining a single-chain or double-chain compound, but can also be prepared to have a different bonding mode through different reactions. Good. For example, when a compound having a plurality of functional groups such as a hydroxyl group, amino group, carboxy group and the like is used as a raw material for constructing the structure of the Lx portion,1xFirst, a single-stranded or double-stranded compound in which is O is obtained, and then a third or more polyalkylene glycol is converted to X by the method shown in Production Method 4x.1xIs R4x-NH-C (= O) -R5xIt can be made to react so that. As described above, it is possible to obtain a compound having three or more chains in which a plurality of polyalkylene glycols are bonded to Lx in the same or different bonding modes by a combination of production methods 1x to 6x. Furthermore, the polyalkylene glycols used may have different molecular weights at each reaction stage, and can be easily obtained by using polyalkylene glycols having different average molecular weights in the reaction of bonding each polyalkylene glycol to Lx. The target product is obtained.
In addition, in the reaction of introducing polyalkylene glycols into Lx, one or more functional groups in Lx (for example, in the case of production method 1x, one or more hydroxyl groups) are left, and other functional groups are replaced with appropriate protecting groups. After protecting, it is also possible to react and bond with polyalkylene glycols, and then remove the protecting group.
The polyalkylene glycols of the present invention can be obtained according to the above production method, even if they are other than the compounds specifically shown in the above production method.
In addition, as described above, in each step of production methods 1x to 6x, commercially available polyalkylene glycols can be used, but various methods summarized by Samuel Zalipsky [bioconjugates]. Chemistry (Bioconjugate Chem.), Vol. 6, p. 150 (1995)].
The obtained polyalkylene glycols are subjected to silica gel chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, recrystallization, extraction, etc., according to the number of branches of polyalkylene glycols. It can be purified to branched polyalkylene glycols of any purity.
The obtained branched polyalkylene glycols can be bound directly to the amino acid side chain, N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group of the physiologically active polypeptide or via a spacer.
The spacer is preferably an amino acid or a peptide, but other spacers may be used as long as they can bind polyalkylene glycols. As amino acids, natural amino acids such as lysine and cysteine can be used, and ornithine, diaminopropionic acid, homocysteine and the like can also be used. More preferred is cysteine. As a peptide, what consists of amino acid residues 2-10 is preferable. Examples of spacers other than amino acids and peptides include glycerol, ethylene glycol, sugar and the like. Here, examples of the sugar include monosaccharides and disaccharides such as glucose, galactose, sorbose, galactosamine, and lactose.
These spacers are bound to the side chains of lysine, cysteine, arginine, histidine, serine, threonine, etc. in the bioactive polypeptide molecule through amide bonds, thioether bonds, ester bonds, etc. An amide bond or an ester bond with the C-terminal carboxyl group of or an amide bond with the N-terminal amino group of the peptide. These linkages can be performed using conventional peptide synthesis methods [Izumiya et al., Peptide Synthesis Basics and Experiments (1985), Maruzen] and gene recombination methods.
In this case, it is desirable to introduce an amino acid, a peptide, or the like serving as a spacer into the C-terminal carboxyl group at the same time as the bioactive polypeptide is synthesized, but the spacer may be bound after the bioactive polypeptide is synthesized. In addition, the C-terminal carboxyl group and the like of the polypeptide can be chemically synthesized and bound to the spacer. In addition, a spacer to which polyalkylene glycols are previously bound can be bound to a physiologically active polypeptide by the above method.
The antibody used in the present invention is obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody using a known means [Antibodies Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) Spring Spring Laboratory (1988)]. be able to.
As the antibody used in the present invention, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, and a monoclonal antibody is preferable.
Examples of the monoclonal antibody of the present invention include antibodies produced by hybridomas, humanized antibodies, and antibody fragments thereof.
Examples of humanized antibodies include human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies.
The human chimeric antibody is a non-human animal antibody heavy chain variable region (hereinafter, the heavy chain is also referred to as H chain, and the variable region is also referred to as HV or VH) and a light chain variable region (hereinafter, light chain is L Means an antibody comprising a human antibody heavy chain constant region (hereinafter also referred to as CH region) and a human antibody light chain constant region (hereinafter also referred to as CL). To do. Any animal other than a human, such as a mouse, rat, hamster, rabbit, etc., can be used as long as it can produce hybridoma cells.
The human CDR-grafted antibody means an antibody in which the CDR amino acid sequences of the H chain and L chain V regions of non-human animal antibodies are transplanted to appropriate positions of the human antibody H chain and L chain V regions. To do.
Antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab')2Single chain antibodies, disulfide stabilized V region fragments, peptides containing complementarity determining regions, and the like.
Fab is obtained by degrading the upper peptide part of two disulfide bonds, which crosslink two H chains at the hinge region of IgG, with the enzyme papain and about half of the H chain on the N-terminal side and the entire L chain. A fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000.
Fab 'is the above F (ab')2A fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond between the hinges.
F (ab ')2Has an antigen-binding activity with a molecular weight of about 100,000, which is obtained by decomposing the lower part of two disulfide bonds in the IgG hinge region with the trypsin enzyme, and is composed of two Fab regions linked at the hinge portion. Fragment.
A single chain antibody (hereinafter also referred to as scFv) is a VH-P-VL or VL-P in which a single VH and a single VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P). -Indicates a VH polypeptide. As the VH and VL contained in the scFv used in the present invention, either the monoclonal antibody of the present invention or the human CDR-grafted antibody can be used.
A disulfide-stabilized V region fragment (hereinafter also referred to as dsFv) refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue, which are linked via a disulfide bond. The amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering, Volume 7, p. 697 (1994)]. . As VH or VL contained in the disulfide stabilized antibody of the present invention, either a monoclonal antibody or a human CDR-grafted antibody can be used.
As the chemically modified polypeptide used in the present invention, a chemically modified polypeptide obtained by chemically modifying interferons is preferable, and a medicine containing this chemically modified polypeptide is also preferable. In addition, as a pharmaceutical containing a chemically modified polypeptide obtained by chemically modifying interferons, a therapeutic agent for multiple sclerosis, a therapeutic agent for hepatitis, a disease involving angiogenesis, which contains a chemically modified polypeptide obtained by chemically modifying interferons. There are therapeutic agents, therapeutic agents for malignant tumors, therapeutic agents for eye diseases, therapeutic agents for skin diseases, and the like. Preferred are therapeutic agents for multiple sclerosis.
The ointment containing the chemically modified polypeptide of the present invention can be produced by an ordinary ointment preparation method. For example, as an ointment base, macrogol which can prepare an ointment of a water-soluble drug, a hydrophilic base such as sol base, an emulsion base such as hydrophilic ointment, hydrophilic petrolatum, hydrophilic plastibase, and purified lanolin, bentonite, bee gum, starch Non-fat bases such as glue and sodium alginate can be used, and a weight ratio of 0.0000001 to 10% of these ointment bases with chemically modified polypeptide aqueous solution, suspension, or lyophilized powder thereof. And kneading in accordance with a conventional ointment preparation method shown in the literature ["Pharmacology" (Sezaki et al., Published in 1992, Yodogawa Shoten). In these dosage forms, commonly used buffers, excipients, pH adjusters, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, colorants, antioxidants, etc. An agent can also be added and used.
As an administration method, a method of applying the ointment of the present invention transdermally or transmucosally or other acceptable methods can be used, and a composition suitable for administration can be used. The compounding amount of the chemically modified polypeptide in the ointment varies depending on conditions such as the type of disease and the condition of the patient, but the physiologically active polypeptide in the chemically modified polypeptide is 0.0000001% to 10% in 1 g of the ointment. % (Weight ratio) is preferable.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The following examples are illustrative of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the invention. Abbreviations in the examples mean the following unless otherwise specified. In addition, the abbreviation regarding the amino acid used in this specification and its protecting group is a recommendation [Europe J. Biochem. (Eur.J.Biochem.) Of the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature regarding biochemical nomenclature. 138, 9 (1984)].
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
MALDI-TOF MS: Matrix Assisted Laser Deposition Ionization Time of Flight Mass
FAB MS: Fast Atom Bombered Mass
UV: Ultra Violet
RI: Refractive Index
NMR: Nuclear Magnetic Resonance
ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
PEG: Polyethylene glycol
mPEG: monomethoxypolyethylene glycol (monomethoxypolyethylene glycol)
IFN: interferon
hIFN: human interferon
rhIFN: Recombinant human interferon
G-CSF: granulocyte-colony stimulating factor
rhG-CSF: Recombinant human granulocyte- colony stimulating factor
SOD: superoxide dismutase
bSOD: bovine superoxide dismutase
hSOD: human superoxide dismutase
DSC: N, N'-disuccinimidyl carbonate (N, N'-disuccinimidyl carbonate)
TEA: triethylamine
DMF: N, N-dimethylformamide (N, N-dimethylformamide)
DMSO: Dimethylsulfoxide
NHS: N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide)
Ts: p-toluenesulfonyl
TsCl: p-sulfonylsulfuryl chloride (p-toluenesulfonyl chloride)
DMAP: Dimethylaminopyridine (dimethylaminopyridine)
PyBOP: Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (benzotriazol-1-yloxypyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)
HOBt: N-hydroxybenzotriazole (N-hydroxybenzotriazole)
DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (N, N'-dicycyclohexylcarbomide)
LAH: Lithium aluminum hydride
NMM: N-methylmorpholine (N-methylmorpholine)
TFA: trifluoroacetic acid
CDI: N, N'-carbonyldiimidazole (N, N'-carbonyldiimidazole)
Example 1 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTO (2UU)
Construction:
Figure 0004142569
cis, cis-1,3,5-cyclohexanetriol dihydrate (Fluka) 420.5 mg (2.5 mmol) and DSC 3.2 g (12.12). 5 mmol) was dissolved in 20 ml of acetonitrile in an argon stream, 2.1 ml (12.5 mmol) of TEA was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure, and chloroform and 0.1 mol / L hydrochloric acid were added for extraction. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure, and cis, cis-1,3,5-tris (succinimidyloxycarbonyloxy) cyclohexane [cis, cis-1,3,5-tris ( succinimidyloxycarbonyl) cyclohexane] (357 mg, 0.64 mmol) was obtained (yield: 25.7%).
Next, monomethoxypolyethyleneglycolpropylamine (mPEG-NH2) [Molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation] 500 mg (0.1 mmol) and the above cis, cis-1,3,5-tris (succinimidyloxycarbonyloxy) cyclohexane in methylene chloride 12 Dissolved in 0.5 ml, added 28 μl of TEA, and stirred at room temperature for 2 hours. Thereafter, the reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 472 mg of residue (yield 94.4%). Of these, 372 mg was purified by reverse phase HPLC. TSK gel ODS120-T (30 mm x 250 mm) (Tosoh) was used for the column, 0.1% TFA aqueous solution was used as the mobile phase, and flowed at a flow rate of 10 ml / min, and eluted with a linear concentration gradient of 0 to 90% acetonitrile. I let you. 30 ml of a target fraction having an average molecular weight of 10,000 was collected, acetonitrile was removed under reduced pressure, and the mixture was extracted with chloroform. This was added dropwise to diethyl ether, and a white precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 121.7 mg of the desired product (recovery rate 32.7%).
<Gel filtration HPLC analysis>
Mobile phase: 150 mmol / L sodium chloride, 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5)
Flow rate: 0.7ml / min
Detection: RI
Separation column: TSK gel G-2000SWXL(7.8 x 300mm) (Tosoh)
Column temperature: room temperature
Retention time: 12.2 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.61 (s, 8 nH), 3.41 (s, 6H), 4.69 (br, 4H), 1.77 (brm, 4H), 5.30 (br, 2H), 0.8-3.4 (m, 9H), 2.84 (s, 4H)
Example 2 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTC (2AA)
Construction:
Figure 0004142569
270. Dissolve 84.0 mg (0.388 mmol) of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetricarboxylic acid (cis, cis-1,3,5-cyclohexane tricarboxylic acid) (manufactured by Fluka) in 50 ml of DMF. 2 mg (2.0 mmol) of HOBt and 1.04 g (2.0 mmol) of PyBOP were added and stirred at 0 ° C. for 30 minutes. 5 g (1.0 mmol) of monomethoxypolyethyleneglycolpropylamine [average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation] was added, followed by 219.7 μl (1.9 mmol) of NMM, and the mixture was stirred overnight. The pH was adjusted to 1 to 2 with 1 mol / L hydrochloric acid, and the mixture was extracted with chloroform. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then added dropwise to diethyl ether. The white precipitate was recovered, and 3.78 g (yield 75.6%) of a crude product containing the target compound was obtained. Next, 300 ml of DEAE-Sepharose F. F. Purified with a column (Amersham-Pharmacia Biotech). The crude product dissolved in water was added to the column, and the column was further washed with 600 ml of water, followed by elution with a 0.6 to 1.2 mmol / L sodium chloride aqueous solution. Then, the fraction of the target product was extracted with chloroform, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 610.4 mg (yield 65.2%) of the target product.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-2000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.0 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 1.56 (m, 3H), 2.1-2.5 (m, 6H), 1.77 (m, 4H), 2.1-2.3 (br, 4H), 3 .38 (br, 4H), 3.64 (s, 8 nH), 3.36 (s, 6H), 6.46 (t, J = 5.23 Hz, 2H)
Example 3 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTO (2EA)
Construction:
Figure 0004142569
50 g (10 mmol) of mPEG [average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation] was dissolved in 150 ml of toluene and dehydrated and refluxed. TEA (3.5 ml, 25 mmol) was added dropwise, and a solution of thionyl bromide (1.55 ml) dissolved in toluene (13.6 ml) in advance was added dropwise over 1 hour. After refluxing for 1 hour, the mixture was filtered using celite and allowed to stand at room temperature for 4 hours. Next, it heated to 50 degreeC and 5g of activated carbon was added. The activated carbon was removed using celite, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 1 day. The next day, after removing the supernatant, the residue was dissolved in 250 ml of ethanol at 60 ° C. 3 g of activated carbon was added thereto, and the activated carbon was removed using celite, and then allowed to stand at 4 ° C. overnight. The next day, the residue was washed with cold ethanol and diethyl ether, dried, and 32.87 g (yield 65.74%) of brominated mPEG (mPEG-Br) was obtained.
<1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.64 (s, 4 nH), 3.38 (s, 3H), 3.48 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 6.3 Hz, 2H)
After sufficiently drying 1.322 g (10 mmol) of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetriol dihydrate (cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrihydrate dihydrate), the product was dissolved in 25 ml of anhydrous DMF and in an argon stream. The solution was added dropwise to 0.48 g (11 mmol) of sodium hydride and stirred for 30 minutes. 10 g (2 mmol) of the above mPEG-Br dissolved in 25 ml of DMF was added dropwise thereto and stirred at room temperature for a whole day and night. Thereafter, the reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the precipitate was dried under reduced pressure. Next, the dried powder was dissolved in an appropriate amount of water, adjusted to pH 3 with 1 mol / L hydrochloric acid, extracted with chloroform, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in a small amount of methylene chloride, added dropwise to diethyl ether, the resulting precipitate was dried under reduced pressure, and 7.5 g (yield) of a single-chain crude product in which one molecule of mPEG was bonded to cyclohexanetriol. 75.0%).
To 5 g of the obtained crude product, 50 ml of toluene was added, and the mixture was dehydrated and refluxed overnight. Further, 5.5 g (1.1 mmol) of mPEG-Br was dissolved in 50 ml of toluene and dehydrated and refluxed at 160 ° C. overnight. Next, 144 mg (3.3 mmol) of sodium hydride was added to the toluene solution of the above crude product and stirred for 30 minutes, and then a toluene solution of mPEG-Br was added dropwise, followed by dehydration and reflux overnight, followed by filtration. Insolubles were removed and dried under reduced pressure. 1 mol / L hydrochloric acid was added to adjust to pH 1-2, and the mixture was extracted with chloroform. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure, and the residue was dissolved by adding a small amount of methylene chloride, and then added dropwise to diethyl ether. The produced white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 7.73 g (yield: 73.6%) of a crude product containing the target compound.
After 1.5 g of the crude product was dissolved in 8% aqueous potassium hydroxide solution, 150 mg (2.11 mmol) of acrylamide was added, and the mixture was stirred at room temperature for 7 hours. Furthermore, 150 mg (2.11 mmol) of acrylamide was added and stirred at room temperature for 4 days. The reaction solution was adjusted to pH 3 with 1 mol / L hydrochloric acid, extracted with chloroform, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in methylene chloride and added dropwise to diethyl ether, and the resulting precipitate was filtered off and dried under reduced pressure to obtain 1.017 g (67.8%) of the crude target product.
60 ml DEAE-Sepharose F. F. It added to the column (Amersham-Pharmacia Biotech), and eluted with 0.4-1.4 mmol / L sodium chloride aqueous solution. Fractions containing the desired product were extracted with chloroform. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 52 mg of the desired product.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.7 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 2.59 (t, J = 16.0 Hz, 2H), 0.8-3.4 (m, 9H), 3.64 (s, 8 nH), 3.38 (s, 6H)
Example 4 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTM (2EA)
Construction:
Figure 0004142569
400 g (80 mmol) of mPEG [average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation] was dissolved in a mixed solvent of 1 L of toluene and 500 ml of methylene chloride. TsCl (50 g) and then TEA (46.4 ml) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 8 hours. Next, 50 g of TsCl was added and stirred for 16 hours. Insolubles were filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in a small amount of chloroform and dropped into diethyl ether. The produced white precipitate was collected and dried under reduced pressure to obtain 344 g of tosyl esterified mPEG (mPEG-OTs) (yield 86.0%).
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 2.45 (s, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.70 (s, 4nH), 4.16 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 7.34 (D, J = 6.8 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.1 Hz, 2H)
344 g of mPEG-OTs was dissolved in 1 L of DMF, 54 g of sodium iodide was added, and the mixture was stirred at 80 to 90 ° C. for 1 hour. Insoluble materials were filtered off, and the filtrate was added dropwise into diethyl ether. The resulting white precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure. The residue was dissolved in 1.5 L of a 10% aqueous sodium thiosulfate solution, stirred for a while, and then extracted with chloroform. The solvent was removed under reduced pressure to obtain 314 g of iodinated mPEG (mPEG-1) (yield 78.5%).
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.27 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.38 (s, 3H), 3.67 (s, 4nH)
40 g of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetricarboxylic acid (manufactured by Fluka) was dissolved in 1 L of n-propanol and 20 ml of concentrated sulfuric acid and stirred at room temperature for 72 hours. Thereafter, an appropriate amount of ethyl acetate was added to the reaction solution, followed by neutralization with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution. The reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure, and 72.4 g of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetricarboxylic acid n-propyl ester (cis, cis-1,3,5-cyclohexane tricarboxylic acid npropyl ester) (yield: quantitative) )
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 0.94 (t, J = 6.4 Hz, 9H), 1.65 (m, 6H), 4.05 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.56,2. 25, 2.40 (each m, total 9H)
1.19 g of LAH was dissolved in 50 ml of diethyl ether, and 12.5 ml of a diethyl ether solution of 3.2 g of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetricarboxylic acid n-propyl ester was added dropwise under an argon atmosphere. The mixture was further refluxed for 41 hours with stirring. Next, 2.5 ml of water was added dropwise and the mixture was stirred for 15 minutes. Further, 5 ml of ethanol was added dropwise and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was filtered, and the insoluble material was extracted with boiling ethanol. This ethanol solution was combined with the previous filtrate, and the solvent was removed under reduced pressure. The resulting residue was extracted with boiling 1,4-dioxane and then dried over sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure to obtain 1.50 g (yield 91.7%) of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol (cis, cis-1,3,5-cyclohexanetriethanol).
<Mass spectrometry (FAB-MS)>
Actual value: (M + H)+175
Theoretical value: C9H18O3= 174
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.21 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 4.35 (t, J = 5.1 Hz, 3H), 0.43, 1.40, 1.75 (each m, 9H in total)
cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol 2.5 g (14 mmol) was dissolved in 10 ml of dry DMF and added dropwise to 2.28 g (46.2 mmol) of sodium hydride in an argon atmosphere at 0 ° C. for 30 minutes. Stir. Thereto, 40 g (8 mmol) of mPEG-1 dissolved in 50 ml of DMF was added dropwise and stirred at room temperature for a whole day and night. Thereafter, the reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the generated precipitate was dried under reduced pressure. Next, the dried precipitate was dissolved in an appropriate amount of water, adjusted to pH 3 with 1 mol / L hydrochloric acid, extracted with chloroform, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in a small amount of methylene chloride, then added dropwise to diethyl ether, the resulting precipitate was dried under reduced pressure, and a double-stranded crude compound in which two molecules of mPEG were bonded to cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol. 33.0 g (83.0%) of product was obtained.
After dissolving 14.0 g of this crude product in an 8% aqueous potassium hydroxide solution, 1.18 g (16.7 mmol) of acrylamide was added and stirred at room temperature for 7 hours. Further, 1.18 g (16.7 mmol) of acrylamide was added and stirred at room temperature for 4 days. The reaction solution was adjusted to pH 3 with 1 mol / L hydrochloric acid, extracted with chloroform, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in a small amount of methylene chloride and then added dropwise to diethyl ether. The resulting precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 10.2 g (73%) of a crude product. This crude product was treated with 1000 ml of DEAE Sepharose F.I. F. Purification was performed using a column (Amersham-Pharmacia Biotech). Elution was performed with a 0.4 to 100 mmol / L aqueous sodium chloride solution. The fraction containing the desired product was extracted with chloroform, the solvent was removed from the chloroform layer under reduced pressure, and the residue was precipitated with diethyl ether to obtain 500 mg of the desired product.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.7 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.38 (s, 6H), 3.64 (s, 8nH), 0.85, 1.26 (each m, total 9H)
Example 5 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTM (2EU)
Construction:
Figure 0004142569
In the same manner as in Example 4, a double-stranded crude product in which two molecules of mPEG were bonded to cyclohexanetrimethanol was obtained. 2.7 g of this crude product was purified by reverse phase HPLC using the TSK gel ODS120-T column shown in Example 1, and fractions containing only the double-stranded PEG derivative were collected. From this fraction, acetonitrile was removed under reduced pressure, and extracted with chloroform. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then dried under reduced pressure to obtain 227 mg of a double-chain PEG derivative (yield 8.4% from the crude product). 20 mg (2 μmol) of the double-stranded PEG derivative was dried under reduced pressure, 1.2 mg (10 μmol) of DMAP and 2.6 mg (10 μmol) of DSC were added, 1 ml of methylene chloride was added, and the mixture was stirred for 6 hours at room temperature in an argon stream. . The reaction solution was filtered, and the filtrate was added dropwise into diethyl ether. The produced precipitate was collected and dried under reduced pressure to obtain 15 mg of the desired product (yield 75%).
<1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 0.5-2.0 (m, 9H), 2.84 (s, 4H), 3.61 (s, 8nH), 3.41 (s, 6H)
Example 6 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviations: 5QNA (2UA), 5QNA (3UA), 5QNA (4UA)
Construction:
Figure 0004142569
In the formula, R in the compound 5QNA (2UA)1, R2, R3, R42 of them are CH3(OCH2CH2)n-NH-CO-, and the remaining two are hydrogen atoms. In compound 5QNA (3UA), R1, R2, R3, R43 of them are CH3(OCH2CH2)n-NH-CO-, and the remaining one is a hydrogen atom. In compound 5QNA (4UA), R1, R2, R3, R4All of CH3(OCH2CH2)n-NH-CO-)
3 mg of (1R, 3R, 4R, 5R)-(−) quinic acid was dissolved in 250 μl of dry DMF, and then 17 μl of triethylamine and a catalytic amount of CuCl were added. Further, 344 mg of mPEG-NCO (average molecular weight 5,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc., structure: CH3(OCH2CH2)n-N = C = O) was added and stirred at room temperature for 1 hour. The solution was added dropwise to 10 times the amount of diethyl ether, and the resulting precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 306 mg (88%) of a crude product. DEAE Sepharose F.E. F. Purification was performed in the same manner as in Example 2 using a column (Amersham-Pharmacia Biotech). The objective fraction was extracted with chloroform, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain the following compound.
The yield of Compound 5QNA (2UA) was 36 mg (10.5% yield), and the retention time on gel filtration HPLC was 12.4 minutes. The yield of compound 5QNA (3UA) was 24 mg (yield 10.2%), and the retention time on gel filtration HPLC was 11.7 minutes. The yield of compound 5QNA (4UA) was 17 mg (yield 5.4%), and the retention time on gel filtration HPLC was 11.1 minutes. Gel filtration HPLC is TSKgel G2000SW.XLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 5.7-4.8 (m, 3H), 3.33 (s, 6H or 9H or 12H), 3.64 (s, 8nH or 12nH or 16nH)
Example 7 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexene derivative
Abbreviations: 5SKA (2UA), 5SKA (3UA)
Construction:
Figure 0004142569
In the formula, R in the compound 5SKA (2UA)1, R2, R32 of them are CH3(OCH2CH2)n-NH-CO-, and the remaining one is a hydrogen atom. In compound 5SKA (3UA), R1, R2, R3All of CH3(OCH2CH2)n-NH-CO-)
After dissolving 3.2 mg of shikimic acid in 250 μl of dry DMF, 15 μl of triethylamine and a catalytic amount of CuCl were added. Furthermore, 300 mg of mPEG-NCO (average molecular weight 5,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc., structure: CH3(OCH2CH2)n-N = C = O) was added and stirred at room temperature for 1 hour. The resultant precipitate was dropped into 10-fold amount of diethyl ether, and the resulting precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 270 mg (89%) of a crude target product. DEAE Sepharose F.E. F. Purification was performed in the same manner as in Example 2 using a column (Amersham-Pharmacia Biotech). The target fraction was extracted with chloroform, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain the target compound.
The yield of compound 5SKA (2UA) was 4 mg (yield 1.3%), and the retention time on gel filtration HPLC was 12.4 minutes. The yield of compound 5SKA (3UA) was 18 mg (yield 6.0%), and the retention time on gel filtration HPLC was 11.7 minutes. Gel filtration HPLC is TSKgel G2000SW.XLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 6.6-5.1 (m, 4H), 3.33 (s, 6H or 9H), 3.64 (s, 8nH or 12nH)
Example 8 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTM (2URa)
Construction:
Figure 0004142569
50 mg of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol synthesized in the same manner as in Example 4 was dissolved in 0.5 ml of dehydrated DMF, 17 mg of sodium hydride was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 15 minutes. 47 μl of 3-bromopropionaldehyde dimethyl acetal was added and stirred at room temperature for 16 hours. Purification by a silica gel column gave 15 mg of a compound in which propionaldehyde dimethylacetal was bonded to the 1-position of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol (yield 38%).
<1H-NMR analysis (DMSO-d6, 300 MHz)>
δ (ppm): 0.62 (m, 9H), 1.54-1.88 (m, 9H), 1.83 (q, J = 6.20 Hz, 2H), 3.27 (d, J = 6.30 Hz, 2H), 3.33 (s, 6H), 3.39 (d, J = 6.30 Hz, 4H), 3.46 (t, J = 6.20 Hz, 2H), 4.51 ( t, J = 5.70 Hz, 1H)
<Mass spectrometry (FAB-MS)>
Actual value: (M + H)+277
Theoretical value: C14H28O5= 276
15 mg of the obtained compound was dissolved in 1 ml of dehydrated DMF, and 31 μl of triethylamine and a catalytic amount of CuCl were added. 598 mg of mPEG-NCO (average molecular weight 5,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc, structure: CH3(OCH2CH2)n-N = C = O) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The solution was added dropwise to 10 times the amount of diethyl ether, and the resulting white precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure. 578 mg of the obtained white solid was purified by reverse phase HPLC as in Example 1 to obtain 383 mg. 100 mg of this was dissolved in 70% aqueous acetic acid and stirred at 40 ° C. for 16 hours. The reaction solution was neutralized with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and extracted with chloroform. After drying over anhydrous sodium sulfate, the reaction solution was concentrated under reduced pressure. The solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure. The product was purified again by reverse phase HPLC to obtain 39 mg of the desired product (yield 41%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.7 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.38 (s, 6H), 9.79 (t, J = 1.56 Hz, 1H), 3.64 (s, 8 nH)
Example 9 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTM (2UM)
Construction:
Figure 0004142569
100 mg of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol and 735 mg of DSC synthesized in the same manner as in Example 4 were dissolved in about 10 ml of acetonitrile, 210 mg of DMAP was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. The solvent was removed under reduced pressure, and an appropriate amount of methylene chloride and 0.1 mol / L hydrochloric acid was added for extraction. The organic layer was dried under reduced pressure to obtain 333 mg of cis, cis-1,3,5-tris (succinimidyloxycarbonyloxymethyl) cyclohexane [cis, cis-1,3,5-tris (succinimidyloxycarbonylmethyl) cyclohexane]. (Yield 97%).
FAB-MS: 598 (M + H)+
30 mg (0.05 mmol) of the obtained compound and mPEG-NH2[Average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation] 500 mg (0.1 mmol) was dissolved in methylene chloride, 20 μl of TEA was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Subsequently, 42 μl (0.5 mmol) of propylene diamine (manufactured by Aldrich) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 2 hours. The reaction solution was filtered, the filtrate was added dropwise to diethyl ether, and the resulting precipitate was dried under reduced pressure to obtain 430 mg of powder (yield 86%).
425 mg of the obtained powder was dissolved in 200 ml of water, and 20 ml of SP Sepharose F.V. F. The column was purified with a column (Amersham-Pharmacia Biotech), extracted with chloroform from the target fraction containing double-stranded PEG, the resulting organic layer was added dropwise to diethyl ether, and the purified precipitate was dried under reduced pressure. 62.5 mg (6.25 μmol) of the obtained precipitate was dissolved in 0.5 ml of a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and 2.1 mg of ethoxycarbonylmaleimide was added and stirred for 10 minutes under ice cooling. Subsequently, 1.5 ml of water was added and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes and extracted three times with chloroform. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 25 mg of the target compound (yield 40%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-2000SWXLAnalysis was conducted in the same manner as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.4 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 0.63-0.75 (m, 3H), 1.75-1.78 (m, 12H), 3.1-3.3 (m, 12H), 3.38 (s, 6H), 3.64 (s, 8 nH), 5.20 (br, 3H), 6.73 (s, 2H)
Example 10 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-cyclohexane derivative
Abbreviation: 5CHTM (2EA2)
Construction:
Figure 0004142569
After dissolving 100 mg of cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol synthesized in the same manner as in Example 4 in 23 ml of dehydrated DMSO, 958 ml of a tert-butanol solution (1 mol / L) of tert-butoxypotassium was added, Stir at room temperature for 1 hour. Bromoacetic acid tert-butyl ester was added and stirred at 90 ° C. for 16 hours. After being allowed to cool to room temperature, it was purified with a silica gel column, and 1-O-tert-butoxycarbonylmethyl-cis, cis-1,3,5-cyclohexanetrimethanol (1-O-tert-butyoxycarbonylmethyl-cis, cis-1). , 3,5-cyclohexanetriethanol) was obtained (yield 13%).
<1H-NMR analysis (DMSO-d6, 300 MHz)>
δ (ppm): 0.60 (m, 9H), 1.55-1.90 (m, 9H), 1.48 (s, 9H), 3.36 (d, J = 6.42 Hz, 2H) , 3.39 (d, J = 6.15 Hz, 4H), 3.95 (s, 2H)
<Mass spectrometry (FAB-MS)>
Actual value: (M + H)+289
Theoretical value: C15H28O5= 288
22 mg of the compound obtained above was dissolved in 200 μl of dehydrated pyridine under an argon atmosphere, and 200 μl of dehydrated pyridine in which tosyl chloride (23 mg) was dissolved was added thereto. After stirring at 0 ° C. for 3 hours, 20 μl of water was added, and then 100 μl was added. The reaction solution was extracted with ice-cooled chloroform, and washed with ice-cooled 1 mol / L hydrochloric acid, water, and a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution in this order. After drying over anhydrous sodium sulfate, the solvent is removed and the residue is purified on a silica gel column to give 1-O-tert-butoxycarbonylmethyl-3-O, 5-O-ditosyl-1,3,5-cyclohexanetri 22 mg of methanol (1-O-tert-butylcarboxylicmethyl-3-O, 5-O-ditosyl-1,3,5-cyclohexanetriethanol) was obtained (yield 48%).
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 1.26 (m, 9H), 1.75 (m, 9H), 1.47 (s, 9H), 2.46 (s, 6H), 3.29 (d, J = 6 .30 Hz, 2H), 3.80 (m, 4H), 3.89 (s, 2H), 7.36 (d, J = 8.10 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8.40 Hz) , 2H)
<Mass spectrometry (FAB-MS)>
Actual value: (M-tert-Butyl + 2H)+541
Theoretical value: C29H40O9S2= 596
1.4 g of mPEG (average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation) was dissolved in 2 ml of dehydrated toluene, added dropwise to 26 mg of sodium hydride under an argon atmosphere, and stirred for 30 minutes. Thereto, 76 mg of 1-O-tert-butoxycarbonylmethyl-3-O, 5-O-ditosyl-1,3,5-cyclohexanetrimethanol dissolved in 500 μl of dehydrated toluene was added dropwise and stirred at room temperature for a whole day and night. Thereafter, the reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the produced white precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure. 1.2 g of the obtained white solid was added to 120 ml of DEAE Sepharose F.V. F. The column was purified in the same manner as in Example 2 to obtain 154 mg of the desired product (yield 11%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.7 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.38 (s, 6H), 3.64 (s, 8 nH), 0.58 (m, 9H), 1.72-1.93 (m, 9H), 3.38 (s , 6H)
Example 11 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-triazine derivative
Abbreviation: PEG2Cl
Construction:
Figure 0004142569
2.0 g of mPEG having an average molecular weight of 5,000 [manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.], 444 mg of zinc oxide and 10 ml of dry benzene were placed in an eggplant flask and heated to 90 to 95 ° C. in an oil bath to remove 4 ml of the first fraction. . The mixture was further refluxed for 5 hours, cooled to room temperature, added with 36 mg of cyanuric chloride and 1 g of molecular sieves 4A, and dehydrated and refluxed for 3 days. After cooling the reaction solution, it was centrifuged at 3,000 rpm, the supernatant was added dropwise to diethyl ether, and the produced precipitate was collected and dried under reduced pressure. 1 g of the obtained white powder was dissolved in 10 ml of 0.1 mol / L boric acid buffer (pH 10.0) containing 30 mg of γ-aminobutyric acid, and reacted at 4 ° C. for 3 days. 1 mol / L hydrochloric acid was added to adjust to pH 1-2, followed by extraction with chloroform. The chloroform layer was concentrated, and 930 mg of a precipitate formed by adding dropwise to diethyl ether was recovered. This was dissolved in 930 ml of water and 80 ml of DEAE Sepharose F.V. F. Purified with a column (Amersham-Pharmacia Biotech). The target fraction was collected, adjusted to pH 1-2 with 1 mol / L hydrochloric acid, extracted with an appropriate amount of chloroform, and concentrated under reduced pressure. The concentrated solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting precipitate was dried under reduced pressure to obtain 618 mg of the desired product (yield 62%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-2000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.4 minutes
<1H-NMR analysis (300 MHz)>
δ (ppm): 2.38 (t, 2H, J = 6.92 Hz), 1.95 (m, 2H), 5.66 (brt, J = 6.33 Hz, 1H), 4.43 (brm, 2H), 3.38 (s, 6H), 3.64 (brs, 8nH)
Example 12 Synthesis of 6 kDa double-chain branched polyethylene glycol-triazine derivative
Abbreviation: PEG2Mal
Construction:
Figure 0004142569
2.0 ml of 1,3-diaminopropane (20 equivalents, 24 mmol) was dissolved in 600 ml of 0.1 mol / l borate buffer (pH 10), and 6 g of the compound prepared in Example 11 was added and stirred overnight. 2 mol / l hydrochloric acid was added to adjust to pH 1-2, and the mixture was extracted with chloroform. The organic layer was washed with a saturated aqueous sodium chloride solution and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure, and a small amount of methylene chloride was added to the residue to dissolve it. Then, the residue was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to give 2,4-bis [methoxypoly (ethylene glycol)]-6-N. 4.48 g of-(3-aminopropyl) amino-s-triazine {2,4-Bis [methoxy poly (ethylene glycol)]-6-N- (3-aminopropyl) amino-s-triazine} was obtained (yield). Rate 75%).
<1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)>
δ (ppm): 3.64 (s, 8 nH), 3.38 (s, 6H), 4.44 (brt, 2H, J = 5.0 Hz), 4.49 (brt, 2H, J = 5. 13 Hz,), 6.02 (brt, 1H, J = 5.74 Hz), 2.83 (t, 2H, J = 6.47 Hz), 1.71 (m, 2H)
676 mg (8 mmol) of maleimide was dissolved in 40 ml of ethyl acetate, and 878 μl (8 mmol) of N-methylmorpholine was added under ice cooling, followed by 946 μl (9.6 mmol, 1 mmol) of ethoxycarbonyl chloride. .2 equivalents) and stirred for 30 minutes. The reaction solution was filtered, and the filtrate was washed with a saturated aqueous sodium chloride solution and then dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure, and recrystallization from an ethyl acetate-diethyl ether system gave 654 mg of N-ethoxycarbonylmaleimide (yield 55.6%).
<1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)>
δ (ppm): 6.82 (s, 2H), 4.42 (q, 2H, J = 7.00 Hz), 1.42 (t, 3H, J = 7.09 Hz)
2,4-Bis [methoxypoly (ethylene glycol)]-6-N- (3-aminopropyl) amino-s-triazine {2,4-Bis [methoxy polycol]]-6-N synthesized above -(3-aminopropyl) amino-s-triazine} 4.48 g (0.448 mmol) was dissolved in 45 ml of saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution under ice-cooling, and 151.5 mg (N-ethoxycarbonylmaleimide) (N-ethoxycarbonyl maleimide) 0.90 mmol) was added and the mixture was stirred at 0 ° C. for 10 minutes. 180 ml of water was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 15 minutes. After extracting with chloroform and drying over anhydrous sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in a small amount of methylene chloride and added dropwise to diethyl ether. The produced precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain the target product {2,4-bis [methoxypoly (ethylene glycol)]-6-N- (3-maleimidopropyl) amino-s-triazine [2,4-Bis [ 3.9 g of (methy poly (ethylene glycol))-6-N- (3-maleimidopropyl) amino-s-triazine]} was obtained (yield 86.7%).
<1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)>
δ (ppm): 3.66 (s, 8 nH), 3.38 (s, 6H), 6.73 (s, 2H), 4.46 (brm, 4H), 5.76 (brt, 1H, J = 5.74 Hz), 2.61 (brt, 2H), 1.85 (m, 2H)
Example 13 Synthesis of 5KDa double chain branched polyethylene glycol-ornithine derivative
Abbreviation: 5ORN (2UA)
Construction:
Figure 0004142569
10 g (2 mmol) of mPEG (average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation) was dissolved in 10 ml of methylene chloride, 2.56 g (10 mmol) of DSC and 1.22 g (10 mmol) of DMAP were added, and the mixture was stirred at room temperature. Insoluble matter was filtered off, and the filtrate was dropped into 200 ml of diethyl ether to cause precipitation. The white precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 8.6 g (yield: 86.0%) of mPEG succinimidyl carbonate.
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.67 (s, 4 nH), 3.38 (s, 3 H), 2.84 (s, 4 H)
Next, 337.2 mg of ornithine hydrochloride (manufactured by Nacalai Tesque) is dissolved in 10 nl of 75 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8), and 1.0 g of succinimidyl carbonate of mPEG prepared above is added little by little to dissolve. did. While adding a 1 mol / l aqueous sodium hydroxide solution, the pH of the solution was maintained at 7.8, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The pH was adjusted to 3 with 1 mol / l hydrochloric acid, followed by extraction with chloroform. The solvent was removed from the organic layer under reduced pressure, and the residue was dissolved in a small amount of methylene chloride and precipitated in diethyl ether. The white precipitate was collected by filtration to obtain 760.2 mg of ornithine to which one molecule of mPEG was bound (yield 76.0%). This was dissolved in methylene chloride, 760.2 mg of mPEG succinimidyl carbonate prepared above was added, and 21.2 μl of TEA was further added, followed by stirring overnight at room temperature in an argon stream. The insoluble material was filtered off, the solvent was removed under reduced pressure, 50 ml of water was added, and the pH was adjusted to 3 with 1 mol / l hydrochloric acid. Extracted with chloroform and concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in a small amount of methylene chloride and dropped into diethyl ether, and the resulting white precipitate was collected by filtration to obtain 1.21 g (yield 79.6%). Purification with a 60 ml DEAE Sepharose FF column (Amersham-Pharmacia Biotech) yielded 416 mg of the desired product (yield 34.4%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-2000SWXLAnalysis was conducted in the same manner as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.4 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 5.21 (br, 1H), 5.57 (br, 1H), 4.1-4.4 (brm, 4H), 3.64 (s, 8 nH), 3.38 (s , 6H), 1.5-2.0 (m, 6H)
Example 14 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-ornithine derivative
Abbreviation: 5ORN (2RaA)
Construction:
Figure 0004142569
Ornithine hydrochloride 24 mg (0.14 mmol) (manufactured by Nacalai Tesque) was suspended in 10 ml of methanol, and 1.5 g (0.3 mmol) of PEG-aldehyde (manufactured by Shearwater Polymers, Inc., average molecular weight 5,000) was added. In addition, the mixture was stirred at room temperature. 89.5 mg (1.4 mmol) of sodium cyanoborohydride (Sodium Cyanoborohydride) was added and stirred overnight at room temperature. Further, 44.8 mg (0.7 mmol) of sodium cyanoborohydride (Sodium Cyanoborohydride) was added and stirred. Thereafter, an appropriate amount of water was added and methanol was removed under reduced pressure, followed by extraction with chloroform. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 1.25 g of a crude product (yield 83.0%).
Next, it refine | purified using SP-Sepharose FF column (120 ml, Amersham-Pharmacia Biotech), and obtained 165 mg of target objects (yield 13.3%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-2000SWXLAnalysis was conducted in the same manner as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.4 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 1.6-2.1 (m, 4H), 3.0-3.3 (m, 6H), 3.38 (s, 6H), 3.64 (s, 8nH), 4 .68 (br, 1H), 4.72 (br, 1H)
Example 15 Synthesis of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-diaminopropionic acid derivative
Abbreviation: 5DPA (2UA)
Construction:
Figure 0004142569
10 g (2 mmol) of mPEG (average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation) was dissolved in methylene chloride, 2.56 g (10 mmol) of DSC and 1.22 g (10 mmol) of DMAP were added, and the mixture was stirred at room temperature. Insoluble materials were filtered off, and the filtrate was added dropwise into diethyl ether. The white precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 8.6 g (yield: 86.0%) of mPEG succinimidyl carbonate.
Next, 281.1 mg (2 mmol) of 2,3-diaminopropionic acid hydrochloride (manufactured by Nacalai Tesque) was dissolved in 10 ml of 75 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8). The pH was adjusted to 8.5 with a 1 mol / l aqueous sodium hydroxide solution, and 1.0 g of the previously prepared mPEG succinimidyl carbonate was gradually added and dissolved. While adding a 1 mol / L aqueous sodium hydroxide solution, the solution was maintained at pH 8.5 and stirred at room temperature overnight. The pH was adjusted to 3 with 1 mol / l hydrochloric acid, followed by extraction with chloroform. The solvent was removed from the organic layer under reduced pressure to obtain 730.0 mg of 2,3-diaminopropionic acid to which one molecule of mPEG was bound (yield 73.0%). This was dissolved in methylene chloride, 730.0 mg of mPEG succinimidyl carbonate prepared above was added, and 20.4 μl of TEA was further added, followed by stirring overnight at room temperature in an argon stream. The insoluble material was filtered off, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 1.18 g of residue (yield 80.8%). The product was purified with 60 ml of DEAE Sepharose FF (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 507 mg (yield 42.9%) of the target product.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-2000SWXLAnalysis was conducted in the same manner as in Example 1 using a column.
Retention time: 12.1 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 6.00 (br, 1H), 5.70 (br, 1H), 4.1 to 4.4 (brm, 4H), 3.64 (s, 8 nH), 3.38 (s , 6H)
Example 16 Synthesis of 5 kDa three-chain branched polyethylene glycol-tricine derivative
Abbreviation: 5TRC (3UA)
Construction:
Figure 0004142569
0.5 mg (2.8 μmol) Tricine (N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, Nacalai Tesque) and 50 mg (1.0 μmol) mPEG-NCO (Shearwater polymers, Inc., average molecular weight) 5,000, structure: CH3(OCH2CH2)n-N = C = O) was dissolved in 0.5 ml of DMF under an argon stream, 1.4 μl (1.0 μmol) of TEA was added, a small amount of copper chloride was added, and the mixture was stirred at room temperature. Furthermore, 25 mg of mPEG-NCO and 1 μl of TEA were added and stirred. 50 ml of 0.1 mol / L hydrochloric acid was added, followed by extraction with 50 ml of chloroform. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 15 mg of a crude product (yield 20%). Next, DEAE Sepharose F.M. F. (Amersham-Pharmacia Biotech) column was purified to obtain 6.0 mg of the desired product (yield 8.0%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG2000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 1 using a column (7.8 × 300 mm) (Tosoh).
Retention time: 11.5 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.38 (s, 9H), 3.64 (s, 12 nH), 4.10 (s, 6H), 5.43 (br, 3H)
Example 17 Synthesis of 5 kDa 3-chain branched polyethylene glycol-pentaerythritol derivative
Abbreviation: 5PET (3UA)
Construction:
Figure 0004142569
Pentaerythritol (136 mg) and DMAP (122 mg) were dissolved in 5 ml of DMF in an argon stream, and 778 mg of CDI was added, followed by stirring overnight. mPEG-NH2(Average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation, structure: CH3(OCH2CH2)n-CH2-NH2) 5.0 g was dissolved in 10 ml of DMF, 1.25 ml of the reaction mixture described above was added, and the mixture was stirred at room temperature. A solution prepared by dissolving 2.6 g of γ-aminobutyric acid in 100 ml of 0.1 mol / L borate buffer (pH 10) was ice-cooled, and the reaction solution was poured therein. After completion of the reaction, the pH was adjusted to acidic with hydrochloric acid and extracted with chloroform to obtain 4.2 g of residue (84.6%). 3.8 g of the residue was purified with 1000 ml of DEAE Sepharose (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 254 mg of the desired product (yield 6.7%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 11.4 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 5.44 (brt, J = 5.0 Hz, 3H), 5.25 (br, 1H), 4.09 (brs, 8H), 3.65 (s, 12 nH), 3.29 (S, 9H), 3.26 (m, 8H), 2.37 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.80 (brm, 2H), 1.77 (m, 6H)
Example 18 Synthesis of 5 kDa three-chain branched polyethylene glycol-pentaerythritol derivative
Abbreviation: 5PET (3UM)
Construction:
Figure 0004142569
Pentaerythritol 136 mg and DMAP 122 mg were dissolved in 5 ml of DMF, 778 mg of CDI was added, and the mixture was stirred overnight in an argon stream. mPEG-NH2(Average molecular weight 5,000, manufactured by NOF Corporation, structure: CH3(OCH2CH2)n-CH2-NH2) 1.0 g was dissolved in 2 ml of DMF, and 0.25 ml of the reaction mixture described above was added and reacted at room temperature. Subsequently, 187 μl of propylenediamine was added and reacted, and then diethyl ether was added. The white precipitate was collected and dried under reduced pressure to obtain 975 mg of residue (yield 97.5%). This residue was washed with 100 ml of SP Sepharose F. F. Purification with a column (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 110 mg of white powder (yield 11.3%).
Next, 100 mg of this white powder was dissolved in a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, 2.3 mg of ethoxycarbonylmaleimide was added at 0 ° C., and the mixture was further stirred at 0 ° C. for 10 minutes. Water was added and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes and extracted with chloroform. The chloroform layer was concentrated under reduced pressure, then added dropwise to diethyl ether, and the white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 35 mg of the desired product (yield 35%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 11.3 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 6.73 (s, 2H), 5.33 (br, 3H), 4.08 (brs, 8H), 3.64 (s, 12 nH), 3.36 (s, 9H), 3.25 (m, 6H), 3.11 (m, 2H), 1.77 (m, 8H)
Example 19 Synthesis of three-chain branched polyethylene glycol-pentaerythritol derivative
Abbreviation: 5PET (3UU)
Construction:
Figure 0004142569
Pentaerythritol 136 mg and DMAP 122 mg were dissolved in DMF 5 ml, CDI 681 mg was added, and the mixture was stirred in an argon stream. mPEG-NH21.0 g (average molecular weight 5,000, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) was dissolved in 2 ml of DMF, 286 μl of the reaction mixture described above was added, and the mixture was reacted at room temperature. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and a white precipitate was collected and dried under reduced pressure to obtain 1 g of a residue (yield 100%). Subsequently, the residue was purified using a TSKgel ODS-120T column (30 mm × 250 mm, Tosoh) to obtain 165 mg of white powder (yield 16.5%).
Next, 80 mg of this white powder was dissolved in methylene chloride, added with 4.1 mg of DSC and 2.1 mg of DMAP, and stirred at room temperature in an argon stream. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 63 mg of the desired product (yield 78.8%).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 10.7 minutes
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 5.49 (br, 3H), 4.11 (brs, 8H), 3.64 (s, 12nH), 3.38 (s, 9H), 3.25 (m, 6H), 2.87 (s, 4H), 1.78 (m, 8H)
Example 20 Synthesis of three-chain branched polyethylene glycol-pentaerythritol derivative
Abbreviation: 5PET (3URa)
Construction:
Figure 0004142569
Pentaerythritol 136 mg and DMAP 122 mg were dissolved in 5 ml of DMF, and 681 mg of CDI was added and stirred in an argon stream. mPEG-NH21.0 g (average molecular weight 5,000, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) was dissolved in 2 ml of DMF, 286 μl of the reaction mixture described above was added, and the mixture was reacted at room temperature. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and a white precipitate was collected and dried under reduced pressure to obtain 950 mg of residue (yield 95%). Subsequently, the residue was purified using a TSKgel ODS-120T column (30 mm × 250 mm, Tosoh) to obtain 300 mg of white powder (yield 31.6%).
Next, 300 mg of this white powder was dissolved in methylene chloride, 15.4 mg of DSC and 7.3 mg of DMAP were added, and the mixture was stirred at room temperature in an argon stream. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure. 1 ml of methylene chloride was added and dissolved, 3.5 μl of 4-aminobutyraldehyde diethylacetal was added, and the mixture was stirred at room temperature. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 250 mg of residue (yield 83.3%).
100 mg of the residue was dissolved in methylene chloride containing 10% TFA, allowed to stand at 0 ° C. for 1 hour, then added dropwise to diethyl ether, and the white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 40 mg of the desired product (yield 40.0% ).
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG2000SWXLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
Retention time: 10.6 minutes
Example 21 Synthesis of 3- to 4-chain branched polyethylene glycol-sugar derivative
Abbreviations: 5SUG (3UA), 5SUG (4UA)
Construction:
Figure 0004142569
(In the compound 5SUG (3UA), R1, R2, R3, R43 of them are CH3(OCH2CH2)n-NH-CO-, and the remaining one is a hydrogen atom. In compound 5 SUG (4UA), R1, R2, R3, R4All of CH3(OCH2CH2)n-NH-CO-)
5.18 g of α-D-glucose pentaacetate was dissolved in 80 ml of DMF, 2.37 g of hydrazine acetate was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. The reaction solution was extracted with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was washed with water and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The solution was concentrated under reduced pressure, and α-D-glucopyranose-2,3,4 , 6-tetraacetate (α-D-Glucopyranose-2,3,4,6-tetraacetate) was obtained 4.0 g (yield 87%).
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
(Ppm): 2.02 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 4.14 (m, 1H), 4 .27 (m, 2H), 4.91 (m, 1H), 5.09 (t, 1H, J = 9.7 Hz), 5.47 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 5.55 (T, 1H, J = 9.8Hz)
850 mg of the above compound was dissolved in 15 ml of methylene chloride, and 4.8 ml of trichloroacetonitrile, 365 ml of DBU (1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene) was added at 0 ° C. The solution was concentrated under reduced pressure and then purified by a silica gel column, and α-D-glucopyranose-2,3,4,6-tetraacetate 1- (2,2,2-trichloroethaneimidate) (α-D-glucopyranose). 635 mg of -2,3,4,6-tetraacetate-1- (2,2,2-Trichloroethanimidate)) was obtained (yield 53%)
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
(Ppm): 2.02 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 4.13 (m, 1H), 4 .21 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 5.13 (m, 1H), 5.19 (t, 1H, J = 9.8 Hz), 5.57 (t, 1H, J = 9.9 Hz), 6.56 (d, 1 H, J = 3.7 Hz), 8.71 (s, 1 H)
693 mg of the above compound and 109 μl of methyl glycolate were dissolved in methylene chloride and stirred at room temperature under an argon atmosphere. The reaction mixture was cooled, 163 μl of a mixed solution (2: 1) of trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate and dehydrated methylene chloride was added, and the mixture was stirred overnight. 77 μl of triethylamine was added and filtered through celite. The solution was concentrated under reduced pressure and then purified by a silica gel column, and [(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) oxy] acetic acid methyl ester [(2,3,4,6 -Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) oxy] acetic acid methyl ester was obtained (yield 27%).
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
(Ppm): 2.01 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 3.70 (m, 1H), 3 .75 (s, 3H), 4.14 (m, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.29 (s, 2H), 4.67 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 5.05 (m, 1H), 5.09 (t, 1H, J = 10.8 Hz), 5.25 (t, 1H, J = 9.5 Hz)
162 mg of the above compound was dissolved in 1 ml of methanol and Amberlyst was added. 9.4 μl of a methanol solution of sodium methoxide (28%) was added and stirred at room temperature. The reaction solution was filtered through Celite, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 80 mg of [(β-D-glucopyranosyl) oxy] acetic acid methyl ester [(β-D-glucopyranosyl) oxy] acetic acid methyl ester (yield 82). %).
<1H-NMR analysis (D2O, 300 MHz)>
(Ppm): 3.39 (s, 2H), 3.40 (m, 2H), 3.69 (m, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.86 (m, 1H), 4 .06 (m, 1H), 4.26 (m, 1H) 4.44 (m, 1H)
2 mg of the above compound was dissolved in 100 μl of DMF and 7 μl of triethylamine and a small amount of CuCl were added. 240 mg of mPEG-NCO was added and stirred. The solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was collected and dried under reduced pressure. 200 mg of the obtained white solid was dissolved in 1 mol / L potassium carbonate aqueous solution and stirred at room temperature for 4 hours. Chloroform and 0.1 mol / L hydrochloric acid were added to the reaction solution, and the chloroform layer was extracted, dried over anhydrous sodium sulfate, and then dried under reduced pressure to obtain 195 mg of a white solid. 20 ml of DEAE Sepharose F. F. Purification by a column (Amersham-Pharmacia Biotech) gave the compounds shown below.
The yield of compound 5SUG (3UA) was 6 mg (5.0% yield), and the retention time on gel filtration HPLC was 10.8 minutes. The yield of compound 5 SUG (4UA) was 12 mg (yield 7.6%), and the retention time on gel filtration HPLC was 10.4 minutes. Gel filtration HPLC is TSKgel G2000SW.XLMeasurement was performed under the same conditions as in Example 1 using a column.
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.38 (s, 9H or 12H), 3.64 (t, 12nH or 16nH), 4.1 to 5.6 (m, 7H)
Example 22 Synthesis of 10 kDa linear polyethylene glycol derivative
Abbreviation: 10 SCM
Construction:
Figure 0004142569
S. Zalipsky and G.M. According to the method of Barany [Journal of Bioactive and compatible polymers, Vol. 5, pp. 227 (1990)], it was produced by the following method.
10 g of mPEG [monomethoxypolyethylene glycol, average molecular weight 10,000, manufactured by NOF Corporation, SUNBRIGHT VFM-3010M] was dissolved in 50 ml of dry toluene, and 1.12 g of tert-butoxypotassium was added and distilled. 30 ml of the minute was removed. After cooling to 50 ° C. in an argon stream, 1.1 ml of ethyl α-bromoacetate was added, and stirring was continued for a whole day and night. The reaction mixture was added dropwise to 500 ml of diethyl ether, and the resulting precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure. Subsequently, 9.2 g of the obtained dry powder was dissolved in 150 ml of a 1 mol / L aqueous sodium hydroxide solution and stirred at room temperature for 1 hour. 160 ml of 1 mol / L hydrochloric acid was added and extracted with 500 ml of chloroform. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated under reduced pressure to 10 ml, then dropped into 300 ml of diethyl ether, and the resulting precipitate was dried under reduced pressure to obtain 7.5 g of the target compound as a white powder (yield 75%). ).
<1H-NMR analysis (CDCl3, 300 MHz)>
δ (ppm): 3.64 (s, 4 nH), 3.38 (s, 3 H), 4.15 (s, 2 H)
Example 23 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5CHTO (2UU) -rhIFN-β
15 mg of the compound obtained in Example 1 (protein) was added to 1.2 ml of unmodified rhIFN-β obtained in Reference Example 1 at 1.3 mg / ml prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing sodium chloride. 20 mol per mol) was added, and the reaction was carried out at 4 ° C. overnight. Next, the reaction solution was subjected to gel filtration using a Sephacryl S300 column 24 ml (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech). A 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and 0.1 mol / L sodium chloride was used as the eluent. 14.5 ml of the fraction containing the desired product was collected, diluted by adding 14.5 ml of water, and CM-Sepharose F.F. F. The column was purified with 1.5 ml (manufactured by Amasham-Pharmacia Biotech). The fraction obtained by gel filtration was passed through the same column, washed with 3 ml of the same buffer, eluted with the same buffer containing 1 mol / L sodium chloride, and fractionated. A 1.4 ml fraction containing 0.24 mg / ml of the desired product was recovered (yield 21.5%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the presence of 2-mercaptoethanol, and bands of 1 to 5 molecule conjugates were confirmed.
<Electrophoresis conditions>
Gel: PAGEL SPG 520L (manufactured by Ato)
Staining: FAST STAINTM
Molecular weight marker: Low Molecular Weight Standard (manufactured by Bio-Rad)
<Gel filtration HPLC analysis>
Mobile phase: 150 mmol / L sodium chloride, 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5)
Flow rate: 0.5ml / min
Detection: UV280nm
Separation column: TSK gel G-4000SWXL(7.8 x 300 mm x 2 linked) (Tosoh Corporation)
Retention time: 40.3 minutes (1-4 molecule conjugate)
Example 24 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5CHTC (2AA) -rhIFN-β
100 mg (0.01 mmol) of the compound of Example 2 was dissolved in 1.0 ml of methylene chloride, 5.7 mg (0.05 mmol) of NHS and 10.3 mg (0.05 mmol) of DCC were added, and the mixture was stirred at 0 ° C. in an argon stream at Stir for minutes. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature for 3 hours, and the reaction solution was added dropwise to diethyl ether. The white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 65.0 mg of NHS ester of the compound of Example 2 (yield 65.0%).
To 1.28 ml (1.067 mg / ml) of the unmodified rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing sodium chloride, 17 mg of the NHS ester (protein) 25 moles per mole) and reacted at 4 ° C. overnight. Next, the reaction solution was subjected to gel filtration using a Sephacryl S300 column 24 ml (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech). A 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and 0.1 mol / L sodium chloride was used as the eluent. 24 ml of the fraction containing the desired product was collected, diluted by adding 24 ml of water, and CM-Sepharose F.F. F. The column was purified with 1.5 ml (manufactured by Amasham-Pharmacia Biotech). The fraction obtained by gel filtration was passed through the same column, washed with 3 ml of the same buffer, eluted with the same buffer containing 1 mol / L sodium chloride, and fractionated. A fraction (1.5 ml) containing 0.49 mg / ml of the desired product was recovered (yield 44.5%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and bands of 1 to 4 molecular conjugates were confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed under the same conditions as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 25 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5CHTO (2EA) -rhIFN-β
20 mg of the compound of Example 3 was dissolved in methylene chloride, 1.15 mg of NHS and 2.06 mg of DCC were added in an argon stream, and the mixture was stirred for 30 minutes under ice cooling, followed by 2 hours at room temperature. Insoluble matter was filtered, and the filtrate was added dropwise to diethyl ether to cause precipitation. The precipitate was dried under reduced pressure to obtain 14.5 mg of NHS ester of the compound of Example 3 (yield 72.5%).
To 0.78 ml (0.937 mg / ml) of the unmodified rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing sodium chloride, 9.1 mg of the NHS ester was added. (25 mol with respect to 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. all day and night. Next, the reaction solution was subjected to gel filtration using a Sephacryl S300 column 24 ml (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech). A 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and 0.1 mol / L sodium chloride was used as the eluent. 8.5 ml of the fraction containing the desired product was recovered, diluted by adding 8.5 ml of water, and CM-Sepharose F.F. F. The column was purified with 1.5 ml (manufactured by Amasham-Pharmacia Biotech). The fraction obtained by gel filtration was passed through the same column, washed with 3 ml of the same buffer, eluted with the same buffer containing 1 mol / L sodium chloride, and fractionated. A fraction (0.5 ml) containing the desired product (0.067 mg / ml) was recovered (yield 4.5%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed under the same conditions as in Example 23 using two columns.
Retention time: 35.9 minutes (1-3 molecule conjugate)
Example 26 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -rhIFN-β
487 mg (48.7 μmol) of the compound of Example 4 was dissolved in methylene chloride, and 16.8 mg (146.0 μmol) of NHS and 30.1 mg (145.9 μmol) of DCC were added in an argon stream, followed by cooling with ice for 30 minutes, followed by room temperature. For 2 hours. Insoluble matter was filtered, and the filtrate was added dropwise to diethyl ether to cause precipitation. The precipitate was dried under reduced pressure to obtain 260.0 mg of NHS ester of the compound of Example 4 (yield 53.4%).
Subsequently, the NHS was added to 1.2 ml (1.22 mg / ml) of the unmodified rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8) containing ethylene glycol and sodium chloride. 14.6 mg of ester (20 moles per mole of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight. Next, the reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol using a gel filtration column Sephadex-G25 (NAP-10, manufactured by Amersham-Pharmacia Biotec). The fraction obtained by gel filtration was purified using CM Sepharose F.M. F. The column was passed through 1.5 ml (Amasham-Pharmacia Biotech), washed with 3 ml of the same buffer, eluted with the same buffer containing 0.2 to 1.0 mol / L sodium chloride, and fractionated. 3.75 ml of a fraction containing 0.194 mg / ml of the desired product was collected (yield 49.7%).
<Electrophoresis>
Analysis was conducted in the same manner as in Example 23, and a modified product in which 1 to 2 molecules of polyethylene glycol were bonded was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 27 Preparation of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5ORN (2UA) -rhIFN-β
100 mg (10 μmol) of the compound of Example 13 was dissolved in 1 ml of methylene chloride, NHS 3.5 mg (30 μmol) and DCC 6.2 mg (30 μmol) were added in an argon stream, and the mixture was stirred for 30 minutes under ice-cooling and then at room temperature for 2 hours. did. The reaction solution was filtered to remove insoluble matters, and then the filtrate was dropped into diethyl ether to precipitate. The precipitate was dried under reduced pressure to obtain 65 mg of NHS ester of the compound of Example 13 (yield 65%).
Next, activated to 1.2 ml (1.0 mg / ml) of rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and 1 mol / L sodium chloride aqueous solution. 12 mg (20 moles per mole of protein) of the modified agent was added and reacted at 4 ° C. overnight.
The reaction solution was purified with 1.5 ml of CM-Sepharose FF column (Amersham-Pharmacia Biotech) in the same manner as in Example 23 to obtain 4.4 ml of the target product of 0.113 mg / ml (yield 41.4%). .
<Electrophoresis>
Analysis by SDS-PAGE in the same manner as in Example 23 confirmed the band of 1 to 4 molecule conjugate.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed under the same conditions as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 28 Preparation of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5ORN (2RaA) -rhIFN-β
100 mg (10 μmol) of the compound of Example 14 was dissolved in 1 ml of methylene chloride, 5.7 mg (50 μmol) of NHS and 10.3 mg (50 μmol) of DCC were added, and the mixture was stirred in an argon stream for 30 minutes under ice-cooling, followed by stirring at room temperature for 2 hours. did. The reaction solution was filtered to remove insoluble matters, and then the filtrate was added dropwise into diethyl ether. The precipitate was dried under reduced pressure to obtain 58 mg (yield 58%) of the NHS ester of the compound of Example 14.
Next, 14.6 mg of the above NHS ester (protein) was added to 1.2 ml (1.2 mg / ml) of rhIFN-β solution prepared with 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and 1 mol / L sodium chloride aqueous solution. (20 mol per 1 mol) was added and reacted. The reaction solution was purified with 1.5 ml of CM-Sepharose FF column (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 3.5 ml of the desired product of 0.12 mg / ml (yield 35.0%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed under the same conditions as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 29 Preparation of 5 kDa double-stranded branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5DPA (2UA) -rhIFN-β
100 mg (10 μmol) of the compound of Example 15 was dissolved in 1 ml of methylene chloride, NHS 57.5 mg (50 μmol) and DCC 10.3 mg (50 μmol) were added in an argon stream, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes and then at room temperature for 2 hours. . The insoluble material was filtered, and the filtrate was added dropwise to diethyl ether. The precipitate was dried under reduced pressure to obtain 71 mg (yield 71%) of NHS ester of the compound of Example 15.
Next, 13.2 mg (protein) of the NHS ester was added to 1.2 ml (1.1 mg / ml) of rhIFN-β solution prepared with 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and 1 mol / L sodium chloride aqueous solution. (20 mol per 1 mol) was added and reacted. The reaction solution was purified with 1.5 ml of CM-Sepharose FF column (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 3.5 ml of the desired product of 0.12 mg / ml (yield 31.8%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed under the same conditions as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 30 Preparation of 6 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: PEG2Mal-rhIFN-β
2.7 mg of the compound (average molecular weight 12,000) obtained in Example 12 was added to 0.62 ml of 2.44 mg / ml rhIFN-β solution prepared with 20 mmol / L phosphate buffer containing sodium chloride, urea and mannitol. (3 moles per mole of protein) was added and reacted. Next, 0.38 ml of the reaction solution was subjected to gel filtration purification using a Sephacryl S-300 column (column size 20 ml, manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.5 ml of a fraction containing 0.17 mg / ml of the target product was collected. (Yield 16.9%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23 to confirm a single molecule conjugate.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLMeasurement was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 44.4 minutes
Example 31 Preparation of 20 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 20Mal-rhIFN-β
MPEG-maleimide (average molecular weight 20,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc.) was added to 0.42 ml of a 1.72 mg / ml rhIFN-β solution prepared with a 20 mmol / L phosphate buffer containing sodium chloride, urea, and mannitol. 2.1 mg (3 mol per 1 mol of protein) was added and reacted. Next, 0.38 ml of the reaction solution was subjected to gel filtration purification using a Sephacryl S-400 column (column size 20 ml, manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.5 ml of a fraction containing 0.10 mg / ml of the target product was collected. (Yield 22.7%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and a band of a single molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 40.0 minutes
Example 32 Preparation of 5 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5Mal-rhIFN-β
To 0.42 ml of a 1.7 mg / ml rhIFN-β solution prepared with a 20 mmol / L phosphate buffer containing sodium chloride, urea and mannitol, mPEG-maleimide (average molecular weight 5,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc.) 0.55 mg (3 mol per mol of protein) was added and reacted. Next, 0.38 ml of the reaction solution was purified by gel filtration on a Sephacryl S-200 column (column size 20 ml, manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and the target fraction 4.5 ml from which the aggregate and unreacted rhIFN-β were removed. Was recovered. Furthermore, it was purified with a CM-Sepharose FF column (column size: 1 ml, manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and 1 ml of a fraction containing 0.082 mg / ml of the target product was recovered (yield 11.3%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of a single molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLMeasurement was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 46.2 minutes
Example 33 Preparation of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5TRC (3UA) -rhIFN-β
To 5 mg (0.33 μmol) of the compound of Example 16, 50 μl (0.66 μmol) of a 1.5 mg / ml NHS solution prepared with methylene chloride and 100 μl (0.66 μmol) of a 1.4 mg / ml DCC solution were added. The mixture was stirred in an air stream at room temperature for 30 minutes under ice cooling for 2 hours. The precipitate formed by adding diethyl ether was dried under reduced pressure to obtain 3.5 mg (70% yield) of NHS ester.
Next, to the 150 μl (0.9 mg / ml) of rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with a 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and sodium chloride, 33.4 mg of the above NHS ester (protein) 34 moles per 1 mole) was added, and the reaction was allowed to stand at 4 ° C. overnight. The reaction solution was exchanged with a gel filtration column Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia Biotech) to 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol, and CM Sepharose F.A. F. Purification with 0.5 ml of column (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 0.40 ml of 0.091 mg / ml of the desired product (yield 27.0%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 42.0 minutes (single molecule conjugate)
44.1 minutes (2 molecule conjugate)
Example 34 Preparation of 5 kDa 3-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5SKA (3UA) -rhIFN-β
16 mg (1.1 μmol) of the compound 5SKA (3UA) of Example 7 was dissolved in 100 μl of methylene chloride, 272 μg of DCC and 152 μg of NHS were added, and the mixture was stirred for 1 hour at room temperature for 1 hour under ice cooling. The white precipitate produced by dropwise addition to diethyl ether was dried under reduced pressure to obtain 14.5 mg of NHS ester of the above compound (yield 91%).
Next, the NHS ester obtained above was added to 100 μl (1.2 mg / ml) of the rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with a 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol and sodium chloride. 6 mg (100 mol per 1 mol of protein) was added, and the reaction was allowed to stand at 4 ° C. overnight. The reaction solution was exchanged with a gel filtration column Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia Biotech) to 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol, and CM Sepharose F.A. F. Purification by column 0.6 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) yielded 80 μl of the desired product of 47 μg / ml (yield 3.3%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the presence of 2-mercaptoethanol in the same manner as in Example 23, and a band of a single molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed under the same conditions as in Example 23 using two columns.
Retention time: 41.7 minutes (single molecule conjugate)
Example 35 Preparation of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5PET (3UU) -rhIFN-β
Obtained in Example 19 to 0.5 ml (1.2 mg / ml) of rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8) containing ethylene glycol and sodium chloride. The compound 5PET (3 UU) (4.5 mg, 10 mol per 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight. 0.5 ml of the reaction solution was exchanged into a 20 mmol / L phosphate buffer solution (pH 6) containing ethylene glycol using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is called CM-Sepharose F.I. F. Purification by column 0.8 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 0.36 ml of a solution containing 0.67 mg / ml of the desired product (yield 40%).
<Electrophoresis>
In the presence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 36 Production of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5PET (3UA) -rhIFN-β
Compound 5 PET (3UA) 254 mg (0.02 mmol) of Example 17 was dissolved in 2.0 ml of methylene chloride, NHS 5.9 mg (0.05 mmol) and DCC 10.5 mg (0.05 mmol) were added, and in an argon stream The mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour and at room temperature for 2 hours. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 132.8 mg of NHS ester of the compound of Example 17 (yield 52.3%).
To the 1.0 ml (1.16 mg / ml) rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8) containing ethylene glycol and sodium chloride, the compound of Example 17 was added. 13 mg of NHS ester (15 mol with respect to 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6) containing ethylene glycol using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is called CM-Sepharose F.I. F. Purification with a column of 1.4 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) yielded 1.0 ml of a solution containing the desired product of 0.14 mg / ml (yield 12%).
<Electrophoresis>
In the presence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 43.8 minutes (single molecule conjugate)
41.2 minutes (bimolecular conjugate)
Example 37 Preparation of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol (conventional reagent) modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: PEG2Lys-rhIFN-β
To 1.3 ml (0.97 mg / ml) of rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8) containing ethylene glycol and sodium chloride, PEG28.3 mg (12.5 moles per mole of protein) of Lys (average molecular weight 10,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc.) was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was buffer-exchanged into a 20 mmol / L sodium acetate buffer solution (pH 6) containing ethylene glycol using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is called CM-Sepharose F.I. F. Purification by column 1.4 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) yielded 2.7 ml of a solution containing 0.36 mg / ml of the desired product (yield 76.7%).
<Electrophoresis>
In the presence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 38 Preparation of 20 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 20 SPA-rhIFN-β
To 1.0 ml / ml rhIFN-β 1.3 ml prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), mPEG-propionic acid NHS ester (average molecular weight 20,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc.) 7 .9 mg (6 mol per 1 mol of protein) was added, and the reaction was allowed to stand at 4 ° C. overnight. Next, the reaction solution was buffer-exchanged to 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) using a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and a reaction solution of 0.52 mg / ml was added. 1 ml was obtained. Of these, 1.9 ml was purified with 2 ml of CM-Sepharose FF column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) to collect 4.9 ml of a fraction containing 0.18 mg / ml of the desired product (yield 66.5%). ).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the conditions of Example 23, and bands of 1-3 molecular conjugates were confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed under the same conditions as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 39 Preparation of 5 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5 SPA-rhIFN-β
To 1.3 ml of 0.8 mg / ml rhIFN-β prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), NHS ester of mPEG-propionic acid (average molecular weight 5,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc.) 1 .6 mg (6 mol per 1 mol of protein) was added, and the reaction was allowed to stand at 4 ° C. overnight. Next, the reaction solution was buffer-exchanged with a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) using a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and a 0.40 mg / ml reaction solution was added. 1 ml was obtained. Of these, 1.9 ml was purified with a 1.5 ml CM-Sepharose FF column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 4.2 ml of a fraction containing the desired product of 0.15 mg / ml was collected (yield 60.60). 1%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and the band of 1 to 4 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 40 Production of 10 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 10 SCM-rhIFN-β
1.0 g (0.1 mmol) of the compound of Example 22 was dissolved in methylene chloride, NHS 21.8 mg (0.19 mmol) and DCC 39.0 mg (0.19 mmol) were added in an argon stream, and the mixture was cooled with ice for 30 minutes. Subsequently, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Insoluble matter was filtered, and the filtrate was added dropwise to diethyl ether to cause precipitation. The precipitate was dried under reduced pressure to obtain 506.8 mg of NHS ester of the compound of Example 22 (yield 50.7%).
Subsequently, the above NHS ester was added to 3.0 ml (0.81 mg / ml) of the rhIFN-β solution obtained in Reference Example 1 prepared with a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8) containing ethylene glycol and sodium chloride. 16.2 mg was added and reacted at 4 ° C. overnight. Next, the reaction solution was desalted using a gel filtration column Sephadex-G25 (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotec). A 4.5 ml fraction obtained by gel filtration was added to CM Sepharose F.A. F. Purification was performed using 2.0 ml of a column (Amasham-Pharmacia Biotech), and 4.0 ml of a fraction containing 0.22 mg / ml of the target product was recovered (yield 36.2%).
<Electrophoresis>
Analysis in the same manner as in Example 23 confirmed a modified product in which 1 to 3 molecules of polyethylene glycol were bonded.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 41 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified natural human interferon-β
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -natural hIFN-β
10 μg of natural hIFN-β (STRATMANN BIOTECH GMBH) was dissolved in 200 μl of isotonic acid buffer, and 1.5 mg of NHS ester of 5CHTM (2EA) obtained in Example 26 (300 mol per 1 mol of protein) was obtained. In addition, it reacted at 20 ° C. all day and night. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L phosphate buffer containing ethylene glycol using a gel filtration column Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia Biotech). Then, CM-Sepharose F.I. F. Purification with 0.5 ml of column (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 0.19 ml of a solution containing 0.021 mg / ml of the desired product (yield 39.9%).
Example 42 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5CHTM (2EA)-17Ser rhIFN-β
Prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.6) containing ethylene glycol and sodium chloride17NHS ester 1.3 mg of the compound of Example 4 (5CHTM (2EA)) obtained in the same manner as Example 26 was added to 0.1 ml (1.0 mg / ml) of Ser rhIFN-β (manufactured by Chiron). (25 mol per 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight. Next, the reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol using a gel filtration column Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia Biotech). The fraction obtained by gel filtration was purified using CM Sepharose F.M. F. The column was purified with 0.25 ml (Amersham-Pharmacia Biotech), and 0.75 ml of a fraction containing 39 μg of the desired product was collected (yield 39%).
<Electrophoresis>
Analysis in the same manner as in Example 23 confirmed a modified product in which 1 to 3 molecules of polyethylene glycol were bonded.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 41.3 minutes (1-3 molecule conjugate)
Example 43 Production of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-β
Abbreviation: 5PET (3UA)-17Ser rhIFN-β
Prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing ethylene glycol and sodium chloride17To a 0.05 ml (2.1 mg / ml) solution of Ser rhIFN-β (manufactured by Chiron), 1.6 mg of NHS ester of the compound of Example 17 (5PET (3UA)) obtained in Example 36 (1 mol of protein) 20 mol) was added, and the reaction was carried out at 4 ° C. all day and night. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6) containing ethylene glycol using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). The fraction obtained by gel filtration was purified using CM-Sepharose F.M. F. Purification with 0.5 ml of column (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 0.30 ml of a solution containing 27.8 μg / ml of the desired product (yield 7.9%).
<Electrophoresis>
In the presence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 44 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-α
Abbreviation: 5CHTC (2AA) -rhIFN-α
The NHS ester 1 of 5CHTC (2AA) obtained in Example 24 was added to 0.1 ml of 1.0 mg / ml rhIFN-α [Immunobiology Laboratories (IBL)] prepared with an isotonic acid buffer (pH 7.5). 0.5 mg (30 mol per mol of protein) was added, and the reaction was carried out at 4 ° C. overnight. Next, 80 μl of the reaction solution was exchanged with a 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and 0.8 ml was recovered. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification was carried out using 1.0 ml of a column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.5 ml of a solution containing 80 μg / ml of the desired product (yield 40.0%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and bands of 1 to 4 molecular conjugates were confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLThe column was used for analysis under the same conditions as in Example 23.
Figure 0004142569
Example 45 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-α
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -rhIFN-α
The NHS ester 1 of 5CHTM (2EA) obtained in Example 26 was added to 0.1 ml of 0.95 mg / ml rhIFN-α [Immunobiology (IBL)] prepared with an isotonic acid buffer (pH 7.5). 0.5 mg (30 mol per mol of protein) was added, and the reaction was carried out at 4 ° C. overnight. Next, 0.1 ml of the reaction solution was exchanged with a 20 mmol / L sodium acetate buffer solution (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and 0.8 ml was collected. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification was performed using 1.0 ml of a column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.6 ml of a solution containing 50 μg / ml of the target product (yield 31.6%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLThe column was used for analysis under the same conditions as in Example 23.
Figure 0004142569
Example 46 Production of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon α
Abbreviation: 5PET (3UA) -rhIFN-α
The compound of Example 17 (5PET) obtained in Example 36 was added to 0.1 ml of a 1.0 mg / ml rhIFN-α solution [Immunobiological Laboratories (IBL)] prepared with an isotonic acid buffer (pH 7.5). (3UA)) NHS ester (1.6 mg, 20 mol per 1 mol of protein) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C overnight. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification with a column 0.7 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 65 μl of a solution containing 0.53 mg / ml of the desired product (yield 34%).
<Electrophoresis>
In the presence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 47 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-γ
Abbreviation: 5CHTC (2AA) -rhIFN-γ
5CHTC obtained in Example 24 was added to 0.1 ml rhIFN-γ (0.10 mg / ml) obtained in Reference Example 2 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8) containing ethylene glycol and sodium chloride. 1.0 mg of NHS ester of (2AA) (200 mol per mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 48 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human interferon-γ
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -rhIFN-γ
To 0.8 ml of rhIFN-γ (0.8 mg / ml) obtained in Reference Example 2 prepared with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.8) containing ethylene glycol and sodium chloride, 5CHTM obtained in Example 26 was added. 10.2 mg (30 mol per mol of protein) of NHS ester of (2EA) was added and reacted at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 49 Production of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5CHTO (2UU) -rhG-CSF derivative
To 100 μl of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.2 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), 1.7 mg of the compound of Example 1 (10 mol relative to 1 mol of protein). ) Was added and allowed to react at 4 ° C. overnight. The reaction solution was diluted with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5), 900 μl of which was passed through a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) equilibrated with the same buffer, and 1.3 ml was recovered. did. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification with a column 0.7 ml (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) gave 360 μl of a solution containing the desired product of 402 μg / ml (yield 50.3%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 4 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 50 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5CHTC (2AA) -rhG-CSF derivative
Obtained in Example 24, 5.1 mg (25 mol per mol of protein) in 100 μl of rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.9 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) 5CHTC (2AA) NHS ester was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was diluted, and 900 μl of the reaction solution was exchanged with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.3 ml was collected. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification with a column 0.7 ml (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) yielded 500 μl of a solution containing 179 μg / ml of the desired product (yield 25.8%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 51 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-modified recombinant human granulocyte colony-stimulating factor derivative
Abbreviation: 5CHTO (2EA) -rhG-CSF derivative
Obtained in Example 25 of 6.0 mg (25 mol per mol of protein) in 100 μl of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.8 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5). 5CHTO (2EA) NHS ester was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was diluted, and 900 μl of the reaction solution was exchanged with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.3 ml was collected. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification with a column 0.7 ml (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) yielded 450 μl of a solution containing 335 μg / ml of the desired product (yield 44.2%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using a column.
Figure 0004142569
Example 52 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -rhG-CSF derivative
487 mg (48.7 μmol) of the compound of Example 4 was dissolved in methylene chloride, and NHS 16.8 mg (146.0 μmol) and DCC 30.1 mg (145.9 μmol) were added in an argon stream, followed by cooling with ice for 30 minutes, Stir at room temperature for 2 hours. The insoluble material was filtered, and the filtrate was added dropwise to diethyl ether. The precipitate was collected and dried under reduced pressure to obtain 260.0 mg of NHS ester of Compound 4 (yield 53.4%).
To 1.25 ml (4.0 mg / ml) of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared with an isotonic acid buffer (pH 7.4), 26.6 mg (25 moles per mole of protein) of the NHS ester described above. ) And reacted at 4 ° C. all day and night. 1.0 ml of the reaction solution was exchanged with a 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.5 ml was collected. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. The column was purified with 5.0 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.7 ml of a solution containing the target product of 1.86 mg / ml (yield 32.5%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 53 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-modified recombinant human granulocyte colony-stimulating factor derivative
Abbreviation: 5CHTM (2EU) -rhG-CSF derivative
To 50 μl of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.9 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.3), 1.0 mg of the compound of Example 5 (10 mol per mol of protein) Was added and reacted at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
Example 54 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony-stimulating factor derivative
Abbreviation: 5CHTM (2EA2) -rhG-CSF derivative
100 mg (0.01 mmol) of the compound of Example 10 was dissolved in 1.0 ml of methylene chloride, 3.5 mg (0.03 mmol) of NHS and 6.2 mg (0.03 mmol) of DCC were added, and 90 minutes at 0 ° C. in an argon stream. Then, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours, and the reaction solution was added dropwise to diethyl ether. The white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 56.5 mg of NHS ester of the compound of Example 10 (yield 56.5%).
4.2 mg (10 mol per mol of protein) of the NHS ester was added to 210 μl of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.9 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5). And reacted at 4 ° C. all day and night. The reaction solution was buffer-exchanged to 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), followed by SP Sepharose F.A. F. The column was purified with 0.7 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 965 μl of a fraction containing 0.31 mg / ml of the desired product (yield 39.6%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
Analysis was performed in the same manner as in Example 23 using a TSK gel G-4000SWXL column.
Figure 0004142569
Example 55 Preparation of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony-stimulating factor derivative
Abbreviation: 5CHTM (2URa) -rhG-CSF derivative
To 50 μl of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.9 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), 5.2 mg of compound obtained in Example 8 (per 1 mol of protein) 50 mol) was added, 10 mmol of 120 mmol / L sodium borohydride was added, and the mixture was allowed to react overnight at room temperature.
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23 to confirm the band of the single molecule conjugate.
Example 56 Preparation of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5ORN (2UA) -rhG-CSF derivative
2 mg of the compound obtained by activating the compound of Example 13 by the method described in Example 27 in 50 μl of rhG-CSF derivative prepared to 3.7 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) 10 moles per mole) was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5), and 0.8 ml was collected. Subsequently, it was purified with 0.7 ml of SP-Sepharose FF column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 400 μl of a solution containing 370 μg / ml of the desired product (yield 25.9%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 57 Preparation of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5ORN (2RaA) -rhG-CSF derivative
In 50 μl of rhG-CSF derivative prepared to 3.8 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.4), 2.0 mg (10 mol per mol of protein) of activated PEG derivative (the compound of Example 14) The compound activated by the method described in Example 28) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5), and 0.8 ml was collected. Subsequently, it was purified with 0.7 ml of SP-Sepharose FF column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 420 μl of a solution containing 71 μg / ml of the target product (yield 19.9%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 58 Preparation of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5DPA (2UA) -rhG-CSF derivative
In 50 μl of rhG-CSF derivative prepared to 3.7 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.4), 2.0 mg (10 mol per mol of protein) of activated PEG derivative (the compound of Example 15) The compound activated by the method described in Example 29) was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5), and 0.8 ml was collected. Subsequently, it was purified with 0.7 ml of SP-Sepharose FF column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 350 μl of a solution containing 67 μg / ml of the target product (yield 16.0%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 59 Preparation of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5SKA (3UA) -rhG-CSF derivative
16 mg (1.1 μmol) of the compound 5SKA (3UA) of Example 7 was dissolved in 100 μl of methylene chloride, 272 μg of DCC and 152 μg of NHS were added, and the mixture was stirred for 1 hour at room temperature for 1 hour under ice cooling. The white precipitate produced by dropping the reaction solution into diethyl ether was dried under reduced pressure to obtain 14.5 mg of NHS ester of Compound 5SKA (3UA) of Example 7 (yield 91%).
To 50 μl of rhG-CSF derivative prepared to 3.7 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), 3.6 mg of NHS ester (25 mol per mol of protein) was added, and reacted at 4 ° C. overnight. I let you. The reaction solution was buffer-exchanged to 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 0.7 ml of SP Sepharose F.F. F. Purified with a column (Amersham-Pharmacia Biotech). The target fraction was concentrated to obtain 165 μl of a solution containing 0.4 mg / ml of the target product (yield 36%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 60 Preparation of 5 kDa 4-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5QNA (4UA) -rhG-CSF derivative
69 mg (3.5 μmol) of the compound 5QNA (4UA) of Example 6 was dissolved in 500 μl of methylene chloride, 1.8 mg of DSC and 0.56 mg of DMAP were added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 44 mg of NHS ester of Compound 5QNA (4UA) of Example 6 (yield 63%).
To 50 μl of the rhG-CSF derivative of Reference Example 3 adjusted to 3.8 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 8), 5.1 mg of the NHS ester (25 mol per mol of protein) was added at 4 ° C. Reacted all day and night.
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23 to confirm the band of the single molecule conjugate.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 40.8 minutes (single molecule conjugate)
Example 61 Production of 5 kDa 3-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5PET (3UU) -rhG-CSF derivative
To 0.5 ml of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.1 mg / ml with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), 12.2 mg of the compound obtained in Example 19 (protein 1) 10 mol) was added, and the reaction was carried out at 4 ° C. overnight. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification by a column 1.5 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) yielded 0.75 ml of a solution containing 1.2 mg / ml of the desired product (yield 58.6%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 62 Production of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5PET (3UA) -rhG-CSF derivative
NHS ester of the compound of Example 17 obtained in Example 36 was added to 0.05 ml of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 4.0 mg / ml with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5). 1.6 mg (10 mol per 1 mol of protein) was added, and the reaction was carried out at 4 ° C overnight. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification with a column 0.7 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 0.30 ml of a solution containing 0.34 mg / ml of the desired product (yield 56.7%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 63 Production of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5SUG (3UA) -rhG-CSF conductor
To 100 mg (6.7 μmol) of compound 5SUG (3UA) prepared in Example 21, 2.3 mg of NHS and 4.1 mg of DCC were added and dissolved in 1 ml of methylene chloride under ice-cooling. For 1.5 hours. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 76.6 mg (yield: 76.6%) of the NHS ester of Compound 5 SUG (3UA) of Example 21.
The activated compound (compound 5SUG (3UA of Example 21) was added to 0.1 ml of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 3.9 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5). ) NHS ester) 10.7 mg (35 mol per 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C overnight. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification by a column 0.7 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 0.39 ml of a solution containing 0.28 mg / ml of the desired product (yield 27.8%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 64 Production of 5 kDa three-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 5PET (3URa) -rhG-CSF derivative
To 0.6 ml of rhG-CSF derivative prepared to 2.35 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), 56.3 mg of compound of Example 20 (50 mol with respect to 1 mol of protein) and 120 mmol / L prepared sodium cyanoborohydride (NaBH)3CN) 10 μl was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was acidified with hydrochloric acid to stop the reaction, and the buffer solution was replaced with a 20 mmol / L sodium acid buffer solution (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is called SP Sepharose F.M. F. Purification by column 1.4 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) gave 0.55 ml of a solution containing 0.24 mg / ml of the desired product (yield 8.5%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23 to confirm the band of the single molecule conjugate.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 41.2 minutes (single molecule conjugate)
Example 65 Production of 10 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 10SCM-rhG-CSF derivative
Example 22 of 21.3 mg (4 moles per mole of protein) in 2.5 ml of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 4.0 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) NHS ester (prepared in Example 40) was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) to recover 4.0 ml. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. The column was purified with 10.0 ml (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 860 μl of a solution containing 2.0 mg / ml of the desired product (yield 34.4%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using a column.
Figure 0004142569
Example 66 Preparation of 20 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: 20 SPA-rhG-CSF derivative
19.1 g (4.5 mol per mol of protein) of activated PEG derivative (M-SPA-) was added to 995 ml of rhG-CSF derivative prepared at 4.0 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.6). 20,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc., average molecular weight 20,000) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. overnight. Next, the mixture was purified by passing through a 2000 ml SP-Sepharose FF column (Amersham-Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mmol / L acid buffer (pH 4.5). 4000 ml of the target fraction was concentrated to obtain 320 ml of a solution containing 11.2 mg / ml of the desired product (yield 90.4%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G-4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 67 Preparation of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative
Abbreviation: PEG2Lys-rhG-CSF derivative
To 0.5 ml of the rhG-CSF derivative obtained in Reference Example 3 prepared to 4.0 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5),210.6 mg of Lys (average molecular weight 10,000, manufactured by Shearwater Polymers, Inc.) (10 mol per 1 mol of protein) was added, and the reaction was performed at 4 ° C. overnight. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. The column was purified with 2.0 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.5 ml of a solution containing 1.05 mg / ml of the desired product (yield 26.3%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 68 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -rhG-CSF
To 0.9 ml of the rhG-CSF solution of Reference Example 4 prepared to 3.9 mg / ml with an isotonic acid buffer solution (pH 7.4), 28.0 mg of NHS ester of 5CHTM (2EA) obtained in Example 26 ( 15 equivalents per mole of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight.
0.8 ml of the reaction solution was exchanged with a 20 mmol / L acetate buffer solution (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.5 ml was collected. This is SP. Sepharose F.M. F. The column was purified with 5.0 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 1.0 ml of a solution containing 1.3 mg / ml of the desired product (yield 33.0%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 69 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor
Abbreviation: 5CHTC (2AA) -rhG-CSF
To 0.2 ml of the rhG-CSF solution obtained in Reference Example 4 prepared to 3.9 mg / ml with an isotonic acid buffer (pH 7.4), NHS ester of 5CHTC (2AA) obtained in Example 24 was used. 0 mg (25 equivalents per mol of protein) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. overnight.
0.2 ml of the reaction solution was exchanged with a 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.0 ml was collected. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification was performed using 1.0 ml of a column (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.3 ml of a solution containing 0.7 mg / ml of the target product (yield 26.8%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Figure 0004142569
Example 70 Preparation of 5 kDa triple chain branched polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor
Abbreviation: 5SKA (3UA) -rhG-CSF
16 mg (1.1 μmol) of the compound 5SKA (3UA) of Example 7 was dissolved in 100 μl of methylene chloride, 272 μg of DCC and 152 μg of NHS were added, and the mixture was stirred for 1 hour at room temperature for 1 hour under ice cooling. The reaction solution was added dropwise to diethyl ether, and the resulting white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 14.5 mg of NHS ester of Compound 5SKA (3UA) of Example 7 (yield 91%).
To 140 μl of rhG-CSF obtained in Reference Example 4 prepared to 4.4 mg / ml with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5), 12.2 mg of the activated NHS ester (25 mol per mol of protein) And reacted at 4 ° C. all day and night. The reaction solution was buffer-exchanged to 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 1.8 ml of SP Sepharose F.F. F. Purified with a column (Amersham-Pharmacia Biotech). The desired fraction was concentrated to obtain 110 μl of a solution containing 1.1 mg / ml of the desired product (yield 19%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSK gel G4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 40 to 45 minutes (1 to 3 molecule conjugate)
Example 71 Preparation of 5 kDa linear polyethylene glycol modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor
Abbreviation: PEG2Lys-rhG-CSF
To 0.5 ml of the rhG-CSF solution of Reference Example 4 prepared to 4.4 mg / ml with an isotonic acid buffer solution (pH 7.4),211.7 mg of Lys (manufactured by Shearwater Polymers, Inc.) (10 mol with respect to 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification was performed using 2.0 ml of a column (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.5 ml of a solution containing 1.78 mg / ml of the desired product (yield 40.5%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 44.2 minutes (single molecule conjugate)
41.8 min (bimolecular conjugate)
Example 72 Production of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5CHTC (2AA) -bSOD
30 mg (3 μmol) of the compound of Example 2 was dissolved in 1 ml of methylene chloride, 1.7 mg (0.015 mmol) of NHS and 3.1 mg (0.015 mmol) of DCC were added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature for 3 hours, and the reaction solution was added dropwise to diethyl ether. The white precipitate was dried under reduced pressure to obtain 21 mg of NHS ester of the compound of Example 2 (yield 70%).
10 μl of aqueous NHS ester solution (156 mg / ml distilled water) prepared immediately before use in 50 μl of bovine Cu, Zn-type SOD solution (2 mg / ml, pH 9 borate buffer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Was allowed to react at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
Example 73 Production of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5CHTO (2EA) -bSOD
20 mg of the compound of Example 3 was activated under the same conditions as in Example 25 to obtain 13 mg of NHS ester of the compound of Example 3 (yield 65%).
10 μl of aqueous NHS ester solution (156 mg / ml distilled water) prepared immediately before use in 50 μl of bovine Cu, Zn-type SOD solution (2 mg / ml, pH 9 borate buffer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Was allowed to react at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
Example 74 Production of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5CHTO (2UU) -bSOD
50 μl of bovine Cu, Zn-type SOD solution (2 mg / ml, pH 9 borate buffer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 μl of the aqueous solution of the compound obtained in Example 1 (156 mg / ml distilled water) (50 moles per mole of protein) In addition, the reaction was allowed to stand at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 75 Production of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -bSOD
487 mg (48.7 μmol) of the compound of Example 4 was activated under the same conditions as described in Example 26 to obtain 260 mg of the NHS ester of the compound of Example 4.
(Yield 53.4%)
10 μl of aqueous NHS ester solution (156 mg / ml distilled water) prepared immediately before use in 50 μl of bovine Cu, Zn-type SOD solution (2 mg / ml, pH 9 borate buffer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Was allowed to react at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 76 Purification of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -bSOD (purified product)
360 mg (36.0 μmol) of the compound of Example 4 was activated under the same conditions as described in Example 26 to obtain 181.9 mg of NHS ester of the compound of Example 4 (yield 50.5%).
To 2.2 ml of bovine Cu, Zn type SOD solution (2 mg / ml, pH 9 borate buffer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added 33.9 mg (25 moles per mole of protein) of the NHS ester of the compound of Example 4 above. The reaction was carried out at 4 ° C all day and night. Next, this reaction solution was added to 4.3 ml of SP-Sepharose F.V. F. Purified with a column (Amersham-Pharmacia Biotech). The target fraction containing no unmodified SOD was concentrated to obtain 200 μl of a 3.73 mg / ml solution (yield 17.2%). Furthermore, CuSO4ZnSO4The activity was recovered by adding each aqueous solution to 10 mmol / L.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 77 Preparation of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5ORN (2UA) -bSOD
20 mg of the compound of Example 13 was activated under the same conditions as described in Example 27 to obtain 16.0 mg of NHS ester of the compound of Example 13 (yield 80.0%).
To 50 μl of bovine Cu, Zn-type SOD solution (2.0 mg / ml, pH 9 borate buffer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 10 μl of the above activated NHS ester aqueous solution (156 mg / ml distilled water) (per mol of protein) 50 mol) was added and the reaction was allowed to stand at 4 ° C. overnight.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and bands of 1 to 5 molecular conjugates were confirmed. Unmodified SOD was not detected.
Example 78 Preparation of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5DPA (2UA) -bSOD
20 mg of the compound of Example 15 was activated under the same conditions as described in Example 29 to obtain 12.0 mg of NHS ester of the compound of Example 15 (yield 60.0%).
To 50 μl of bovine Cu, Zn-type SOD solution (2.0 mg / ml, pH 9 borate buffer, Wako Pure Chemical Industries), 10 μl of the above NHS ester aqueous solution (156 mg / ml distilled water) (50 moles per mole of protein) Was allowed to react at 4 ° C. for 24 hours.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and bands of 1 to 5 molecular conjugates were confirmed. Unmodified SOD was not detected.
Example 79 Production of 10 kDa linear polyethylene glycol modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 10 SCM-bSOD (purified product)
NHS ester of the compound of Example 22 (prepared in Example 40) in 1.0 ml of bovine Cu, Zn-type SOD solution (2.0 mg / ml, 50 mmol / L borate buffer (pH 9.0), manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) 18.8 mg (15 mol per mol of protein) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. overnight.
Next, this reaction solution was mixed with 2.0 ml of SP-Sepharose F.V. F. Purification was performed using a column (Amersham-Pharmacia Biotech), and the target fraction containing no unmodified bSOD was concentrated to obtain 120 μl of a 5.9 mg / ml solution (yield 35.4%). Furthermore, CuSO4ZnSO4The activity was recovered by adding each aqueous solution to 10 mmol / L.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 80 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol-modified human Cu, Zn-type superoxide dismutase
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -hSOD
487 mg (48.7 μmol) of the compound of Example 4 was activated under the same conditions as described in Example 26 to obtain 260 mg of NHS ester of the compound of Example 4 (yield 53.4%).
Human Cu, Zn-type SOD solution (1.9 mg / ml, pH 9 borate buffer solution, manufactured by CELLULAR PRODUCTS, INC.) 50 μl of the above NHS ester aqueous solution (156 mg / ml distilled water) prepared immediately before use 10 μl (protein 1 mol) 50 mol), and the mixture was allowed to react at 4 ° C. for 24 hours.
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and the band of 1 to 3 molecule conjugate was confirmed.
Example 81 Production of 5 kDa double chain branched polyethylene glycol modified human Cu, Zn type superoxide dismutase
Abbreviation: 5CHTM (2UM) -hSOD (purified product)
3.13 mg (10 mol per mol of protein) of the compound of Example 9 was added to human Cu, Zn-type SOD solution [2.63 mg / ml, phosphate buffer (pH 7.5), CELLULAR PRODUCTS, INC. Made] In addition to 0.6 ml, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours to react.
Next, it was purified with a 20 ml Sephacryl S-300 gel filtration column (Amersham-Pharmacia Biotech). The fraction of the modified product not containing unreacted SOD was collected and concentrated to 0.5 ml. This solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L acetate buffer (pH 3.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 0.8 ml was recovered. This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. The column was purified with 0.7 ml (Amersham-Pharmacia Biotech), and the target fraction was concentrated. In addition, CuSO4ZnSO4Each solution containing an aqueous solution was added to 10 mmol / L to recover the activity of SOD. 180 μl of a solution containing 0.25 mg / ml of the target product was obtained (yield 4.5%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 23, and a band of a single molecule conjugate was confirmed.
Example 82 Production of 5 kDa 3-chain branched polyethylene glycol-modified human Cu, Zn-type superoxide dismutase
Abbreviation: 5PET (3UM) -hSOD (purified product)
The compound obtained in Example 18 was added to 0.5 ml (1.34 mg / ml) of Cu, Zn type hSOD solution (manufactured by CELLULAR PRODUCTS, INC.) Prepared with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5). 1 mg (10 mol with respect to 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. all day and night. The reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L sodium acetate buffer (pH 3.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is referred to as SP-Sepharose F.I. F. Purification was performed using 0.7 ml of a column (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.62 ml of a solution containing 0.33 mg / ml of the target product (yield 30.6%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23 to confirm the band of the single molecule conjugate.
<Gel filtration HPLC analysis>
TSKgelG4000SWXLAnalysis was performed in the same manner as in Example 23 using two columns.
Retention time: 41.1 minutes (one molecule conjugate)
Example 83 Production of 5 kDa double-chain branched polyethylene glycol modified anti-GD3 chimeric antibody
Abbreviation: 5CHTM (2EA) -KM-871
NHS ester of the compound obtained in Example 4 was added to 0.5 ml of KM-871 aqueous solution (prepared according to JP-A-5-30489) prepared to 2.6 mg / ml with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5). 1.0 mg (10 mol per 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C overnight. 0.5 ml of the reaction solution was buffer-exchanged with a 20 mmol / L sodium acetate buffer solution (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech), and 0.8 ml was recovered. This is called CM-Sepharose F.I. F. The column was purified with 1.2 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 0.38 ml of a solution containing 0.59 mg / ml of the desired product (yield 17.1%).
<Electrophoresis>
SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
Example 84 Production of 5 kDa 3-chain branched polyethylene glycol modified anti-GD3 chimeric antibody
Abbreviation: 5PET (3UA) -KM-871
The 5 PET (3UA) obtained in Example 36 was added to 1.0 ml of KM-871 solution (prepared according to JP-A-5-30489) prepared to 1.1 mg / ml with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5). 0.6 mg of NHS ester (5 mol with respect to 1 mol of protein) was added and reacted at 4 ° C. overnight. 1.0 ml of the reaction solution was subjected to buffer exchange with a 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5) using a Sephadex G-25 column (Amersham-Pharmacia Biotech). This is called CM-Sepharose F.I. F. The column was purified with 1.0 ml (Amersham-Pharmacia Biotech) to obtain 430 μl of a solution containing 0.52 mg / ml of the target compound (yield 20.4%).
<Electrophoresis>
In the absence of 2-mercaptoethanol, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 23, and a band of 1 to 2 molecule conjugate was confirmed.
Test Example 1 Antiviral activity of chemically modified interferon-β
The antiviral activity of chemically modified rhIFN-β and chemically modified natural hIFN-β, unmodified rhIFN-β, and unmodified natural hIFN-β obtained in Example 23 to Example 43 was reduced to the following neutral red (NR ) Investigated by uptake method.
<NR uptake method>
The antiviral activity was measured with reference to the method of Konagaya et al. [Protein Nucleic Acid Enzyme (separate volume), page 355 (1981)].
That is, Eagle MEM medium supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS) was added to a sterilized transfer plate. Next, 50 μl each of IFN domestic standard [α (green cross) and β (Toray)] solutions were dispensed into wells, and serial dilutions were performed twice. On the other hand, chemically modified IFN solution or unmodified IFN solution prepared in a medium at a predetermined concentration was similarly dispensed into wells in an amount of 50 μl. These solutions were transferred to a 96-well plate containing a predetermined number of cell lines derived from human amnion (FL cells) and stirred for several seconds. An antiviral state was created by culturing in a CO2 incubator at 37 ° C. all day and night.
Next, after removing the culture solution, the virus solution is added, and CO is added at 37 ° C. for 2 days.2The virus was infected by culturing in an incubator. IFN changed the antiviral state of the cells and caused cytopathic changes. Subsequently, the culture solution was removed and an NR solution was added. CO for 1 hour at 37 ° C2The NR solution was removed by leaving it in an incubator. The wells were washed with an isotonic acid buffer, an extract (0.01 mol / L hydrochloric acid-30% ethanol) was added, and the mixture was stirred for 2 to 3 minutes.
The surviving cells were stained with NR. After extraction, the absorbance at 492 nm was measured, and the quantitative curve was plotted. The relative activity of chemically modified IFN was calculated with the activity of unmodified IFN calculated from the quantitative curve as 100%.
The specific activities of each IFN-β are shown in Tables 1, 2 and 3.
Figure 0004142569
Figure 0004142569
Figure 0004142569
From the above results, it was confirmed that all chemically modified IFN-β used in the present invention retained antiviral activity.
Test Example 2 Antiviral activity of chemically modified interferon-α
The antiviral activity of chemically modified rhIFN-α and unmodified rhIFN-α obtained in Example 44 to Example 46 was examined by the NR incorporation method shown in Test Example 1.
When each IFN-α was allowed to act at a concentration of 1 μg / ml, each chemically modified IFN-α (5CHTC (2AA) -rhIFN-α of Example 44, 5CHTM (2EA) -rhIFN-α of Example 45, In Example 46, 5PET (3UA) -rhIFN-α), the antiviral activity was completely retained (having the same activity as that of unmodified rhIFN-α).
Test Example 3 Enzymatic activity of chemically modified superoxide dismutase
The enzymatic activity of the chemically modified SOD prepared in Examples 72-82 was determined by McCord, J. et al. M.M. And Fridovici, I, xanthine-xanthine oxidase-cytochrome C system [The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 244, 6049 (1969)]. One unit of SOD activity (U) is the amount of SOD enzyme that inhibits the reduction rate of cytochrome C by 50% at pH 7.8 and 30 ° C., and was calculated by the following formula.
Figure 0004142569
The enzyme activities of chemically modified bovine SOD and chemically modified human SOD are shown in Tables 4 and 5, respectively.
SOD 50U / ml = 0.000256mg (in the case of 3900U / mg)
ΔA / min: measured value
Figure 0004142569
Figure 0004142569
It was confirmed that the chemically modified human SOD used in the present invention maintained the enzyme activity.
Test Example 4 Growth-promoting action of chemically modified recombinant human granulocyte colony-stimulating factor derivative on mouse leukemia cell NFS60
Example 49-Example 71, unmodified hG-CSF derivatives and unmodified rhG-CSF mouse leukemia cells NFS60 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6687 (1985)] was measured according to the method of Asano et al. [Pharmacology and Treatment, 19, 2767 (1991)].
When the compounds of Examples 49 to 63 and Example 66 were allowed to act on cells at a concentration of 100 ng / ml, they were equivalent to the unmodified rhG-CSF derivative (acted on cells at a concentration of 100 ng / ml) (Non-modified rhG-CSF derivative was retained).
When the compounds of Examples 68 to 70 were allowed to act on cells at a concentration of 100 ng / ml, NFS60 cell growth promotion equivalent to that of unmodified rhG-CSF (acted on cells at a concentration of 100 ng / ml) Activity was observed (retaining activity equivalent to that of unmodified rhG-CSF).
It was confirmed that both the chemically modified rhG-CSF derivative and the chemically modified rhG-CSF used in the present invention maintained a growth promoting action on NFS60 cells.
Test Example 5 Binding activity of chemically modified anti-GD3 chimeric antibody
The binding activity of the chemically modified anti-GD3 chimeric antibody prepared in Example 84 was determined according to Kenya. S, et al. [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
Table 6 shows the GD3 binding activity of the chemically modified anti-GD3 chimeric antibody.
The activity was shown as a relative activity when the binding activity of the unmodified anti-GD3 chimeric antibody was taken as 100%.
Figure 0004142569
It was confirmed that the chemically modified anti-GD3 chimeric antibody used in the present invention still has binding activity to GD3.
Test Example 6 Stabilizing effect of chemically modified recombinant human interferon-β in macrogol ointment
The polyethylene glycol modified rhIFN-β (5CHTM (2EA)-of Example 26 was prepared using a 20 mmol / l phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol and sodium chloride to a concentration of 1.0 mg / ml. rhIFN-β) solution, unmodified rhIFN-β solution, or unmodified rhIFN-β solution was added with 2 mg / ml of mPEG (average molecular weight 20,000). Next, 100 μl of each solution was added to 0.9 g of a macrogol ointment base (manufactured by Toho Pharmaceutical Co., Ltd.) and kneaded uniformly for 5 minutes to prepare an ointment. 100 mg of each ointment was dispensed into an Eppendorf tube, sealed and stored at room temperature. Samples were taken immediately after preparation of the ointment and 24 hours later, 20 mmol / l phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol and sodium chloride was added to dissolve the ointment, and antiviral activity was measured.
Table 7 shows the activity after 24 hours, assuming that the activity immediately after preparation of the ointment is 100%.
A decrease in activity was confirmed in unmodified rhIFN-β and unmodified rhIFN-β added with mPEG, but the activity was maintained in the chemically modified rhIFN-β solution.
Figure 0004142569
Test Example 7 Stabilizing effect of chemically modified recombinant human interferon-β in hydrophilic ointment
The polyethylene glycol modified rhIFN-β (5CHTM (2EA)-of Example 26 was prepared using a 20 mmol / l phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol and sodium chloride to a concentration of 1.0 mg / ml. rhIFN-β) solution or unmodified rhIFN-β solution with 2 mg / ml of mPEG (average molecular weight 20,000) was prepared. Next, 100 μl of each solution was added to 0.9 g of hydrophilic ointment (Iwaki Pharmaceutical Co., Ltd.) and kneaded uniformly for 5 minutes to prepare an ointment. 100 mg of each ointment was dispensed into an Eppendorf tube, sealed and stored at 37 ° C. Each ointment was sampled over time, and a 20 mmol / l phosphate buffer (pH 6.0) containing ethylene glycol and sodium chloride was added to suspend the ointment. The rhIFN-β content in the suspension was calculated from an ELISA calibration curve.
The results are shown in FIG. Both the concentrations of chemically modified rhIFN-β and unmodified rhIFN-β gradually decreased, but the residual rate was higher in chemically modified rhIFN-β than in unmodified rhIFN-β. showed that.
Test Example 8 Stabilizing effect of chemically modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase in macrogol ointment
5CHTM (2EA) -bSOD (purified product) solution (prepared in Example 76), unmodified bSOD solution, prepared to a concentration of 3.73 mg / ml using 20 mmol / l acetate buffer (pH 4.5), or 50 μl each of a mixture of the unmodified bSOD solution and mPEG was added to 450 mg of the macrogol ointment base to prepare a uniform ointment. 50 mg was sampled over time, 200 μl of isotonic acid buffer solution was added, and the activity was measured using a part thereof.
The change in activity over time is shown in FIG. 2 with the bSOD activity immediately after preparation of the ointment as 100%. In the ointment, the activity decreased with time, but high activity was maintained for a long time only with the PEG-modified 5CHTM (2EA) -bSOD.
Test Example 9 Stabilizing effect of chemically modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative in macrogol ointment
Macrogol ointment base (manufactured by Toho Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.9 g of the derivative (20 SPA-rhG-CSF derivative) solution of Example 66 prepared in acetic acid buffer (pH 4.5) to a concentration of 6 mg / ml, 100 μl each of unmodified rhG-CSF derivative solution at a concentration or a solution obtained by adding 12 mg / ml of mPEG (average molecular weight 20,000, manufactured by NOF Corporation) to the same concentration of rhG-CSF derivative, 5 An ointment was prepared by kneading uniformly for minutes. 100 mg of each ointment was dispensed into an Eppendorf tube, sealed and stored at room temperature. Each tube was sampled over time, and a 20 mmol / l acetate buffer containing 150 mmol / sodium chloride was added to dissolve the ointment. The supernatant of this solution was analyzed by electrophoresis under the conditions of Example 23, and changes in protein bands were observed.
As shown in FIGS. 3 and 4, no change in the band was observed after 72 hours with the chemically modified rhG-CSF derivative, whereas a band gradually increased with the unmodified rhG-CSF derivative 24 hours after the preparation of the ointment. It thinned and disappeared almost completely in 72 hours.
The above results suggest that the chemically modified rhG-CSF derivative is stably present in the macrogol ointment, but the unmodified rhG-CSF derivative is gradually denatured and precipitated.
Test Example 10 Stabilization effect of chemically modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative in hydrophilic ointment
0.9 g of hydrophilic ointment (manufactured by Iwaki Pharmaceutical Co., Ltd.), the derivative (20 SPA-rhG-CSF derivative) solution of Example 66 prepared at a concentration of 6 mg / ml with an acetate buffer (pH 4.5), or the same concentration An ointment was prepared by adding 100 μl of each unmodified rhG-CSF derivative solution and kneading uniformly for 5 minutes. 100 mg of each ointment was dispensed into an Eppendorf tube, sealed and stored at 37 ° C. Each tube was sampled over time, and a 20 mmol / l acetate buffer containing 150 mmol / sodium chloride was added to suspend the ointment. This suspension was suspended uniformly and centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes. The aqueous phase (lower layer) was collected and analyzed by electrophoresis under the same conditions as in Example 23.
5 and 6 show the change over time of the ointment stored at 37 ° C.
In the chemically modified rhG-CSF derivative, no band change was observed after 24 hours, whereas in the unmodified rhG-CSF derivative, the band gradually became thin immediately after the preparation of the ointment, and disappeared almost completely in 2 hours.
7 and 8 show the change over time of the ointment stored at room temperature.
In the chemically modified rhG-CSF derivative, no significant band change was observed after 30 days, whereas in the unmodified rhG-CSF derivative, the band gradually became thinner and disappeared almost completely after 30 days. In a solution in which mPEG is simply added to an unmodified rhG-CSF derivative (acetic acid buffer (pH 4.5) 100 μl containing 12 mg / ml mPEG (average molecular weight: 20000) and 6 mg / ml unmodified rhG-CSF derivative)) The disappearance of the band was not suppressed even by the prepared ointment.
The above results suggest that the chemically modified rhG-CSF derivative is stably present in the hydrophilic ointment, while the unmodified rhG-CSF derivative gradually denatured during storage.
Reference Example 1 Production of Recombinant Human Interferon-β (Unmodified rhIFN-β) rhIFN-β was obtained from Mizukami et al. [Biotechnology Letter, Vol. 8, 605 (1986)], and Kuga et al. Hyundai Kagaku Extra Number 12: Genetic Engineering in Medicine, 135 (1986), Tokyo Chemical Doujin].
Escherichia coli K-12 strain harboring plasmid pMG-1 containing DNA encoding rhIFN-β was transformed into LGTrpAp medium (bactotryptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, sodium chloride 5 g / l, glucose 1 g / l, L -Seed culture with tryptophan 50 mg / l, ampicillin 50 μg / l). For the production of rhIFN-β, MCGAp medium (0.5% casamino acid and 50 μg / ml ampicillin added to M9 medium) was used in a 2-liter jar fermenter to maintain the glucose concentration at 1% and the pH at 6.5. Then, the cells were cultured at 20 ° C. for several days. The culture was shaken at 750 rpm and aerated at 1 L / min. An extract was prepared from the culture solution by a freeze-thaw method [DNA, 2, 265 (1983)]. Furthermore, rhIFN-β was obtained from the cell residue according to the method disclosed in JP-A-61-69799.
Reference Example 2 Production of recombinant human interferon-γ
rhIFN-γ is in accordance with the above-mentioned method for producing rhIFN-β, according to Ito et al. [Medical Molecular Biology, 355 (1987), Nanoedo], and Kuga et al. (Modern Chemistry Extra Number 12: Genetic Engineering in Medicine, page 135 (1986). Year) and Tokyo Chemical Doujin).
Escherichia coli pGKA2 strain carrying plasmid pKYP10 containing DNA encoding rhIFN-γ was transformed into LGTrpAp medium (bactotryptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, sodium chloride 5 g / l, glucose 1 g / l, L-tryptophan 50 mg / l l, ampicillin 50 μg / l). For the production of rhIFN-γ, MCGAp medium (0.5% casamino acid and 50 μg / ml ampicillin added to M9 medium) was used in a 2-liter jar fermenter to maintain the glucose concentration at 1% and the pH at 6.5. And cultured at 37 ° C. for 1-2 days. The culture was shaken at 750 rpm and aerated at 1 L / min. The culture was collected by centrifugation at 8,000 rpm for 10 minutes, and washed with a 30 mmol / L aqueous sodium chloride solution and a 30 mmol / L Tris / HCl buffer (pH 7.5). The washed cells were suspended in 30 ml of the above buffer solution and subjected to ultrasonic crushing at 0 ° C. for 10 minutes (BRANSON SONIC POWER COMPANY, SONIFIER CELL DISPUPTOR 200, OUTPUT CONTROL 2). The ultrasonic crushed material was centrifuged at 9,000 rpm for 30 minutes to obtain cell residue.
Further, after adding rhIFN-γ by adding a strong protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride to the cell residue, the method of Marston et al. [Biotechnology (BIO / TECHNOLOGY), Vol. 2, p. 800 (1984) )] RhIFN-γ was extracted, purified, solubilized and regenerated.
Reference Example 3 Preparation of recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) derivative
The first threonine of hG-CSF having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is alanine, the third leucine is threonine, the fourth glycine is tyrosine, the fifth proline is arginine, the 17th cysteine RhG-CSF derivatives each substituted with serine were obtained by the method described in JP-B-7-96558.
Escherichia coli W3110strA strain (Escherichia coli ECfBD28 FERM BP-1479) carrying the plasmid pCfBD28 containing the DNA encoding the above rhG-CSF derivative was treated with LG medium (bactotryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 5 g, glucose 1 g in water. In 1 L, the pH is adjusted to 7.0 with NaOH and cultured at 37 ° C. for 18 hours, and 5 ml of this culture is mixed with MCG medium (Na containing 25 μg / ml tryptophan and 50 μg / ml ampicillin).2HPO40.6%, KH2PO40.3%, sodium chloride 0.5%, casamino acid 0.5%, MgSO41 mmol / L, vitamin B 14 μg / ml, pH 7.2) Ingested in 100 ml, cultured at 30 ° C. for 4 to 8 hours, and then tryptophan inducer 3β-indoleacrylic acid (3β-indoleacrylic acid, hereinafter abbreviated as IAA) Was added at 10 μg / ml, and the culture was further continued for 2 to 12 hours. The culture was collected by centrifugation at 8,000 rpm for 10 minutes, and washed with a 30 mmol / L aqueous sodium chloride solution and a 30 mmol / L Tris / HCl buffer (pH 7.5). The washed cells were suspended in 30 ml of the above buffer solution and subjected to ultrasonic disruption (BRANSON SONIC POWER COMPANY, SONFIER CELL DISPUPTOR 200, OUTPUT CONTROL 2) at 0 ° C. for 10 minutes. The ultrasonic crushed material was centrifuged at 9,000 rpm for 30 minutes to obtain cell residue.
The rhG-CSF derivative was extracted, purified, solubilized and regenerated from the cell residue according to the method of Marston et al. [Biotechnology (BIO / TECHNOLOGY), Vol. 2, page 800 (1984)].
Reference Example 4 Preparation of recombinant human granulocyte colony stimulating factor
RhG-CSF having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was prepared according to the method described in Reference Example 3.
Industrial applicability
According to the present invention, an ointment containing a chemically modified physiologically active polypeptide that is superior in stability in an ointment compared to a physiologically active polypeptide is provided.
[Sequence Listing]
Figure 0004142569
Figure 0004142569
Figure 0004142569

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the stabilizing effect of chemically modified recombinant human interferon-β in a hydrophilic ointment. In FIG. 1, symbols (-♦-,-■-) represent the following meanings.
-◆-: Change in residual amount of rhIFN-β in unmodified rhIFN-β
-■-: Change in residual amount of rhIFN-β in 5CHTM (2EA) -rhIFN-β
FIG. 2 shows the stabilizing effect of chemically modified bovine Cu, Zn type superoxide dismutase in macrogol ointment. In FIG. 2, the symbols (−Δ−, − ◯ −, − □ −, − ● −) represent the following meanings.
-Δ-: Macrogol ointment containing chemically modified bSOD (5CHTM (2EA) -bSOD)
-○-: Ointment in which macrogol is mixed with bSOD
-□-: Ointment prepared by mixing macrogol with a mixture of bSOD and mPEG-●-: bSOD aqueous solution
FIG. 3 shows the stabilizing effect (SDS-PAGE) of a recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative in a macrogol ointment. In FIG. 3, the numbers (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8)) have the following meanings. The vertical axis represents molecular weight.
(1): Molecular weight marker
(2) G-CSF derivative aqueous solution
(3): Immediately after preparation of the ointment
(4): After 1 hour at room temperature
▲ 5 ▼: One day after room temperature
▲ 6 ▼: Room temperature 2 days later
▲ 7 ▼: Room temperature 3 days later
▲ 8 ▼: After 7 days at room temperature
FIG. 4 shows the stabilizing effect (SDS-PAGE) of a chemically modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative in a macrogol ointment. In FIG. 4, the numbers (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8)) have the following meanings. The vertical axis represents molecular weight.
(1): Molecular weight marker
(2): Chemically modified G-CSF derivative aqueous solution
(3): Immediately after preparation of the ointment
(4): After 1 hour at room temperature
▲ 5 ▼: One day after room temperature
▲ 6 ▼: Room temperature 2 days later
▲ 7 ▼: Room temperature 3 days later
▲ 8 ▼: After 7 days at room temperature
FIG. 5 shows the stabilizing effect (SDS-PAGE) at 37 ° C. in a hydrophilic ointment of a recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative. In FIG. 5, numbers ((1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), and (9)) represent the following meanings. The vertical axis represents molecular weight.
(1): Molecular weight marker
(2) G-CSF derivative aqueous solution
(3): Immediately after preparation of the ointment
(4): After 37 minutes at 37 ° C
(5): After 1 hour at 37 ° C
(6): After 2 hours at 37 ° C
(7): After 4 hours at 37 ° C
(8): After 8 hours at 37 ° C
(9): After 24 hours at 37 ° C
FIG. 6 shows the stabilization effect (SDS-PAGE) at 37 ° C. in a hydrophilic ointment of a chemically modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative. In FIG. 6, the numbers (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9)) have the following meanings. The vertical axis represents molecular weight.
(1): Molecular weight marker
(2): Chemically modified G-CSF derivative aqueous solution
(3): Immediately after preparation of the ointment
(4): After 37 minutes at 37 ° C
(5): After 1 hour at 37 ° C
(6): After 2 hours at 37 ° C
(7): After 4 hours at 37 ° C
(8): After 8 hours at 37 ° C
(9): After 24 hours at 37 ° C
FIG. 7 shows the stabilizing effect (SDS-PAGE) at room temperature in a hydrophilic ointment of a recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative. In FIG. 7, the numbers ((1), (2), (3), (4), (5), (6)) represent the following meanings. The vertical axis represents molecular weight.
(1): Molecular weight marker
(2) G-CSF derivative aqueous solution
(3): Immediately after preparation of the ointment
(4): After 10 days at room temperature
(5): Room temperature 20 days later
▲ 6 ▼: Room temperature 30 days later
FIG. 8 shows the stabilizing effect (SDS-PAGE) at room temperature in a hydrophilic ointment of a chemically modified recombinant human granulocyte colony stimulating factor derivative. In FIG. 8, the numbers ((1), (2), (3), (4), (5), (6)) have the following meanings. The vertical axis represents molecular weight.
(1): Molecular weight marker
(2): Chemically modified G-CSF derivative aqueous solution
(3): Immediately after preparation of the ointment
(4): After 10 days at room temperature
(5): Room temperature 20 days later
▲ 6 ▼: Room temperature 30 days later

Claims (6)

少なくとも 1 個のポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）と軟膏基剤を含有する治療用軟膏剤。A therapeutic ointment comprising a granulocyte-colony stimulating factor chemically modified with at least one polyalkylene glycol and an ointment base . ポリアルキレングリコール類がポリエチレングリコールもしくはその誘導体、ポリプロピレングリコールもしくはその誘導体またはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体もしくはその誘導体である請求項１記載の治療用軟膏剤。Polyalkylene glycol polyethylene glycol or derivatives thereof, polypropylene glycol or derivatives thereof or polyethylene glycol - polypropylene glycol copolymer or therapeutic ointment according to claim 1, wherein a derivative thereof. 軟膏基剤がマクロゴールまたは親水軟膏である請求項１または２記載の治療用軟膏剤。The therapeutic ointment according to claim 1 or 2, wherein the ointment base is macrogol or a hydrophilic ointment. 顆粒球コロニー刺激因子（ Granulocyte-Colony Stimulating Factor ）および軟膏基剤を含有する治療用軟膏剤において、該顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）を少なくとも 1 個のポリアルキレングリコール類で化学修飾することを特徴とする該顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）の経時的変性を抑制する安定化方法。 In granulocyte colony stimulating factor (Granulocyte-Colony Stimulating Factor) and a therapeutic ointment containing the ointment base, chemically modified with the granulocyte colony stimulating factor (Granulocyte-Colony Stimulating Factor) at least one polyalkylene glycol A stabilization method for suppressing the time-dependent denaturation of the granulocyte-colony stimulating factor. ポリアルキレングリコール類がポリエチレングリコールもしくはその誘導体、ポリプロピレングリコールもしくはその誘導体またはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体もしくはその誘導体である請求項４記載の安定化方法。The stabilization method according to claim 4, wherein the polyalkylene glycol is polyethylene glycol or a derivative thereof, polypropylene glycol or a derivative thereof, or a polyethylene glycol-polypropylene glycol copolymer or a derivative thereof. 軟膏基剤がマクロゴールまたは親水軟膏である請求項４または５記載の安定化方法。The stabilization method according to claim 4 or 5, wherein the ointment base is macrogol or hydrophilic ointment.
JP2003506922A 2001-06-22 2002-06-21 Ointment Expired - Fee Related JP4142569B2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001190330 2001-06-22
JP2001190330 2001-06-22
PCT/JP2002/006227 WO2003000278A1 (en) 2001-06-22 2002-06-21 Ointments

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2003000278A1 JPWO2003000278A1 (en) 2004-10-07
JP4142569B2 true JP4142569B2 (en) 2008-09-03

Family

ID=19029116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003506922A Expired - Fee Related JP4142569B2 (en) 2001-06-22 2002-06-21 Ointment

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4142569B2 (en)
WO (1) WO2003000278A1 (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE444984T1 (en) * 2002-12-31 2009-10-15 Nektar Therapeutics Al Corp HYDROLYSIS-STABLE POLYMERS CONTAINING MALEIMIDE END GROUPS
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
JP5096363B2 (en) 2005-12-16 2012-12-12 ネクター セラピューティックス GLP-1 polymer complex

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
ES8800982A1 (en) * 1985-07-05 1987-12-01 Takeda Chemical Industries Ltd Modified enzymes, production and use thereof.
JP2532919B2 (en) * 1987-04-30 1996-09-11 寳酒造株式会社 Composition for insulin-binding carrier
JPH0751592B2 (en) * 1987-12-28 1995-06-05 帝人株式会社 Cyclotriphosphazene derivative
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
JPH07118165A (en) * 1993-10-22 1995-05-09 Asahi Chem Ind Co Ltd Transcutaneous absorption composition containing calcitonin gene relating peptide
GB2344519B (en) * 1998-12-07 2004-05-19 Johnson & Johnson Medical Ltd Sterile therapeutic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003000278A1 (en) 2003-01-03
JPWO2003000278A1 (en) 2004-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4593048B2 (en) Branched polyalkylene glycols
US7547765B2 (en) Branched polyalkylene glycols
JP2020097626A (en) Conjugates of il-2 moiety and polymer
TWI364295B (en) Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
JP5909755B2 (en) Glycopolysial oxidation of non-blood clotting proteins
JP2022163194A (en) Conjugates of il-7 moiety and polymer
KR101330338B1 (en) Conjugates of a gm-csf moiety and a polymer
JP6711935B2 (en) Nucleophilic catalyst for oxime ligation
JP2009503111A (en) G-CSF moiety and polymer composite
JP6208269B2 (en) Glycopolysial oxidation of non-blood clotting proteins
JP2013536199A (en) Synergistic biomolecule-polymer conjugate
JP4142569B2 (en) Ointment
KR100480432B1 (en) Conjugates of granulocyte-colony stimulating factor and polyethylene glycol derivatives
KR20030017908A (en) multi-branched polymer used in conjugating protein or peptide, and resulting conjugator

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20041220

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20041220

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080318

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080425

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20080603

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20080612

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110620

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110620

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110620

Year of fee payment: 3

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110620

Year of fee payment: 3

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees