JP4121432B2 - 免疫測定試薬用カゼイン - Google Patents
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また、本発明の免疫測定試薬の製造方法の特徴は、分子量が90万ダルトンより大きな画分であるカゼイン(a)の含有量(重量%)が分子量が7万5千〜37万5千ダルトンであるカゼイン(A)の重量に基づいて1以下である(A)を含有する免疫測定試薬を製造する方法であって、(A)を含有する溶液を20〜60℃で加温処理した後、(a)を吸着除去する工程を含む点を要旨とする。
また、本発明の免疫測定試薬の製造方法で製造された免疫測定試薬は、カゼイン(a)となり得るカゼイン(a)前駆体が除去されているため、経日的にカゼイン(a)が生成することはない。従って、本発明の製造方法は、標識配位子の非特異反応を防止する効果が極めて高く、また、経日的に非特異反応の防止効果が低減しにくい免疫測定試薬を簡便に製造することができる。
なお、この除去工程は、免疫測定試薬を調製する前、調整中、調整した後のいずれでも(a)を除くこともできるが、カゼイン(a)を除去したカゼインを用いても免疫測定試薬に調整する工程で、カゼイン(a)が生じる場合があるため、カゼイン(a)を除く工程は免疫測定試薬を調製する最終工程で行うことが好ましい。
カゼイン(a)前駆体をカゼイン(a)に変化させる方法としては、カゼインを含有する溶液(免疫測定試薬調整後の溶液を含む)を一定温度下で一定期間放置する等が適用できる。一定温度(℃)としては、20〜60が好ましく、さらに好ましくは30〜50、特に好ましくは35〜45である。放置期間は、温度により異なり、35〜45℃の場合、1〜14日が好ましく、さらに好ましくは2〜10日、特に好ましくは3〜7日である。温度が低くなる程、長く放置することが好ましい。
このようにカゼイン(a)前駆体を除いた免疫測定試薬は、経日的にカゼイン(a)の発生は認められない。
<実施例1>
本実施例は、本発明の免疫測定試薬用カゼイン(A)を酵素標識抗体含有免疫測定用試薬に適用した際、非特異的反応が低いことを示す例である。
カゼインナトリウム塩(シグマアルドリッチ製、αs−、β−及びκ−を含む)5gをリン酸緩衝液(0.02M,pH7.2)100mLに投入し、攪拌下95℃に加熱、溶解した後、孔径0.45μmのメンブレンフィルターでろ過し、カゼイン溶液Aとした。次いでこのカゼイン溶液A 20mLをゲルろ過カラム(ファルマシア製、Superdex 200 prep grade 60/600)で1mL/分の流速[リン酸緩衝液(0.02M、pH7.2)使用]で分画した。そして、同一条件でマウスIgMを分画した結果から、マウスIgM以下の分子量の画分をカゼイン溶液Bとして分取した。また、マウスIgMより大きな分子量の画分をカゼイン溶液Cとして分取した。また、カゼイン溶液Bを再度同様にゲルろ過カラムで分離しマウスIgM以下の分子量の画分をカゼイン溶液Dとして分取した。
カゼイン溶液A〜Dをゲルろ過HPLC(カラム:昭和電工製Shodex GS-620HQ)で分析した結果、カゼイン溶液中の90万ダルトンより大きなカゼイン(a)の全カゼインに対する比(重量%)は次の通りであった。
カゼイン溶液A: 3.2%
カゼイン溶液B: 0.3%
カゼイン溶液C:92.4%
カゼイン溶液D: 0.1%
1)抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズの調製
抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体(ダコジャパン社製)をpH9の0.1M炭酸緩衝液に20μg/mlの濃度で溶解した。直径3.2mmのポリスチレンビーズ(イムノケミカル社製)1000個をこの溶液20mlに加え、2〜10℃で48時間静置させて、ポリスチレンビーズに抗β2−マイクログロブリンポリクロナール抗体を物理吸着させた。その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、20mLの0.1重量%牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液(pH7.2)でビーズを2回洗浄し、抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズを調製した。この抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズを再度50mLの0.1重量%牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液に浸漬し、浸漬状態で冷蔵(2〜10℃)保存した。
抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体(ダコジャパン(株)製)及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ(東洋紡(株)製)を用い、文献[エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール;ジェイ.バイオケム,Vol.92(1982)1413−1424]に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体を調製し、冷凍(−30℃)保存した。
牛血清アルブミン(マイルス社製)1g、塩化ナトリウム0.85g、アジ化ナトリウム0.05gをリン酸緩衝液(0.02M、pH7.2)100mLに溶解し、免疫測定用緩衝液とした。使用まで冷蔵保存した。
上記で作成したカゼイン溶液A〜D及びペルオキシダーゼ標識抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体を用いて次の通り酵素標識抗体液を作成した。すなわち、リン酸緩衝液(1M、pH6.0)10mLにカゼインの重量が0.1gとなるようカゼイン溶液A〜Dを添加し、さらにペルオキシダーゼ標識抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体を蛋白量で100μg添加した後、アジ化ナトリウム0.05g及び4−(メチルチオ)フェノール0.05gを加え攪拌溶解後、脱イオン水で100mLとし、これを酵素標識抗体液とした。この時、カゼイン溶液A〜Dを種々に組み合わせて用いることで、分子量90万ダルトン(Da)より大きいカゼイン(a)の割合(重量%)が下表のようになるように標識抗体液を作成し、使用時まで冷蔵保存した。
200μlの35重量%過酸化水素水を脱イオン水1リットルに溶解し、過酸化水素水とした。使用するまで冷蔵保存した。
ルミノール(東京化成製)0.18g及び4−(シアノメチルチオ)フェノール0.1gを0.1M(モル/L)、pH8.5のトリス/塩酸緩衝液1リットルに溶解した。使用するまで遮光、冷蔵保存した。
12×75mm試験管中に、免疫測定用緩衝液300μL、標準β2−マイクログロブリン溶液10μL(濃度0,15,200ng/mL){三洋化成工業(株)製臨床検査薬「グラザイムβ2-Microglobulin-EIA TEST」中のものを使用した。}及び抗β2−マイクログロブリンポリクロナール抗体結合ビーズ1個を加え、37℃で、10分反応させた。反応液をアスピレータで除去した後、生理食塩水2mLを加てビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。さらに生理食塩水2mLを加え同様に洗浄した。次に、酵素標識抗体液300μLを、洗浄後のビーズに加え37℃、10分反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水2mLを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。さらに生理食塩水2mLを加え同様に2回洗浄した。洗浄後のビーズについて、酵素活性の測定を行った。
洗浄後のビーズが入った試験管(12×75mm)をアロカ社製ルミネッセンスリーダーBLR−201型のサンプルホルダーにセットし、基質液200μL及び過酸化水素水200μLを加え化学発光反応を開始した。発光反応開始40秒後から10秒間の発光量を計測し、酵素活性を示す発光量とした。β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズ1個を投入し、37℃で10分間反応させた。生理食塩水500マイクロリットルでビーズを3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗β2−マイクログロブリンポリクローナル抗体溶液150マイクロリットルを試験管に分注し、37℃で10分反応させた。生理食塩水500マイクロリットルでビーズを3回洗浄した後、基質液、過酸化水素水の各100マイクロリットルを試験管に添加し、添加後40秒〜45秒の発光量を光電子増倍管を用いたルミノメーター(アロカ社製、BLR−201)で測定した。
酵素標識抗体液1〜9を用いて上述の測定操作にしたがって標準β2−マイクログロブリン溶液(濃度0,15,200ng/L)を測定した結果を表2に示した。なお、表2中括弧内の数値はS/N比すなわち発光量を標準0g/mLの発光量で除した値である。
本実施例は、本発明の免疫測定用試薬用カゼイン(A)を酵素標識抗体含有免疫測定用試薬に適用した際に、経時的に劣化した場合でも非特異的反応が低いことを示す例である。
実施例1で作成した酵素標識抗体液1〜9を25℃で10日間放置し、加熱による劣化処理をおこなった。この酵素標識抗体液をそれぞれ1’〜9’とした。
酵素標識抗体液1’〜9’について、実施例1と同様に標準β2−マイクログロブリン溶液(濃度0ng/mL、15ng/mL、200ng/mL)を測定した結果を表3に示した。また、劣化処理前の同測定結果及び劣化処理前後の差を併せて表3に示した。
本実施例は非特異的反応が上昇した免疫測定(反応)試薬から高分子カゼインを除くことで非特異的反応が抑制されることを示すものである。
1.酵素標識抗体液中の高分子カゼインの除去
実施例2で作成した酵素標識抗体液9’を限外ろ過膜(東洋濾紙製、ウルトラフィルターQ0500)を用いて1/50の容量に濃縮した。この溶液を実施例1のカゼインの分画と同様に、ゲルろ過カラム法により、90万ダルトンより大きな分子量部分を除去した。分取した画分を限外ろ過膜でカゼイン濃度0.1重量%となるまで濃縮し、酵素標識抗体液10とした。
酵素標識抗体10について、実施例1と同様に標準β2−マイクログロブリン溶液(濃度0ng/mL、15ng/mL、200ng/mL)を測定した結果を表4に示した。また、酵素標識抗体液9’についての測定値を転記した。
本実施例は本発明の免疫測定試薬用カゼイン(A)が長期保存した後でもカゼインの高分子量化が起こらないことを示す例である。
実施例1及び実施例3で作成した酵素標識抗体液1〜9及び10を冷蔵(2〜10℃)で6ヶ月間保存した。
保存後の酵素標識抗体液を限外ろ過膜(東洋濾紙製、ウルトラフィルターQ0500)を用いて1/10の容量に濃縮した後、ゲルろ過HPLC(カラム:昭和電工製Shodex GS-620HQ)で分析し、カゼイン溶液中の90万ダルトン(Da)より大きなカゼイン(a)の全カゼインに対する比(重量%)を求めた。結果を表5に示した。
本実施例は珪藻土によって高分子量カゼインを除去する方法により調製した、インシュリン測定用免疫測定試薬の例である。
1)抗インシュリンポリクローナル抗体結合ビーズの調製
抗インシュリンポリクローナル抗体(ダコジャパン社製)を用いて実施例1記載の方法と同様にして抗インシュリンポリクローナル抗体結合ビーズを調製し、保存した。
抗インシュリンポリクローナル抗体(ダコジャパン社製)を用いて実施例1記載の方法と同様にペルオキシダーゼ標識抗インシュリンポリクローナル抗体を調製し、冷凍(−30℃)保存した。
牛血清アルブミン(マイルス社製)1g、塩化ナトリウム0.85g、アジ化ナトリウム0.05gをリン酸緩衝液(0.02M、pH7.2)100mLに溶解し、免疫測定用緩衝液とした。使用まで冷蔵保存した。
リン酸緩衝液(0.1M、pH6.0)100mLにカゼインナトリウム塩(シグマアルドリッチ製)0.2gを加え、攪拌下95℃に加熱、溶解した後、孔径0.45μmのメンブレンフィルターでろ過した。さらにペルオキシダーゼ標識抗インシュリンポリクローナル抗体を蛋白量で500μg添加した後、アジ化ナトリウム0.05g及び4−(メチルチオ)フェノール0.05gを加え攪拌溶解し、酵素標識抗体液を調製した。
調製した酵素標識抗体液を40℃で5日間保存し加温処理した(標識抗体液11)。標識抗体液11の100mL当たり20gの珪藻土(商品名:セライトNo.545,和光純薬工業より購入)を投入し、室温(約25℃)で10分間攪拌した。攪拌後、ブフナー漏斗を用いて、濾紙(東洋濾紙製:5A)でろ過し酵素標識抗体液12を得た。
実施例1記載の方法と同様に、酵素標識抗体液11及び酵素標識抗体液12をゲルろ過HPLC(カラム:昭和電工製Shodex GS-620HQ)で分析した結果、溶液中の90万ダルトンより大きなカゼイン(a)の全カゼインに対する比(重量%)は次の通りであった。
酵素標識抗体液11: 8.4%
酵素標識抗体液12: 0.6%
実施例1記載の免疫反応操作及び酵素活性操作法に準じて、上記で作成した試薬を用いて標準インシュリン溶液(濃度0,25,250μIU/mL)を測定した。なお標準インシュリン溶液は三洋化成工業(株)製臨床検査薬「スフィアライトインシュリン用キャリブレーターセット」中の0,250μIU/mL及びそれらから希釈調製した25μIU/mLである。
酵素標識抗体液11及び12を用いて標準インシュリン溶液(濃度0,25,250μIU/mL)を測定した結果を表6に示した。なお、表6中括弧内の数値はS/N比すなわち発光量を標準0μIU/mLの発光量で除した値である。
Claims (5)
- 分子量が90万ダルトンより大きな画分であるカゼイン(a)の含有量(重量%)が、分子量が7万5千〜37万5千ダルトンであるカゼイン(A)の重量に基づいて1以下であることを特徴とする免疫測定試薬用カゼイン(A)。
- 請求項1に記載のカゼイン(A)を含有してなる免疫測定試薬。
- カゼイン(A)の含有量(g/リットル)が免疫測定試薬の25℃における容積に基づいて0.01以上30以下である請求項2に記載の免疫測定試薬。
- さらに標識配位子を含有してなる請求項2又は3に記載の免疫測定試薬。
- 分子量が90万ダルトンより大きな画分であるカゼイン(a)の含有量(重量%)が分子量が7万5千〜37万5千ダルトンであるカゼイン(A)の重量に基づいて1以下である(A)を含有する免疫測定試薬を製造する方法であって、(A)を含有する溶液を20〜60℃で加温処理した後、(a)を吸着除去する工程を含むことを特徴とする免疫測定試薬の製造方法。
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