JP4122694B2 - Protein-DNA linking molecule and use thereof - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質−ＤＮＡ連結分子及びそれを用いるタンパク質の機能解析方法に関する。本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、タンパク質の進化分子工学やゲノムの機能解析における、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用解析等の試験管内選択に応用される。
【０００２】
【従来技術】
タンパク質の進化分子工学は、医薬・環境分野等への応用、タンパク質の起源・進化の問題、分子間相互作用の解析等生命科学の基礎研究において重要な役割を果たすことが期待されている（根本, 土居, 柳川, 1998, 生化学, 70, 1251-1261）。また、生物の全ゲノム塩基配列情報を基礎として、全ゲノム機能解明を目指すゲノム生物学（統合化生物学）の確立は、２１世紀の生命科学の大きな命題となっている。このゲノム機能解析には、タンパク質、核酸、その他の生体分子と相互作用する未知のタンパク質を、種々の生物や組織由来のｃＤＮＡライブラリーの中から効率的に選び出すことが必要である。
【０００３】
進化分子工学やゲノム機能解析において、タンパク質の試験管内選択の応用が期待されている。タンパク質の試験管内選択を実現するためには、タンパク質（表現型）とそれをコードする核酸（遺伝子型）とを連結しておく必要がある。
【０００４】
タンパク質（表現型）とその遺伝情報を担う核酸（遺伝子型）とを連結させる、従来公知の方法として、ファージ・ディスプレイ法（Smith, G. P., 1985, Science, 228, 1315-1317）、リボゾーム・ディスプレイ法（Hanes, J. and Pluckthun, A. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942）、試験管内ウイルス法（Nemoto, N. et al., 1997, FEBS Lett., 414, 405-408; Roberts, R. W. and Szostak, J. W., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302）等がある。現在広く用いられているファージ・ディスプレイ法は、（１）大腸菌の形質転換という過程が必要であり培養に時間がかかる、（２）集団のサイズが小さくなる、（３）大腸菌にとって有害なタンパク質や、大腸菌内で分解されるタンパク質、さらに大腸菌の膜を透過出来ないタンパク質は提示できない、等の問題点がある。
【０００５】
一方、リボゾーム・ディスプレイ法や試験管内ウイルス（In vitro virus）法は、すべての過程を試験管内で行うため上記の制約を回避できる。しかしながら、これらの方法では、タンパク質と連結させる遺伝子型がｍＲＮＡであるため分解されやすく、また、タンパク質の終止コドンを除いた遺伝子ライブラリーを用いる等の必要があるので、ｃＤＮＡライブラリー等をそのまま提示できないという欠点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ファージ・ディスプレイ法の長所は遺伝子型が安定なＤＮＡであることであり、その短所は生きた細胞を用いる必要があることである。他方、リボゾーム・ディスプレイ法及び試験管内ウイルス法の長所は細胞を必要としない試験管内での方法であることであり、その短所は遺伝子型がｍＲＮＡであり、かつその終止コドンを除く必要があることである。したがって、遺伝子型が安定なＤＮＡを用いて、それが終止コドンを含むものでも試験管内でタンパク質−ＤＮＡ連結分子を製造する方法の開発が望まれていた。
【０００７】
一方、多様な生物の全遺伝子機能を核酸−核酸相互作用に基づいて迅速かつ効率的に解析するための技術として、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイがある（Gerhold, D. G. et al., 1999, TIBS, 168-173）。ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイは、スライドガラス、シリコン、プラスチックス等の基板に、多数のＤＮＡ分子を整列させたもので、遺伝子の発現や変異、多型性等の同時解析に非常に有用であり、実用化されている。また、ＤＮＡチップと同様にタンパク質をチップ上に固定したタンパク質チップがある。タンパク質チップは、ゲノム機能解析においてタンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用を高い効率で調べるのに有用であるが、タンパク質の固定化や安定化に問題があり、まだ実用化の段階に達していない。
【０００８】
タンパク質−タンパク質相互作用や、タンパク質−核酸相互作用をする物質を試験管内で選択するためには、基本的に、ある１つの選ばれた特定の標的分子（タンパク質、核酸、糖質・脂質、その他どの様な化合物でもよい）と相互作用するタンパク質（これを「被標的タンパク質（candidate protein）」と呼ぶことがある）を１つのライブラリーから選択することが必要である。しかし、標的分子を１つの分子に限らずに、沢山の標的分子からなる第１のライブラリーを用意し、その中の何れかの分子と相互作用する被標的タンパク質を第２のライブラリーから選択すれば、１度に多くの分子間相互作用を知ることができる。ゲノム機能解析のように、非常に膨大な数の遺伝子やタンパク質の間の相互作用を調べる必要がある場合には、このようなライブラリー対ライブラリーの選択法が非常に有用である。最近、細胞内（in vivo）でライブラリー対ライブラリーの選択を行う方法がいくつか提案されているが（Rudert, F. et al., 1998, FEBS Lett., 440, 135-140; Pelletier, J.N. et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17, 683-690）、試験管内（in vitro）でタンパク質のライブラリー対ライブラリーの選択を行う方法は開発されていない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、被標的タンパク質とその遺伝情報を担うＤＮＡとが安定に連結した「タンパク質−ＤＮＡ連結分子」を試験管内で構築すべく鋭意検討した。その結果、本発明者らは、被標的タンパク質（表現型）とこれをコードするＤＮＡ（遺伝子型）とを、被標的タンパク質に融合したアダプタータンパク質とそのＤＮＡに結合させたリガンドとの結合を介して連結できることを見出した。また、本発明者らは、かくして構築されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子が、タンパク質の相互作用の解析、タンパク質の高速な試験管内進化実験等に利用可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、標識物質で標識したタンパク質−核酸連結分子を含むタンパク質−核酸連結分子のライブラリーを用い、ライブラリー対ライブラリーの選択を行うことができることを見出した。このようなスクリーニングから得られる知見を基に、タンパク質や核酸の相互作用ネットワークのデータベースを構築すれば、医薬品の開発に有用な情報を提供することが可能となる。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明の第１の態様によれば、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されている、タンパク質−ＤＮＡ連結分子が提供される。
【００１１】
好ましくは、被標的タンパク質はｃＤＮＡの翻訳産物である。
好ましくは、アダプタータンパク質は、ビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及び抗体からなる群から選ばれる。
好ましくは、アダプタータンパク質はビオチン結合タンパク質であり、リガンドはビオチンである。
好ましくは、ビオチン結合タンパク質は、アビジン又はストレプトアビジンである。
好ましくは、タンパク質−ＤＮＡ連結分子に、さらに標識物質が結合してなる。
【００１２】
本発明の第２の態様によれば、被標的タンパク質がｃＤＮＡの翻訳産物である上記した本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子からなるライブラリーが提供される。
本発明の第３の態様によれば、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法が提供される。
【００１３】
本発明の第４の態様によれば、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、タンパク質の合成はマイクロカプセル内で行われる。
好ましくは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。
【００１５】
本発明の第５の態様によれば、本発明の方法により製造されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーから所望の性質を有する連結分子を選択することを含む、タンパク質のスクリーニング方法が提供される。
本発明の第６の態様によれば、本発明の方法により製造されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーから所望の性質を有する連結分子を選択し、更に連結分子中の被標的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を誘発させ、所望の性質が更に改変された被標的タンパク質を含有する連結分子を選択することを特徴とする、タンパク質の機能改変方法が提供される。
【００１６】
本発明の第７の態様によれば、（ａ）第１の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第１のライブラリーと、第１の標識物質とは異なる第２の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第２のライブラリーとを混合する工程；
（ｂ）第１のライブラリー中のタンパク質−連結分子と第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子との複合体を、第１及び第２の標識物質の標識に基づいて選択する工程；及び
（ｃ）上記工程（ｂ）で選択された第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体が有する核酸部分を解読して複合体を形成するタンパク質を同定する工程：
を含む、相互作用を有するタンパク質の機能解析方法が提供される。
【００１７】
好ましくは、第１のライブラリーを標識するための第１の標識はビーズであり、第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体の選択は、セルソーター又は光ピンセットで行う。
好ましくは、第１の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第１のライブラリーは、固相上に一種類ずつ固定化されている。
【００１８】
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されている、タンパク質−ＤＮＡ連結分子である。
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、被標的タンパク質のＣ末端と該タンパク質をコードする核酸の３’末端とが核酸誘導体を介して結合されているものである。
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、ファージ表面に提示される被標的タンパク質をコードするＤＮＡをファージ粒子内に包み込んだものである。
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、被標的タンパク質と、該タンパク質をコードする核酸とがリボゾームを介して結合されているものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
（１）本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子
先ず、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子について説明する。
本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されることによって構成されている。
【００２０】
融合タンパク質を構成する「被標的タンパク質（candidate protein）」とは、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質を意味する。この被標的タンパク質は、天然タンパク質又はその変異体、及び人工タンパク質又はその変異体の何れでもよい。天然タンパク質としては、種々の生物の器官、組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写翻訳される多様性を有するタンパク質のライブラリーを含むものである。人工タンパク質としては、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、又はランダムなアミノ酸配列を含むものである。
【００２１】
「アダプタータンパク質」とは、ある分子（リガンド）と特異的に結合する能力を有するタンパク質を意味し、これらの中には、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体等も含まれる。
「リガンド」とは、アダプタータンパク質に特異的に結合する分子を意味する。
アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、DNA結合タンパク質／DNA、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質／ATP、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。
【００２２】
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）等が好ましく、特に、ストレプトアビジン／ビオチンが最も好ましい。
これらの結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タンパク質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
【００２３】
「融合タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域とアダプタータンパク質をコードするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである。本発明で用いる融合タンパク質をコードするＤＮＡにおいては、通常、その一方の末端にリガンドが結合している。該ＤＮＡの末端に結合したリガンドと該ＤＮＡにより発現される融合タンパク質中のアダプタータンパク質部分との結合を介して、融合タンパク質とＤＮＡとが物理的に連結される。
【００２４】
（２）本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法
上記した本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造できる。好ましくは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造される。
【００２５】
すなわち、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法は、（ｉ）試験管内でＤＮＡからタンパク質を合成するために無細胞転写翻訳系を用いること、（ii）無細胞転写翻訳系に加えるＤＮＡとそこから合成されるタンパク質とが自然に連結できるように、被標的タンパク質にはアダプタータンパク質を融合させるとともに、転写翻訳されるＤＮＡにはリガンドを結合させておくこと、そして（iii）ＤＮＡを１種類もしくは１分子ずつマイクロチューブ等の試験管、マイクロプレートのウェル、またはカプセル等の中に隔離した状態でタンパク質合成を行わせ、合成された融合タンパク質とそれをコードするＤＮＡとをアダプタータンパク質とリガンドとの結合を介して連結させるという、３つの特徴を有している。
【００２６】
本発明において、「転写翻訳開始領域」とは、ＤＮＡ上に存在し、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を可能とするようなあらゆる塩基配列を有するＤＮＡセグメントを指す。具体的には、プロモーター、エンハンサー、コザック配列、シャイン・ダルガーノ配列等を含むＤＮＡセグメントが挙げられる。
【００２７】
「被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域」とは、前記した被標的タンパク質をコードするＤＮＡを意味し、このＤＮＡ領域が、融合タンパク質を構成する被標的タンパク質に翻訳される。多様性を有する諸種のタンパク質の全部またはその一部に翻訳されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡのライブラリーは、主にタンパク質コード領域の塩基配列が互いに異なっている１種類以上のＤＮＡからなる。このような被標的タンパク質をコードする領域の多様性を実現する１つの方法として、天然タンパク質をコードする塩基配列の一部又は全部をランダム配列で置き換える方法(Doi, N. et al., 1997, FEBS Lett., 402, 177-180; Doi, N. et al., 1998, FEBS Lett., 427, 51-54) 及びモジュールや二次構造単位のような単位領域を組み合わせる方法(Tsuji, T. et al., 1999, J. Mol. Biol., 286, 1581-1596)が挙げられる。
【００２８】
「アダプタータンパク質をコードするＤＮＡ領域」とは、前記したアダプタータンパク質をコードするＤＮＡを意味し、このＤＮＡ領域が、融合タンパク質を構成するアダプタータンパク質に翻訳される。
上記した転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域及びアダプタータンパク質をコードするＤＮＡ領域を、これらタンパク質をコードする領域の５’側に転写翻訳開始領域がくるように結合し、更に、そのＤＮＡの何れかの末端にリガンドを結合することによって、転写翻訳させるＤＮＡのライブラリーを調製することができる。
【００２９】
ＤＮＡの末端へのリガンドの結合は、例えば、好ましくは、ＤＮＡの３’末端側からのＤＮＡ鎖の伸長のために用いるプライマーの５’末端側にリガンドが結合したプライマーを調製し、該プライマーを用いるＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)法により行うことができる。例えば、リガンドがビオチンの場合は、ＰＣＲ法で該ＤＮＡを増幅する際、ビオチンが予め結合しているプライマーを用いて行うことにより、容易にＤＮＡの末端にビオチンを導入することができる。
【００３０】
ビオチンが予め結合しているプライマーを得るには、プライマーをＤＮＡ合成機で合成する際にその最後の段階でビオチンホスホアミダイドを用いて反応させればよい。各種ヌクレオチドのビオチンホスホアミダイドは、グレン・リサーチ社等にて市販されている。リガンドがペプチド、脂質、糖等の場合は、上記プライマーを合成する際に、ヌクレオチドの５’末端に、炭素数３〜６の炭化水素基を介して保護されたアミノ基を持つホスホアミダイド（アルキルホスホアミダイドリンカー）を反応させた後、アミノ基を脱保護し、所望のリガンドのサクシニル誘導体を化学結合させる。リガンドがニッケル等の金属イオンの場合は、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を、必要な場合スペーサーを介してプライマーの末端に結合させ、結合後、金属イオンを配位させることができる。
【００３１】
上記したＤＮＡ末端へのリガンドの結合方法は、それ自体既知の当業者によく知られた方法であり、容易に行うことができる。
かくして調製されたＤＮＡのライブラリーを用い、該ＤＮＡが一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離された無細胞転写翻訳系で該ＤＮＡを発現させてタンパク質合成が行われる。
【００３２】
ここで、「無細胞転写翻訳系」とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞及びバクテリア細胞又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられ、特に好ましい具体例としては、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。
【００３３】
ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離するための方法としては、マイクロチューブ等の試験管、マイクロプレートまたはカプセル等を利用する方法が挙げられる。例えば、ＤＮＡのライブラリーが、１個ずつクローニングされカタログ化されているｃＤＮＡライブラリー等の場合、それぞれのＤＮＡはあらかじめ１種類ずつ分離されているので、それぞれ別々にマイクロチューブやマイクロプレートのウェル中の無細胞転写翻訳系に加えればよい。
【００３４】
ＤＮＡのライブラリーが、化学合成されたランダム配列等のように、混合物として調製される場合、その混合物をプラスミド等のベクターにクローニングし、大腸菌等の細胞の中で１種類ずつ隔離し、それぞれのＤＮＡを細胞から抽出してくる方法がある。また、細胞を使わずに試験管内でＤＮＡを隔離する方法として、ＤＮＡの混合物をＤＮＡ１分子の隔離が可能になるまで希釈し、それぞれのＤＮＡ１分子を取り出し、ＰＣＲ法により増幅することも可能である（Ohuchi, S. et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4339-4346）。これらのＤＮＡをそれぞれ別々にマイクロチューブやマイクロプレートのウェル中の無細胞転写翻訳系に加えることができる。
【００３５】
さらに別の方法として、マイクロカプセルを利用してＤＮＡを隔離する方法もある。具体的には、ＤＮＡのライブラリーを加えた無細胞転写翻訳系の水相を、油相に加え撹拌することによって形成される逆相ミセル（水／油型エマルジョン；water-in-oil emulsion）がある。逆相ミセルの作成及び逆相ミセル中での無細胞転写翻訳は、Tawfik, D.S. and Griffith, A.D., 1998, Nat. Biotechnol., 16, 652-656; Nametkin, S.N., Kolosov, M.I. et al., 1992, FEBS Lett., 309, 330-332; 国際公開WO 99/02671号公報に記載の方法に準じ行うことができる。
【００３６】
逆相ミセル（water-in-oil emulsion）の作成法は非常に多くの方法が知られているが、本発明で用いる方法には、ミセルが安定であること、そして転写翻訳反応を阻害しないことという条件が求められる。この条件は、用いる油に１種もしくはそれ以上の界面活性剤を加えてミセルを安定化することにより達成できる。これらの界面活性剤はエマルジョン化試薬と呼ばれ、水相と油相とが分離してしまわないようにするものである。用いられる油（オイル）としては、light white mineral oilが好ましく、特にプロテアーゼやヌクレアーゼを含まない純度の高いものが望ましい。用いられる界面活性剤としては、sorbitan monooleate（例えばSpan-80）、polyoxyethylenesorbitan monooleate（例えばTween-80）等の非イオン系界面活性剤、コール酸ナトリウムやタウロコール酸ナトリウム等のアニオン性界面活性剤が挙げられる。エマルジョン作製は、それ自体既知の通常用いられる撹拌装置を用いて行うことができる。特に簡便には、マグネチックスターラー、ホモジナイザー、超音波等が利用可能である。攪拌装置の回転数は毎分500回転から2000回転程度が望ましい。攪拌時の温度はエマルジョン作製時に転写翻訳の反応が進まないように４℃以下で行うのが望ましい。
【００３７】
また、別のマイクロカプセルの具体例として、例えば、天然のリン脂質や人工の合成両親媒性分子で形成されるリポソーム等を用いることができる(Chakrabarti, A.C., Breaker, R.R. et al., 1994, J. Mol. Evol., 39(6), 555-559)。
【００３８】
（３）本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーからの所望の性質を有する連結分子の選択（タンパク質のスクリーニング方法）、並びにそれを利用したタンパク質の機能改変方法
本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を用いる試験管内選択を行う前に、あらかじめ無細胞転写翻訳系由来のタンパク質、その他の夾雑物から、タンパク質−ＤＮＡ連結分子を分離及び精製しておくことが好ましい。精製の具体例として、エピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００３９】
必要に応じて、精製・回収されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーは、試験管内選択に利用することができる。
即ち、得られるタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーを、目的とする生物活性により選択し、選択された連結分子のＤＮＡを、例えばＰＣＲ法により増幅して、塩基配列を解析することにより、タンパク質−ＤＮＡ連結分子中のタンパク質の配列を容易に知ることができる。
【００４０】
また、タンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリー中から所望の性質を有するタンパク質−ＤＮＡ連結分子を目的とする生物活性により選択し、さらにタンパク質−ＤＮＡ連結分子中のＤＮＡを増幅するに際し、該被標的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を誘発させ、所望の性質がさらに改良された被標的タンパク質を含有するタンパク質−ＤＮＡ連結分子を選択することができる。変異の誘発は、既に確立しているError-prone PCR (Leung, D.W. et al., 1989, J. Methods Cell. Mol. Biol., 1, 11-15)やSexual PCR (Stemmer, W.P.C., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10747-10751)を用いて容易に行うことができる。
【００４１】
ここで、「所望の性質を有するタンパク質」とは、所望の標的分子に結合するタンパク質、所望の化学反応を触媒するタンパク質、上記したタンパク質の結合能、触媒能、基質特異性、熱安定性及び環境条件が改変されたタンパク質等をいう。
【００４２】
目的とする生物活性により被標的タンパク質を選択する方法としては、標的分子との結合能を指標にして選択する方法と、触媒活性を指標にして選択する方法が挙げられる。これら結合能または触媒活性を指標として、例えば、親和性樹脂吸着法、免疫沈降法、電気泳動法、クロマトグラフィー法、フローサイトメトリー法等を利用して所望の性質を有する被標的タンパク質を選択することができる。より具体的には、タンパク質、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、糖質、脂質等の標的分子を、予めマイクロプレートやビーズ等の固相に結合させておき、これに上記で構築されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子を加え、適当な温度条件で、一定時間反応させた後に洗浄し、標的分子に結合した連結分子を解析する方法が挙げられる。この方法は、既に確立しているEnzyme Linked Immunosorbent Assay (ＥＬＩＳＡ) (Crowther, J.R., 1995, Method in Molecular Biology, Vol. 42, Humana Press Inc.)に準じて行うことができる。
【００４３】
触媒活性を指標として被標的タンパク質（酵素タンパク質）を選択する際、例えば、次の２つの方法を用いることができる。その１つは触媒抗体の場合のように、所望の触媒反応の遷移状態アナログを固定化した樹脂に結合するタンパク質を選択する方法である（Tramontano, A. et al., 1986, Science, 234, 1566-1570）。もう１つはＲＮＡ酵素（リボザイム）の場合のように、触媒活性による分子の結合・切断によって、タンパク質−ＤＮＡ連結分子が樹脂に結合・解離されるように工夫する方法である（Gold, L. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763-797）。前者の選択法は酵素活性のターンオーバーを増やすことが難しいのに対して、後者の選択法は、リボザイムの多くの成功例が示しているように、結合ではなく最初から触媒活性で選択する方法であり、後者の方法が有効である。
【００４４】
また、触媒抗体が抗体構造によって制限されることも、天然酵素ほどの活性をもつものが得られていない理由の１つである。本発明では、リボザイム型の選択法が利用可能であり、タンパク質の構造の選択範囲も抗体に限らず自由なので、従来の触媒抗体を越えた新規触媒タンパク質の創出に大きく寄与することが期待できる。
【００４５】
また、本発明では、細胞を使わない試験管内での選択が可能であるため、細胞が生育できないような温度・圧力・有機溶媒中等の過酷な環境条件で働く酵素の創出にも利用できる。リボゾーム・ディスプレイや試験管内ウイルス等の従来法では遺伝子としてｍＲＮＡを使用するのに対して、本発明の連結分子においては安定なＤＮＡを使用しているので、このような場合にも有利である。
【００４６】
このような方法により選択された連結分子に含有されるＤＮＡを、上記の通り、例えば、ＰＣＲ法により増幅し、クローニングしたＤＮＡの塩基配列を決定することによって、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を知ることができる。ＰＣＲ法によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子中のＤＮＡの増幅には、タンパク質コード領域の前後の非コード領域（ＵＴＲ）に共通に含まれるＤＮＡに相補的なプライマーを用いればよい。
【００４７】
上記の通り、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、酵素活性の検出、タンパク質−タンパク質相互作用の解析、タンパク質−核酸相互作用の解析、タンパク質の修飾の解析等の生化学的機能を解析して、遺伝子の機能を解析することにより、治療・診断あるいは産業上の問題を解決するためにタンパク質の利用が考えられるようなあらゆる分野に応用可能である。既存のタンパク質の改良ばかりでなく、新しい機能を有するタンパク質の創出にも役立つ。
【００４８】
（４）タンパク質−核酸連結分子を利用したライブラリー対ライブラリーのスクリーニング
蛍光性物質等で標識された本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を含むタンパク質−核酸連結分子を利用すると、１種類の標的分子に対するライブラリーのスクリーニングだけでなく、ライブラリー対ライブラリーのスクリーニングも可能になる。
【００４９】
即ち、本発明によれば、（ａ）第１の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第１のライブラリーと、第１の標識物質とは異なる第２の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第２のライブラリーとを混合する工程；
（ｂ）第１のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子と第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子との複合体を、第１及び第２の標識物質の標識に基づいて選択する工程；及び
（ｃ）上記工程（ｂ）で選択された第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体が有する核酸部分を解読して複合体を形成するタンパク質を同定する工程：
を含む、相互作用を有するタンパク質の機能解析方法が提供される。
【００５０】
本発明で用いることができる標識物質の具体例としては、蛍光性物質、放射性物質、非放射性標識物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、NBD系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光性タンパク質がある。また、放射性物質として、³²Ｐ、³⁵Ｓ等の放射性同位元素等が挙げられる。その他、非放射性標識物質としては、糖類、脂質類、色素、ビーズ、ナノビーズ等、タンパク質またはＤＮＡと結合可能な化合物であれば如何なるものでもよい。
【００５１】
前記タンパク質−ＤＮＡ連結分子を標識する最も簡単な方法は、ＤＮＡのライブラリーをあらかじめ標識しておくことである。例えば、フルオレセイン等の蛍光色素で標識したプライマーとリガンドが結合したプライマーを用いて、ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、ＤＮＡライブラリーを調製する方法が挙げられる。この方法は、従来のファージ・ディスプレイ法、リボゾーム・ディスプレイ法、試験管内ウィルス法等で構築される「タンパク質と核酸が連結した分子」を標識化するよりもはるかに容易であり、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の大きな利点の１つである。
【００５２】
本発明においては、本明細書中上記した本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子の他に、ファージ・ディスプレイ法、リボゾーム・ディスプレイ法、試験管内ウィルス法、その他の方法で製造されるタンパク質−核酸連結分子を標識物質で標識化して用いることができる。本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子を含むこれら全てのタンパク質−核酸連結分子は、基本的に、転写翻訳開始領域とタンパク質コード領域を含む核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を調製し、それを細胞または無細胞転写翻訳系に加えてタンパク質を合成させ、何らかの方法で核酸と合成されたタンパク質とを連結させた構造を有する。したがって、連結分子を標識化するためには、この製造過程の何れかの段階で、核酸部分、タンパク質部分、またはタンパク質−核酸連結分子に含まれるそれ以外の部分に、検出のための標識物質を結合させる必要がある。標識化されたタンパク質−核酸連結分子はさまざまな方法でライブラリー対ライブラリーの試験管内選択に利用できる。
【００５３】
ここで言う「タンパク質コード領域」とは、前記した被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含む転写翻訳されるべきＤＮＡ領域を意味する。また、「転写翻訳領域」、「無細胞転写翻訳系」、「標識物質」等は前記した意味を有する。
タンパク質（表現型）とその遺伝情報を担う核酸（遺伝子型）とを連結させたタンパク質−核酸連結分子の調製方法として上記したファージ・ディスプレイ法（Smith, G. P., 1985, Science, 228, 1315-1317）、リボゾーム・ディスプレイ法（Hanes, J. and Pluckthun, A., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942）、及び試験管内ウイルス法（Nemoto, N. et al., 1997, FEBS Lett., 414, 405-408; Roberts, R.W. and Szostak, J.W., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302; 国際公開WO98/16636号公報）はそれ自体既知の方法である。
【００５４】
即ち、ファージ・ディスプレイ法は、大腸菌に感染して増殖するファージを利用する方法である。ファージ粒子はファージを構成する外被蛋白質がそれ自身をコードするＤＮＡを包み込む形態をしている。ＤＮＡライブラリーを外被蛋白質遺伝子に挿入することにより、ファージ粒子の表面にペプチドが提示されたファージライブラリーを作成できる。提示されたペプチドと標的分子との相互作用に基づいて選択したファージを増幅し、そのＤＮＡを調べることにより、選択されたペプチドの配列を知ることができる。
【００５５】
リボゾーム・ディスプレイ法と試験管内ウイルス法は、無細胞翻訳系で合成されたタンパク質とそれをコードするｍＲＮＡを連結する方法である。リボゾーム・ディスプレイ法では、終止コドンを除いたｍＲＮＡを用いて翻訳されたタンパク質をリボゾーム上にトラップさせ、この結果生じるタンパク質−リボゾームｍＲＮＡ複合体をタンパク質−核酸連結分子として利用することができる。
【００５６】
一方、試験管内ウイルス法では、同じく終止コドンを除いたｍＲＮＡの３’末端にＤＮＡスペーサーと核酸誘導体、例えばピューロマイシンとを結合し、それを鋳型として無細胞転写翻訳を行うことで、タンパク質とｍＲＮＡが核酸誘導体を介して共有結合した単純な分子である「試験管内ウィルス」を構築することができる。これらのタンパク質−ｍＲＮＡ連結分子は試験管内選択後、逆転写ＰＣＲ法により遺伝子を増幅し解読することができる。
【００５７】
この試験管内ウイルス法で用いられる核酸誘導体としては、ピューロマイシン(Puromycin)、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド(3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside; PANS-アミノ酸)、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸が利用できる。また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基がアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオチド(3'-aminoacyladenosine aminonucleoside; AANS-アミノ酸)、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸が利用できる(Harris, R.J., Hanlon, J.E. and Symuns, R.H., 1971, Biochem. Biophys. Acta., 240, 244-262)。これらの中で、ピューロマイシンを利用するのが最も好ましい。
【００５８】
タンパク質−核酸連結分子の標識化は、具体的には、例えば次の通り行うことができる。
まず、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の標識は、前記した通り、ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅するとき、プライマーに標識物質、例えばフルオレセイン等の蛍光色素やビーズ等を結合したものを用いて行えばよい。この標識プライマーを用いて増幅したＤＮＡを鋳型に用い、無細胞転写翻訳を行えば、蛍光性物質やビーズ等で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子が得られる。
【００５９】
また、ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅するとき、蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸を用いれば、蛍光性物質や放射性物質で標識されたＤＮＡを作成できる。これらの標識されたＤＮＡを用いて無細胞転写翻訳を行えば、蛍光性物質や放射性物質等で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子を作成できる。アダプタータンパク質に対する蛍光抗体を作製して、アダプタータンパク質部分に結合させても、タンパク質−ＤＮＡ連結分子を蛍光標識することができる。蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたアミノ酸や、それから誘導されるアミノアシル-ｔＲＮＡ を用いて無細胞転写翻訳を行えば、合成されるタンパク質−ＤＮＡ連結分子のタンパク質部が蛍光性物質や放射性物質で標識される。
【００６０】
ファージ・ディスプレイ法においてファージを標識化するには、蛍光性タンパク質、例えばＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）の遺伝子をファージの外被タンパク質遺伝子に挿入して、発現させる方法がある。また、外被タンパク質の蛍光抗体を外被タンパク質に結合させて、ファージを蛍光標識させてもよい。
【００６１】
リボゾーム・ディスプレイ法において、タンパク質−ｍＲＮＡ複合体を標識化するには、あらかじめｍＲＮＡを標識する方法がある。例えば、蛍光性物質やビーズ等をキャップ構造の中の核酸塩基やリボース部分に蛍光またはビーズ等を化学結合させた標識化キャップ構造を作製し、これを転写の段階で加えれば、ｍＲＮＡが蛍光性物質やビーズ等で標識される。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質、例えば³²Ｐで標識されたリボヌクレオチド三リン酸を用いて転写すれば、蛍光性物質や放射性物質で標識されたｍＲＮＡを作成できる。これらのｍＲＮＡを用いて無細胞転写翻訳を行えば、ｍＲＮＡ−リボゾームタンパク質複合体が標識される。また、ｍＲＮＡやリボゾームＲＮＡの核酸部を核酸染色性の蛍光色素（たとえばSYPRO Orange）等で、染色して蛍光標識させる方法もある。さらに、発現、提示するタンパク質を既知タンパク質との融合タンパク質として発現するように予め遺伝子に組み込み、該既知タンパク質に対する蛍光抗体を調製し、これをｍＲＮＡ−リボゾームタンパク質複合体のタンパク質部に結合させれば、ｍＲＮＡ−リボゾームタンパク質複合体を蛍光標識できる。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質、例えば³²Ｓ−メチオニンで標識されたアミノ酸や、それから誘導されるアミノアシル-ｔＲＮＡ を用いて無細胞転写翻訳を行えば、合成されるタンパク質が蛍光性物質や放射性物質で標識され、その結果タンパク質−ｍＲＮＡ連結分子が標識される。
【００６２】
試験管内ウィルス法で調製されるタンパク質−核酸連結分子の標識化は次の通り行うことができる。
試験管内ウイルスは上記の通り、ｍＲＮＡ−スペーサー−核酸誘導体−タンパク質から構成される。標識物質、例えば、蛍光性物質またはビーズ等をキャップ構造の中の核酸塩基やリボース部分に化学結合させた蛍光またはビーズ標識キャップ構造をつくり、これを転写の段階で加えれば、ｍＲＮＡが蛍光またはビーズ等で標識される。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたリボヌクレオチド三リン酸を用いて転写を行えば、蛍光性物質や放射性物質で標識されたｍＲＮＡを作成できる。
【００６３】
これらの標識されたｍＲＮＡを用いて無細胞転写翻訳を行うと、試験管内ウイルスであるｍＲＮＡ−スペーサー−核酸誘導体−タンパク質のｍＲＮＡ部分が標識される。予めスペーサーの特定部分やピューロマイシン及びその誘導体の核酸塩基部分に蛍光性物質やビーズ等を化学的に結合させ、その結果、試験管内ウイルスを標識化することもできる。また、ｍＲＮＡ部分を核酸染色性の蛍光色素（たとえばSYPRO Orange）等で、染色して蛍光標識させる方法もある。
【００６４】
さらに、発現、提示するタンパク質部を既知タンパク質との融合タンパク質として発現するように予め遺伝子に組み込み、該既知タンパク質に対する蛍光抗体やビーズ結合抗体を調製し、ｍＲＮＡ−スペーサー−核酸誘導体−タンパク質におけるタンパク質部分に特異的に結合させれば、試験管内ウイルスが蛍光またはビーズで標識される。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたアミノ酸や、それから誘導されるアミノアシル-ｔＲＮＡ を用いて無細胞転写翻訳を行えば、合成される試験管内ウイルスのタンパク質部分が蛍光性物質や放射性物質で標識される。
【００６５】
かくして標識されたタンパク質−核酸連結分子は、必要に応じて精製した後、ライブラリー対ライブラリーのスクリーニングに用いて、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を解析することができる。
即ち、前記の通り、第１のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子と第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子との複合体を、第１及び第２の標識物質の標識に基づいて選択し、上記工程で選択された第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体が有する核酸部分を解読して複合体を形成するタンパク質を同定することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を同時に選択でき、複合体を形成するタンパク質を解析、同定することができる。
【００６６】
ここで、複合体を形成しているタンパク質−核酸連結分子の選択は、それぞれの標識物質の標識に基づき、例えば、親和性樹脂吸着法、免疫沈降法、ポリアクリルアミドゲル及びアガロースゲル電気泳動法、クロマトグラフィー法、フローサイトメトリー法、蛍光及び放射能スキャナー法、シンチレーションカウント法、蛍光相関分光法、蛍光偏向解消法等を利用して行うことができる。かくして選択された連結分子の複合体が含有する核酸をＰＣＲ法等により増幅し、塩基配列を解読することにより選択されたタンパク質を解析、同定することができる。
【００６７】
本発明においては、一方のライブラリーがビーズで標識されたものを用いることが好ましい。即ち、第１のライブラリーであるビーズで標識された連結分子のライブラリーと、第２のライブラリーであるビーズとは異なる標識物質で標識された連結分子のライブラリーとを混合し、ビーズとビーズとは異なる標識物質で標識されている連結分子の複合体をセルソーターまたは光ピンセットを用いて分離し、連結分子の複合体が有する核酸部をそれぞれ増幅、解読することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を有するタンパク質を同時に、選択、解析、同定することができる。
【００６８】
本発明においては、第１のライブラリーをビーズで標識し、第２のライブラリーを蛍光標識したものを用いることがより好ましい。即ち、第１のライブラリーであるタンパク質−核酸連結分子をビーズで標識し、第２のライブラリーであるタンパク質−核酸連結分子を蛍光標識する。両者を混合し、蛍光を発するビーズをセルソーター等を用いて分離し、そこにあるタンパク質−核酸連結分子の核酸を増幅、解読することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を有するタンパク質を同時に選択、解析、同定することができる。
【００６９】
図５に、ビーズで標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリー対蛍光性物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーの間に存在するタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を有するタンパク質を同時に選択、解析、同定する方法を示す。両者のライブラリーを混合し、蛍光を発するビーズをセルソーターや光ピンセットを用いて分離し、そこにあるタンパク質−核酸連結分子の核酸を増幅、解読することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を同時に選択、解析することができる。
【００７０】
更に好ましい方法として、蛍光性物質等で標識されたタンパク質−核酸連結分子と、マイクロアレイやチップ技術を組み合わせて、ライブラリー対ライブラリーのスクリーニングを行う方法が挙げられる。
具体的には、タンパク質−核酸連結分子の第１ライブラリーを、一種類ずつ固相、例えばマイクロアレイまたはチップ上に固定化しておき、第２のライブラリーである蛍光標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーを添加し、非特異的に吸着する分子を洗い流す。特異的に吸着したタンパク質−核酸連結分子の蛍光を検出することによって、第１のライブラリー中のどのタンパク質−核酸連結分子に吸着したかが分かる。一方、そこに吸着しているタンパク質−核酸連結分子の核酸部を増幅し、解読することによって、第２のライブラリーのどの分子が吸着したかが分かる。結果的に、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を同時に選択、解析することが可能となる。
【００７１】
なお、本明細書における、核酸の単離・調製、核酸の連結、核酸の合成、ＰＣＲ、プラスミドの構築、無細胞系での翻訳等の遺伝子操作技術は、特に明記しない限り、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。
【００７２】
（５）本発明の応用
本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を利用したタンパク質の進化分子工学では、タンパク質を進化させるために必要なすべての過程を試験管内で行うことができるのでライブラリーのサイズや配列に制限がなく、また、遺伝子型としてＤＮＡを利用しているので安定であり、生きた細胞を用いないので、ｃＤＮＡライブラリーの提示への障害もない。また、リボゾーム・ディスプレイ法や試験管内ウイルス法で必要とされる逆転写やスペーサーの結合等の過程も必要なく、あるサイクルで釣り上げたＤＮＡをそのまま次のサイクルの鋳型として使用できるので、従来法に比べきわめて簡便かつ高速な（High Throughput）試験管内タンパク質進化を実現することが可能となる。
【００７３】
タンパク質の高速進化により全く新しいタンパク質が創製できるようになれば、環境汚染物質の分解酵素のような新規酵素触媒、分子センサー、新しいリガンドやヒト化抗体のような治療・診断薬等、医療・環境分野、生化学・細胞生物学等多くの分野の進歩に寄与することが期待できる。また、現在ゲノム解析計画の進展に伴い大量の遺伝子情報が蓄積しているが、シグナル伝達、転写制御、発生分化等高次の生命現象を研究するためには、各遺伝子の機能と同時に、それらの遺伝子間の相互作用（ネットワーク）を解析する必要がある。本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を用いれば、ある遺伝子（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質またはそのタンパク質の代謝産物）が相互作用している未知のタンパク質をｃＤＮＡライブラリーの中から、試験管内で手軽に効率よくスクリーニングする、ゲノムの機能解析が可能になる。したがって、本発明は、医療・環境問題や、物質・エネルギー生産等、２１世紀の生命科学全般に大きく貢献することが期待できる。
【００７４】
更に、現在ゲノム解析計画の進展に伴い大量の遺伝子情報が蓄積しているが、シグナル伝達、転写制御、発生分化等高次の生命現象を研究するためには、各遺伝子の機能と同時に、それらの遺伝子間の相互作用（ネットワーク）を解析する必要がある。本発明の標識されたタンパク質−核酸連結分子を用いるライブラリー対ライブラリーの選択法を利用すれば、ある遺伝子（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質またはそのタンパク質の代謝産物）が相互作用している未知のタンパク質をｃＤＮＡライブラリーの中から、試験管内で容易にかつ効率よくスクリーニングすることができる。この様に本発明を用いることにより、効率のよいゲノム機能解析が可能になる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例は本発明の一例を示すものに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例により何ら制限されるものでない。本発明の精神から離れることなく、以下の実施例に変更、改変又は改良を加えて本発明を実施できることは当業者には自明である。
【００７５】
【実施例】
実施例１：ストレプトアビジン−ビオチンを介して結合したタンパク質−ＤＮＡ連結分子の構築
タンパク質とそれをコードするＤＮＡとを連結するために、ストレプトアビジン−ビオチン複合体を利用した。すなわち、被標的タンパク質をストレプトアビジンとの融合タンパク質として合成させ、ビオチンで標識したＤＮＡと連結させた。この「タンパク質−ＤＮＡ連結分子」を利用した試験管内選択が可能であることを確認するために、10アミノ酸残基のランダムペプチドライブラリーを作製し、その中からNi（ニッケル）キレート樹脂（Ni-NTA樹脂）に結合するペプチドの濃縮を行った。
【００７６】
図１は、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を利用したタンパク質の試験管内選択の概念図である。まず、あるアダプタータンパク質（図１のＡ、例えばアビジン）とそれに結合するリガンド（図１のＢ、例えばビオチン）を用意する。次に、スクリーニングしようとするＤＮＡライブラリーにリガンドを結合し、無細胞転写翻訳系に加える。また、あらかじめライブラリーのタンパク質がアダプタータンパク質との融合タンパク質として合成されるようにＤＮＡを構築しておく。無細胞転写翻訳系で合成されたタンパク質は、アダプタータンパク質とリガンドとの結合を介して、そのタンパク質をコードするＤＮＡと連結する。完成したタンパク質−ＤＮＡ連結分子を回収・混合し、標的物質に結合するタンパク質を、例えば親和性樹脂等への吸着を利用してスクリーニングする。さらに、樹脂に吸着したタンパク質−ＤＮＡ連結分子のＤＮＡは、ＰＣＲ法により増幅され、解読される。
【００７７】
実験材料
放線菌ストレプトミセス・アビジニー（Streptomyces avidinii）は理化学研究所より購入した。オリゴＤＮＡはエスペックオリゴサービスで合成された。大腸菌、プラスミド、各種酵素・試薬等は次の通り市販のものを用いた。
【００７８】
大腸菌JM109、プラスミドpUC18及びpUC19（東洋紡）、pET20b（Novagen）、大腸菌S30抽出液（プロメガ）；制限酵素NdeI、NheI、XbaI（NEB）、BamHI 、EcoRI及びHindIII（東洋紡）；Ligation High及びRNaseインヒビター（東洋紡）、T7 RNAポリメラーゼ（プロメガ）、Ex Taq ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）；Wizard PCR Preps（プロメガ）、RecoChip（宝酒造）、Ni-NTA樹脂（QIAGEN）、ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI）。
遺伝子工学の基本操作（クローニング、大腸菌の形質転換及び培養、プラスミドの回収等）は、サンブルック等のモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989) CSH Press）に従った。
【００７９】
ライブラリーの構築
ストレプトアビジン遺伝子を、放線菌Streptomyces avidiniiゲノムを鋳型として、ストレプトアビジン遺伝子の上流及び下流に相補的なプライマー（配列番号１及び２）を用いてＰＣＲで増幅し、BamHI 及び EcoRIで消化し、pUC18のBamHI-EcoRI部位にクローニングし、pUC-STA を得た。これを鋳型として、ストレプトアビジン遺伝子の５’側にＴ７タグを付加するためのプライマー（配列番号３）及びストレプトアビジン遺伝子下流に相補的なプライマー（配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、５’側にＴ７タグ配列をもつストレプトアビジン遺伝子を得た。さらに、この上流にＴ７プロモーターを含む非コード領域（５’-ＵＴＲ）を付加するために、pET20bを鋳型として、５’-ＵＴＲの上流及び下流に相補的なプライマー（配列番号５及び６）を用いてＰＣＲ増幅した断片をNdeI及びNheIで消化し、NheI-HindIII処理したＴ７タグ−ストレプトアビジン遺伝子と共に、pUC19のNdeI-HindIII 部位にクローニングし、pT7-STAを得た。
【００８０】
これを鋳型として、Ｔ７プロモーターの上流に相補的なプライマー（配列番号７）及びストレプトアビジン遺伝子の３’側にランダム配列（ＮＮＹ；Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ，Ｙ＝Ａ，Ｇの等モル混合物）及び３’-ＵＴＲを付加し、ＤＮＡの３’ 側をビオチン化するためのプライマー（配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、３’末端にランダム配列をもつストレプトアビジン遺伝子ライブラリーを得た（STA-Random；図２）。同様に、pT7-STA を鋳型として、Ｔ７プロモーターの上流に相補的なプライマー（配列番号７）及びストレプトアビジン遺伝子の３’側にヒスチジン（His）タグ及び３’-ＵＴＲを付加し、ＤＮＡの３’ 側をビオチン化するためのプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲを行った。かくして３’側にHisタグ及びビオチンのついたストレプトアビジン遺伝子を作製した（STA-His; 図２）。
【００８１】
図２は、実施例１で使用したＤＮＡライブラリーの模式図である。ストレプトアビジン（STA）遺伝子の５’側には１１アミノ酸残基のＴ７タグ（MASMTGGQQMG）をコードする塩基配列が付加されている。Ｔ７タグはストレプトアビジンの発現量と溶解度を上げることが知られている（Gallizia, A. et al., 1998, Protein Expr. Purif., 14, 192-196）。また、Ｔ７タグを認識する抗体カラムを利用してタンパク質−ＤＮＡ連結分子を精製することもできる。遺伝子の３’側には10アミノ酸残基のランダム配列（STA-Random）、又はHisタグをコードする塩基配列が付加されている（STA-His）。これらの遺伝子はＴ７プロモーター支配下で転写される。ＤＮＡの３’ 側にはビオチンが結合している。これらをWizard PCR Prepsにより精製し、His タグ付き遺伝子を希釈してランダム遺伝子ライブラリーに加えることにより、最終的なＤＮＡライブラリーを得た。
【００８２】
無細胞転写翻訳
無細胞転写翻訳系として大腸菌S30抽出液にT7 RNAポリメラーゼを添加した系を用いた。この系におけるタンパク質の発現及びタンパク質−ＤＮＡ連結分子の生成を確認するために、STA-His ＤＮＡまたはその５’側をＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で蛍光標識したものを上記の系に加え、合成反応を行った。図３に示すように、フルオレセイン−ビオチン連結化合物を反応液に添加・結合させたSTA-Hisタンパク質（レーン１、２）、ＦＩＴＣで標識されたＤＮＡ（レーン２、３）、及びＦＩＴＣとビオチンで標識されたＤＮＡと STA-Hisタンパク質との連結分子（レーン３）が蛍光イメージアナライザーにより検出された。
以上の結果から、蛍光性物質で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子が構築されることが明らかとなった。
【００８３】
試験管内選択
ＤＮＡを１分子ずつ隔離するために、逆相ミセル（水／油型エマルジョン）を用いた（Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D., 1998, Nat. Biotechnol., 16, 652-656）。まず、上記のＤＮＡライブラリー 1 nM を氷上で 50 μl の大腸菌S30抽出液に加えた。油相として、1mlのlight white mineral oil（シグマ社製）に4.5%のSpan-80（sorbitan monooleate、シグマ社製）、0.5%の Tween-80 (polyoxyethylene-sorbitan monooleate、シグマ社製）加えたものを用いた。
上記溶液を、４℃で 1 mlの油相（Span-80 4.5％、Tween-80 0.5%を含む）に加え、マグネチックスターラーで1150ｒｐｍの速度で撹拌し、水／油型エマルジョン（water-in-oil emulsion）を形成させた。
この系を４℃から 25 ℃に移し１時間反応させることにより、各ミセルの中でタンパク質が合成され、それ自身をコードするＤＮＡと結合する。反応終了後、エーテル処理により水層をオイル層から分離し、「タンパク質−ＤＮＡ連結分子」のライブラリーを回収した。この溶液をNi-NTA 樹脂と１時間混合し、樹脂に吸着させ、洗浄バッファー（0.1M NaH₂PO₄、10mM Tris-HCl、2M NaCl 、1% Tween-20、20mMイミダゾール、2.25M 塩酸グアニジン、20mMメルカプトエタノール）で５回洗浄した。
【００８４】
濃縮の確認
上記の操作でNi-NTA樹脂に吸着しやすいHisタグ付き遺伝子（STA-His；図２）が、濃縮されることを確認するために、吸着・洗浄した樹脂の一部を鋳型として、Ｔ７プロモーターの上流に相補的なプライマー（配列番号７）及びＤＮＡの３’側をＦＩＴＣ標識するための３’-ＵＴＲに相補的な蛍光プライマー（配列番号 10 ）を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをBamHIで消化した。図２に示すように、BamHIはSTA-His遺伝子のみを切断し、ランダムライブラリー（STA-Random）は切断しないので、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、蛍光イメージアナライザーでスキャンすることによって切断された蛍光ＤＮＡの割合を定量化できる。
【００８５】
図４に示すように、STA-His遺伝子は試験管内選択により約10倍濃縮されることが分かった。すなわち、図４は、タンパク質−ＤＮＡ連結分子を利用した試験管内選択の結果、ランダム配列のライブラリー（STA-Random）からHisタグ配列（STA-His）が濃縮されたことを示す図である。（Ａ）試験管内選択を行う前のSTA-HisとSTA-Randomとの比率は、１：10（レーン１）、１：100（レーン２）及び１：1000（レーン３）である。（Ｂ）試験管内選択によってSTA-His の割合は約10倍増加した。以上の結果から、タンパク質−ＤＮＡ連結分子の構築及びそれを利用した試験管内選択が可能であることが分かった。
【００８６】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子型が安定なＤＮＡを用いて、それが終止コドンを含むものでも試験管内でタンパク質−ＤＮＡ連結分子を製造する方法が提供されることになった。また、本発明により、ゲノム機能解析のように非常に膨大な数の遺伝子やタンパク質の間の相互作用を調べるのに有用な試験管内（in vitro）でタンパク質のライブラリー対ライブラリーの選択を行う方法が提供されることになった。
【００８７】
【配列表】

【００８８】

【００８９】

【００９０】

【００９１】

【００９２】

【００９３】

【００９４】

【００９５】

【００９６】

【００９７】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子、その構築方法、連結分子の選択等の概略を示す図である。
【図２】図２は、３’側にランダム配列をもつストレプトアビジン遺伝子ライブラリー（STA-Random）及び３’側にヒスチジン（His）タグのついたストレプトアビジン遺伝子（STA-His）を表す。
【図３】図３は、STA-His ＤＮＡ（ＤＮＡ１）、ＦＩＴＣで蛍光標識したSTA-His ＤＮＡ（ＤＮＡ２）ならびにビオチンで標識するとともにＦＩＴＣで蛍光標識したSTA-His ＤＮＡ（ＤＮＡ３）を無細胞転写翻訳系に加えて得られる、STA-Hisタンパク質（レーン１及び２）、ＦＩＴＣで標識されたＤＮＡ（レーン２及び３）及びＦＩＴＣとビオチンで標識されたＤＮＡとSTA-Hisタンパク質との連結分子（レーン３）の説明図とＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図４】図４は、STA-Random遺伝子及びSTA-His遺伝子のポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図５】図５は、本発明のタンパク質機能解析方法の概略を示す図である。ビーズで標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリー対蛍光性物質で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーの間に存在するタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を同時に解析する方法を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein-DNA linked molecule and a protein functional analysis method using the same. The protein-DNA linking molecule of the present invention is applied to in vitro selection such as protein-protein interaction and protein-nucleic acid interaction analysis in protein evolution molecular engineering and genome functional analysis.
[0002]
[Prior art]
Evolutionary molecular engineering of proteins is expected to play an important role in basic research in life sciences such as application to medicine and environment fields, problems of protein origin and evolution, and analysis of intermolecular interactions. Doi, Yanagawa, 1998, Biochemistry, 70, 1251-1261). In addition, the establishment of genome biology (integrated biology) aimed at elucidating the function of the entire genome based on the information on the entire genome base sequence of organisms has become a major proposition of life science in the 21st century. In this genomic function analysis, it is necessary to efficiently select unknown proteins that interact with proteins, nucleic acids, and other biomolecules from cDNA libraries derived from various organisms and tissues.
[0003]
Applications of in vitro protein selection are expected in evolutionary molecular engineering and genome function analysis. In order to achieve in vitro selection of a protein, it is necessary to link the protein (phenotype) and the nucleic acid (genotype) that encodes it.
[0004]
As a conventionally known method for linking a protein (phenotype) and a nucleic acid (genotype) carrying its genetic information, phage display method (Smith, GP, 1985, Science, 228, 1315-1317), ribosome display (Hanes, J. and Pluckthun, A. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942), in vitro virus method (Nemoto, N. et al., 1997, FEBS Lett., 414 405-408; Roberts, RW and Szostak, JW, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302). Phage display methods currently widely used are: (1) the process of transformation of E. coli is necessary and takes a long time to culture, (2) the size of the population is reduced, (3) proteins harmful to E. coli However, there are problems that proteins that are degraded in E. coli and proteins that cannot permeate the membrane of E. coli cannot be presented.
[0005]
On the other hand, the ribosome display method and the in vitro virus method can avoid the above-mentioned restrictions because all processes are performed in a test tube. However, in these methods, since the genotype to be linked to the protein is mRNA, it is easily decomposed, and it is necessary to use a gene library excluding the protein stop codon. There is a disadvantage that it can not.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The advantage of the phage display method is that the genotype is stable DNA, and the disadvantage is that live cells must be used. On the other hand, the advantage of the ribosome display method and the in vitro virus method is that it is an in vitro method that does not require cells, and its disadvantage is that the genotype is mRNA and its stop codon must be removed. It is. Therefore, it has been desired to develop a method for producing a protein-DNA linked molecule in a test tube using DNA having a stable genotype, even if it contains a stop codon.
[0007]
On the other hand, there are DNA chips and DNA microarrays as techniques for rapidly and efficiently analyzing all gene functions of various organisms based on nucleic acid-nucleic acid interactions (Gerhold, DG et al., 1999, TIBS, 168 -173). A DNA chip or DNA microarray is an array of many DNA molecules on a substrate such as a glass slide, silicon, or plastics, and is very useful for simultaneous analysis of gene expression, mutation, polymorphism, etc. It has been put into practical use. In addition, there is a protein chip in which a protein is immobilized on a chip, similar to a DNA chip. Protein chips are useful for investigating protein-protein interactions and protein-nucleic acid interactions with high efficiency in genome function analysis, but there are problems in protein immobilization and stabilization, and they have yet to be put to practical use. Not.
[0008]
In order to select a protein-protein interaction or a substance that interacts with a protein-nucleic acid in a test tube, basically, one selected specific target molecule (protein, nucleic acid, carbohydrate / lipid, etc.) is selected. It is necessary to select from a library a protein that interacts with any compound (sometimes referred to as a “candidate protein”). However, the target molecule is not limited to one molecule, but a first library consisting of many target molecules is prepared, and a target protein that interacts with any of the molecules is selected from the second library. Then, many intermolecular interactions can be known at a time. Such a library-to-library selection method is very useful when it is necessary to examine the interaction between a very large number of genes and proteins, such as genome function analysis. Recently, several methods for library-to-library selection in cells (in vivo) have been proposed (Rudert, F. et al., 1998, FEBS Lett., 440, 135-140; Pelletier, JN et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17, 683-690), a method for selecting a library of libraries versus a library in vitro has not been developed.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventors diligently studied to construct a “protein-DNA linked molecule” in which a target protein and DNA carrying genetic information are stably linked in a test tube. As a result, the present inventors have made a target protein (phenotype) and a DNA (genotype) encoding the target protein through a binding between an adapter protein fused to the target protein and a ligand bound to the DNA. And found that they can be linked. Further, the present inventors have found that the protein-DNA linking molecule thus constructed can be used for analysis of protein interactions, high-speed in vitro evolution experiments of proteins, and the like. Furthermore, the present inventors have found that a library-to-library selection can be performed using a library of protein-nucleic acid linked molecules including a protein-nucleic acid linked molecule labeled with a labeling substance. By building a database of protein and nucleic acid interaction networks based on the knowledge obtained from such screening, it is possible to provide useful information for drug development. The present invention has been completed based on these findings.
[0010]
That is, according to the first aspect of the present invention, the fusion protein of the target protein and the adapter protein, and the DNA encoding the fusion protein and bound to the ligand bind the adapter protein and the ligand. Protein-DNA linking molecules are provided that are linked via
[0011]
Preferably, the target protein is a translation product of cDNA.
Preferably, the adapter protein is selected from the group consisting of biotin binding protein, maltose binding protein, polyhistidine peptide, glutathione-S-transferase and antibody.
Preferably, the adapter protein is a biotin binding protein and the ligand is biotin.
Preferably, the biotin binding protein is avidin or streptavidin.
Preferably, a labeling substance is further bound to the protein-DNA linking molecule.
[0012]
According to the second aspect of the present invention, there is provided a library comprising the protein-DNA linked molecules according to the present invention as described above, wherein the target protein is a translation product of cDNA.
According to the third aspect of the present invention, DNA having at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding an adapter protein and having a ligand bound thereto is expressed in a cell-free transcription / translation system. A method for producing a protein-DNA linked molecule according to the present invention.
[0013]
According to the fourth aspect of the present invention, a library of DNA having at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding an adapter protein and having a ligand bound thereto is obtained. Provided is a method for producing a protein-DNA linked molecule according to the present invention, wherein the protein is synthesized by expressing it in a cell-free transcription / translation system isolated so that the DNA in the rally is contained in one kind or one molecule at a time. Is done.
[0014]
Preferably, protein synthesis is performed in microcapsules.
Preferably, the library of DNAs having at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding an adapter protein and having a ligand bound thereto is a cDNA library.
[0015]
According to the fifth aspect of the present invention, there is provided a protein screening method comprising selecting a linking molecule having a desired property from a library of protein-DNA linking molecules produced by the method of the present invention. .
According to the sixth aspect of the present invention, a linking molecule having a desired property is selected from a library of protein-DNA linking molecules produced by the method of the present invention, and further encodes a target protein in the linking molecule. There is provided a method for modifying a function of a protein, which comprises mutating DNA and selecting a linking molecule containing a target protein whose desired property is further modified.
[0016]
According to the seventh aspect of the present invention, (a) a first library that is a library of protein-nucleic acid linked molecules labeled with a first labeling substance and a second that is different from the first labeling substance Mixing a second library which is a library of protein-nucleic acid linked molecules labeled with the labeling substance of
(B) selecting a complex of the protein-linking molecule in the first library and the protein-nucleic acid linking molecule in the second library based on the labels of the first and second labeling substances; as well as
(C) A step of identifying a protein that forms a complex by decoding a nucleic acid part of a protein-nucleic acid linking molecule complex in the first and second libraries selected in the step (b) above:
A method for analyzing the function of a protein having an interaction is provided.
[0017]
Preferably, the first label for labeling the first library is a bead, and the selection of the protein-nucleic acid linking molecule complex in the first and second libraries is performed with a cell sorter or optical tweezers. .
Preferably, the first library, which is a library of protein-nucleic acid linked molecules labeled with the first labeling substance, is immobilized one by one on the solid phase.
[0018]
Preferably, the protein-nucleic acid linking molecule comprises a fusion protein of a target protein and an adapter protein, and a DNA that encodes the fusion protein and has a ligand bound thereto, through the binding between the adapter protein and the ligand. It is a protein-DNA linking molecule that is linked.
Preferably, the protein-nucleic acid linking molecule is one in which the C-terminal of the target protein and the 3'-end of the nucleic acid encoding the protein are bound via a nucleic acid derivative.
Preferably, the protein-nucleic acid linking molecule is one in which DNA encoding a target protein displayed on the phage surface is encapsulated in the phage particle.
Preferably, the protein-nucleic acid linking molecule is one in which a target protein and a nucleic acid encoding the protein are bound via a ribosome.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(1) Protein-DNA linked molecule of the present invention
First, the protein-DNA connecting molecule of the present invention will be described.
The protein-DNA linking molecule of the present invention comprises a fusion protein of a target protein and an adapter protein, and a DNA that encodes the fusion protein and has a ligand bound thereto, through the binding between the adapter protein and the ligand. It is constituted by being connected.
[0020]
The “candidate protein” constituting the fusion protein means a protein to be subjected to functional analysis, functional modification or the like. The target protein may be a natural protein or a variant thereof, and an artificial protein or a variant thereof. Natural proteins include libraries of diverse proteins that are transcribed and translated from cDNA libraries derived from organs, tissues or cells of various organisms. The artificial protein includes a sequence obtained by combining all or a partial sequence of a natural protein, or a random amino acid sequence.
[0021]
“Adapter protein” means a protein having the ability to specifically bind to a certain molecule (ligand), and these include binding proteins, receptor proteins constituting the receptors, antibodies and the like.
“Ligand” means a molecule that specifically binds to an adapter protein.
Examples of adapter protein / ligand combinations include biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin / biotin, maltose-binding protein / maltose, G protein / guanine nucleotide, polyhistidine peptide / nickel or cobalt or other metal ions, glutathione-S -Transferase / glutathione, DNA binding protein / DNA, antibody / antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin binding peptide, ATP binding protein / ATP, or various receptor proteins such as estradiol receptor protein / estradiol / ligands thereof It is done.
[0022]
Among these, adapter protein / ligand combinations include biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin / biotin, maltose-binding protein / maltose, polyhistidine peptides / metal ions such as nickel or cobalt, glutathione-S-transferase / Glutathione, antibody / antigen molecule (epitope) and the like are preferable, and streptavidin / biotin is most preferable.
These binding proteins are known per se, and the DNA encoding the protein has already been cloned.
[0023]
The “DNA encoding a fusion protein” is DNA having a DNA region encoding a target protein and a DNA region encoding an adapter protein. In the DNA encoding the fusion protein used in the present invention, a ligand is usually bound to one end thereof. The fusion protein and the DNA are physically linked through the bond between the ligand bound to the end of the DNA and the adapter protein portion in the fusion protein expressed by the DNA.
[0024]
(2) Production method of protein-DNA linked molecule of the present invention
The above-described protein-DNA linking molecule of the present invention comprises at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding an adapter protein, and a DNA to which a ligand is bound, in a cell-free transcription / translation system. It can be produced by expressing and synthesizing a protein. Preferably, a library of DNA having at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding an adapter protein, and having a ligand bound thereto, is one type of DNA in the DNA library. Alternatively, it is produced by synthesizing a protein by expressing in a cell-free transcription / translation system isolated so as to contain each molecule.
[0025]
That is, the method for producing a protein-DNA linked molecule of the present invention comprises: (i) using a cell-free transcription / translation system to synthesize a protein from DNA in a test tube; The adapter protein is fused to the target protein so that the protein synthesized therefrom can be naturally linked, and a ligand is bound to the DNA to be translated and translated. (Iii) One kind of DNA Alternatively, protein synthesis is performed in a state where each molecule is isolated in a test tube such as a microtube, a well of a microplate, or a capsule, and the synthesized fusion protein and the DNA encoding the protein are combined with an adapter protein and a ligand. It has the three characteristics of being connected through the coupling.
[0026]
In the present invention, the “transcription translation initiation region” refers to a DNA segment that exists on DNA and has any base sequence that enables transcription from DNA to mRNA and translation from mRNA to protein. Specific examples include DNA segments containing promoters, enhancers, Kozak sequences, Shine-Dalgarno sequences, and the like.
[0027]
The “DNA region encoding the target protein” means the DNA encoding the target protein described above, and this DNA region is translated into the target protein constituting the fusion protein. A library of DNAs encoding amino acid sequences that are translated into all or part of various types of proteins mainly consists of one or more types of DNAs having different base sequences in protein coding regions. As one method for realizing the diversity of the region encoding the target protein, a method for replacing part or all of the base sequence encoding the natural protein with a random sequence (Doi, N. et al., 1997, FEBS Lett., 402, 177-180; Doi, N. et al., 1998, FEBS Lett., 427, 51-54) and methods of combining unit regions such as modules and secondary structural units (Tsuji, T. et al., 1999, J. Mol. Biol., 286, 1581-1596).
[0028]
The “DNA region encoding an adapter protein” means DNA encoding the adapter protein described above, and this DNA region is translated into an adapter protein constituting a fusion protein.
The above transcription / translation initiation region, the DNA region encoding the target protein, and the DNA region encoding the adapter protein are combined so that the transcription / translation initiation region is located 5 ′ of the region encoding these proteins, A library of DNA to be transcriptionally translated can be prepared by binding a ligand to either end of the DNA.
[0029]
Ligand binding to the end of DNA is preferably performed, for example, by preparing a primer having a ligand bound to the 5 ′ end side of a primer used for extending a DNA strand from the 3 ′ end side of the DNA. It can be performed by the PCR (Polymerase Chain Reaction) method used. For example, when the ligand is biotin, biotin can be easily introduced into the end of the DNA by amplifying the DNA by PCR using a primer to which biotin is bound in advance.
[0030]
In order to obtain a primer to which biotin is bound in advance, a primer may be reacted with biotin phosphoramidide at the final stage when the primer is synthesized with a DNA synthesizer. Biotin phosphoramidides of various nucleotides are commercially available from Glen Research. When the ligand is a peptide, lipid, sugar or the like, when the primer is synthesized, a phosphoramidide having an amino group protected via a hydrocarbon group having 3 to 6 carbon atoms at the 5 ′ end of the nucleotide (alkylphospholipid) After the reaction, the amino group is deprotected and the succinyl derivative of the desired ligand is chemically bound. When the ligand is a metal ion such as nickel, a chelating reagent such as nitrilotriacetic acid or iminodiacetic acid that can coordinate with the metal ion is bound to the end of the primer via a spacer, if necessary. Can be coordinated.
[0031]
The above-described method for binding a ligand to a DNA terminus is a method well known to those skilled in the art and can be easily performed.
Using the thus-prepared DNA library, protein is synthesized by expressing the DNA in a cell-free transcription / translation system that is isolated so that the DNA is contained one kind or one molecule at a time.
[0032]
Here, the “cell-free transcription / translation system” is a system including all elements necessary for transcription from DNA to mRNA and translation from mRNA to protein, and the DNA is encoded by adding DNA thereto. Refers to any system in which a protein is synthesized. Specific examples of the cell-free transcription / translation system include transcription / translation systems prepared on the basis of extracts from eukaryotic cells and bacterial cells or parts thereof. Particularly preferred specific examples include rabbit reticulocytes, Examples thereof include a transcription translation system prepared based on an extract from wheat germ and E. coli (E. coli S30 extract).
[0033]
Examples of the method for isolating the DNA in the DNA library so as to contain one kind or one molecule at a time include a method using a test tube such as a microtube, a microplate or a capsule. For example, in the case of a cDNA library or the like in which a DNA library is cloned and cataloged one by one, each type of DNA is separated in advance, so that it is separately stored in a microtube or microplate well. To the cell-free transcription / translation system.
[0034]
When a library of DNA is prepared as a mixture, such as a chemically synthesized random sequence, the mixture is cloned into a vector such as a plasmid and isolated one by one in cells such as E. coli. There is a method for extracting DNA from cells. As a method for isolating DNA in a test tube without using cells, it is also possible to dilute the DNA mixture until it becomes possible to isolate one DNA molecule, take out each DNA molecule, and amplify it by the PCR method. (Ohuchi, S. et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4339-4346). These DNAs can be separately added to the cell-free transcription / translation system in the wells of microtubes and microplates.
[0035]
As yet another method, there is a method of isolating DNA using microcapsules. Specifically, reversed-phase micelles (water-in-oil emulsion) formed by adding an aqueous phase of a cell-free transcription / translation system with a DNA library to the oil phase and stirring. There is. The generation of reversed-phase micelles and cell-free transcription translation in reversed-phase micelles are described in Tawfik, DS and Griffith, AD, 1998, Nat. Biotechnol., 16, 652-656; Nametkin, SN, Kolosov, MI et al., 1992, FEBS Lett., 309, 330-332; It can be performed according to the method described in International Publication WO 99/02671.
[0036]
There are many known methods for preparing reversed-phase micelles (water-in-oil emulsions), but the method used in the present invention is that micelles are stable and do not inhibit transcription-translation reactions. This condition is required. This condition can be achieved by adding one or more surfactants to the oil used to stabilize the micelles. These surfactants are called emulsifying reagents and prevent the water phase and the oil phase from separating. As the oil (oil) used, light white mineral oil is preferable, and a highly pure oil containing no protease or nuclease is particularly desirable. Examples of the surfactant used include nonionic surfactants such as sorbitan monooleate (eg, Span-80) and polyoxyethylenesorbitan monooleate (eg, Tween-80), and anionic surfactants such as sodium cholate and sodium taurocholate. It is done. Emulsion preparation can be performed using a commonly used stirring apparatus known per se. In particular, a magnetic stirrer, a homogenizer, an ultrasonic wave, or the like can be used. The number of revolutions of the agitator is preferably about 500 to 2000 revolutions per minute. The agitation temperature is desirably 4 ° C. or lower so that the transcription / translation reaction does not proceed during the preparation of the emulsion.
[0037]
As another specific example of the microcapsule, for example, liposomes formed from natural phospholipids or artificial synthetic amphiphilic molecules can be used (Chakrabarti, AC, Breaker, RR et al., 1994, J. Mol. Evol., 39 (6), 555-559).
[0038]
(3) Selection of a linking molecule having a desired property from a library of protein-DNA linking molecules of the present invention (protein screening method), and a function modification method of a protein using the same
Prior to performing in vitro selection using the protein-DNA linking molecule of the present invention, it is preferable to separate and purify the protein-DNA linking molecule from proteins derived from the cell-free transcription / translation system and other contaminants in advance. As a specific example of purification, a DNA region encoding an epitope peptide, polyhistidine peptide, glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein, etc. is introduced into the DNA to be transcribed and expressed as described above. The protein can be purified by utilizing affinity with a substance having affinity for the protein.
[0039]
If necessary, the purified / recovered library of protein-DNA linked molecules can be used for in vitro selection.
That is, a library of protein-DNA linking molecules obtained is selected based on the target biological activity, DNA of the selected linking molecule is amplified by, for example, the PCR method, and the nucleotide sequence is analyzed. The sequence of the protein in the DNA linking molecule can be easily known.
[0040]
In addition, a protein-DNA linking molecule having a desired property is selected from a library of protein-DNA linking molecules according to a desired biological activity, and the target protein is further amplified when amplifying the DNA in the protein-DNA linking molecule. A protein-DNA linking molecule containing a target protein whose desired properties are further improved can be selected by inducing mutation in the DNA encoding. Mutagenesis is based on the well-established Error-prone PCR (Leung, DW et al., 1989, J. Methods Cell. Mol. Biol., 1, 11-15) and Sexual PCR (Stemmer, WPC, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10747-10751).
[0041]
Here, “a protein having a desired property” means a protein that binds to a desired target molecule, a protein that catalyzes a desired chemical reaction, the binding ability, catalytic ability, substrate specificity, thermal stability, and the above-mentioned protein. This refers to proteins with modified environmental conditions.
[0042]
Examples of a method for selecting a target protein according to a target biological activity include a method for selecting using a binding ability to a target molecule as an index, and a method for selecting using a catalytic activity as an index. Using these binding ability or catalytic activity as an index, for example, a target protein having a desired property is selected using an affinity resin adsorption method, immunoprecipitation method, electrophoresis method, chromatography method, flow cytometry method, etc. be able to. More specifically, target molecules such as proteins, nucleic acids (DNA or RNA), carbohydrates, and lipids are previously bound to a solid phase such as a microplate and beads, and the protein-DNA constructed as described above. An example is a method in which a linking molecule is added, reacted for a predetermined time at an appropriate temperature condition, washed, and analyzed for a linking molecule bound to a target molecule. This method can be performed according to the already established Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) (Crowther, J.R., 1995, Method in Molecular Biology, Vol. 42, Humana Press Inc.).
[0043]
When selecting a target protein (enzyme protein) using the catalytic activity as an index, for example, the following two methods can be used. One is a method of selecting a protein that binds to a resin to which a desired catalytic transition state analog is immobilized, as in the case of catalytic antibodies (Tramontano, A. et al., 1986, Science, 234, 1566-1570). The other is a method in which a protein-DNA linked molecule is bound to or dissociated from a resin by binding / cleaving of the molecule by catalytic activity as in the case of RNA enzyme (ribozyme) (Gold, L. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763-797). The former selection method is difficult to increase the turnover of enzyme activity, while the latter selection method selects from the beginning rather than binding, as shown by many successful ribozymes. The latter method is effective.
[0044]
In addition, the fact that the catalytic antibody is limited by the antibody structure is one of the reasons why an antibody having activity as natural enzyme has not been obtained. In the present invention, a ribozyme type selection method can be used, and the selection range of the protein structure is not limited to an antibody, so it can be expected to greatly contribute to the creation of a novel catalytic protein that exceeds conventional catalytic antibodies.
[0045]
Further, in the present invention, since selection in a test tube that does not use cells is possible, it can also be used to create an enzyme that works under harsh environmental conditions such as temperature, pressure, and an organic solvent in which cells cannot grow. In contrast to conventional methods such as ribosome display and in vitro virus, which use mRNA as a gene, the linking molecule of the present invention uses stable DNA, which is advantageous in this case.
[0046]
As described above, the DNA contained in the linking molecule selected by such a method is amplified by, for example, the PCR method, and the amino acid sequence of the selected protein is determined by determining the base sequence of the cloned DNA. be able to. For amplification of DNA in a protein-DNA linked molecule by the PCR method, a primer complementary to DNA commonly contained in the non-coding region (UTR) before and after the protein coding region may be used.
[0047]
As described above, the protein-DNA linking molecule of the present invention can analyze biochemical functions such as enzyme activity detection, protein-protein interaction analysis, protein-nucleic acid interaction analysis, and protein modification analysis. By analyzing gene functions, it can be applied to all fields where the use of proteins can be considered in order to solve treatment / diagnosis or industrial problems. It is useful not only for improving existing proteins but also for creating proteins with new functions.
[0048]
(4) Library-to-library screening using protein-nucleic acid linking molecules
Using a protein-nucleic acid linking molecule containing the protein-DNA linking molecule of the present invention labeled with a fluorescent substance or the like allows not only screening of a library for one type of target molecule, but also screening of a library versus a library. become.
[0049]
That is, according to the present invention, (a) a first library which is a library of protein-nucleic acid linked molecules labeled with a first labeling substance and a second labeling substance different from the first labeling substance Mixing with a second library which is a library of protein-nucleic acid linked molecules labeled with
(B) selecting a complex of the protein-nucleic acid linking molecule in the first library and the protein-nucleic acid linking molecule in the second library based on the labels of the first and second labeling substances. ;as well as
(C) A step of identifying a protein that forms a complex by decoding a nucleic acid part of a protein-nucleic acid linking molecule complex in the first and second libraries selected in the step (b) above:
A method for analyzing the function of a protein having an interaction is provided.
[0050]
Specific examples of labeling substances that can be used in the present invention include fluorescent substances, radioactive substances, non-radioactive labeling substances, and the like. Examples of the fluorescent substance include fluorescent dyes such as fluorescein series, rhodamine series, eosin series, NBD series, and fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). In addition, as radioactive material,³²P,³⁵Radioactive isotopes such as S can be mentioned. In addition, any non-radioactive labeling substance may be used as long as it is a compound capable of binding to protein or DNA, such as saccharides, lipids, dyes, beads, and nanobeads.
[0051]
The simplest method of labeling the protein-DNA linking molecule is to label a DNA library in advance. For example, a method of amplifying DNA by a PCR method using a primer labeled with a fluorescent dye such as fluorescein and a primer bound with a ligand to prepare a DNA library can be mentioned. This method is much easier than labeling a “molecule linked nucleic acid and nucleic acid” constructed by the conventional phage display method, ribosome display method, in vitro virus method, etc. -One of the major advantages of DNA linking molecules.
[0052]
In the present invention, in addition to the protein-DNA linking molecule according to the present invention described above in the present specification, the protein-nucleic acid linking molecule produced by the phage display method, ribosome display method, in vitro virus method, and other methods. Can be used after labeling with a labeling substance. All these protein-nucleic acid linking molecules, including protein-DNA linking molecules according to the present invention, basically prepare a nucleic acid (DNA or RNA) containing a transcription and translation initiation region and a protein coding region, which is cell or cell free. In addition to a transcription / translation system, a protein is synthesized, and a nucleic acid and a protein synthesized by some method are linked together. Therefore, in order to label the linking molecule, at any stage of the production process, a labeling substance for detection is added to the nucleic acid moiety, the protein moiety, or the other part of the protein-nucleic acid linking molecule. Need to be combined. Labeled protein-nucleic acid linking molecules can be used for in vitro selection of libraries versus libraries in a variety of ways.
[0053]
The “protein coding region” as used herein means a DNA region to be transcribed and translated, including a DNA region encoding the target protein. Further, “transcription translation region”, “cell-free transcription translation system”, “labeling substance” and the like have the above-mentioned meanings.
The phage display method (Smith, GP, 1985, Science, 228, 1315-1317) described above as a method for preparing a protein-nucleic acid-linked molecule in which a protein (phenotype) and a nucleic acid (genotype) carrying genetic information are linked ), Ribosome display method (Hanes, J. and Pluckthun, A., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942), and in vitro virus method (Nemoto, N. et al., 1997, FEBS Lett., 414, 405-408; Roberts, RW and Szostak, JW, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302; International Publication No. WO98 / 16636) is known per se It is a method.
[0054]
That is, the phage display method is a method that utilizes phages that grow by infecting E. coli. The phage particle has a form in which the coat protein constituting the phage wraps the DNA encoding itself. By inserting the DNA library into the coat protein gene, a phage library in which peptides are displayed on the surface of the phage particle can be prepared. The sequence of the selected peptide can be known by amplifying the phage selected based on the interaction between the displayed peptide and the target molecule and examining the DNA.
[0055]
The ribosome display method and the in vitro virus method are methods for linking a protein synthesized in a cell-free translation system and mRNA encoding the protein. In the ribosome display method, a protein translated using mRNA excluding the stop codon can be trapped on the ribosome, and the resulting protein-ribosome mRNA complex can be used as a protein-nucleic acid linking molecule.
[0056]
On the other hand, in the in vitro virus method, a protein and mRNA are also obtained by binding a DNA spacer and a nucleic acid derivative, such as puromycin, to the 3 ′ end of mRNA except for the stop codon, and performing cell-free transcription translation using it as a template. Can be constructed as “in vitro viruses” which are simple molecules covalently linked via nucleic acid derivatives. These protein-mRNA linking molecules can be amplified and decoded by reverse transcription PCR after selection in vitro.
[0057]
Examples of nucleic acid derivatives used in this in vitro virus method include puromycin, 3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (PANS-amino acid), for example, the amino acid part of which is glycine. PANS-Gly, PAN-Val of valine, PANS-Ala of alanine, and other PANS-amino acids corresponding to all amino acids can be used. In addition, 3'-aminoacyladenosine aminonucleoside (AANS-amino acid) in which the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of the amino acid are connected by an amide bond, for example, AANS- in which the amino acid part is glycine GLY, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, and other AANS-amino acids corresponding to all amino acids can be used (Harris, RJ, Hanlon, JE and Symuns, RH, 1971, Biochem. Biophys. Acta., 240 , 244-262). Of these, it is most preferable to use puromycin.
[0058]
Specifically, the protein-nucleic acid linking molecule can be labeled, for example, as follows.
First, as described above, the protein-DNA linking molecule of the present invention can be labeled using a primer bound with a labeling substance, for example, a fluorescent dye such as fluorescein or beads, when the DNA is amplified by the PCR method. Good. When DNA amplified using the labeled primer is used as a template and cell-free transcription / translation is performed, a protein-DNA linked molecule labeled with a fluorescent substance or beads is obtained.
[0059]
In addition, when DNA is amplified by PCR, DNA labeled with a fluorescent substance or radioactive substance can be prepared by binding a fluorescent substance or using deoxynucleotide triphosphate labeled with a radioactive substance. When cell-free transcription and translation is performed using these labeled DNAs, protein-DNA linked molecules labeled with a fluorescent substance, a radioactive substance or the like can be prepared. Even if a fluorescent antibody against the adapter protein is prepared and bound to the adapter protein portion, the protein-DNA linked molecule can be fluorescently labeled. When cell-free transcription and translation is performed using a fluorescent substance bound, an amino acid labeled with a radioactive substance, or an aminoacyl-tRNA derived therefrom, the protein part of the protein-DNA linked molecule synthesized is a fluorescent substance. Or labeled with radioactive material.
[0060]
In order to label a phage in the phage display method, there is a method in which a fluorescent protein, for example, a GFP (Green Fluorescent Protein) gene is inserted into a phage coat protein gene and expressed. Alternatively, the fluorescent protein of the coat protein may be bound to the coat protein to fluorescently label the phage.
[0061]
In the ribosome display method, in order to label a protein-mRNA complex, there is a method of labeling mRNA in advance. For example, if a labeled cap structure in which a fluorescent substance or a bead is chemically bonded to a nucleobase or ribose moiety in the cap structure with a fluorescent or bead is added and added at the transcription stage, the mRNA becomes fluorescent. Labeled with substance or beads. In addition, fluorescent substances can bind or radioactive substances such as³²If transcription is performed using ribonucleotide triphosphate labeled with P, mRNA labeled with a fluorescent substance or radioactive substance can be prepared. When cell-free transcription and translation is performed using these mRNAs, the mRNA-ribosome protein complex is labeled. There is also a method in which the nucleic acid part of mRNA or ribosomal RNA is fluorescently labeled by staining with a nucleic acid-staining fluorescent dye (for example, SYPRO Orange). Furthermore, if the protein to be expressed and presented is previously incorporated into a gene so that it is expressed as a fusion protein with a known protein, a fluorescent antibody against the known protein is prepared, and this is bound to the protein part of the mRNA-ribosome protein complex. The mRNA-ribosome protein complex can be fluorescently labeled. In addition, fluorescent substances can bind or radioactive substances such as³²When cell-free transcription and translation is performed using amino acids labeled with S-methionine and aminoacyl-tRNA derived therefrom, the synthesized protein is labeled with a fluorescent substance or radioactive substance, resulting in a protein-mRNA-linked molecule. Is labeled.
[0062]
Labeling of protein-nucleic acid linking molecules prepared by the in vitro virus method can be performed as follows.
As described above, the in vitro virus is composed of mRNA-spacer-nucleic acid derivative-protein. If a fluorescent or bead-labeled cap structure is formed by chemically binding a labeling substance, such as a fluorescent substance or a bead, to a nucleobase or ribose moiety in the cap structure, and this is added at the transcription stage, the mRNA is fluorescent or beaded. And so on. Alternatively, mRNA labeled with a fluorescent substance or radioactive substance can be prepared by binding a fluorescent substance or performing transcription using ribonucleotide triphosphate labeled with a radioactive substance.
[0063]
When cell-free transcription and translation is performed using these labeled mRNAs, the mRNA portion of mRNA-spacer-nucleic acid derivative-protein which is a virus in vitro is labeled. In advance, a fluorescent substance, beads, or the like can be chemically bonded to a specific part of the spacer or the nucleobase part of puromycin or a derivative thereof, so that the in vitro virus can be labeled. There is also a method in which the mRNA portion is fluorescently labeled by staining with a nucleic acid staining fluorescent dye (for example, SYPRO Orange).
[0064]
Furthermore, the protein part to be expressed and presented is previously incorporated into a gene so that it is expressed as a fusion protein with a known protein, a fluorescent antibody or a bead-binding antibody against the known protein is prepared, and the protein part in mRNA-spacer-nucleic acid derivative-protein When specifically bound to, the in vitro virus is labeled with fluorescence or beads. In addition, when cell-free transcription and translation is performed using a fluorescent substance bound, an amino acid labeled with a radioactive substance, or an aminoacyl-tRNA derived therefrom, the protein portion of the synthesized in vitro virus is the fluorescent substance. Or labeled with radioactive material.
[0065]
The protein-nucleic acid linking molecule thus labeled can be purified as necessary, and then used for library-to-library screening to analyze protein-protein interaction or protein-nucleic acid interaction.
That is, as described above, the complex of the protein-nucleic acid linking molecule in the first library and the protein-nucleic acid linking molecule in the second library is based on the labels of the first and second labeling substances. By selecting and identifying the protein that forms the complex by decoding the nucleic acid portion of the protein-nucleic acid linking molecule complex in the first and second libraries selected in the above step, two different All protein-protein interactions and protein-nucleic acid interactions existing between the libraries can be selected simultaneously, and the proteins forming the complex can be analyzed and identified.
[0066]
Here, the selection of the protein-nucleic acid linking molecule forming the complex is based on the labeling of each labeling substance, for example, affinity resin adsorption method, immunoprecipitation method, polyacrylamide gel and agarose gel electrophoresis method, A chromatography method, a flow cytometry method, a fluorescence and radioactivity scanner method, a scintillation counting method, a fluorescence correlation spectroscopy method, a fluorescence deflection elimination method, and the like can be used. Thus, the selected protein can be analyzed and identified by amplifying the nucleic acid contained in the selected linking molecule complex by PCR or the like and decoding the base sequence.
[0067]
In the present invention, it is preferable to use one library labeled with beads. That is, a library of linked molecules labeled with beads as the first library and a library of linked molecules labeled with a labeling substance different from the beads as the second library are mixed, and the beads and Two different libraries are obtained by separating the complex of linked molecules labeled with a labeling substance different from the beads using a cell sorter or optical tweezers, and amplifying and decoding the nucleic acid part of each linked molecule complex. Proteins having all protein-protein interactions and protein-nucleic acid interactions existing in between can be selected, analyzed and identified simultaneously.
[0068]
In the present invention, it is more preferable to use the first library labeled with beads and the second library fluorescently labeled. That is, the protein-nucleic acid linking molecule as the first library is labeled with beads, and the protein-nucleic acid linking molecule as the second library is fluorescently labeled. By mixing the two, separating the fluorescent beads using a cell sorter or the like, and amplifying and decoding the nucleic acid of the protein-nucleic acid linking molecule therein, all the proteins present between the two different libraries Proteins having protein interactions and protein-nucleic acid interactions can be simultaneously selected, analyzed and identified.
[0069]
FIG. 5 shows protein-protein interactions and protein-nucleic acid interactions existing between a library of protein-nucleic acid linked molecules labeled with beads versus a library of protein-nucleic acid linked molecules labeled with a fluorescent substance. A method for simultaneously selecting, analyzing, and identifying proteins possessed is shown. By mixing both libraries, separating the fluorescent beads using a cell sorter or optical tweezers, and amplifying and decoding the nucleic acid of the protein-nucleic acid linked molecule, it exists between two different libraries. All protein-protein interactions or protein-nucleic acid interactions can be selected and analyzed simultaneously.
[0070]
A more preferable method is a method of screening a library versus a library by combining a protein-nucleic acid linking molecule labeled with a fluorescent substance or the like with a microarray or chip technology.
Specifically, a first library of protein-nucleic acid linked molecules is immobilized on a solid phase, for example, a microarray or a chip, one by one, and a fluorescently labeled protein-nucleic acid linked molecule as a second library. Add the library and wash away non-specifically adsorbed molecules. By detecting the fluorescence of the specifically adsorbed protein-nucleic acid linked molecule, it can be determined which protein-nucleic acid linked molecule in the first library is adsorbed. On the other hand, by amplifying and decoding the nucleic acid part of the protein-nucleic acid linking molecule adsorbed thereto, it can be determined which molecule in the second library has been adsorbed. As a result, all protein-protein interactions or protein-nucleic acid interactions existing between two different libraries can be selected and analyzed simultaneously.
[0071]
In this specification, genetic manipulation techniques such as nucleic acid isolation / preparation, nucleic acid ligation, nucleic acid synthesis, PCR, plasmid construction, cell-free translation, and the like, unless otherwise specified, Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or a method analogous thereto.
[0072]
(5) Application of the present invention
Protein evolution using the protein-DNA linking molecule of the present invention In molecular engineering, all processes necessary for protein evolution can be performed in vitro, so there is no restriction on the size or sequence of the library, and Since it uses DNA as a genotype, it is stable and does not use living cells, so there is no obstacle to the presentation of a cDNA library. In addition, there is no need for reverse transcription or spacer binding required for the ribosome display method or in vitro virus method, and the DNA picked up in one cycle can be used as a template for the next cycle. In comparison, it is possible to achieve in vitro protein evolution that is extremely simple and fast (High Throughput).
[0073]
If a completely new protein can be created by rapid protein evolution, medical / environmental technologies such as novel enzyme catalysts such as degrading enzymes of environmental pollutants, molecular sensors, therapeutic ligands such as new ligands and humanized antibodies, etc. It can be expected to contribute to progress in many fields such as fields, biochemistry and cell biology. In addition, a large amount of gene information has been accumulated with the progress of the genome analysis plan. However, in order to study higher-order life phenomena such as signal transduction, transcriptional control, and developmental differentiation, the functions of each gene are not limited. It is necessary to analyze the interaction (network) between genes. Using the protein-DNA linking molecule of the present invention, an unknown protein with which a certain gene (DNA, mRNA, protein or metabolite of the protein) interacts can be efficiently obtained from a cDNA library in a test tube. It is possible to analyze the function of the genome by screening well. Therefore, it can be expected that the present invention will greatly contribute to life sciences in the 21st century, such as medical / environmental problems, material / energy production, and the like.
[0074]
Furthermore, a large amount of gene information has been accumulated with the progress of the genome analysis plan, but in order to study higher-order biological phenomena such as signal transduction, transcriptional control, and developmental differentiation, the functions of each gene and those are also considered. It is necessary to analyze the interaction (network) between genes. An unknown protein with which a certain gene (DNA, mRNA, protein or metabolite of the protein) interacts can be obtained by using the library-to-library selection method using the labeled protein-nucleic acid linking molecule of the present invention. Can be easily and efficiently screened from a cDNA library in a test tube. By using the present invention in this way, efficient genome function analysis becomes possible.
The following examples further illustrate the present invention. The following examples are merely examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples. It will be apparent to those skilled in the art that the present invention can be practiced with modification, alteration, or improvement to the following examples without departing from the spirit of the present invention.
[0075]
【Example】
Example 1: Construction of a protein-DNA linked molecule bound via streptavidin-biotin
In order to link the protein and the DNA encoding it, a streptavidin-biotin complex was used. That is, the target protein was synthesized as a fusion protein with streptavidin and ligated with DNA labeled with biotin. In order to confirm that in vitro selection using this "protein-DNA linking molecule" is possible, a random peptide library of 10 amino acid residues was prepared, from which a Ni (nickel) chelate resin (Ni- Peptides that bind to (NTA resin) were concentrated.
[0076]
FIG. 1 is a conceptual diagram of in vitro selection of a protein using the protein-DNA linking molecule of the present invention. First, a certain adapter protein (A in FIG. 1, for example, avidin) and a ligand (B in FIG. 1, for example, biotin) are prepared. Next, the ligand is bound to the DNA library to be screened and added to the cell-free transcription / translation system. In addition, DNA is constructed in advance such that the library protein is synthesized as a fusion protein with the adapter protein. The protein synthesized in the cell-free transcription / translation system is linked to DNA encoding the protein through binding between the adapter protein and the ligand. The completed protein-DNA linking molecule is collected and mixed, and the protein that binds to the target substance is screened using, for example, adsorption to an affinity resin. Further, the DNA of the protein-DNA linked molecule adsorbed on the resin is amplified and decoded by the PCR method.
[0077]
Experimental material
Streptomyces avidinii was purchased from RIKEN. Oligo DNA was synthesized by Espec Oligo Service. Commercially available E. coli, plasmid, various enzymes and reagents were used as follows.
[0078]
E. coli JM109, plasmids pUC18 and pUC19 (Toyobo), pET20b (Novagen), E. coli S30 extract (Promega); restriction enzymes NdeI, NheI, XbaI (NEB), BamHI, EcoRI and HindIII (Toyobo); Ligation High and RNase inhibitors ( Toyobo, T7 RNA polymerase (Promega), Ex Taq DNA polymerase (Takara Shuzo); Wizard PCR Preps (Promega), RecoChip (Takara Shuzo), Ni-NTA resin (QIAGEN), ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI).
The basic operations of genetic engineering (cloning, transformation and culture of E. coli, plasmid recovery, etc.) were in accordance with molecular cloning such as Sunbrook et al. (Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989) CSH Press).
[0079]
Library construction
Streptavidin gene was amplified by PCR using Streptomyces avidinii genome as a template and primers upstream and downstream of streptavidin gene (SEQ ID NO: 1 and 2), digested with BamHI and EcoRI, and pUC18 Cloning into the BamHI-EcoRI site yielded pUC-STA. Using this as a template, PCR was performed using a primer (SEQ ID NO: 3) for adding a T7 tag to the 5 ′ side of the streptavidin gene and a complementary primer (SEQ ID NO: 4) downstream of the streptavidin gene. A streptavidin gene having a T7 tag sequence on the side was obtained. Furthermore, in order to add a non-coding region (5′-UTR) containing a T7 promoter upstream of this, complementary primers (SEQ ID NOs: 5 and 6) are used upstream and downstream of 5′-UTR using pET20b as a template. The PCR amplified fragment was digested with NdeI and NheI and cloned into the NdeI-HindIII site of pUC19 together with the N7I-HindIII-treated T7 tag-streptavidin gene to obtain pT7-STA.
[0080]
Using this as a template, a complementary primer (SEQ ID NO: 7) upstream of the T7 promoter and a random sequence (NNY; N = A, G, C, T, Y = A, G, etc.) on the 3 ′ side of the streptavidin gene Molar mixture) and 3′-UTR, PCR is performed using a primer (SEQ ID NO: 8) for biotinylating the 3 ′ side of DNA, and a streptavidin gene library having a random sequence at the 3 ′ end is obtained. Obtained (STA-Random; FIG. 2). Similarly, using pT7-STA as a template, a complementary primer (SEQ ID NO: 7) upstream of the T7 promoter and a histidine (His) tag and 3′-UTR are added to the 3 ′ side of the streptavidin gene. PCR was performed using a primer (SEQ ID NO: 9) for biotinylating the 'side. Thus, a streptavidin gene having a His tag and biotin on the 3 'side was prepared (STA-His; Fig. 2).
[0081]
FIG. 2 is a schematic diagram of the DNA library used in Example 1. A base sequence encoding a T7 tag (MASMTGGQQMG) of 11 amino acid residues is added to the 5 'side of the streptavidin (STA) gene. The T7 tag is known to increase the expression level and solubility of streptavidin (Gallizia, A. et al., 1998, Protein Expr. Purif., 14, 192-196). Alternatively, protein-DNA linked molecules can be purified using an antibody column that recognizes the T7 tag. A random sequence of 10 amino acid residues (STA-Random) or a base sequence encoding a His tag is added to the 3 'side of the gene (STA-His). These genes are transcribed under the control of the T7 promoter. Biotin is bound to the 3 'side of the DNA. These were purified by Wizard PCR Preps, and His-tagged genes were diluted and added to a random gene library to obtain a final DNA library.
[0082]
Cell-free transcription translation
As a cell-free transcription / translation system, a system in which T7 RNA polymerase was added to an E. coli S30 extract was used. In order to confirm the expression of protein and the generation of protein-DNA linked molecules in this system, STA-His DNA or its 5'-side fluorescently labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate) is added to the above system, and the synthesis reaction Went. As shown in FIG. 3, STA-His protein (lanes 1 and 2) to which a fluorescein-biotin linked compound was added and bound to the reaction solution, DNA labeled with FITC (lanes 2 and 3), and FITC and biotin A linking molecule (lane 3) between the labeled DNA and the STA-His protein was detected by a fluorescence image analyzer.
From the above results, it was revealed that a protein-DNA linked molecule labeled with a fluorescent substance was constructed.
[0083]
In-tube selection
Reverse phase micelles (water / oil emulsion) were used to sequester DNA molecules one by one (Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D., 1998, Nat. Biotechnol., 16, 652-656). First, 1 nM of the above DNA library was added to 50 μl of E. coli S30 extract on ice. As oil phase, 1% light white mineral oil (Sigma) plus 4.5% Span-80 (sorbitan monooleate, Sigma) and 0.5% Tween-80 (polyoxyethylene-sorbitan monooleate, Sigma) Was used.
The above solution is added to 1 ml of an oil phase (containing 4.5% of Span-80 and 0.5% of Tween-80) at 4 ° C., stirred with a magnetic stirrer at a speed of 1150 rpm, and a water-in emulsion (water-in emulsion) -oil emulsion).
By transferring this system from 4 ° C. to 25 ° C. and reacting for 1 hour, a protein is synthesized in each micelle and binds to DNA encoding itself. After completion of the reaction, the aqueous layer was separated from the oil layer by ether treatment, and the “protein-DNA linked molecule” library was recovered. This solution is mixed with Ni-NTA resin for 1 hour, adsorbed on the resin, and washed with buffer (0.1M NaH₂PO_Four, 10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1% Tween-20, 20 mM imidazole, 2.25 M guanidine hydrochloride, 20 mM mercaptoethanol).
[0084]
Confirmation of concentration
In order to confirm that the His-tagged gene (STA-His; Fig. 2), which is easily adsorbed to Ni-NTA resin by the above operation, is concentrated, T7 promoter using a part of the adsorbed and washed resin as a template. PCR was carried out using a complementary primer (SEQ ID NO: 7) upstream of the DNA and a fluorescent primer (SEQ ID NO: 10) complementary to 3′-UTR for labeling the 3 ′ side of the DNA with FITC, and the amplified DNA Digested with BamHI. As shown in FIG. 2, BamHI cleaves only the STA-His gene and not the random library (STA-Random), so it is cleaved by scanning with a fluorescence image analyzer after 10% polyacrylamide gel electrophoresis. The proportion of the fluorescent DNA can be quantified.
[0085]
As shown in FIG. 4, it was found that the STA-His gene was concentrated about 10 times by in vitro selection. That is, FIG. 4 is a diagram showing that the His tag sequence (STA-His) is concentrated from the random sequence library (STA-Random) as a result of in vitro selection using protein-DNA linking molecules. (A) The ratio of STA-His to STA-Random before performing in vitro selection is 1:10 (lane 1), 1: 100 (lane 2), and 1: 1000 (lane 3). (B) The ratio of STA-His increased by about 10 times by in vitro selection. From the above results, it was found that the construction of a protein-DNA linked molecule and selection in vitro using the same can be performed.
[0086]
【The invention's effect】
The present invention provides a method for producing a protein-DNA linked molecule in vitro using DNA having a stable genotype, even if it contains a stop codon. In addition, the present invention allows the selection of a protein library versus a library in vitro that is useful for investigating interactions between a vast number of genes and proteins, such as genomic function analysis. A method was to be provided.
[0087]
[Sequence Listing]

[0088]

[0089]

[0090]

[0091]

[0092]

[0093]

[0094]

[0095]

[0096]

[0097]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an outline of the protein-DNA linking molecule of the present invention, its construction method, selection of the linking molecule, and the like.
FIG. 2 shows a streptavidin gene library (STA-Random) having a random sequence on the 3 ′ side and a streptavidin gene (STA-His) with a histidine (His) tag on the 3 ′ side.
FIG. 3 shows cell-free transcription of STA-His DNA (DNA1), STA-His DNA (DNA2) fluorescently labeled with FITC, and STA-His DNA (DNA3) labeled with biotin and fluorescently labeled with FITC. In addition to the translation system, STA-His protein (lanes 1 and 2), DNA labeled with FITC (lanes 2 and 3), and a linking molecule between DNA labeled with FITC and biotin and STA-His protein ( It is explanatory drawing of a lane 3), and the photograph of SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
FIG. 4 is a photograph of polyacrylamide gel electrophoresis of STA-Random gene and STA-His gene.
FIG. 5 is a diagram showing an outline of the protein function analysis method of the present invention. A method for simultaneously analyzing protein-protein interactions or protein-nucleic acid interactions existing between a library of protein-DNA linked molecules labeled with beads versus a library of protein-DNA linked molecules labeled with a fluorescent substance Indicates.

Claims (9)

被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したDNAとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されている、タンパク質−DNA連結分子であって、アダプタータンパク質が、ビオチン結合タンパク質であり、リガンドがビオチンである連結分子。A protein-DNA linking molecule in which a fusion protein of a target protein and an adapter protein and a DNA that encodes the fusion protein and to which a ligand is bound are linked via the binding between the adapter protein and the ligand A linking molecule in which the adapter protein is a biotin-binding protein and the ligand is biotin . 被標的タンパク質がｃDNAの翻訳産物である請求項１記載の連結分子。  The linking molecule according to claim 1, wherein the target protein is a translation product of cDNA. タンパク質−ＤＮＡ連結分子に、さらに標識物質が結合してなる請求項１または２に記載の連結分子。The linking molecule according to claim 1 or 2 , wherein a labeling substance is further bound to the protein-DNA linking molecule. 被標的タンパク質がｃＤＮＡライブラリーの翻訳産物よりなる、請求項１から３の何れかに記載のタンパク質−ＤＮＡ連結分子からなるライブラリー。The library comprising a protein-DNA linking molecule according to any one of claims 1 to 3 , wherein the target protein comprises a translation product of a cDNA library. 少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、請求項１から３何れかに記載のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法。A protein that has at least a transcription-translation initiation region, a region that encodes a target protein, and a region that encodes a biotin-binding protein that is an adapter protein and that is bound with biotin that is a ligand and is expressed in a cell-free transcription and translation system The method for producing a protein-DNA linked molecule according to any one of claims 1 to 3 , wherein the protein is synthesized. 少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、請求項１から３何れかに記載のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法。A library of DNA having at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding a biotin-binding protein that is an adapter protein and having biotin as a ligand bound thereto is contained in the DNA library. The protein-DNA linked molecule according to any one of claims 1 to 3 , wherein the protein is synthesized by expressing it in a cell-free transcription / translation system isolated so that the DNA is contained in one kind or one molecule at a time. Production method. タンパク質の合成がマイクロカプセル内で行われる請求項６に記載の方法。The method according to claim 6 , wherein the protein synthesis is performed in a microcapsule. 少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡのライブラリーが、ｃＤＮＡライブラリーである請求項６又は７に記載の方法。The library of DNA having at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding a biotin-binding protein that is an adapter protein and bound to biotin as a ligand is a cDNA library. The method according to 6 or 7 . 少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成し、合成されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーを、混合して回収した後に、該ライブラリーから所望の性質を有する連結分子を選択することを含む、タンパク質のスクリーニング方法。A library of DNA having at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding a biotin-binding protein that is an adapter protein and having biotin as a ligand bound thereto is contained in the DNA library. A protein is synthesized by expressing it in a cell-free transcription / translation system that is isolated so that DNA is contained in one kind or one molecule at a time, and the synthesized protein-DNA linked molecule library is mixed and recovered, A method for screening a protein, comprising selecting a linking molecule having a desired property from a library.

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