JP4120778B2

JP4120778B2 - Bone metabolic disease marker and use thereof

Info

Publication number: JP4120778B2
Application number: JP2002136030A
Authority: JP
Inventors: 達夫竹家; 浩司林
Original assignee: 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2002-05-10
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2022-05-10
Also published as: JP2003169687A; WO2003027284A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は破骨細胞の分化や活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の診断に有用な疾患マーカーに関する。より詳細には、本発明は破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患、例えば関節炎や骨粗鬆症等の疾患の遺伝子診断において、プライマーまたは検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカーに関する。また本発明は、かかる疾患マーカーを利用した破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患の検出方法（診断方法）に関する。
【０００２】
さらに本発明は、上記疾患マーカーを利用して、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬として有効な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法で調製される上記物質を有効成分とする骨代謝異常疾患の改善剤または治療剤に関する。
【０００３】
【従来の技術】
骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とが絶えず繰り返されている動的組織である。骨芽細胞と破骨細胞の機能バランスに異常が生じると、この動的平衡状態が破綻し様々な骨代謝異常疾患が引き起こされることが知られている。またステロイド治療等による治療の副作用によっても骨代謝異常が生じる場合がある。また骨代謝異常疾患はその進行に従って身体活動能力の低下が生じ、ひいては腰痛・関節痛等の痛みを伴うため、日常生活動作に支障をきたすことも多い。
【０００４】
近年、骨密度の測定手法（DXA法；Dual energy X-ray absorptiometry法）が改良されたことから骨密度の健診が安価で容易に受けられるようになり、これによって骨代謝異常の診断の機会も増している。
【０００５】
一方で、最近の医療現場では、骨代謝異常疾患に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。高齢化社会でのQOL（Quality of life）向上の必要性が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マーカーが有用であり、その探索並びに開発を目指した研究が精力的に行われているのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、骨代謝異常疾患の診断及び治療に有用な疾患マーカーを提供することを目的とする。より詳細には、本発明は破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患を特異的に反映した疾患マーカーを提供することを目的とする。さらに本発明は該疾患マーカーを利用した骨代謝異常疾患の検出方法（遺伝子診断方法）、該疾患の改善または治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の改善または治療に有用な薬物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、従来、Ｔ細胞におけるサイトカイン遺伝子の発現誘導で機能することが知られているNF-ATc isoform a 遺伝子（以下、本明細書において「NFATC1遺伝子」ともいう。）（GenBank Accession No. U08015, Nature 369, 497-502 (1994)）、並びに塩化物イオンチャンネルとして知られているChloride intracellular channel 4遺伝子（以下、本明細書において「CICC4遺伝子」ともいう。）（GenBank Accession No. AL117424, Genome Res.11(3), 422-435 (2001)）が、骨代謝異常疾患患者の骨組織に特異的に検出され、しかもそれらの遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の亢進に応じて有意な発現増大挙動を示すことを見出した。さらに、これらの遺伝子は正常骨組織では発現がみられないか、みられてもごくわずかである。このようにこれらの遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患患者に特異的に見出されることから、本発明者らは当該骨代謝異常疾患の疾患マーカーとなり得るとの確信を得た。本発明はかかる知見に基づいて開発されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
項１．配列番号1若しくは３に記載のNFATC1遺伝子の塩基配列または配列番号２若しくは４に記載のCICC4遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の疾患マーカー。
項２．破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される項１記載の疾患マーカー。
項３．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された当該RNAに相補的なポリヌクレオチドと請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
項４．配列番号５に記載のNFATC1のアミノ酸配列よりなるタンパク質、または配列番号６に記載のCICC4のアミノ酸配列よりなるタンパク質を認識する抗体を有する、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の疾患マーカー。
項５．破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の検出においてプローブとして使用される項４記載の疾患マーカー。
項６．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と項４または５に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
項７．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質とNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
(ｃ) （ｂ）の比較結果に基づいて、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
項８．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質とNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
項９．破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項８に記載のスクリーニング方法。
項１０．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質と、NFATC1またはCICC4を含む細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のNFATC1またはCICC4由来の機能（活性）を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分の上記NFATC1またはCICC4の機能または活性と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、上記細胞またはその細胞画分のNFATC1またはCICC4の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
項１１．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、NFATC1の機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質と、NFATC1を含みかつInterleukin-2 遺伝子を発現可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のInterleukin-2 遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分のInterleukin-2 遺伝子の発現量と比較する工程、
(ｃ) (ｂ)の比較結果に基づいて、上記細胞またはその細胞画分のInterleukin-2遺伝子の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
項１２．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、CICC4の機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質と、CICC4を含む細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分の塩化物イオンの膜透過活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分の塩化物イオンの膜透過活性と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、上記細胞またはその細胞画分の塩化物イオンの膜透過活性を抑制する被験物質を選択する工程。
項１３．破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項１０乃至１２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項１４． NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤。
項１５． NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑制する物質が項７乃至９のいずれかに記載のスクリーニング法により得られるものである、項１４記載の骨代謝異常疾患の改善または治療剤。
項１６． NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物質を有効成分とする、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤。
項１７． NFATC1またはCICC4の機能・活性抑制物質が、項１０乃至１３のいずれかに記載のスクリーニング法により得られるものである、項１６記載の骨代謝異常疾患の改善または治療剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１０】
本明細書において「遺伝子」または「DNA」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「DNA」には、特定の塩基配列（配列番号：1〜4）で示される「遺伝子」または「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体(ホモログ)、変異体及び誘導体など）をコードする「遺伝子」または「DNA」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「DNA」としては、具体的には、後述の(1-1)項に記載のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：1〜4で示される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「遺伝子」または「DNA」を挙げることができる。
【００１１】
例えばヒト由来のタンパク質の同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http: // www. ncbi. nlm. nih. Gov / HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、例えば、特定のヒト遺伝子の塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http: // www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
【００１２】
なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１３】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００１４】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、同族体（ホモログ）、誘導体、および変異体が包含される。ここで同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、アミノ酸配列が少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。
【００１５】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１６】
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、骨代謝異常疾患、特に破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の罹患の有無若しくは罹患の程度を診断するために、また破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の改善または治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものであり、これには、例えば破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生体内での発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド（オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが含まれる）または抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内で発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００１７】
本発明は、前述するように、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が、骨代謝異常疾患患者の骨組織、特に破骨細胞の分化や活性化に関わる組織で、その破骨細胞の分化や活性化の亢進に関連して特異的に発現していることを見出したことに基づくものである。従って、これらの遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、ペプチド（オリゴペプチド及びポリペプチドが含まれる）〕は、骨代謝異常疾患、特に破骨細胞の分化や活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。また、これらの遺伝子及びその発現産物並びにそれらからの派生物（例えば、抗体など）は、上記骨代謝異常疾患の治療、並びに該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用することができる。さらに、個体または骨組織における、上記遺伝子の発現またはその発現産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現不全の検出は、骨代謝異常疾患の解明や診断に有効に利用することができる。
【００１８】
以下、これらのNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子、並びにこれらの発現産物（NFATC1またはCICC4など）やそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
【００１９】
（１）骨代謝異常疾患の疾患マーカー及びその応用
(1-1) ポリヌクレオチド
本発明の配列番号１および３に示すポリヌクレオチドは、それぞれヒト由来のNFATC1遺伝子およびマウス由来のNFATC1遺伝子としていずれも公知の遺伝子であり、それら取得方法についても、Nature 369, pp.497-502 (1994)、またはBiochem. Biophys. Res. Commun. 240, pp.314-323 (1997)に記載されるように公知である。
【００２０】
また、本発明の配列番号２および４に示すポリヌクレオチドは、それぞれヒト由来のCICC4遺伝子およびマウス由来のCICC4遺伝子として公知の遺伝子であり、その取得方法についてもGenome Res.11(3), pp.422-435 (2001)またはAm. J. Physiol. 276, F398-F408 (1999)、並びにJ. Biol. Chem. 274, pp.36488-36497 (1999)に記載されるように公知である。
【００２１】
本発明は、前述するように、破骨細胞の分化や活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患に罹患した患者の骨組織に、上記のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が特異的に発現しているという知見を発端に、これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって上記骨代謝異常疾患の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
【００２２】
上記ポリヌクレオチドは、被験者が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患に罹患しているか否かまたはその罹患の程度を診断するためのツール（疾患マーカー）として有用である。具体的には、当該ポリヌクレオチド（疾患マーカー）は、被験者の骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現の有無またはその程度（発現量）の検出に使用される。
【００２３】
また上記ポリヌクレチドは、後述の(3-1)項に記載するような破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００２４】
本発明の疾患マーカーは、配列番号１若しくは３に記載のNFATC1遺伝子の塩基配列または配列番号２若しくは４に記載のCICC4遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列をもつポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
【００２５】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号１、２、３または４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件（ハイブリダイズ後の洗浄条件）として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件（ハイブリダイズ後の洗浄条件）として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００２６】
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号１、２、３または４に記載の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００２７】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及びその相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００２８】
本発明の骨代謝異常疾患の疾患マーカーは、具体的にはNFATC1遺伝子の塩基配列に関する配列番号１若しくは３、またはCICC4遺伝子の塩基配列に関する配列番号２若しくは４に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号１若しくは３で示されるNFATC1遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド（例えば、cDNA等のDNAやRNA等が例示される。）、または配列番号２若しくは４で示されるCICC4遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。このような部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２９】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、NFATC1遺伝子、CICC4遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法においてはNFATC1遺伝子、CICC4遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００３０】
そのような本発明の疾患マーカーは、配列番号１若しくは３で示されるNFATC1遺伝子、または配列番号２若しくは４で示されるCICC4遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK HYPERLINK "http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi" http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi、http: // www. genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。
【００３１】
具体的にはNFATC1遺伝子の塩基配列またはCICC4遺伝子の塩基配列をprimer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００３２】
本発明で用いる疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００３３】
本発明において骨代謝異常疾患の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に破骨細胞の分化に関わる骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の少なくとも１方の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の疾患マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチド、例えば該ＲＮＡをもとにしたRT-PCR法において生成されるＤＮＡ等の各種のポリペプチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００３４】
上記疾患マーカーを骨代謝異常疾患の検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
【００３５】
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができ、これによって破骨細胞の分化・活性化の亢進に関わる骨代謝異常疾患に関連するNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。なお、測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の骨組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製されるtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００３６】
また、生体組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベルは、DNAチップを利用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該DNAチップのプローブとして使用することができる（例えば、Affymetrix社の Gene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,Eの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。かかるDNAチップを、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたは標識RNAとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズによって形成された上記プローブ（疾患マーカー）と標識DNAまたは標識RNAとの複合体を該標識DNAまたは標識RNAの標識を指標として検出することにより、生体組織中でのNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
【００３７】
本発明の疾患マーカーは、骨代謝異常疾患の診断、特に破骨細胞の分化・活性化が亢進することによって生じた骨代謝異常疾患の検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した骨代謝異常疾患の診断は、被験者の骨組織と正常者の骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の骨組織と正常者の骨組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的にはNFATC1遺伝子またはCICC 4遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患で発現誘導を示すので、被験者の骨組織で発現されており、該発現量が正常者の骨組織の発現量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多ければ、当該被験者について破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患の罹患が疑われる。
【００３８】
（1-2）抗体
また本発明は、破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連する骨代謝異常疾患の疾患マーカーとしてNFATC1遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「NFATC1」ともいう）またはCICC4遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「CICC4」ともいう）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
【００３９】
本発明は、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が、骨代謝異常疾患患者の骨組織に特異的に検出され、しかもそれらの遺伝子が破骨細胞の分化・活性化の亢進に応じて有意な発現増大挙動を示しているという知見を発端に、これらの遺伝子の発現産物（RNAまたはタンパク質）の発現の有無や発現の程度（RNAまたはタンパク質の生成量）を検出することによって上記骨代謝異常疾患の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
【００４０】
上記抗体は、被験者が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患に罹患しているか否かまたはその罹患の程度を診断するためのツール（疾患マーカー）として有用である。具体的には、当該抗体（疾患マーカー）は、被験者の骨組織におけるNFATC1またはCICC4の発現の有無またはその程度（発現量）の検出に使用される。
【００４１】
NFATC1としては配列番号１若しくは３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、CICC 4としては配列番号２若しくは４に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げることができる。なお、配列番号１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、また配列番号２に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができる。
【００４２】
なお、ここで配列番号５に示すタンパク質は、ヒト由来のNFATC1遺伝子によってコードされる公知のヒトタンパク質であり、その取得方法についてもNature 369, pp.497-502 (1994)に記載されるように公知である。また配列番号６に示すタンパク質はヒト由来のCICC4遺伝子によってコードされる公知のヒトタンパク質であり、その取得方法についてもGenome Res.11(3), pp.422-435 (2001)またはAm. J. Physiol. 276, F398-F408 (1999) に記載されるように公知である。
【００４３】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、NFATC1またはCICC4を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには当該NFATC1またはCICC4のアミノ酸配列において少なくとも連続する８アミノ酸からなるポリペプチドに対して結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００４４】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したNFATC1またはCICC4を用いて、あるいは常法に従って当該NFATC1またはCICC4の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、これらを免疫抗原として用いて、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したNFATC1またはCICC4、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを免疫抗原として、マウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００４５】
また、抗体の作製において免疫抗原として使用されるタンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１、２、３または４）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。具体的にはNFATC1またはCICC4をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらNFATC1またはCICC4は、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号５、６）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００４６】
なお、ここで免疫抗原として用いられるNFATC1またはCICC4には、配列番号５または配列番号６に示すタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号５または配列番号６で示されるタンパク質と同等の免疫学的活性を有するタンパク質を挙げることができる（当該同様の免疫学的活性を有する限り、生物学的機能の同等性は特に問わない。）。
【００４７】
なお、ここで配列番号５または配列番号６で示されるタンパク質と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつNFATC1またはCICC4に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００４８】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その免疫学的活性が保持される限り制限はない。免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がNFATC1またはCICC4の免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００４９】
また本発明の抗体は、NFATC1またはCICC4の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、NFATC1またはCICC4と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有し、NFATC1またはCICC4のアミノ酸配列において少なくとも連続する８アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
【００５０】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００５１】
なお、NFATC1に特異的に結合する抗体は既に市販されており（抗NF-ATc1抗体7A6：Santa Cruz社製など）、これらを本発明の抗体として用いることも可能である。
【００５２】
本発明の抗体はNFATC1またはCICC4に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク質（NFATC1またはCICC4）を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるNFATC1またはCICC4のタンパク発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
【００５３】
具体的には、患者の骨組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従ってタンパク質を抽出・精製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによってNFATC1またはCICC4の有無やその量を検出することができる。
【００５４】
破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患の診断に際しては、被験者の骨組織における少なくともNFATC1またはCICC4の一方と正常な骨組織における対応するこれらのタンパク質との量の違いを判定すればよい。この場合、タンパク量の違いには、タンパクのある／なし、あるいはタンパク量の違いが2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的には、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患で発現誘導を示すので、被験者の骨組織で該遺伝子の発現産物（NFATC1及び／またはCICC4）が存在しており、該タンパク質量が正常な骨組織における対応する発現産物量（タンパク質量）と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多いことが判定されれば、当該被験者について破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患の罹患が疑われる。
【００５５】
（２）骨代謝異常疾患の検出方法（診断方法）
本発明は、前述する本発明の骨代謝異常疾患の疾患マーカーを利用した骨代謝異常疾患の診断、特に破骨細胞の分化・活性化の亢進に関与した骨代謝異常疾患の診断方法を提供する。
【００５６】
具体的には、本発明の診断方法は、被験者の骨組織の一部をバイオプシなどで採取し、そこに含まれる骨代謝異常疾患に関連するNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベル、またはこれらの遺伝子に由来するタンパク質（NFATC1、CICC4）を検出し、その発現量（ＲＮＡ量）またはそのタンパク質量を測定することにより、当該被験者について骨代謝異常疾患の罹患の有無またはその程度を診断するものである。
【００５７】
本発明の診断方法は次の(a)、(b)及び(c)の工程を含む：
(a) 被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
(b) 生体試料中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベル、またはNFATC1またはCICC4のタンパク質の量を、上記疾患マーカーと指標として測定する工程、
(c) (b)の結果をもとに、被験者について破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
【００５８】
ここで用いられる生体試料としては、被験者の骨組織から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織から調製されるタンパク質を含む試料を挙げることができる。かかるRNA、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む試料は、被験者の骨組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製することができる。
【００５９】
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
【００６０】
(2-1) 測定対象物としてRNAを利用する場合
測定対象物としてRNAを利用する場合、骨代謝異常疾患の検出は、具体的に下記の工程（a）、（b）及び（c）を含む方法によって実施することができる：
（a）被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された前記RNAに相補的なポリヌクレオチドと上記本発明の疾患マーカー（NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
（b）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（c）（b）の測定結果に基づいて、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
【００６１】
測定対象物としてRNAを利用する場合、本発明の骨代謝異常疾患の検出方法（診断方法）は該RNA中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベル（例えば、これらの遺伝子に対応するRNA量）を検出し、測定することによって実施することができる。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカー（NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００６２】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現（これらの遺伝子に対応するRNA）の有無やその発現レベル（RNA量）を検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（³²P、³³Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された疾患マーカー（DNA）とRNAとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、このプロトコールに従って疾患マーカー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００６３】
RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、RNA中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現（これらの遺伝子に対応するRNA）の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子に対応する領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００６４】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B,C, D, Eを挙げることができる。かかるＤＮＡチップを用いた、被験者RNA中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定については、実施例において詳細に説明する。
【００６５】
(2-2) 測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合、本発明の骨代謝異常疾患の検出方法（診断方法）は生体試料中のNFATC1またはCICC4を検出し、その量を測定することによって実施される。具体的に下記の工程（a）、（b）及び（c）を含む方法によって実施することができる：
（a）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と抗体に関する本発明の疾患マーカー（例えば、配列番号５または６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体）とを結合させる工程、
（b）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（c）（b）の測定結果に基づいて、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
【００６６】
より具体的には、抗体に関する本発明の疾患マーカー（例えば、配列番号５または６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体）を用いてウエスタンブロット法などの公知方法で、NFATC1またはCICC4を検出、定量する方法を挙げることができる。ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、二次抗体として¹²⁵Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質などで標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (Amersham Pharmacia Biotech 社製)を用いて、該プロトコールに従って、上記一次抗体と生体試料中のNFATC1またはCICC4との結合物を検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定することもできる。
【００６７】
骨代謝異常疾患の診断は、被験者の骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベル（これらの遺伝子に対応するRNAの量）、もしくはNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現産物であるタンパク質（NFATC1またはCICC4）の量を正常な骨組織における上記に対応する遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
【００６８】
この場合、正常な骨組織から採取調製した生体試料（RNAまたはタンパク質を含む試料）が必要であるが、これらは骨代謝異常疾患に罹患していない人の骨組織をバイオプシ等で採取することによって取得することができる。なお、ここでいう「骨代謝異常疾患に罹患していない人」とは、少なくとも骨代謝異常疾患の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、例えばDXA法：Dual energy X-ray absorptiometry 法により検査の結果、骨代謝異常疾患でないと診断された人をいう。なお、当該「骨代謝異常疾患に罹患していない人」を以下、本明細書では単に正常者という場合もある。
【００６９】
被験者の骨組織と正常な骨組織（骨代謝異常疾患に罹患していない人の骨組織）との遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行なわない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な骨組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベル、若しくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（NFATC1またはCICC4）の量の平均値または統計的中間値を、正常者の当該遺伝子の遺伝子発現レベル若しくはタンパク質の量として、比較に用いることができる。
【００７０】
被験者が、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患であるかどうかの判断は、該被験者の骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベル（これらの遺伝子に対応するRNA量）、またはその発現産物であるNFATC1またはCICC4の量が、正常者のそれらと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。また、被験者の上記遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量が、いかなる正常者のそれらのレベルまたは量に比べて多ければ、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患であると判断することができる。
【００７１】
（３）候補物質のスクリーニング方法
(3-1) 遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列を有するNFATC1遺伝子または配列番号２に記載の塩基配列を有するCICC4遺伝子の発現を制御する物質（候補物質）をスクリーニングする方法を提供する。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法は次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) 被験物質とNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させた細胞のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
(c) 上記の比較結果に基づいて、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【００７３】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としてはNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現する細胞であって、かつ破骨細胞への分化が可能である、破骨細胞前駆細胞を挙げることができる。破骨細胞への分化が可能な破骨細胞前駆細胞としては、具体的には、脾臓や骨髄から取得される細胞や、マウスRAW264細胞（RIKEN Cell Bank; HYPERLINK HYPERLINK "http://www.rtc.riken.go.jp/CELL/HTML/RIKEN" http://www.rtc.riken.go.jp/CELL/HTML/RIKEN、http://www.rtc.riken.go.Jp/CELL /HTML/RIKEN Cell Bank. Htmlから入手可能）などを挙げることができる。なお、マウスRAW264細胞は、分化誘導物質であるODF（osteoclast differentiation factor）の添加で破骨細胞に分化することが知られている細胞である（Biochem.Biophys.Res. Commun. 282, 278-283 (2001)）。好ましくはRAW264細胞である。当該細胞は、後述する実施例に示すように、ODFの添加によって破骨細胞に分化し、その過程でNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が発現誘導されることが確認されている。
【００７４】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００７５】
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００７６】
実施例に示すように、骨粗鬆症といった骨代謝異常疾患に罹患した患者の骨組織には、特異的に、破骨細胞の分化・活性化の亢進が見られるとともにNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が発現している。この知見から、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現は、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と関連していると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現またはその発現誘導が、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患と関連していることを利用したものである。よって、該骨代謝異常疾患の緩和／抑制作用を有する（骨代謝異常疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、上記NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベルの減少、あるいは発現誘導の抑制が指標とされる。
【００７７】
すなわち、本発明のスクリーニング方法はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑制する物質を探索することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【００７８】
候補物質の選別は、具体的には下記にようにして行うことができる。すなわち、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が発現している細胞を用いる場合は、被験物質を添加した細胞におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベルが被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなること、またNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質（例えば、RAW264細胞の場合はODF）によって誘導される発現が被験物質の存在によって抑制されること、すなわち発現誘導物質存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることをもって、当該被験物質を候補物質として選択することができる。
【００７９】
より具体的には、例えばRAW264細胞を用いて破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質をスクリーニングするには、ODFを添加したRAW264細胞（対照細胞）と、ODFと被験物質とを同時に加えたRAW264細胞とでNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベルを比較し、その発現レベルの減少を指標として、被験物質の中から候補物質を選別することができる。また、ODFを添加して、既にNFATC１遺伝子またはCICC4遺伝子が発現誘導された状態のRAW264細胞に被験物質を添加し、被験物質を添加しない対照のRAW264細胞と、そのNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベルを比較して、その発現レベルの低下を指標として、被験物質の中から候補物質を選別することもできる。
【００８０】
このような本発明のスクリーニング方法における遺伝子発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したRNAまたは該RNAから転写された当該RNAに対して相補的なポリヌクレチドと本発明の疾患マーカーとを用いて、前記(2-1)項に記述したように、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法の他、DNAチップなどを利用して実施できる。指標とする遺伝子発現の低下（減少）の程度は、被験物質を添加した細胞におけるNFATC1遺伝子またはCICC4 遺伝子の発現が、被験物質を添加しない対照細胞での上記に対応する遺伝子の発現量と比較して10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上の低下（減少）を例示することができ、この場合に当該被験物質を候補物質として選択することができる。
【００８１】
またNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実施することもできる。本発明のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現制御物質のスクリーニング方法及び本発明の骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含され、この意味において請求項７及び８に記載する「NFATC1遺伝子」の概念には、NFATC1遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれ、また「CICC4遺伝子」の概念には、CICC4遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【００８２】
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子もまた使用することができる。ここでNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１kb、好ましくは約2kbを用いることができる。融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【００８３】
以上のスクリーニング方法により、被験物質から選別される物質（候補物質）はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現抑制剤として位置づけることができる。これらの物質は、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑制することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進を抑制し得ると考えられる。よって、これらの物質は、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【００８４】
(3-2) タンパク質の機能を指標とするスクリーニング方法
本発明は、NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a)被験物質と NFATC1またはCICC4を含む細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のNFATC1またはCICC4由来の機能または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分の上記に対応するタンパク質の機能または活性と比較する工程、
(c) (b) の比較結果に基づいてNFATC1またはCICC4由来の機能または活性を抑制する被験物質を選択する工程。
【００８５】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、内在性及び外来性などの由来に関わらず、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現しており、NFATC1またはCICC4を有する細胞を挙げることができる。具体的には、例えば前記（3-1）に記述したようなマウスRAW264細胞などを挙げることができる。また細胞画分とは、かかる細胞に由来する各種の画分を意味するものであり、例えば細胞膜画分、細胞質画分、および細胞核画分などを挙げることができる。
【００８６】
実施例に示すように、骨代謝異常疾患の一種である骨粗鬆症に罹患した患者の骨組織には、特異的に破骨細胞の分化・活性化の亢進が見られるとともに、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が発現している。この知見から、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子によりコードされるタンパク質の機能（活性）が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と関連していると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子によりコードされるタンパク質が、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患と関連していることを利用したものである。よって、該骨代謝異常疾患の緩和／抑制作用を有する（骨代謝異常疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、上記NFATC1またはCICC4の少なくとも１方のタンパク質の機能または活性の低下もしくは抑制が指標とされる。
【００８７】
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物質を探索することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【００８８】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸、ペプチド、蛋白質（NFATC1またはCICC4に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記細胞または細胞画分と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００８９】
ところで、NFATC1は転写因子であり、Interleukin-2遺伝子の発現に関与することが知られている（Mol. Cell. Biol. 19, 2300-2307 (1999)）。詳細には、NFATC1は、カルシニューリンにより脱リン酸化されて核内に移行した後、転写因子として機能してInterleukin-2遺伝子等の発現を増加させることが知られている（J. Biol. Chem. 276, 20805-20808 (2001)、Oncogene 20, 2476-2489 (2001)）。従って、この公知の性質に基づいて、NFATC1の機能または活性を抑制する候補物質のスクリーニングは、Interleukin-2遺伝子の発現量の減少を指標にして行うこともできる。この場合は、上記細胞として、NFATC1を有し、且つInterleukin-2遺伝子を発現可能な細胞を用いることができる。
【００９０】
この場合、Interleukin-2遺伝子の発現量を直接の指標としてもよいし、前述するようにマーカー遺伝子に由来するタンパク質の活性を指標としてスクリーニングを行ってもよい。後者の場合、具体的には、NFATC1を有し且つInterleukin-2遺伝子を発現可能な細胞として、例えばNFATC1がInterleukin-2遺伝子を発現制御するために必要な遺伝子配列を含むInterleukin-2遺伝子の発現制御領域と、ルシフェラーゼなどのマーカー遺伝子とをつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、Interleukin-2遺伝子の発現量をマーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによって間接的に検出し、定量する方法を挙げることができる。
【００９１】
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には上記ルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダ−ゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子もまた使用することができる。同様なスクリーニング方法は公知であり(Biochem. Cell. Biol. 74, 585-593 (1996), Biologicals 26, 1-5 (1998)) 、これに準じて行うことができる。候補物質の選抜は、具体的には被験物質を添加した細胞におけるマーカー遺伝子由来のタンパク質の活性が、被験物質を添加しない対照細胞の上記に対応するタンパク質の活性レベルに比して、低くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選択するすることができる。
【００９２】
またCICC4は塩化物イオンチャンネルであることが知られている（Am. J. Physiol. 276, F398-F408 (1999), J. Biol. Chem. 272, 12575-12582 (1997) ）。従ってこの公知の性質に基づいて、CICC4の機能を抑制する候補物質のスクリーニングは、CICC4を有する細胞またはその細胞画分における塩化物イオンの膜透過活性を指標に行うことができる。
【００９３】
例えば、常法の遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, T. Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS(1985)）を用いて作成した、CICC4遺伝子を発現する形質転換培養細胞またはその細胞膜画分を用いてパッチクランプ法により、該細胞またはその細胞画分についてCICC4の塩化物イオンの膜透過活性を調べることができる。同様な測定法はCICC４と同種の塩化物イオンチャンネルタンパク質で公知であり(J. Biol. Chem. 272, 12575-12582 (1997)) 、これに準じて測定することができる。候補物質の選抜は、具体的には被験物質を添加した細胞またはその細胞画分における塩化物イオンの膜透過活性が、被験物質を添加しない対照細胞またはその細胞画分の該膜透過活性レベルに比して、低くなることをもって、当該被験物質を候補物質として選択することができる。
【００９４】
斯くして被験物質の中ら選抜取得される物質は、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【００９５】
上記(3-1)または(3-2)に記載する本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに骨代謝異常疾患モデル動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに骨代謝異常疾患患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な骨代謝異常疾患改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【００９６】
（４）骨代謝異常疾患の改善・治療剤
本発明は、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の改善・治療剤を提供するものである。
【００９７】
本発明はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と関連しているという新たな知見からNFATC1遺伝子（配列番号１もしくは３）またはCICC4遺伝子（配列番号２もしくは４）の発現を抑制する物質、あるいは、CICC4（配列番号５）またはNFATC1（配列番号６）の機能または活性を抑制する物質が、上記疾患の改善または治療に有効であるという考えに基づくものである。すなわち、本発明の骨代謝異常疾患の改善・治療剤はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑制する物質、あるいはNFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物質を有効成分とするものである。
【００９８】
当該有効成分となるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現抑制物質、あるいはNFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って工業的に製造されたものであってもよい。
【００９９】
NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現抑制物質、あるいはNFATC1またはCICC4の機能（活性）抑制物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数百ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
【０１００】
また、上記の物質がDNAによりコードされるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。さらに、上記有効成分がNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合は、そのまま若しくは遺伝子治療用ベクターにこれを組み込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１０１】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
参考例１マウスODFタンパク質の作成
破骨細胞分化に必要な分化誘導タンパク質であるODF [osteoclast differentiation factor](ODFはRANKLともいう。Bone 27, 761-764 (2000))を下記のようにして作成した。
【０１０２】
ODF遺伝子を有するマウスストローマ細胞ST2からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したRNA 3μgから作成したｃDNA １μgを鋳型として、配列番号７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配列番号８に示す配列を有するオリゴヌクレオチドをアンチオセンスプライマーとしてPCR法を行って、ODF（osteoclast differentiation factor)遺伝子を増幅した。なお、PCR法はPfx DNA polymerase（GIBCO-BRL社製）を用い、付属のプロトコールに従って50μｌの系で94℃15秒、52℃30秒、および68℃1分のサイクルを5サイクル行った後、94℃15秒、56℃30秒、68℃1分のサイクルを15サイクル行うことによって実施した。かかるPCR法で増幅させて得られたODF遺伝子を制限酵素MnuIで切断し、pGEX-2TKベクター（Amersham Pharmacia Biotech社製）のGST（glutathione S-transferase）のコード領域の下流に位置するEcoRI部位に挿入して、GST／ODF融合タンパク質発現プラスミドを作製した。
【０１０３】
次いで得られたGST／ODF融合タンパク質発現プラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、該形質転換体をアンピシリン（終濃度50ng/ml）を含む培地で7時間前培養した。得られた形質転換体をさらにアンピシリンを同様に含む250mlのLB培地でOD₅₅₀が0.6になるまで37℃で培養した。その後、終濃度が0.25mMになるようにIPTG（isopropyl-1-thio-β-D-galactoside）を加えて、18℃で12時間培養した。培養後、6000rpmで10分間遠心して菌体を回収し、これを20mlのNETN（20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% NP-40）に懸濁して、4℃でソニケーターを用いて破砕した（power max, 20秒で4回）。これを9000rpm、30分の条件で2回遠心して上清を回収し、これを大腸菌破砕液とした。この大腸菌破砕液に250μlのグルタチオンセファロースビーズを加え、4℃で2時間以上反応させた。その後、遠心してビーズのみを回収し、NETNで3回、及びElution buffer（20mM NaCl, 4mM MgCl₂, 1mM 2-メルカプトエタノール, 20mM HEPES/NaOH pH7.4）で洗浄し、これにグルタチオン溶液（100mM グルタチオン還元型, 100mM Tris-HClpH8.0, 1M NaCl）250μlを加えて、4℃で2時間以上反応させ、ビーズから組換え体タンパク（GST／ODF融合タンパク質）を溶出させた。次いで、得られたGST／ODF融合タンパク質をSDS-PAGEにより精製し、フィルター滅菌して、破骨細胞分化誘導タンパク質として下記の実験に用いた。
【０１０４】
また、コントロール品として、ODF遺伝子を組み込まないｐGEX-2TKベクターについても上記と同様の操作を行い、GSTタンパク質を得た。
【０１０５】
実施例１ ODF添加によるマウスRAW264細胞の破骨細胞分化
参考例１で調製したODFタンパク質（GST／ODF融合タンパク質）を用いて、破骨細胞の前駆細胞の性質を有するマウスRAW264細胞（Leukemic monocyte由来のマクロファージ様細胞）を、破骨細胞に分化させた。
【０１０６】
具体的には、マウスRAW264細胞は、使用するまえに、予めE-MEM培地（ウシ胎児血清10％、ペニシリン50U/mLを含む）で、37℃、CO₂濃度5％の条件下で培養しておき、このRAW264細胞を一晩培養した翌日、参考例１で調製したODFタンパク質（GST/ODF融合タンパク質）またはGSTタンパク質（コントロールタンパク質）を含む培地と交換し、同条件でさらに4日間培養した。その破骨細胞への分化状況はTRAP染色（tartrate resistantacid phosphatase 染色）を行うことによって調べた。ODFタンパク質（GST/ODF融合タンパク質）を添加したRAW264細胞は、TRAP染色から72時間後には、TRAP陽性の多核細胞が見え始め、96時間後には大多数の細胞が破骨細胞様多核細胞に分化しているのが観察された。それに対して、上記ODFタンパク質（GST/ODF融合タンパク質）に代えてGSTタンパク質をRAW264細胞に加えた場合には、破骨細胞への分化は見られなかった。このことから、RAW264細胞は参考例１で調製したGST/ODF融合タンパク質中のODFタンパク質の機能（分化誘導能）に基づいて破骨細胞に分化されることが確認された。
【０１０７】
実施例２破骨細胞分化過程でのRAW264細胞からのtotal RNAの調製
実施例１で破骨細胞への分化が見られたGST/ODF融合タンパク質添加系RAW264細胞（以下、本明細書において「ODFタンパク質処理RAW264細胞」ともいう。）についてtotal RNAを調製した。具体的には実施例１と同様にしてGST/ODF融合タンパク質を添加した後、培養2, 5, 12, 24, 48, 72,及び96時間経過後のRAW264細胞からそれぞれtotal RNAを調製した。なお、total RNAの調製は、培養上清を除去した細胞を氷冷したPBS（phosphate-buffered saline）で3回洗浄した後、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて付属のプロトコールに従って行った。得られたtotal RNAはTE溶液（10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA）に溶解した。
【０１０８】
同様にして、比較対照のため何も添加しないで培養したRAW264細胞（以下、本明細書において「未処理RAW264細胞」ともいう。）からtotal RNAを調製し、また、GST/ODF融合タンパク質に代えてGSTタンパク質を添加したRAW264細胞（以下、本明細書において「GSTタンパク質処理RAW264細胞」ともいう。）についても、GSTタンパク質を加えた後、培養2, 5, 12, 24, 48, 72, 96時間経過後に同様にしてtotal RNAを調製した。
【０１０９】
実施例３ DNAチップ解析
実施例２で調製したtotal RNAを用いてDNAチップ解析を行った。なお、DNAチップ解析はAffymetrix社Gene Chip Murine Genome U74Aを用いて行った。具体的には、解析は、(1) total RNAからcDNAの調製、(2) 該cDNAからラベル化cRNAの調製、(3) ラベル化cRNAのフラグメント化、(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ、(5) プローブアレイの染色、(6) プローブアレイのスキャン、及び(7) 遺伝子発現解析、の手順で行った。
【０１１０】
(1) total RNAからcDNAの調製
実施例２で得られた各total RNA 10μgとT7-(dT)24プライマー(Amersham社製)100pmolを含む11μLの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μL、該キットに含まれる0.1M DTT （dithiothreitol）2μL、該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加し、42℃で2分間加熱した。更に、該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、42℃で1時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、DEPC処理水（ナカライテスク社製）滅菌蒸留水91μL、該キットに含まれる5×Second Strand Reaction Buffer 30μL、10mM dNTP Mix 3μL、該キットに含まれるE. coli DNA Ligase 1μL(10U)、該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μL(40U)、該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μL(2U)を添加し、16℃で2時間反応させた。次いで、該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、16℃で5分間反応させた後、0.5M EDTA 10μLを添加した。次いで、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μLを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、室温で14,000rpm、2分間遠心分離した後、145μLの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μL、エタノール362.5μLを加えて混合した後、4℃で14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したcDNAを含むペレットを得た。その後、該ペレットに80%エタノール0.5mLを添加し、4℃で14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、DEPC処理水12μLに溶解した。以上の操作から実施例２で調製した各total RNAから、各cDNAを取得した。
【０１１１】
(2) cDNAからラベル化cRNAの調製
各cDNA溶液5μLに、DEPC処理水17μL、BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit(ENZO社製)に含まれる10×HY Reaction Buffer 4μL、該キットに含まれる10×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μL、該キットに含まれる10×DTT 4μL、該キットに含まれる10×RNase Inhibitor Mix 4μL、該キットに含まれる20×T7 RNA Polymerase 2μLを混合し、37℃で5時間反応させて、ラベル化cRNAを調製した。反応後、該反応液にDEPC処理水60μLを加えたのち、RNeasy Mini Kit（GIAGEN社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化cRNAを精製した。
【０１１２】
(3) ラベル化cRNAのフラグメント化
各ラベル化cRNA 20μgを含む溶液に、5×Fragmentation Buffer（200mMトリス−酢酸 pH8.1(Sigma社製)、 500mM酢酸カリウム(Sigma社製)、150mM酢酸マグネシウム(Sigma社製)）8μLを加えた反応液40μLを、94℃で35分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化cRNAをフラグメント化した。
【０１１３】
(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化cRNA 40μLに、5nM Control Oligo B2（Amersham社製）4μL、100×Control cRNA Cocktail 4μL、Herring sperm DNA（Promega社製）40μg、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）200μg、2×MES Hybridization Buffer(200mM MES、2M [Na⁺], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7) 200μL、及びDEPC処理水144μLを混合し、400μLのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを99℃で5分間加熱し、更に45℃で5分間加熱した。加熱後、室温で14,000rpm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
【０１１４】
一方、1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたMurine genome U74Aプローブアレイ（Affymetrix社製）を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpmで10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清200μLを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpmで16時間回転させ、フラグメント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
【０１１５】
(5) プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Non-Stringent Wash Buffer(6×SSPE(20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈)、0.01%Tween20、0.005%Antifoam0-30(Sigma社製))で満たした。次にNon-Stringent Wash BufferおよびStringent Wash Buffer(100mM MES、0.1M NaCl、0.01%Tween20)をセットしたGeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置にフラグメント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールEuKGE-WS2に従って、１次染色液(10μg/mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(MolecμLar Probe社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl(Ambion社製)、0.05%Tween20、0.005%Antifoam0-30)、 2次染色液（100μg/mL Goat IgG (Sigma社製)、3μg/mL Biotinylated Anti-Streptavidin antibody (Vector Laboratories社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.05%Tween20、0.005%Antifoam0-30）により染色した。
【０１１６】
(6) プローブアレイのスキャン、及び (7) 遺伝子発現解析
染色した各プローブアレイをHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにGeneChip Workstation System(Affymetrix社製)によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってNormalization、遺伝子発現の比較解析を行った。
【０１１７】
実施例４ RAW264細胞を用いたin vitro破骨細胞分化系での遺伝子発現の変動解析
GST/ODF融合タンパク質を添加した後、培養2, 5, 12, 24, 48, 72, 及び96時間経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量（average difference）を、未処理RAW264細胞における発現量と、GeneChip Workstation System(Affymetrix社製)にある解析ツールComparison Analysisを用いて比較した。Comparison Analysisは解析プロトコールに基づいて行った。
【０１１８】
次に、GST/ODF融合タンパク質を添加した後、培養2, 5, 12, 24, 48, 72, 96時間経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量（average difference）と、GSTタンパク質を添加した後、培養2, 5, 12, 24, 48, 72, 及び96時間経過後の各RAW264細胞での遺伝子発現量（average difference）とを、経過時間ごとにComparison Analysisを同様に行って比較した。
【０１１９】
これらの比較解析の結果から得られた、遺伝子発現の増減の判定（Diff Call）および発現変動倍率（Fold Change）の値から、発現変動遺伝子を選抜した。選抜方法は、各培養時間において、GSTタンパク質処理RAW264細胞での遺伝子発現量（average difference）が、未処理RAW264細胞での遺伝子発現量、及びGSTタンパク質処理RAW264細胞での遺伝子発現量と比較して、両方とも2倍以上の発現変動（Diff CallがIあるいはDの判定、かつFold Changeが-2以下あるいは2以上）を示したプローブを選抜した。同様の解析をすべての培養時間における細胞について行って、全ての培養時間において2倍以上の発現変動を示したプローブを選抜した。
【０１２０】
実施例５ヒト骨粗鬆症患者の骨とヒト正常骨での遺伝子発現の変動解析
ヒト骨粗鬆症患者の骨組織１サンプルとヒトの正常な骨組織３サンプルからtotal RNAを調製し、得られたtotal RNAを用いてDNAチップ解析を行った。DNAチップ解析はAffymetrix社Gene Chip Human Genome U95A,B,C,D,Eを用いて、実施例３と同様な方法で行った。また実施例３及び４と同様に、遺伝子発現の比較解析から正常骨組織に比べ、骨粗鬆症患者の骨組織で3倍以上の発現増を示したプローブを選抜した。選抜プローブの中には、表１に示すように、TRAP5、CathepsinKなど破骨細胞特異的な発現遺伝子が含まれており、上記の選抜方法で確かに破骨細胞特異的な発現遺伝子が得られていることが確認された。
【０１２１】
【表１】

【０１２２】
なお、表中、発現増倍率とは、正常骨組織における遺伝子発現量を１とした場合の骨粗鬆症患者の骨組織で遺伝子発現量を示すものである。
【０１２３】
選抜した該プローブの中から、さらに骨粗鬆症患者の骨組織でのみ発現しているプローブを選抜した。具体的には、DNAチップ解析結果から得られるAbs Callを指標にして、骨粗鬆症患者の骨組織でのAbs CallがPresentのプローブで、かつ、正常骨組織でのAbs CallがすべてAbsentのプローブを選抜した。
【０１２４】
実施例６ in vitro破骨細胞分化での発現誘導と骨粗鬆症患者の骨での発現増をともに示した遺伝子
実施例４においてRAW264細胞を用いたin vitro破骨細胞分化系で発現誘導を示したマウス遺伝子と、実施例５において骨粗鬆症患者の骨と正常骨での遺伝子発現の比較で骨粗鬆症患者の骨で特異的な発現していたヒト遺伝子とから、共通の遺伝子を選抜した。これらのマウス遺伝子とヒト遺伝子との対応付けは、遺伝子名、タンパク質名をもとに、あるいはHomologene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）を用いて行った。その結果、NFATC1遺伝子およびCICC4遺伝子が選抜された（表２、表３、表４）。
【０１２５】
【表２】

【０１２６】
Murine Genome U74A Chipを用いたaverage difference 値の発現変動の経時変化を示す。GST/ODFはGST/ODF融合タンパク質添加したRAW264細胞、GSTはGSTタンパク質を添加したRAW264細胞をそれぞれ示し、各細胞の培養時間の経過によるNFATC1遺伝子の発現変動を示す。なお、0時間は未処理RAW264細胞でのaverage difference値である。NFATC1遺伝子のMurine Genome U74A Chipにおけるプローブ名は102209#atである。
【０１２７】
【表３】

【０１２８】
Murine Genome U74A Chipを用いたaverage difference 値の発現変動の経時変化を示した。CICC4遺伝子のMurine Genome U74A Chipにおけるプローブ名は94255#g#atである。
【０１２９】
【表４】

【０１３０】
表中、発現増倍率は、Human Genome U95 Chipで解析した正常骨組織の遺伝子発現量に１とした場合における骨粗鬆症患者の骨組織での遺伝子発現量を示す。
【０１３１】
表４の結果からわかるように、これら２つの遺伝子は、正常な骨組織では発現しておらず、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連のある骨代謝異常疾患で発現が増大しているため、該骨代謝異常疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。また、これらの遺伝子を用いることによって破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連のある骨代謝異常疾患を緩和、抑制する治療薬の候補薬をスクリーニングすることが可能である。
【０１３２】
実施例７破骨細胞分化とNFATC1遺伝子発現の相関
24穴プレートに2.5 ×10⁴、5 ×10⁴、1 ×10⁵、2 ×10⁵個のRAW264細胞をそれぞれ播き、GST/ODF融合タンパク質添加96時間後に分化した破骨細胞（TRAP positive MN cells：TRAP染色で染色された多核細胞）数を顕微鏡観察下で計数した。TRAP染色は細胞をPBSで3回洗浄後、メタノール処理30秒で固定し、酒石酸耐性酸ホススファターゼ（TRAP）の基質（Naphthol AS-MX phosohate）と色素（Fastredviolet LB salt）を含む溶液を加え、37℃で30分から2時間インキュベートして行い（Takahasi N. et al., Endcrinology, 122, p1373-p1382(1988)）、赤く染色された細胞をTRAP positive MN cells（破骨細胞）と判定した。プレート内の一定面積内で破骨細胞数を計数した結果を図１aに示す。図１aには2.5 ×10⁴個の場合での破骨細胞数（100％）に対する割合(%)として表す。結果は3回の平均値である。図１aに示すように、2.5 ×10⁴細胞（低密度培養条件：およそ細胞密度1.3×10⁴細胞／cm²以下）時には、約2500個の破骨細胞が見られた。しかし、5×10⁴細胞時では破骨細胞数は上記の10％程度まで減少し、さらに10×10⁴細胞（高密度培養条件：およそ5×10⁴細胞／cm²以上）時では5％以下まで減少した。
【０１３３】
図１bは、GST/ODF融合タンパク質添加96時間後のRAW264細胞の形態を示す。左は低密度培養条件（2.5×10⁴個のRAW264細胞を播いた際）のRAW264細胞で、巨大な破骨細胞がみられた。右は高密度培養条件（20×10⁴個RAW264細胞を播いた際）のRAW264細胞である。このことから、RAW264細胞を高密度培養した際にはGST/ODF融合タンパク質を添加しても破骨細胞分化が阻害されることがわかった。
【０１３４】
破骨細胞分化とNFATC1遺伝子の発現増加の相関を確認するために、高密度培養したRAW264細胞、及び低密度培養したRAW264細胞のそれぞれに、GST/ODF融合タンパク質を添加して2, 5, 12および24時間経過後のRAW264細胞からtotal RNAをそれぞれ調製し、実施例3と同様にAffymetrix社Gene Chip Murine Genome U74Aを用いてDNAチップ解析を行った。高密度培養時及び低密度培養時における各「ODFタンパク質処理RAW264細胞」の遺伝子発現を比較するために、培養2, 5, 12及び24時間経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量（average difference）を、GeneChip Workstation System(Affymetrix社製)を用いて解析した。表５に、Affymetrix社Gene Chip Murine Genome U74Aを用いたGST/ODF融合タンパク質添加後のNFATC1遺伝子の発現量（average difference）の経時変化を示す。表中、「低密度培養」は破骨細胞分化条件下、「高密度培養」は破骨細胞分化阻害条件下を表す。なお、0時間の値は未処理RAW264細胞でのaverage differenceである。NFATC1遺伝子のMurine Genome U74A Chipにおけるプローブ名は102209#atである。
【０１３５】
【表５】

【０１３６】
表５に示すように、ODFタンパク質処理RAW264細胞でGST/ODF融合タンパク質添加２〜５時間後に顕著な発現増加を示したNFATC１遺伝子は、高密度培養時のRAW264細胞では発現増加が見られなかった。破骨細胞分化とNFATC1遺伝子の発現増加に相関が認められ、NFATC1遺伝子が破骨細胞分化に重要であることが確認された。
【０１３７】
実施例８破骨細胞分化過程でのNFATC1タンパク質の変動
ODFタンパク質処理RAW264細胞の破骨細胞分化過程におけるNFATC1（タンパク質）の変動を調べた。未処理RAW264細胞とGST/ODF融合タンパク質添加24, 48, 72および96時間後のRAW264細胞からそれぞれタンパク質画分を調製し、抗NF-ATc1抗体7A6（Santa Cruz社製）、抗β-actin抗体AC-74（Sigma社製）を用いて、ウエスタンブロット解析を行った。各レーン3μgのタンパク質画分を用い、ウエスタンブロット解析はBiochem. Biophys. Res. Commun. 282, 278-283 (2001)に記載の方法と同様な方法で行った。図２ａに示すように、未処理RAW264細胞ではNFATC1（タンパク質）はほとんど見られなかったが、GST/ODF融合タンパク質を添加してから24時間後にはNFATC1（タンパク質）の顕著な増加が認められた。なお、図中、0時間は未処理RAW264細胞の結果を指す。
【０１３８】
また、高密度培養条件下RAW264細胞でのNFATC1（タンパク質）の発現を調べた。10 cm培養ディッシュに5 ×10⁵細胞（低密度培養条件）、10×10⁵細胞、20×10⁵細胞、40×10⁵細胞（高密度培養条件）のRAW264細胞をそれぞれ播き、GST/ODF融合タンパク質を添加してから24時間後のRAW264細胞からタンパク質を調製し、うち各5μgのタンパク質画分を用いて上記と同様にウエスタンブロット解析を行った。図２bに示すように、破骨細胞への分化が阻害される高密度培養時にはNFATC1（タンパク質）は検出されず、破骨細胞分化とNFATC1タンパク質の出現に相関がある結果が得られた。
【０１３９】
実施例９破骨細胞分化へのサイクロスポリンの影響
NFATC1（タンパク質）はカルシニューリンにより脱リン酸化されて核に移行し、転写因子として機能する（J. Biol. Chem. 276, 20805-20808 (2001), Oncogene 20, 2476-2489 (2001)）。一方、サイクロスポリンAはサイクロフィリンタンパク質と結合してカルシニューリンの脱リン酸化反応を阻害し、NFATC1（タンパク質）の核移行を妨げる（Cell 66, 807-815 (1991), J. Biol. Chem. 271, 10884-10891 (1996), Nature 382, 370-373 (1996), Nature 383, 837-840 (1996)）。サイクロスポリンA（CsA：Sigma社製）を終濃度0, 10, 100, 1000 ng/ml となるようにGST/ODF融合タンパク質と同時にRAW264細胞に添加し、96時間後に分化した破骨細胞（TRAP positive MN cells）数を実施例７と同様な方法で計数した。結果を図３に示す。図３ではControl (CsA：0 ng/ml)の場合での破骨細胞数（100％）に対する割合（％）で表した。結果は3回の平均値である。サイクロスポリンAをODFタンパク質処理RAW264細胞に加えたところ、破骨細胞分化はサイクロスポリンの濃度依存的に阻害され、サイクロスポリンAを1000 ng/ml添加した際には破骨細胞がほとんど検出されなかった。
【０１４０】
サイクロスポリンA（CsA）を終濃度0, 10, 100, 1000 ng/ml となるようにGST/ODF融合タンパク質と同時にRAW264細胞に添加し、72時間後に各細胞から調製した総タンパク質画分、核画分、細胞質画分を用いて、NFATC1（タンパク質）の細胞内局在を調べた。核画分、細胞質画分の分画は「Cells: a laboratory manual」DL. Spector, RD. Goldman, LA. Leinwand, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)に記載の方法に準じて行った。ウエスタンブロット解析は、サイクロスポリン処理条件毎に等量の細胞から調製した総タンパク質画分、核画分および細胞質画分を用いて抗NF-ATc1抗体7A6（Santa Cruz社製）、抗β-actin抗体AC-74（Sigma社製）、抗Rb抗体G3-245（PharMingen社製）を用いて行った。結果を図４に示す。図からわかるように、サイクロスポリンAを添加しないRAW264細胞ではNFATC1（タンパク質）は核画分において多く検出された。しかし、サイクロスポリンAを1000 ng/ml添加した際には、NFATC1（タンパク質）は細胞質画分に多く、核画分では少量しか検出されなかった（図４）。
【０１４１】
実施例１０ NFATC1遺伝子の発現抑制による破骨細胞分化への影響
まずNFATC1遺伝子の発現抑制に用いるプラスミドを以下のように作製した。ODFタンパク質処理RAW264細胞から調製したRNAからcDNAを合成し、配列番号９および配列番号１０に記載のプライマーを用いてPCR法によりNFATC1 遺伝子のDNA断片を得た。このDNA断片をpGEM-Tベクター（Promega社製）にクローニングした後、制限酵素Not IとSma IでNFATC1遺伝子の5’末端側を含む231塩基を切り出し、pTRE2ベクター（Clontech社製）のTRE／minCMVプロモーター下流の制限酵素部位Not IとPvu II間に逆向きに挿入した。こうしてテトラサイクリンやドキシサイクリンに依存してNFATC1アンチセンスRNAを生成可能なプラスミドpNFATC1-ASを作製した。
【０１４２】
NFATC1アンチセンスを発現する細胞は、プラスミドpNFATC1-ASをRT3細胞（あらかじめpTet-Onプラスミド（Clontech社製）を導入したRAW264細胞）へと導入し、ネオマシンおよびハイグロマイシン耐性な細胞を選抜することで調製した。なお、当該NFATC1アンチセンスを発現する細胞（RT3／NFATC1-AS細胞）の作製、選抜にはTet-On^TM gene expression system（Clontech社製）を用い、添付ユーザーマニュアルや「Molecular Cloning, a laboratory manual 3^rd edition」J. Sambrook, DW. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) に準じて行った。
【０１４３】
GST/ODF融合タンパク質添加72時間後の20μM ドキシサイクリン（図中DOXで示す）添加（DOX＋）、あるいは無添加（DOX-）条件下でのRAW264細胞、RT3細胞(pTet-Onプラスミドのみを導入したRT3細胞)およびRT3／NFATC1-AS細胞からタンパク質画分を調製し、抗NF-ATc1抗体7A6（Santa Cruz社製）、抗β-actin抗体AC-74（Sigma社製）を用いてウエスタンブロット解析を行った。抗NF-ATc1抗体を用いたウエスタンブロット解析では各10μgのタンパク質画分を用いた。抗β-actin抗体を用いたウエスタンブロット解析では各5.7μgのタンパク質画分を用いた。RT3／NFATC1-AS細胞ではNFATC1（タンパク質）の減少が見られ、NFATC1の発現抑制が確認された（図５a）。
【０１４４】
上記と同条件下でRAW264細胞、RT3細胞およびRT3／NFATC1-AS細胞から分化した破骨細胞（TRAP positive MN cells）数を実施例７と同様な方法で計数した。結果を図５bに示す。当該図は、ドキシサイクリン無添加（DOX-）における形質転換していないRAW264細胞での破骨細胞数（100％）に対する割合（％）を示す。結果は3回の平均値である。GST/ODF融合タンパク質添加により分化した破骨細胞数は、pTet-Onプラスミドのみを導入したRT3細胞では、形質転換をしていないRAW264細胞と同程度見られたが、RT3／NFATC1-AS細胞では破骨細胞数は有意に減少した。
【０１４５】
以上説明するように、上記の実施例９から、サイクロスポリンAを用いてNFATC1の核移行を阻止してNFATC1の働きを阻害することによって、破骨細胞の分化が抑制されることが示された（なお、NFATC1は核に移行しないとその機能を発揮しない。）。また上記の実施例１０から、NFATC1遺伝子のアンチセンスヌクレオチドによりNFATC1の発現を抑制することによって、破骨細胞の分化が抑制されることが示された。これらの結果は、NFATC1の機能または活性を抑制することによって、またはNFATC1遺伝子の発現を抑制することによって、破骨細胞の分化を抑制することができることを実証するものである。すなわち、上記の実施例９及び１０の結果から、NFATC1遺伝子の発現を抑制することによって、またはNFATC1の機能または活性を抑制することによって、破骨細胞の分化亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患を改善または治療することができると考えられる。
【０１４６】
実施例１１ NFATC1遺伝子および／またはCICC４遺伝子発現抑制剤のスクリーニング
マウスRAW264細胞を実施例１と同じ条件で培養する。計数したRAW264細胞を5x10³/cm²でプレートに播種し、37℃、CO₂濃度5%で一夜培養する。翌日、参考例１記載のODFタンパク質を終濃度100ng/ml含む培地と交換し、それぞれ100μM、10μM、および1μMの濃度に調製した被験物質含有溶液を添加し、37℃、CO₂濃度５％で２日間培養する。ここで、対照実験として、被験物質無添加の細胞についても同様に培養する（コントロール）。これらの各培養細胞より抽出したRNAを用いて実施例３に記載された方法で、NFATC1遺伝子および／またはCICC４遺伝子の発現量を調べる。その発現量からコントロールと比べてNFATC1遺伝子および／またはCICC４遺伝子の発現量が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上減少している培養系に添加した被験物質を骨代謝異常疾患の緩和、抑制（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１４７】
【発明の効果】
本発明によって、破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患、例えば関節炎や骨粗しょう症などの疾患で発現が特異的に増大している遺伝子（NFATC1遺伝子およびCICC4遺伝子）が明らかになった。かかる遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用である。かかるマーカー遺伝子によれば骨代謝異常疾患が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した疾患であるかどうか、その原因を明らかにすることができ（診断精度が向上）、これによりより適切な治療を施すことが可能となる。すなわち、骨代謝異常疾患の適切な治療のためのツールとして利用することができる。
【０１４８】
また、上記遺伝子の発現増加と破骨細胞の分化・活性化の亢進並びにそれによる骨代謝異常疾患との関連性から、該遺伝子の発現を抑制する化合物は、上記骨代謝異常疾患の治療薬として有用であると思われる。従って、本発明の遺伝子によれば、その発現の抑制若しくは減少を指標にすることによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の治療薬となり得る候補薬をスクリーニング選別することが可能である。すなわち、本発明は、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の治療薬の開発に有用である。
【０１４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図1aは、実施例７において、24穴プレートに播いたRAW264細胞数と、GST/ODF融合タンパク質添加96時間後の破骨細胞（TRAP positive MN cells）数との関係を調べた結果を示す図である。当該図は、RAW264細胞2.5×10⁴個の場合での破骨細胞数(100％)に対する割合(%)で表している。結果は3回の平均値である。また図1bは、実施例７において、低密度培養条件下および高密度培養条件下でのGST/ODF融合タンパク質添加96時間後のRAW264細胞の形態を示す図である。左は低密度培養条件下（2.5×10⁴個のRAW264細胞を播いた際）でのRAW264細胞である。右は高密度培養条件下（2 ×10⁵個RAW264細胞を播いた際）でのRAW264細胞である。
【図２】図２aは、実施例８において、未処理RAW264細胞とGST/ODF融合タンパク質添加24, 48, 72および96時間後のRAW264細胞におけるNFATC1（タンパク質）、β-actin（タンパク質）の発現をウエスタンブロット解析によって調べた結果を示す図である。なお、0時間は未処理RAW264細胞を指している。また図２bは、実施例８において、10 cm培養ディッシュに播いたRAW264細胞数と、GST/ODF融合タンパク質添加24時間後のNFATC1（タンパク質）、β-actin（タンパク質）の出現との関係をウエスタンブロット解析によって調べた結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例９において、RAW264細胞に加えたサイクロスポリンA（CsA）濃度と、GST/ODF融合タンパク質添加96時間後の破骨細胞（TRAP positive MN cells）数との関係を調べた結果を示す図である。図ではControl (CsA ：0 ng/ml)の場合での破骨細胞数（100％）に対する割合（％）を示す。結果は3回の平均値である。
【図４】図４は、実施例９において、RAW264細胞に加えたサイクロスポリンA（CsA）濃度と、GST/ODF融合タンパク質添加72時間後のRAW264細胞におけるNFATC1（タンパク質）、retinoblastoma（タンパク質）、β-actin（タンパク質）の出現との関係をウエスタンブロット解析によって調べた結果を示す図である。図中、totalとは総タンパク質画分を、nuclearとは核画分を、cytoplasmとは細胞質画分を示す。
【図５】図５aは、実施例１０において、ドキシサイクリン（図中DOXで示す）添加（DOX＋）、無添加（DOX-）条件下で、RAW264細胞、RT3細胞およびRT3／NFATC1-AS細胞におけるNFATC1（タンパク質）、β-actin（タンパク質）の出現をウエスタンブロット解析によって調べた結果を示す図である。また図５bは、実施例１０において、ドキシサイクリン添加（DOX＋）、無添加（DOX-）条件下で、RAW264細胞、RT3細胞およびRT3／NFATC1-AS細胞から分化した破骨細胞（TRAP positive MN cells）数を調べた結果を示す図である。図はドキシサイクリン無添加（DOX-）における形質転換していないRAW264細胞での破骨細胞数（100％）に対する割合（％）で示す。結果は3回の平均値である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a disease marker useful for diagnosing diseases of abnormal bone metabolism that occur in association with increased osteoclast differentiation and activation. More specifically, the present invention is a disease that can be effectively used as a primer or a detection probe in genetic diagnosis of diseases of abnormal bone metabolism caused by increased osteoclast differentiation / activation, for example, diseases such as arthritis and osteoporosis. Regarding markers. The present invention also relates to a detection method (diagnostic method) for diseases of abnormal bone metabolism associated with increased osteoclast differentiation / activation using such disease markers.
[0002]
Furthermore, the present invention provides a method for screening a substance effective as an ameliorating agent or therapeutic agent for a bone metabolic disorder caused by the increased differentiation and activation of osteoclasts using the disease marker, and the method The present invention relates to an agent for improving or treating a bone metabolic disorder comprising the substance prepared in (1) as an active ingredient.
[0003]
[Prior art]
Bone is a dynamic tissue in which bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts are constantly repeated. It is known that when an abnormality occurs in the functional balance between osteoblasts and osteoclasts, this dynamic equilibrium state is broken and various bone metabolic disorders are caused. Bone metabolism abnormalities may also occur due to side effects of treatment such as steroid treatment. In addition, abnormal bone metabolism causes a decrease in ability of physical activity as the disease progresses, which in turn is accompanied by pains such as back pain and joint pain, and thus often interferes with daily living activities.
[0004]
In recent years, the bone density measurement method (DXA method: Dual energy X-ray absorptiometry method) has been improved, making it easier and cheaper to receive a bone density medical checkup. Is also increasing.
[0005]
On the other hand, in the recent medical field, it is desired to select a treatment method accurately according to the symptoms of individual patients, not limited to abnormal bone metabolism. In recent years, when the need for improving the quality of life (QOL) in an aging society has been recognized, it is not a treatment that is common to all people, but appropriate treatment that is tailored to the symptoms of individual patients. Is strongly demanded. In order to carry out such so-called tailor-made treatments, disease markers that accurately reflect the symptoms of patients and their causes (genetic background) are useful for each disease, and research aimed at the search and development of such markers is vigorous. This is the current situation.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a disease marker useful for diagnosis and treatment of diseases of abnormal bone metabolism. More specifically, an object of the present invention is to provide a disease marker that specifically reflects a disease of abnormal bone metabolism that occurs in association with increased differentiation and activation of osteoclasts. Furthermore, the present invention provides a method for detecting a disease of abnormal bone metabolism (genetic diagnosis method) using the disease marker, a method for screening a drug useful for improving or treating the disease, and a drug useful for improving or treating the disease. The purpose is to provide.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have conducted extensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the NF-ATc isoform a gene (hereinafter referred to as the present gene), which has been known to function in the induction of cytokine gene expression in T cells, has been heretofore known. In the specification, it is also referred to as “NFATC1 gene”.) (GenBank Accession No. U08015, Nature 369, 497-502 (1994)), and Chloride intracellular channel 4 gene known as a chloride ion channel (hereinafter referred to as the present specification) (GenBank Accession No. AL117424, Genome Res. 11 (3), 422-435 (2001)) is specifically detected in bone tissues of patients with abnormal bone metabolism, and they are also referred to as “CICC4 gene”. These genes were found to show a significant increase in expression in response to increased osteoclast differentiation and activation. In addition, these genes are not expressed in normal bone tissue or very little if seen. Thus, since these genes are specifically found in patients with abnormal bone metabolism caused by increased osteoclast differentiation / activation, the present inventors have become disease markers for the abnormal bone metabolic disease. Got confident of getting. The present invention has been developed based on such knowledge.
[0008]
That is, the present invention is as follows:
Item 1. A polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the NFATC1 gene described in SEQ ID NO: 1 or 3 or the CICC4 gene sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide A disease marker for diseases of abnormal bone metabolism associated with increased differentiation and activation of osteoclasts.
Item 2. Item 2. The disease marker according to Item 1, which is used as a probe or primer in the detection of a disease of abnormal bone metabolism associated with increased osteoclast differentiation / activation.
Item 3. A method for detecting a disease of abnormal bone metabolism associated with enhanced differentiation / activation of osteoclasts, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a polynucleotide complementary to the RNA transcribed therefrom and the disease marker according to

claim

1 or 2;
(B) a step of measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA using the disease marker as an index,
(C) A step of determining the morbidity of a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation based on the measurement result of (b).
Item 4. Bone metabolism associated with increased differentiation and activation of osteoclasts, comprising an antibody that recognizes the protein consisting of the amino acid sequence of NFATC1 described in SEQ ID NO: 5 or the protein consisting of the amino acid sequence of CICC4 described in SEQ ID NO: 6 Disease marker for abnormal diseases.
Item 5. Item 5. The disease marker according to Item 4, which is used as a probe in detecting a bone metabolic disorder related to increased osteoclast differentiation / activation.
Item 6. A method for detecting a disease of abnormal bone metabolism associated with enhanced differentiation / activation of osteoclasts, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of binding a protein prepared from a biological sample of a subject and the disease marker according to

Item

4 or 5,
(B) measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) A step of determining the morbidity of a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation based on the measurement result of (b).
Item 7. A screening method for a substance that regulates the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with a cell capable of expressing the NFATC1 gene or the CICC4 gene;
(b) measuring the expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the gene corresponding to the above in the control cell not contacted with the test substance;
(c) A step of selecting a test substance that varies the expression level of the NFATC1 gene or the CICC4 gene based on the comparison result of (b).
Item 8. A screening method for a substance that regulates the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with a cell capable of expressing the NFATC1 gene or the CICC4 gene;
(b) measuring the expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the gene corresponding to the above in the control cell not contacted with the test substance;
(c) A step of selecting a test substance that decreases the expression level of the NFATC1 gene or the CICC4 gene based on the comparison result of (b).
Item 9. Item 9. The screening method according to Item 8, which is a method for searching for an effective component of an agent for improving or treating a bone metabolic disorder related to increased osteoclast differentiation / activation.
Item 10. A screening method for a substance that suppresses the function or activity of NFATC1 or CICC4, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting a test substance with a cell containing NFATC1 or CICC4 or a cell fraction prepared from the cell,
(b) a function (activity) derived from NFATC1 or CICC4 derived from a cell contacted with a test substance or a cell fraction thereof is measured, and the NFATC1 or cell fraction of the control cell or the cell fraction not contacted with the test substance. Comparing with the function or activity of CICC4,
(c) A step of selecting a test substance that suppresses the function (activity) of NFATC1 or CICC4 of the cell or a fraction of the cell based on the comparison result of (b).
Item 11. A screening method for a substance that suppresses the function or activity of NFATC1, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with a cell containing NFATC1 and capable of expressing the Interleukin-2 gene or a cell fraction prepared from the cell,
(b) Measure the expression level of the Interleukin-2 gene in the cell contacted with the test substance or its cell fraction, and express the expression level of the Interleukin-2 gene in the control cell or its cell fraction not contacted with the test substance Process to compare with the quantity,
(c) A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of the Interleukin-2 gene in the cell or the cell fraction based on the comparison result of (b).
Item 12. A screening method for a substance that suppresses the function or activity of CICC4, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with a cell containing CICC4 or a cell fraction prepared from the cell,
(b) The membrane permeation activity of the chloride ion of a cell contacted with the test substance or its cell fraction is measured, and the chloride ion membrane permeation activity of the control cell or its cell fraction not contacted with the test substance The process of comparing with,
(c) A step of selecting a test substance that suppresses the membrane permeation activity of chloride ions of the cell or the cell fraction based on the comparison result of (b).
Item 13. Item 13. The screening method according to any one of Items 10 to 12, which is a method for searching for an effective ingredient of an agent for improving or treating a bone metabolic disorder related to increased osteoclast differentiation / activation.
Item 14. An agent for ameliorating or treating bone metabolic disorders related to increased differentiation and activation of osteoclasts, which comprises a substance that suppresses the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene as an active ingredient.
Item 15. Item 14. The agent for improving or treating a bone metabolic disorder according to Item 14, wherein the substance that suppresses the expression of the NFATC1 gene or CICC4 gene is obtained by the screening method according to any one of Items 7 to 9.
Item 16. An agent for improving or treating an abnormal bone metabolism disease associated with increased osteoclast differentiation / activation, comprising a substance that suppresses the function or activity of NFATC1 or CICC4 as an active ingredient.
Item 17. Item 16. The agent for improving or treating an abnormal bone metabolism disease according to Item 16, wherein the NFATC1 or CICC4 function / activity inhibitor is obtained by the screening method according to any one of Items 10 to 13.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, in the present specification, indications using abbreviations such as amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides, etc. are defined in IUPAC-IUB [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 ( 1984)], “Guidelines for the preparation of specifications including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Japan Patent Office), and conventional symbols in the field.
[0010]
In the present specification, “gene” or “DNA” is used to include not only double-stranded DNA but also each single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand constituting the DNA. The length is not particularly limited. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, a gene (DNA) is a double-stranded DNA containing human genomic DNA and a single-stranded DNA containing DNA (positive strand) and a sequence having a complementary sequence to the positive strand. Both double-stranded DNA (complementary strand) and fragments thereof are included. In addition, the “gene” or “DNA” includes not only the “gene” or “DNA” represented by a specific base sequence (SEQ ID NOs: 1 to 4), but also the protein and biological function encoded by them. Included are “genes” or “DNA” encoding proteins that are equivalent (eg, homologues, variants and derivatives, etc.). The “gene” or “DNA” encoding the homologue, variant or derivative is specifically the above-mentioned SEQ ID NO: 1 under the stringent conditions described in (1-1) below. Examples thereof include “gene” or “DNA” comprising a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the specific base sequence represented by ˜4.
[0011]
For example, as a gene (homolog) encoding a homologue of a human-derived protein, genes of other species such as mouse and rat corresponding to the human gene encoding the protein can be exemplified, and these genes (homolog) are homologous genes. (Http: // www. Ncbi. Nlm. Nih. Gov / HomoloGene /). Specifically, for example, the base sequence of a specific human gene is represented by BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993, http: // www. Ncbi. Nlm. Nih.gov/BLAST/ ) To obtain the accession number of the sequence that matches (Score is the highest, E-value is 0, and Identity is 100%). The UniGene Cluster ID (number indicated by Hs.) Obtained by inputting the accession number to UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) is input to the homologene. From the list showing the correlation of gene homologues between the other species gene and the human gene obtained as a result, genes of other species such as mice and rats as homologues corresponding to the human gene indicated by a specific base sequence Can be selected.
[0012]
The gene or DNA does not ask for distinction of the functional region, and can include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron.
[0013]
In the present specification, “polynucleotide” is used to include both RNA and DNA. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. The RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
[0014]
In this specification, “protein” or “(poly) peptide” means not only “protein” or “(poly) peptide” represented by a specific amino acid sequence, but also biological functions equivalent to these. Limits include fragments, homologues, derivatives, and variants thereof. Here, examples of homologues include proteins of other species such as mice and rats that correspond to human proteins. These are homologs (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/). Can be a priori identified from the base sequence of the gene identified by. Variants also include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having amino acid sequences modified by artificial deletions, substitutions, additions and insertions. . Examples of the mutant include a protein or (poly) peptide having no mutation and an amino acid sequence at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous. it can.
[0015]
As used herein, the term “antibody” includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or an antibody having an antigen binding property such as a Fab fragment or a fragment generated by a Fab expression library. Some are included.
[0016]
Further, in the present specification, the term “disease marker” is used for diagnosing the presence or the degree of morbidity of a bone metabolic disorder, particularly a bone metabolic disorder caused in association with increased differentiation and activation of osteoclasts. In addition, it is used directly or indirectly to screen candidate substances useful for the improvement or treatment of diseases of abnormal bone metabolism caused by the increased differentiation and activation of osteoclasts. Is a nucleotide (including oligonucleotides and polynucleotides) that can specifically recognize and bind to a gene or protein whose expression in vivo varies, for example, in relation to increased differentiation and activation of osteoclasts. Or an antibody. Based on the above properties, these (poly) (oligo) nucleotides and antibodies are used as probes for detecting the genes and proteins expressed in vivo, and (oligo) nucleotides are the genes expressed in vivo. It can be effectively used as a primer for amplification.
[0017]
In the present invention, as described above, the NFATC1 gene or the CICC4 gene is a bone tissue of a patient with abnormal bone metabolism, particularly a tissue involved in osteoclast differentiation and activation, and the osteoclast differentiation and activation is enhanced. It is based on the finding that it is specifically expressed in relation to Accordingly, these genes and their expression products [proteins, peptides (including oligopeptides and polypeptides)] are abnormal bone metabolism diseases, particularly bone metabolism abnormalities associated with increased osteoclast differentiation and activation. It can be effectively used for elucidation, diagnosis, prevention and treatment of diseases, and such information can provide useful information and means in medicine and clinical science. In addition, these genes and their expression products and derivatives thereof (for example, antibodies, etc.) can be suitably used for the treatment of the above-mentioned bone metabolic disorders and the development of drugs that are effectively used for the treatment. . Furthermore, the detection of the expression of the above gene or its expression product in the individual or bone tissue, or the detection of the mutation of this gene or its expression deficiency can be effectively used for the elucidation or diagnosis of bone metabolic abnormal diseases.
[0018]
Hereinafter, specific uses of these NFATC1 gene or CICC4 gene, their expression products (such as NFATC1 or CICC4) and their derivatives will be described.
[0019]
(1) Disease markers for bone metabolism disorders and their applications
(1-1) Polynucleotide
The polynucleotides shown in SEQ ID NOs: 1 and 3 of the present invention are genes known as human-derived NFATC1 gene and mouse-derived NFATC1 gene, respectively, and methods for obtaining them are also described in Nature 369, pp.497-502 ( 1994), or Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, pp.314-323 (1997).
[0020]
Further, the polynucleotides shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 of the present invention are genes known as human-derived CICC4 gene and mouse-derived CICC4 gene, respectively, and the method for obtaining them is also described in Genome Res. 11 (3), pp. 422-435 (2001) or Am. J. Physiol. 276, F398-F408 (1999), and J. Biol. Chem. 274, pp. 36488-36497 (1999).
[0021]
As described above, the present invention specifically expresses the above-mentioned NFATC1 gene or CICC4 gene in the bone tissue of a patient suffering from a bone metabolic disorder caused by increased osteoclast differentiation and activation. By detecting the presence or absence and the degree of expression of these genes, it is possible to specifically detect the presence or degree of the above-mentioned bone metabolism disorder and accurately diagnose the disease. It is based on the idea that it can be done.
[0022]
The polynucleotide is useful as a tool (disease marker) for diagnosing whether or not a subject suffers from a bone metabolic disorder related to increased osteoclast differentiation / activation or the degree of the disease. . Specifically, the polynucleotide (disease marker) is used to detect the presence or absence (expression level) of NFATC1 gene or CICC4 gene in bone tissue of a subject.
[0023]
In addition, the above-mentioned polynucleotide is used for the screening of candidate substances useful for the improvement or treatment of bone metabolic disorders related to the enhancement of osteoclast differentiation / activation as described in (3-1) below. Alternatively, it is useful as a screening tool (disease marker) for detecting changes in the expression of the CICC4 gene.
[0024]
The disease marker of the present invention is a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the NFATC1 gene shown in SEQ ID NO: 1 or 3 or the CICC4 gene shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and / or It consists of a polynucleotide having a base sequence complementary to the nucleotide base sequence.
[0025]
Here, a complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) is a full-length sequence of a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 or a length of at least 15 bases continuous in the base sequence It has a base-complementary relationship based on base pair relationships such as A: T and G: C with respect to the partial sequence having the base sequence (for convenience, these are also referred to as “positive strands”). It means a polynucleotide. However, such a complementary strand is not limited to the case where it forms a completely complementary sequence with the target positive strand base sequence, but has a complementary relationship that allows it to hybridize with the target positive strand under stringent conditions. You may have. Note that stringent conditions here bind the complex or probe as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid. For example, as washing conditions after hybridization, the conditions of about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned. The complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Although not particularly limited, “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” is set as stricter hybridization conditions (washing conditions after hybridization), and “0.1 × is set as stricter hybridization conditions (washing conditions after hybridization). A cleaning condition of “SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” can be given. Specifically, as such a complementary strand, a strand consisting of a base sequence that is completely complementary to the target positive strand base sequence, and at least 90%, preferably 95% homology with the strand. An example is a chain composed of a base sequence having the same.
[0026]
In addition, the polynucleotide on the positive strand side has not only a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 or a partial sequence thereof, but also a complementary relationship to the nucleotide sequence of the complementary strand. The chain | strand which consists of a base sequence in can be included.
[0027]
Furthermore, the above-mentioned normal polynucleotide and its complementary strand (reverse strand) may each be used as a disease marker in a single-stranded form, or may be used as a disease marker in a double-stranded form. .
[0028]
The disease marker for abnormal bone metabolism of the present invention is specifically a nucleotide sequence (full-length sequence) described in SEQ ID NO: 1 or 3 relating to the nucleotide sequence of the NFATC1 gene, or SEQ ID NO: 2 or 4 relating to the nucleotide sequence of the CICC4 gene. The polynucleotide which consists of may be sufficient, and the polynucleotide which consists of the complementary sequence may be sufficient. In addition, the NFATC1 gene represented by SEQ ID NO: 1 or 3 or a polynucleotide derived from the gene (for example, DNA such as cDNA or RNA is exemplified), the CICC4 gene represented by SEQ ID NO: 2 or 4, or the A polynucleotide consisting of a partial sequence of the full-length sequence or a complementary sequence thereof may be used as long as it selectively (specifically) recognizes a polynucleotide derived from a gene. Examples of such a partial sequence include a polynucleotide having at least 15 consecutive base lengths arbitrarily selected from the base sequence of the full-length sequence or its complementary sequence.
[0029]
Here, “selectively (specifically)” means that, for example, in Northern blotting, NFATC1 gene, CICC4 gene or a polynucleotide derived therefrom can be specifically detected, and RT-PCR method. Means that the NFATC1 gene, CICC4 gene or a polynucleotide derived therefrom is specifically produced, but the present invention is not limited thereto, and those skilled in the art can derive the above-mentioned detection product from these genes. Anything that can be determined to be a thing can be used.
[0030]
Such a disease marker of the present invention is based on the nucleotide sequence of the NFATC1 gene represented by SEQ ID NO: 1 or 3, or the CICC4 gene represented by SEQ ID NO: 2 or 4, for example, primer 3 (HYPERLINK HYPERLINK "http: / /www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi "http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, http: // www genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi) or vector NTI (manufactured by Infomax).
[0031]
Specifically, a primer or probe candidate sequence obtained by applying the nucleotide sequence of the NFATC1 gene or the CICC4 gene to the software of primer 3 or vector NTI, or a sequence partially including the sequence as a primer or probe Can be used.
[0032]
The disease marker used in the present invention is not limited as long as it has a length of at least 15 consecutive bases as described above. Specifically, the length can be appropriately selected and set according to the use of the marker. it can.
[0033]
In the present invention, the detection (diagnosis) of an abnormal bone metabolism disease is the presence or absence or expression level (expression level) of at least one of NFATC1 gene or CICC4 gene in a biological tissue of a subject, particularly a bone tissue involved in osteoclast differentiation. Is done by evaluating. In this case, the disease marker of the present invention is an RNA produced by expression of the gene or a polynucleotide derived therefrom, for example, various polypeptides such as DNA produced by RT-PCR based on the RNA. It can be used as a primer for specifically recognizing and amplifying, or as a probe for specifically detecting the RNA or a polynucleotide derived therefrom.
[0034]
When the disease marker is used as a primer in the detection of bone metabolic abnormalities (gene diagnosis), those having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp can be exemplified. When used as a detection probe, those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.
[0035]
The disease marker of the present invention can be used as a primer or a probe according to a conventional method in a known method for specifically detecting a specific gene such as Northern blotting, RT-PCR, in situ hybridization, etc. Thus, it is possible to evaluate the presence / absence or expression level (expression level) of the NFATC1 gene or CICC4 gene associated with abnormal bone metabolism associated with increased osteoclast differentiation / activation. As the measurement target sample, depending on the type of detection method used, a part of the bone tissue of the subject may be collected with a biopsy or the like, and total RNA prepared therefrom according to a conventional method may be used. Various polynucleotides prepared based on the RNA may be used.
[0036]
Moreover, the gene expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the living tissue can be detected or quantified using a DNA chip. In this case, the disease marker of the present invention can be used as a probe of the DNA chip (for example, in the case of Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, E of Affymetrix, a 25 bp long polynucleotide) Used as a probe). This DNA chip is hybridized with labeled DNA or labeled RNA prepared based on RNA collected from living tissue, and the above-mentioned probe (disease marker) formed by hybridization and labeled DNA or labeled RNA are combined. By detecting the body using the label of the labeled DNA or labeled RNA as an indicator, the presence or absence of the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene in the living tissue or the expression level (expression level) can be evaluated.
[0037]
The disease marker of the present invention is useful for diagnosing abnormal bone metabolism, particularly for detecting abnormal bone metabolic disease caused by increased osteoclast differentiation / activation (diagnosis of presence or degree of morbidity). is there. Specifically, the diagnosis of a bone metabolic disorder using the disease marker can be performed by determining the difference in the gene expression level of the NFATC1 gene or the CICC4 gene in the bone tissue of the subject and the bone tissue of a normal subject. . In this case, the difference in gene expression level is not only the difference between the presence / absence of expression but also the difference in expression level between the two even when both the bone tissue of the subject and the bone tissue of the normal subject are expressed. The case of more than double, preferably 3 times or more is included. Specifically, NFATC1 gene or CICC 4 gene is expressed in the bone tissue of the subject because it is induced in abnormal bone metabolism related to increased osteoclast differentiation / activation, and the expression level is normal. If the expression level of the bone tissue of a person is 2 times or more, preferably 3 times or more, the subject is suspected of suffering from a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation.
[0038]
(1-2) Antibody
The present invention also provides an NFATC1 gene expression product (protein) (also referred to herein as “NFATC1”) or CICC4 as a disease marker for abnormal bone metabolism associated with increased osteoclast differentiation / activation. Provided is an antibody capable of specifically recognizing a gene expression product (protein) (also referred to herein as “CICC4”).
[0039]
In the present invention, the NFATC1 gene or the CICC4 gene is specifically detected in the bone tissue of a patient with an abnormal bone metabolism disease, and these genes exhibit a significant expression increasing behavior in response to increased differentiation and activation of osteoclasts. Beginning with the knowledge that these are present, the presence or absence of expression of these genes (RNA or protein) and the level of expression (the amount of RNA or protein produced) is detected to detect the presence or absence of the above bone metabolism disorder It is based on the idea that the degree of morbidity and morbidity can be specifically detected and the disease can be diagnosed accurately.
[0040]
The above antibody is useful as a tool (disease marker) for diagnosing whether or not a subject suffers from a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation, or the degree of the disease. Specifically, the antibody (disease marker) is used to detect the presence or absence (expression level) of NFATC1 or CICC4 in bone tissue of a subject.
[0041]
Examples of NFATC1 include a protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and CICC 4 includes a protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Specific examples of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 include a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a specific example of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2. As a specific embodiment, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 can be exemplified.
[0042]
The protein shown in SEQ ID NO: 5 is a known human protein encoded by a human-derived NFATC1 gene, and the method for obtaining it is also described in Nature 369, pp.497-502 (1994). It is known. The protein shown in SEQ ID NO: 6 is a known human protein encoded by a human-derived CICC4 gene, and the method for obtaining it is also known as Genome Res. 11 (3), pp. 422-435 (2001) or Am. Physiol. 276, F398-F408 (1999).
[0043]
The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody having NFATC1 or CICC4 as an immunizing antigen, or a monoclonal antibody thereof, and further at least in the amino acid sequence of the NFATC1 or CICC4. An antibody having binding ability to a polypeptide comprising 8 consecutive amino acids is also included in the antibody of the present invention.
[0044]
Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, an oligopeptide having a partial amino acid sequence of NFATC1 or CICC4 using NFATC1 or CICC4 expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method or according to a conventional method Can be used as immunizing antigens to immunize non-human animals such as rabbits and obtained from the sera of the immunized animals according to conventional methods. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, a non-human animal such as a mouse is immunized with NFATC1 or CICC4 expressed and purified in Escherichia coli according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of these proteins as an immunizing antigen. Spleen cells and myeloma cells can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4- 11.11).
[0045]
In addition, a protein used as an immunizing antigen in the production of an antibody is DNA cloning, construction of each plasmid, host to the host based on the sequence information (SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4) of the gene provided by the present invention. Transfection, culture of transformants and recovery of protein from the culture. These operations are based on methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). Can be done. Specifically, a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene encoding NFATC1 or CICC4 in a desired host cell is prepared, introduced into the host cell, transformed, and the transformant is cultured. The target protein can be recovered from the obtained culture. These NFATC1 or CICC4 can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) in accordance with the amino acid sequence information (SEQ ID NOs: 5 and 6) provided by the present invention.
[0046]
The NFATC1 or CICC4 used as the immunizing antigen here includes not only the protein shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, but also homologues thereof. The homologue consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6 and shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. And a protein having an immunological activity equivalent to that of the protein (the biological function is not particularly equivalent as long as it has the same immunological activity).
[0047]
Here, the protein having the same immunological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 induces a specific immune response in an appropriate animal or its cell and is resistant to NFATC1 or CICC4. Mention may be made of proteins having the ability to specifically bind to antibodies.
[0048]
The number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the immunological activity is maintained. Indicators that determine how and how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of immunological activity include computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star software. Can be found using. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. The amino acid to be substituted is not particularly limited as long as the protein obtained after substitution retains the immunological activity of NFATC1 or CICC4, but from the viewpoint of maintaining the structure of the protein, the polarity, charge, solubility, The amino acid is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as hydrophobicity, hydrophilicity and amphiphilicity. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as nonpolar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are mutually uncharged amino acids. Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
[0049]
The antibody of the present invention may be prepared using an oligopeptide or polypeptide having a partial amino acid sequence of NFATC1 or CICC4. The oligo (poly) peptide used for antibody induction does not need to have functional biological activity, but desirably has immunogenic properties similar to those of NFATC1 or CICC4. An oligo (poly) peptide preferably having such properties and consisting of at least 8 consecutive amino acids in the amino acid sequence of NFATC1 or CICC4 can be exemplified.
[0050]
Generation of antibodies against such oligo (poly) peptides can also be carried out by enhancing immunological reaction using various adjuvants depending on the host. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pluronic polyol, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. There are active substances, human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.
[0051]
Antibodies that specifically bind to NFATC1 are already commercially available (anti-NF-ATc1 antibody 7A6, manufactured by Santa Cruz, etc.), and these can also be used as the antibody of the present invention.
[0052]
Since the antibody of the present invention has a property of specifically binding to NFATC1 or CICC4, it is possible to specifically detect the protein (NFATC1 or CICC4) expressed in the tissue of a subject by using the antibody. it can. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of NFATC1 or CICC4 protein expression in the tissue of a subject.
[0053]
Specifically, a part of the patient's bone tissue is collected with a biopsy or the like, and then the protein is extracted and purified according to a conventional method. For example, the above antibody is usually used in a known detection method such as Western blotting or ELISA. The presence or amount of NFATC1 or CICC4 can be detected by using as a probe according to the law.
[0054]
When diagnosing disorders of bone metabolism that are associated with increased osteoclast differentiation / activation, the difference in the amount of at least one of NFATC1 or CICC4 in the bone tissue of the subject and the corresponding protein in normal bone tissue should be determined. What is necessary is just to judge. In this case, the difference in protein amount includes the presence / absence of protein or the case where the difference in protein amount is 2 times or more, preferably 3 times or more. Specifically, since NFATC1 gene or CICC4 gene induces expression in bone metabolic disorders associated with increased differentiation and activation of osteoclasts, the expression product of this gene (NFATC1 and / or CICC4) is present, and if it is determined that the amount of the protein is more than twice, preferably more than three times the amount of the corresponding expression product (protein amount) in normal bone tissue, the subject is broken. Suspected of suffering from diseases of abnormal bone metabolism related to increased differentiation and activation of bone cells.
[0055]
(2) Detection method (diagnosis method) of diseases with abnormal bone metabolism
The present invention provides a method for diagnosing abnormal bone metabolism using the above-described disease marker for abnormal bone metabolism according to the present invention, in particular, a method for diagnosing abnormal bone metabolism related to increased differentiation and activation of osteoclasts. .
[0056]
Specifically, in the diagnostic method of the present invention, a part of the bone tissue of a subject is collected with a biopsy or the like, and the gene expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene associated with a bone metabolic disorder contained therein, or these By detecting the protein (NFATC1, CICC4) derived from the gene and measuring its expression level (RNA level) or its protein level, the subject is diagnosed as to whether or not he or she is suffering from a bone metabolic disorder. is there.
[0057]
The diagnostic method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the biological sample of the subject with the disease marker of the present invention,
(b) measuring the gene expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the biological sample, or the amount of NFATC1 or CICC4 protein as the disease marker and indicator,
(c) A step of determining the morbidity of a bone metabolic disorder related to increased osteoclast differentiation / activation on the subject based on the result of (b).
[0058]
Examples of the biological sample used here include a sample prepared from a bone tissue of a subject. Specifically, an RNA-containing sample prepared from the tissue, a sample containing a polynucleotide further prepared therefrom, or a sample containing a protein prepared from the tissue can be mentioned. A sample containing such RNA, polynucleotide or protein can be prepared according to a conventional method by collecting a part of the bone tissue of a subject with a biopsy or the like.
[0059]
The diagnostic method of the present invention is specifically performed as follows according to the type of biological sample used as a measurement target.
[0060]
(2-1) When using RNA as a measurement target
When RNA is used as a measurement object, the detection of a bone metabolic disorder can be carried out by a method that specifically includes the following steps (a), (b), and (c):
(A) RNA prepared from a biological sample of a subject or a polynucleotide complementary to the RNA transcribed from the RNA and the disease marker of the present invention (polynucleotide having at least 15 bases continuous in the nucleotide sequence of NFATC1 gene or CICC4 gene) A nucleotide and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide)
(B) a step of measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA using the disease marker as an index,
(C) A step of determining the morbidity of a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation based on the measurement result of (b).
[0061]
When RNA is used as a measurement object, the bone metabolic disorder detection method (diagnostic method) of the present invention uses the expression level of NFATC1 gene or CICC4 gene in the RNA (for example, the amount of RNA corresponding to these genes). It can be implemented by detecting and measuring. Specifically, the disease marker of the present invention comprising the aforementioned polynucleotide (a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the NFATC1 gene or CICC4 gene and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide) as a primer Or it can carry out by performing well-known methods, such as a Northern blot method, RT-PCR method, a DNA-chip analysis method, an in situ hybridization analysis method, using as a probe.
[0062]
When using the Northern blot method, the presence or absence of the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene in RNA (RNA corresponding to these genes) and its expression level (RNA amount) by using the disease marker of the present invention as a probe. ) Can be detected and measured. Specifically, the disease marker (complementary strand) of the present invention is a radioisotope (complementary strand) ³² P, ³³ P, etc .: labeled with RI) or a fluorescent substance, and hybridized with RNA derived from the biological tissue of the subject transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and then the formed disease marker (DNA) and RNA A method of detecting and measuring a signal derived from a marker (RI or fluorescent substance) of a disease marker with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film) or a fluorescence detector. it can. In addition, using AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharamcia Biotech), a disease marker (probe DNA) is labeled according to this protocol, hybridized with RNA derived from the subject's biological tissue, and then labeled with the disease marker It is also possible to use a method of detecting and measuring a signal derived from the above by a multi-bioimager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
[0063]
When using the RT-PCR method, the presence or absence and expression level of NFATC1 gene or CICC4 gene expression in RNA (RNA corresponding to these genes) is detected by using the disease marker of the present invention as a primer. Can be measured. Specifically, prepared from the disease marker of the present invention so as to amplify a region corresponding to the target NFATC1 gene or CICC4 gene by preparing cDNA from RNA derived from the biological tissue of a subject according to a conventional method and using this as a template The pair of primers (the normal strand that binds to the cDNA (-strand) and the reverse strand that binds to the + strand) are hybridized with this primer and subjected to the PCR method according to a conventional method. A method of detecting can be exemplified. In addition, the detection of the amplified double-stranded DNA was performed by a method for detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using a primer previously labeled with RI or a fluorescent substance. For example, a method can be used in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled disease marker is used as a probe and hybridized with the marker to detect it. The produced labeled double-stranded DNA product can be measured with an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems). Also, prepare an RT-PCR reaction solution with SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems) according to the protocol, and react with ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) to detect the reaction product. You can also.
[0064]
When DNA chip analysis is used, a DNA chip on which the above-mentioned disease marker of the present invention is attached as a DNA probe (single strand or double strand) is prepared, and RNA is derived from RNA derived from a subject's living tissue. Examples include a method in which a double strand of DNA and cRNA formed by hybridization with a cRNA prepared by the method is bound to a labeled probe prepared from the disease marker of the present invention and detected. In addition, a DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of the NFATC1 gene or the CICC4 gene can also be used as the DNA chip. Examples of DNA chips that can detect and measure the expression level of such genes include Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, and E from Affymetrix. The detection and measurement of the gene expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the subject RNA using such a DNA chip will be described in detail in Examples.
[0065]
(2-2) When protein is used as the measurement target
When a protein is used as the measurement object, the bone metabolic disorder detection method (diagnostic method) of the present invention is carried out by detecting NFATC1 or CICC4 in a biological sample and measuring the amount thereof. Specifically, it can be carried out by a method comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of binding a protein prepared from a biological sample of a subject and the disease marker of the present invention relating to the antibody (for example, an antibody that recognizes a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6);
(B) measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) A step of determining the morbidity of a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation based on the measurement result of (b).
[0066]
More specifically, NFATC1 or CICC4 is detected by a known method such as Western blotting using the disease marker of the present invention relating to an antibody (for example, an antibody that recognizes a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6). The method of detecting and quantifying can be mentioned. Western blotting uses the above disease marker of the present invention as a primary antibody, and then uses it as a secondary antibody. ¹²⁵ Using a labeled antibody labeled with a radioisotope such as I or a fluorescent substance (an antibody that binds to the primary antibody), the signal derived from the radioisotope or fluorescent substance of the resulting labeled compound is measured with a radiation measuring instrument (BAS-1800II : Manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector, etc. Further, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, using the ECL Plus Western Blotting Detction System (Amersham Pharmacia Biotech), according to the protocol, the primary antibody and NFATC1 or CICC4 in a biological sample The bound substance can be detected and measured with a multi-bioimager STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0067]
Diagnosis of abnormal bone metabolism is based on the expression level of NFATC1 or CICC4 gene (the amount of RNA corresponding to these genes) in the bone tissue of the subject, or the protein (NFATC1 or CICC4) that is the expression product of NFATC1 or CICC4 gene. ) Is compared with the gene expression level or protein amount corresponding to the above in normal bone tissue, and the difference between the two is determined.
[0068]
In this case, biological samples collected from normal bone tissue (samples containing RNA or protein) are required, but these are obtained by collecting bone tissue of a person who does not suffer from a bone metabolic disorder with a biopsy or the like. Can be acquired. As used herein, “a person who does not suffer from a bone metabolic disorder” has at least no subjective symptom of a bone metabolic disorder, preferably by other examination methods such as the DXA method: Dual energy X-ray absorptiometry method. A person who has been diagnosed as having no bone metabolism disorder as a result of the test. The “person who does not suffer from a bone metabolism disorder” may be simply referred to as a normal person in the present specification.
[0069]
Comparison of the gene expression level or the amount of protein between the subject's bone tissue and normal bone tissue (the bone tissue of a person who does not suffer from a bone metabolic disorder) This can be done by performing the measurements in parallel. If not performed in parallel, the NFATC1 gene or CICC4 gene obtained by measurement under uniform measurement conditions using multiple (at least 2, preferably 3 or more, more preferably 5 or more) normal bone tissues The average value or statistical intermediate value of the gene expression level or the amount of protein (NFATC1 or CICC4) that is the expression product of these genes is used as a gene expression level or protein amount of the gene of the normal person for comparison. Can do.
[0070]
The determination of whether a subject is a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation is based on the expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the bone tissue of the subject (corresponding to these genes). RNA amount), or the amount of NFATC1 or CICC4 that is an expression product thereof is 2 times or more, preferably 3 times or more compared to those of normal subjects. In addition, if the subject's gene expression level or the amount of protein is higher than that of any normal subject, it is determined that the disease is a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation. can do.
[0071]
(3) Candidate substance screening method
(3-1) Screening method using gene expression level as an index
The present invention provides a method for screening a substance (candidate substance) that controls the expression of the NFATC1 gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the CICC4 gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 2.
[0072]
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with a cell capable of expressing the NFATC1 gene or the CICC4 gene;
(b) measuring the gene expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the gene corresponding to the above in the control cell not contacted with the test substance;
(c) A step of selecting a test substance that varies the gene expression level of the NFATC1 gene or the CICC4 gene based on the comparison result.
[0073]
Examples of cells used for such screening include osteoclast precursor cells that express the NFATC1 gene or CICC4 gene and can differentiate into osteoclasts. Specific examples of osteoclast precursor cells that can differentiate into osteoclasts include cells obtained from spleen and bone marrow, and mouse RAW264 cells (RIKEN Cell Bank; HYPERLINK HYPERLINK "http: //www.rtc .riken.go.jp / CELL / HTML / RIKEN "http://www.rtc.riken.go.jp/CELL/HTML/RIKEN, http://www.rtc.riken.go.Jp/CELL / HTML / RIKEN Cell Bank. Available from Html). Mouse RAW264 cells are known to differentiate into osteoclasts upon addition of ODF (osteoclast differentiation factor), a differentiation inducer (Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 278-283). (2001)). RAW264 cells are preferred. As shown in Examples described later, the cells are differentiated into osteoclasts by the addition of ODF, and it has been confirmed that the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene is induced in the process.
[0074]
Candidate substances include, but are not limited to, nucleic acids (including antisense nucleotides of NFATC1 gene or CICC4 gene), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, etc. Screening is specifically for these candidates. It can be performed by contacting a sample (test sample) containing a test substance that can be a substance with the tissue / or cells. Examples of such test samples include, but are not limited to, cell extracts, gene library expression products, synthetic low molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
[0075]
In the screening, conditions for bringing the test substance into contact with the cells are not particularly limited, but culture conditions (temperature, pH, medium composition, etc.) that allow the cells to die and express the NFATC1 gene or CICC4 gene are selected. Is preferred.
[0076]
As shown in the examples, the bone tissue of a patient suffering from a bone metabolic disorder such as osteoporosis specifically shows increased osteoclast differentiation / activation and NFATC1 gene or CICC4 gene is expressed. Yes. From this finding, it is considered that the expression of the NFATC1 gene or the CICC4 gene is associated with a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation. That is, the screening method of the present invention utilizes the fact that the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene or its induction is associated with an abnormal bone metabolism caused by increased osteoclast differentiation / activation. . Therefore, in the search for a substance having a mitigating / suppressing action on the bone metabolic disorder (which exhibits an improvement / treatment effect on the bone metabolic disorder), the expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene is decreased or expressed. Inhibition of induction is used as an index.
[0077]
That is, the screening method of the present invention searches for substances that suppress the expression of the NFATC1 gene or the CICC4 gene, so that an effective drug for improving or treating bone metabolic disorders associated with increased osteoclast differentiation / activation is effective. The candidate substance used as a component is provided.
[0078]
Specifically, the candidate substances can be selected as follows. That is, when using cells expressing the NFATC1 gene or CICC4 gene, the expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the cell to which the test substance is added is lower than that of the cell to which the test substance is not added. In addition, when cells that require an expression inducer for expression of the NFATC1 gene or CICC4 gene are used, the expression induced by the expression inducer (for example, ODF in the case of RAW264 cells) is suppressed by the presence of the test substance. That is, the gene expression of a cell contacted with a test substance in the presence of an expression inducer is lower than that of a control cell (positive control) not contacted with the test substance in the presence of an expression inducer. Substances can be selected as candidate substances.
[0079]
More specifically, for example, using RAW264 cells to screen candidate substances that are effective ingredients for improving or treating bone metabolic disorders associated with increased osteoclast differentiation / activation, ODF Compare the expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene between the added RAW264 cells (control cells) and the RAW264 cells to which ODF and the test substance are added at the same time, and use the decrease in the expression level as an index. Substances can be sorted out. In addition, a test substance is added to RAW264 cells in which the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene has already been induced by addition of ODF, and the expression level of the NFATC1 gene or CICC4 gene in the control RAW264 cells to which no test substance is added And candidate substances can be selected from the test substances using the decrease in the expression level as an index.
[0080]
Such detection and quantification of gene expression level in the screening method of the present invention is performed using RNA prepared from the cells or a polynucleotide complementary to the RNA transcribed from the RNA and the disease marker of the present invention. As described in the above section (2-1), in addition to known methods such as Northern blotting and RT-PCR, it can be carried out using a DNA chip or the like. The degree of decrease (decrease) in gene expression used as an indicator is compared with the expression level of the corresponding gene in the control cells to which no test substance is added when the expression of NFATC1 or CICC4 gene in the cell to which the test substance is added. 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more of decrease (decrease), and in this case, the test substance can be selected as a candidate substance.
[0081]
In addition, detection and quantification of NFATC1 gene or CICC4 gene expression level is performed by introducing a fusion gene with a marker gene such as a luciferase gene into the gene region that controls the expression of the NFATC1 gene or CICC4 gene (expression control region). It can also be carried out by measuring the activity of a protein derived from a marker gene using a strain. The screening method for the NFATC1 gene or CICC4 gene expression control substance of the present invention and the screening method for the effective component of the therapeutic agent for improving or treating bone metabolic disorders of the present invention search for a target substance using the expression level of the marker gene as an index. In this sense, the concept of “NFATC1 gene” described in

claims

7 and 8 includes a fusion gene of the expression control region of NFATC1 gene and a marker gene, and the concept of “CICC4 gene”. Includes a fusion gene of the expression control region of CICC4 gene and a marker gene.
[0082]
The marker gene is preferably a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction. Specifically, in addition to the luciferase gene, the chloramphenicol / acetyltransferase gene, β-glucuronidase gene, β-galactosidase Genes and reporter genes such as the aequorin gene can also be used. Here, as the expression control region of the NFATC1 gene or CICC4 gene, for example, about 1 kb upstream of the transcription start site of the gene, preferably about 2 kb can be used. Creation of a fusion gene and measurement of activity derived from a marker gene can be performed by known methods.
[0083]
By the above screening method, a substance (candidate substance) selected from the test substance can be positioned as a gene expression inhibitor of the NFATC1 gene or the CICC4 gene. These substances are considered to be able to suppress the enhancement of osteoclast differentiation and activation by suppressing the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene. Therefore, these substances are promising candidate substances for drugs that alleviate or suppress (improve or treat) bone metabolic disorders caused by increased osteoclast differentiation / activation.
[0084]
(3-2) Screening method using protein function as an index
The present invention provides a method of screening for a substance that suppresses the function or activity of NFATC1 or CICC4.
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with cells containing NFATC1 or CICC4 or a cell fraction prepared from the cells,
(b) Measure the function or activity derived from NFATC1 or CICC4 of the cell contacted with the test substance or the cell fraction thereof, and the function or activity corresponds to the above for the control cell or the cell fraction not contacted with the test substance Comparing with the function or activity of the protein,
(c) A step of selecting a test substance that suppresses the function or activity derived from NFATC1 or CICC4 based on the comparison result of (b).
[0085]
Examples of cells used for such screening include cells that express NFATC1 gene or CICC4 gene and have NFATC1 or CICC4 regardless of origin such as endogenous or exogenous. Specific examples include mouse RAW264 cells as described in (3-1) above. The cell fraction means various fractions derived from such cells, and examples thereof include a cell membrane fraction, a cytoplasm fraction, and a cell nucleus fraction.
[0086]
As shown in the examples, the bone tissue of a patient suffering from osteoporosis, which is a type of bone metabolism disorder, has specifically increased osteoclast differentiation and activation, and NFATC1 gene or CICC4 gene It is expressed. From this finding, it is considered that the function (activity) of the protein encoded by the NFATC1 gene or the CICC4 gene is related to a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation. That is, the screening method of the present invention utilizes the fact that the protein encoded by the NFATC1 gene or CICC4 gene is associated with a bone metabolic disorder caused by increased osteoclast differentiation / activation. Therefore, the function or activity of at least one of the NFATC1 and CICC4 proteins described above is used to search for a substance having a mitigating / suppressing action on the bone metabolic disorder (which exhibits an improvement / treatment effect on the bone metabolic disorder). The reduction or suppression of this is taken as an indicator.
[0087]
That is, the screening method of the present invention is an effective method for improving or treating bone metabolic disorders caused by increased osteoclast differentiation / activation by searching for substances that suppress the function or activity of NFATC1 or CICC4. The candidate substance used as a component is provided.
[0088]
Examples of candidate substances include, but are not limited to, nucleic acids, peptides, proteins (including antibodies to NFATC1 or CICC4), organic compounds, inorganic compounds, etc. The screening of the present invention is specifically a candidate substance. It is performed by contacting a sample (test sample) containing a test substance to be obtained with the cells or cell fraction. Such test samples include, but are not limited to, cell extracts, gene library expression products, synthetic low molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
[0089]
By the way, NFATC1 is a transcription factor and is known to be involved in the expression of the Interleukin-2 gene (Mol. Cell. Biol. 19, 2300-2307 (1999)). Specifically, NFATC1 is known to be dephosphorylated by calcineurin and transferred into the nucleus, and then function as a transcription factor to increase the expression of the Interleukin-2 gene and the like (J. Biol. Chem. 276, 20805-20808 (2001), Oncogene 20, 2476-2489 (2001)). Therefore, based on this known property, screening for a candidate substance that suppresses the function or activity of NFATC1 can also be performed using a decrease in the expression level of the Interleukin-2 gene as an index. In this case, a cell having NFATC1 and capable of expressing the Interleukin-2 gene can be used as the cell.
[0090]
In this case, the expression level of the Interleukin-2 gene may be used as a direct index, or screening may be performed using the activity of the protein derived from the marker gene as an index as described above. In the latter case, specifically, as a cell having NFATC1 and capable of expressing the Interleukin-2 gene, for example, expression of the Interleukin-2 gene containing a gene sequence necessary for NFATC1 to control the expression of the Interleukin-2 gene. Using a cell line into which a fusion gene connecting a control region and a marker gene such as luciferase is introduced, the expression level of the Interleukin-2 gene is indirectly detected by measuring the activity of the protein derived from the marker gene, The method of quantifying can be mentioned.
[0091]
The marker gene is preferably a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction. Specifically, in addition to the luciferase gene, a chloramphenicol / acetyltransferase gene, a β-glucuronidase gene, a β-galactosidase gene Reporter genes such as the ze gene and the aequorin gene can also be used. Similar screening methods are known (Biochem. Cell. Biol. 74, 585-593 (1996), Biologicals 26, 1-5 (1998)), and can be performed according to this. Specifically, the selection of candidate substances is such that the activity of the protein derived from the marker gene in the cells to which the test substance is added is lower than the activity level of the protein corresponding to the above in the control cells to which no test substance is added. As an index, the test substance can be selected as a candidate substance.
[0092]
CICC4 is known to be a chloride ion channel (Am. J. Physiol. 276, F398-F408 (1999), J. Biol. Chem. 272, 12575-12582 (1997)). Therefore, based on this known property, screening for candidate substances that suppress the function of CICC4 can be performed using the membrane permeation activity of chloride ions in cells having CICC4 or cell fractions thereof as an index.
[0093]
For example, it expresses the CICC4 gene created using conventional gene recombination technology (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). The transmembrane activity of chloride ions of CICC4 can be examined for the transformed cell or its cell membrane fraction by patch clamp method using the patch clamp method. A similar measurement method is known for the same kind of chloride ion channel protein as CICC4 (J. Biol. Chem. 272, 12575-12582 (1997)), and the measurement can be performed according to this. Specifically, the selection of the candidate substance is carried out in such a manner that the membrane permeation activity of chloride ions in the cell to which the test substance is added or the cell fraction thereof is changed to the membrane permeation activity level of the control cell or the cell fraction to which the test substance is not added. The test substance can be selected as a candidate substance by being lower than that of the test substance.
[0094]
Thus, a substance selected and obtained from the test substances is a promising candidate substance for a drug that alleviates or suppresses (improves or treats) a bone metabolic disorder caused by increased osteoclast differentiation / activation.
[0095]
Candidate substances selected by the screening method of the present invention described in (3-1) or (3-2) above are further tested for efficacy, safety, and bone metabolism disorder using a bone metabolism disorder disease model animal. It may be subjected to clinical trials for patients, and by carrying out these trials, a more practical bone metabolic disorder amelioration or therapeutic agent can be obtained. The substances thus selected can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation) or genetic manipulation based on the structural analysis results.
[0096]
(4) Agents for improving or treating bone metabolic disorders
The present invention provides an agent for improving / treating diseases of abnormal bone metabolism that occur in association with increased differentiation / activation of osteoclasts.
[0097]
From the new finding that the expression of the NFATC1 gene or the CICC4 gene is associated with a bone metabolic disorder associated with increased osteoclast differentiation / activation, the NFATC1 gene (SEQ ID NO: 1 or 3) or the CICC4 gene A substance that suppresses the expression of (SEQ ID NO: 2 or 4), or a substance that suppresses the function or activity of CICC4 (SEQ ID NO: 5) or NFATC1 (SEQ ID NO: 6) is said to be effective for the improvement or treatment of the above diseases. It is based on ideas. That is, the agent for improving or treating a bone metabolic disorder of the present invention comprises a substance that suppresses the expression of NFATC1 gene or CICC4 gene, or a substance that suppresses the function or activity of NFATC1 or CICC4 as an active ingredient.
[0098]
The NFATC1 gene or CICC4 gene expression-suppressing substance, or the substance that suppresses the function or activity of NFATC1 or CICC4, which is the active ingredient, relates to the selected substance as well as those selected using the above screening method. It may be industrially produced according to a conventional method based on information.
[0099]
NFATC1 or CICC4 gene expression-suppressing substance, or NFATC1 or CICC4 function (activity) -suppressing substance is used as it is or a pharmaceutically acceptable carrier (excipient, extender, binder, lubricant, etc.). And a conventional additive can be mixed to prepare a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition is prepared in a form (oral administration such as tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups; parenteral administration such as injections, drops, external preparations, suppositories, etc.), etc. Depending on the dosage, it can be administered orally or parenterally. The dose varies depending on the type of active ingredient, administration route, administration subject or patient's age, weight, symptoms, etc., and cannot be defined unconditionally, but the daily dose is several hundred mg to 2 g, preferably about several tens mg. Can be administered in one to several times a day.
[0100]
In addition, if the above substance is encoded by DNA, it may be possible to incorporate the DNA into a gene therapy vector and perform gene therapy. Furthermore, when the active ingredient is an antisense oligonucleotide of the NFATC1 gene or CICC4 gene, gene therapy can be performed as it is or by incorporating it into a gene therapy vector. In these cases, the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but those skilled in the art can appropriately select them.
[0101]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
Reference example 1 Creation of mouse ODF protein
ODF [osteoclast differentiation factor] (ODF is also called RANKL. Bone 27, 761-764 (2000)), which is a differentiation-inducing protein necessary for osteoclast differentiation, was prepared as follows.
[0102]
RNA is extracted from mouse stromal cell ST2 having ODF gene, and then 1 μg of cDNA prepared from 3 μg of extracted RNA is used as a template, the oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 7 is a sense primer, and the sequence shown in SEQ ID NO: 8 PCR was performed using oligonucleotides as an antisense primer to amplify an ODF (osteoclast differentiation factor) gene. In addition, PCR method uses Pfx DNA polymerase (manufactured by GIBCO-BRL), and after performing 5 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 52 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute according to the attached protocol, It was carried out by performing 15 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 56 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute. The ODF gene obtained by amplification by such a PCR method is cleaved with the restriction enzyme MnuI, and placed in the EcoRI site located downstream of the coding region of GST (glutathione S-transferase) of the pGEX-2TK vector (Amersham Pharmacia Biotech). Inserted to create a GST / ODF fusion protein expression plasmid.
[0103]
The resulting GST / ODF fusion protein expression plasmid was then used to transform E. coli, and the transformant was precultured for 7 hours in a medium containing ampicillin (final concentration 50 ng / ml). The obtained transformant was further OD in 250 ml of LB medium containing ampicillin in the same manner. ₅₅₀ The culture was continued at 37 ° C. until the value reached 0.6. Thereafter, IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactoside) was added to a final concentration of 0.25 mM, and the cells were cultured at 18 ° C. for 12 hours. After incubation, the cells are collected by centrifugation at 6000 rpm for 10 minutes, suspended in 20 ml of NETN (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40) and sonicator at 4 ° C. (Power max, 4 times in 20 seconds). This was centrifuged twice at 9000 rpm for 30 minutes to recover the supernatant, which was used as the E. coli disruption solution. 250 μl of glutathione sepharose beads were added to this E. coli disrupted solution and reacted at 4 ° C. for 2 hours or more. After that, centrifuge to collect only the beads, 3 times with NETN, and Elution buffer (20 mM NaCl, 4 mM MgCl ₂ , 1mM 2-Mercaptoethanol, 20mM HEPES / NaOH pH7.4), add 250µl of glutathione solution (100mM glutathione reduced form, 100mM Tris-HCl pH8.0, 1M NaCl) to 4 ℃ for 2 hours or more After the reaction, the recombinant protein (GST / ODF fusion protein) was eluted from the beads. Next, the obtained GST / ODF fusion protein was purified by SDS-PAGE, filter sterilized, and used as an osteoclast differentiation-inducing protein in the following experiment.
[0104]
As a control product, a pGEX-2TK vector not incorporating the ODF gene was also subjected to the same operation as described above to obtain a GST protein.
[0105]
Example 1 Osteoclast differentiation of mouse RAW264 cells by ODF addition
Using the ODF protein (GST / ODF fusion protein) prepared in Reference Example 1, mouse RAW264 cells (macroid-like cells derived from Leukemic monocyte) having the properties of osteoclast precursor cells were differentiated into osteoclasts. .
[0106]
Specifically, before use, mouse RAW264 cells were pre-cultured in E-MEM medium (containing 10% fetal bovine serum and penicillin 50 U / mL) at 37 ° C, CO ₂ Cultivate under conditions of 5% concentration, and replace the medium with the ODF protein (GST / ODF fusion protein) or GST protein (control protein) prepared in Reference Example 1 the day after culturing RAW264 cells overnight. The cells were further cultured for 4 days under the same conditions. The differentiation into osteoclasts was examined by TRAP staining (tartrate resistant acid phosphatase staining). In RAW264 cells supplemented with ODF protein (GST / ODF fusion protein), TRAP-positive multinucleated cells begin to appear 72 hours after TRAP staining, and the majority of cells become osteoclast-like multinucleated cells 96 hours later. Observed. On the other hand, when GST protein was added to RAW264 cells instead of the ODF protein (GST / ODF fusion protein), differentiation into osteoclasts was not observed. From this, it was confirmed that RAW264 cells differentiate into osteoclasts based on the function (differentiation inducing ability) of the ODF protein in the GST / ODF fusion protein prepared in Reference Example 1.
[0107]
Example 2 Preparation of total RNA from RAW264 cells during osteoclast differentiation
Total RNA was prepared for GST / ODF fusion protein-added RAW264 cells (hereinafter also referred to as “ODF protein-treated RAW264 cells” in the present specification) in which differentiation into osteoclasts was observed in Example 1. Specifically, after adding the GST / ODF fusion protein in the same manner as in Example 1, total RNA was prepared from RAW264 cells after 2, 5, 12, 24, 48, 72, and 96 hours of culture. The total RNA was prepared by washing the cells from which the culture supernatant had been removed with ice-cooled PBS (phosphate-buffered saline) three times, and then using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) according to the attached protocol. The obtained total RNA was dissolved in a TE solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA).
[0108]
Similarly, total RNA was prepared from RAW264 cells cultured without any addition for comparison (hereinafter also referred to as “untreated RAW264 cells”), and replaced with a GST / ODF fusion protein. As for RAW264 cells to which GST protein is added (hereinafter also referred to as “GST protein-treated RAW264 cells” in this specification), the

culture

2, 5, 12, 24, 48, 72, 96 is added after adding GST protein. After a lapse of time, total RNA was prepared in the same manner.
[0109]
Example 3 DNA chip analysis
DNA chip analysis was performed using the total RNA prepared in Example 2. The DNA chip analysis was performed using Affymetrix Gene Chip Murine Genome U74A. Specifically, analysis includes (1) preparation of cDNA from total RNA, (2) preparation of labeled cRNA from the cDNA, (3) fragmentation of labeled cRNA, (4) fragmented cRNA and probe array (5) staining of the probe array, (6) scanning of the probe array, and (7) gene expression analysis.
[0110]
(1) Preparation of cDNA from total RNA
An 11 μL mixed solution containing 10 μg of each total RNA obtained in Example 2 and 100 pmol of T7- (dT) 24 primer (manufactured by Amersham) was heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then cooled on ice. After cooling, 4 μL of 5 × First Strand cDNA Buffer included in SuperScript Choice System for cDNA Synthesis (Gibco-BRL), 2 μL of 0.1 M DTT (dithiothreitol) included in the kit, and 1 μL of 10 mM dNTP Mix included in the kit Added and heated at 42 ° C. for 2 minutes. Further, 2 μL (400 U) of Super Script II RT contained in the kit was added, heated at 42 ° C. for 1 hour, and then cooled on ice. After cooling, DEPC-treated water (manufactured by Nacalai Tesque) 91 μL sterilized distilled water, 5 × Second Strand Reaction Buffer 30 μL included in the kit, 10 mM dNTP Mix 3 μL included in the kit E. coli DNA Ligase 1μL (10U), included in the kit E. coli DNA Polymerase I 4μL (40U), included in the kit E. coli 1 μL (2U) of RNaseH was added and reacted at 16 ° C. for 2 hours. Next, 2 μL (10 U) of T4 DNA Polymerase contained in the kit was added, and the mixture was reacted at 16 ° C. for 5 minutes, and then 10 μL of 0.5 M EDTA was added. Next, 162 μL of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution (Nippon Gene) was added and mixed. The mixture was transferred to Phase Lock Gel Light (manufactured by Eppendorf) that had been centrifuged at 14,000 rpm for 30 seconds in advance, and centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes at room temperature, and then a 145 μL aqueous layer was added to the Eppendorf tube. Moved to. The resulting solution was mixed with 72.5 μL of 7.5 M ammonium acetate solution and 362.5 μL of ethanol, and then centrifuged at 14,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. After centrifugation, the supernatant was discarded to obtain a pellet containing the prepared cDNA. Thereafter, 0.5 mL of 80% ethanol was added to the pellet and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was discarded. After performing the same operation again, the pellet was dried and dissolved in 12 μL of DEPC-treated water. From the above operations, each cDNA was obtained from each total RNA prepared in Example 2.
[0111]
(2) Preparation of labeled cRNA from cDNA
5 μL of each cDNA solution, 17 μL of DEPC-treated water, 4 μL of 10 × HY Reaction Buffer included in BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (manufactured by ENZO), 4 μL of 10 × Biotin Labeled Ribonucleotides included in the kit, included in the kit 4 μL of 10 × DTT, 4 μL of 10 × RNase Inhibitor Mix included in the kit, and 2 μL of 20 × T7 RNA Polymerase included in the kit were mixed and reacted at 37 ° C. for 5 hours to prepare labeled cRNA. After the reaction, 60 μL of DEPC-treated water was added to the reaction solution, and the prepared labeled cRNA was purified using RNeasy Mini Kit (manufactured by GIAGEN) according to the attached protocol.
[0112]
(3) Fragmentation of labeled cRNA
To a solution containing 20 μg of each labeled cRNA, 8 μL of 5 × Fragmentation Buffer (200 mM Tris-acetate pH 8.1 (Sigma), 500 mM potassium acetate (Sigma), 150 mM magnesium acetate (Sigma)) was added. 40 μL of the reaction solution was heated at 94 ° C. for 35 minutes and then placed on ice. This fragmented the labeled cRNA.
[0113]
(4) Hybridization of fragmented cRNA and probe array
5 nM in 40 μL of each fragmented cRNA Control Oligo B2 (Amersham) 4 μL, 100 × Control cRNA Cocktail 4 μL, Herring sperm DNA (Promega) 40 μg, Acetylated BSA (Gibco-BRL) 200 μg, 2 × MES Hybridization Buffer (200 mM MES, 2M [Na ⁺ ], 40 mM EDTA, 0.02% Tween20 (Pierce), pH 6.5-6.7) 200 μL and DEPC-treated water 144 μL were mixed to obtain 400 μL of hybrid cocktail. Each obtained hybrid cocktail was heated at 99 ° C. for 5 minutes, and further heated at 45 ° C. for 5 minutes. After heating, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at room temperature to obtain a hybrid cocktail supernatant.
[0114]
On the other hand, the Murine genome U74A probe array (Affymetrix) filled with 1 × MES hybridization buffer was rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 10 minutes, and then 1 × MES hybridization buffer was removed. A probe array was prepared. 200 μL of the hybrid cocktail supernatant obtained above was added to the probe array and rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 16 hours to obtain a probe array hybridized with the fragmented cRNA.
[0115]
(5) Staining the probe array
After collecting and removing the hybrid cocktail from each of the hybridized probe arrays obtained above, Non-Stringent Wash Buffer (6 × SSPE (diluted 20 × SSPE (Nacalai Tesque)), 0.01% Tween20, 0.005% Antifoam0 -30 (manufactured by Sigma)). Next, a probe array hybridized with the fragmented cRNA at a predetermined position of GeneChip Fluidics Station 400 (Affymetrix) with Non-Stringent Wash Buffer and Stringent Wash Buffer (100 mM MES, 0.1 M NaCl, 0.01% Tween20) set Installed. Thereafter, according to the staining protocol EuKGE-WS2, primary staining solution (10 μg / mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE) (Molec μLar Probe), 2 mg / mL Acetylated BSA, 100 mM MES, 1 M NaCl (Ambion), 0.05% Tween20, 0.005 % Antifoam0-30), secondary staining solution (100 μg / mL Goat IgG (Sigma), 3 μg / mL Biotinylated Anti-Streptavidin antibody (Vector Laboratories), 2 mg / mL Acetylated BSA, 100 mM MES, 1M NaCl, 0.05 % Tween 20, 0.005% Antifoam 0-30).
[0116]
(6) Probe array scanning, and (7) Gene expression analysis
Each stained probe array was subjected to HP GeneArray Scanner (Affymetrix) and the staining pattern was read. Based on the staining pattern, gene expression on the probe array was analyzed by GeneChip Workstation System (Affymetrix). Next, normalization and comparative analysis of gene expression were performed according to the analysis protocol.
[0117]
Example 4 Variation analysis of gene expression in in vitro osteoclast differentiation system using RAW264 cells
After adding the GST / ODF fusion protein, the gene expression level (average difference) in each RAW264 cell after the

culturing

2, 5, 12, 24, 48, 72, and 96 hours is expressed as the expression level in the untreated RAW264 cell. Comparison was made using an analysis tool Comparison Analysis in GeneChip Workstation System (Affymetrix). Comparison Analysis was performed based on the analysis protocol.
[0118]
Next, after adding the GST / ODF fusion protein, after adding the GST protein, the gene expression level (average difference) in each RAW264 cell after 2, 5, 12, 24, 48, 72, 96 hours of culture The gene expression level (average difference) in each RAW 264 cell after culturing 2, 5, 12, 24, 48, 72, and 96 hours was compared with each other for the elapsed time in the same manner.
[0119]
Expression variation genes were selected from the values of the increase / decrease in gene expression (Diff Call) and the expression variation magnification (Fold Change) obtained from the results of these comparative analyses. The selection method shows that, at each culture time, the gene expression level (average difference) in GST protein-treated RAW264 cells was compared with the gene expression level in untreated RAW264 cells and the gene expression level in GST protein-treated RAW264 cells. Both of these probes were selected to show expression fluctuations of 2 times or more (Diff Call was judged as I or D and Fold Change was -2 or less or 2 or more). The same analysis was performed on the cells at all the culture times, and probes that showed an expression variation of 2 times or more at all the culture times were selected.
[0120]
Example 5 Variation analysis of gene expression in human osteoporosis bone and normal human bone
Total RNA was prepared from 1 sample of bone tissue of human osteoporosis patient and 3 samples of normal human bone tissue, and DNA chip analysis was performed using the obtained total RNA. DNA chip analysis was performed in the same manner as in Example 3 using Affymetrix Gene Chip Human Genome U95A, B, C, D, E. Further, as in Examples 3 and 4, from the comparative analysis of gene expression, probes that showed an expression increase of 3 times or more in the bone tissue of osteoporosis patients were selected compared to normal bone tissue. As shown in Table 1, the selection probes contain osteoclast-specific expression genes such as TRAP5 and CatepsinK, and the above-described selection methods can certainly produce osteoclast-specific expression genes. It was confirmed that
[0121]
[Table 1]

[0122]
In the table, the expression multiplication factor indicates the gene expression level in the bone tissue of an osteoporosis patient when the gene expression level in normal bone tissue is 1.
[0123]
From the selected probes, probes that were expressed only in the bone tissue of osteoporosis patients were further selected. Specifically, using Abs Call obtained from DNA chip analysis results as an index, Abs Call in bone tissue of osteoporosis patients is a Present probe, and Abs Call in normal bone tissue is all Absent probes. did.
[0124]
Example 6 Genes that showed both inducible expression in osteoclast differentiation in vitro and increased expression in bone of osteoporosis patients
In Example 4, a mouse gene that showed expression induction in an in vitro osteoclast differentiation system using RAW264 cells, and in Example 5, the gene expression in osteoporotic patients' bones and normal bones was compared. A common gene was selected from human genes that had been expressed. These mouse genes and human genes were associated with each other based on the gene name and protein name, or using Homologene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/). As a result, NFATC1 gene and CICC4 gene were selected (Table 2, Table 3, Table 4).
[0125]
[Table 2]

[0126]
The time-dependent change of the expression fluctuation of average difference value using Murine Genome U74A Chip is shown. GST / ODF represents RAW264 cells to which GST / ODF fusion protein was added, and GST represents RAW264 cells to which GST protein was added. The expression variation of the NFATC1 gene with the passage of the culture time of each cell is shown. In addition, 0 hour is an average difference value in untreated RAW264 cells. The probe name of the NFATC1 gene in Murine Genome U74A Chip is 102209 # at.
[0127]
[Table 3]

[0128]
The time-dependent change in the expression difference of the average difference value using Murine Genome U74A Chip was shown. The probe name of CICC4 gene in Murine Genome U74A Chip is 94255 # g # at.
[0129]
[Table 4]

[0130]
In the table, the expression multiplication factor indicates the gene expression level in the bone tissue of an osteoporosis patient when the gene expression level in normal bone tissue analyzed by Human Genome U95 Chip is set to 1.
[0131]
As can be seen from the results in Table 4, these two genes are not expressed in normal bone tissue, and the expression is increased in diseases of abnormal bone metabolism related to increased osteoclast differentiation / activation. Therefore, it was considered to be a gene that can be applied as a marker gene for the bone metabolic disorder. In addition, by using these genes, it is possible to screen for candidate drugs for therapeutic agents that alleviate or suppress bone metabolic disorders related to increased osteoclast differentiation / activation.
[0132]
Example 7 Correlation between osteoclast differentiation and NFATC1 gene expression
2.5 x 10 in 24 hole plate ^Four , 5 × 10 ^Four , 1 × 10 ^Five , 2 × 10 ^Five Each RAW264 cell was seeded, and the number of osteoclasts (TRAP positive MN cells: multinucleated cells stained with TRAP staining) differentiated 96 hours after addition of the GST / ODF fusion protein was counted under a microscope. For TRAP staining, the cells were washed 3 times with PBS, fixed in methanol for 30 seconds, and a solution containing a tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) substrate (Naphthol AS-MX phosohate) and a dye (Fastredviolet LB salt) was added. Incubated at 37 ° C for 30 minutes to 2 hours (Takahasi N. et al., Endcrinology, 122, p1373-p1382 (1988)), and the cells stained red were determined to be TRAP positive MN cells (osteoclasts) . The result of counting the number of osteoclasts within a certain area in the plate is shown in FIG. 1a. Figure 1a shows 2.5 x 10 ^Four Expressed as a percentage (%) to the number of osteoclasts (100%) in the case of individual. The result is an average of three times. As shown in Figure 1a, 2.5 x 10 ^Four Cells (Low density culture conditions: Cell density 1.3 x 10 ^Four Cells / cm ² (Below) Occasionally about 2500 osteoclasts were seen. But 5 × 10 ^Four In the case of cells, the number of osteoclasts decreases to about 10% of the above, and 10 × 10 ^Four Cells (high density culture conditions: approx. 5 x 10 ^Four Cells / cm ² Above), it decreased to less than 5%.
[0133]
FIG. 1b shows the morphology of RAW264 cells 96 hours after addition of GST / ODF fusion protein. The left is the low density culture condition (2.5 × 10 ^Four When RAW264 cells were seeded, giant osteoclasts were found in the RAW264 cells. On the right is a high-density culture condition (20 × 10 ^Four RAW264 cells) when seeded with individual RAW264 cells. From this, it was found that osteoclast differentiation was inhibited even when GST / ODF fusion protein was added when RAW264 cells were cultured at high density.
[0134]
To confirm the correlation between osteoclast differentiation and increased expression of the NFATC1 gene, GST / ODF fusion protein was added to each of RAW264 cells cultured at high density and RAW264 cells cultured at low density. Total RNA was prepared from RAW264 cells after 24 hours, and DNA chip analysis was performed using Affymetrix Gene Chip Murine Genome U74A in the same manner as in Example 3. In order to compare the gene expression of each “ODF protein-treated RAW264 cell” during high-density culture and low-density culture, the gene expression level (average difference) in each RAW264 cell after 2, 5, 12 and 24 hours of culture. Was analyzed using GeneChip Workstation System (Affymetrix). Table 5 shows changes over time in the expression level (average difference) of the NFATC1 gene after addition of the GST / ODF fusion protein using Affymetrix Gene Chip Murine Genome U74A. In the table, “low density culture” represents osteoclast differentiation conditions, and “high density culture” represents osteoclast differentiation inhibition conditions. The value of 0 hour is an average difference in untreated RAW264 cells. The probe name of the NFATC1 gene in Murine Genome U74A Chip is 102209 # at.
[0135]
[Table 5]

[0136]
As shown in Table 5, NFATC1 gene, which showed a significant increase in expression 2 to 5 hours after addition of GST / ODF fusion protein in ODF protein-treated RAW264 cells, did not increase in expression in RAW264 cells during high-density culture. . There was a correlation between osteoclast differentiation and increased expression of the NFATC1 gene, confirming that the NFATC1 gene is important for osteoclast differentiation.
[0137]
Example 8 Changes in NFATC1 protein during osteoclast differentiation
Changes in NFATC1 (protein) during osteoclast differentiation of ODF protein-treated RAW264 cells were examined. Prepare protein fractions from untreated RAW264 cells and

RAW264 cells

24, 48, 72 and 96 hours after addition of GST / ODF fusion protein, anti-NF-ATc1 antibody 7A6 (manufactured by Santa Cruz), anti-β-actin antibody Western blot analysis was performed using AC-74 (Sigma). Western blot analysis was performed in the same manner as described in Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 278-283 (2001) using 3 μg of protein fraction in each lane. As shown in FIG. 2a, NFATC1 (protein) was hardly observed in untreated RAW264 cells, but a significant increase in NFATC1 (protein) was observed 24 hours after the addition of the GST / ODF fusion protein. . In the figure, 0 hour indicates the result of untreated RAW264 cells.
[0138]
In addition, the expression of NFATC1 (protein) in RAW264 cells under high-density culture conditions was examined. 5 x 10 in 10 cm culture dish ^Five Cells (low density culture conditions), 10 x 10 ^Five Cell, 20 × 10 ^Five Cell, 40 × 10 ^Five Cells are seeded with RAW264 cells (high-density culture conditions), and proteins are prepared from RAW264 cells 24 hours after adding the GST / ODF fusion protein. Of these, 5 μg of each protein fraction is used as above. Western blot analysis was performed. As shown in FIG. 2b, NFATC1 (protein) was not detected during high-density culture in which differentiation into osteoclasts was inhibited, and a result correlated with osteoclast differentiation and the appearance of NFATC1 protein was obtained.
[0139]
Example 9 Effects of cyclosporine on osteoclast differentiation
NFATC1 (protein) is dephosphorylated by calcineurin and translocated to the nucleus, and functions as a transcription factor (J. Biol. Chem. 276, 20805-20808 (2001), Oncogene 20, 2476-2489 (2001)). On the other hand, cyclosporin A binds to the cyclophilin protein and inhibits the dephosphorylation of calcineurin and prevents NFATC1 (protein) nuclear translocation (Cell 66, 807-815 (1991), J. Biol. Chem. 271, 10884-10891 (1996), Nature 382, 370-373 (1996), Nature 383, 837-840 (1996)). Cyclosporin A (CsA: manufactured by Sigma) was added to RAW264 cells simultaneously with GST / ODF fusion protein at final concentrations of 0, 10, 100, 1000 ng / ml, and osteoclasts differentiated 96 hours later ( The number of TRAP positive MN cells) was counted in the same manner as in Example 7. The results are shown in FIG. In FIG. 3, it represented with the ratio (%) with respect to the number of osteoclasts (100%) in the case of Control (CsA: 0 ng / ml). The result is an average of three times. When cyclosporin A was added to ODF protein-treated RAW264 cells, osteoclast differentiation was inhibited in a cyclosporin concentration-dependent manner, and most of the osteoclasts were added when 1000 ng / ml of cyclosporin A was added. Not detected.
[0140]
Cyclosporin A (CsA) was added to RAW264 cells at the same time as the GST / ODF fusion protein to a final concentration of 0, 10, 100, 1000 ng / ml, and 72 hours later, the total protein fraction prepared from each cell, Using the nuclear and cytoplasmic fractions, the intracellular localization of NFATC1 (protein) was examined. The fractionation of the nuclear fraction and the cytoplasm fraction was performed according to the method described in “Cells: a laboratory manual” DL. Spector, RD. Goldman, LA. Leinwand, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998). Western blot analysis was performed using anti-NF-ATc1 antibody 7A6 (manufactured by Santa Cruz), anti-β-, using the total protein fraction, nuclear fraction and cytoplasm fraction prepared from an equal amount of cells for each cyclosporine treatment condition. Actin antibody AC-74 (manufactured by Sigma) and anti-Rb antibody G3-245 (manufactured by PharMingen) were used. The results are shown in FIG. As can be seen from the figure, a large amount of NFATC1 (protein) was detected in the nuclear fraction in RAW264 cells to which no cyclosporin A was added. However, when cyclosporin A was added at 1000 ng / ml, NFATC1 (protein) was abundant in the cytoplasm fraction and only a small amount was detected in the nuclear fraction (FIG. 4).
[0141]
Example 10 Effect of NFATC1 gene suppression on osteoclast differentiation
First, a plasmid used for suppressing expression of the NFATC1 gene was prepared as follows. CDNA was synthesized from RNA prepared from ODF protein-treated RAW264 cells, and a DNA fragment of the NFATC1 gene was obtained by PCR using the primers shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. After cloning this DNA fragment into the pGEM-T vector (Promega), 231 bases including the 5 ′ end of the NFATC1 gene were excised with the restriction enzymes Not I and Sma I, and the TRE / vector of the pTRE2 vector (Clontech) was excised. It inserted in the reverse direction between the restriction enzyme sites Not I and Pvu II downstream of the minCMV promoter. Thus, a plasmid pNFATC1-AS capable of generating NFATC1 antisense RNA depending on tetracycline or doxycycline was prepared.
[0142]
Cells expressing NFATC1 antisense can be obtained by introducing plasmid pNFATC1-AS into RT3 cells (RAW264 cells previously introduced with pTet-On plasmid (manufactured by Clontech)) and selecting cells resistant to neomachines and hygromycin. Prepared. In addition, Tet-On for the production and selection of cells expressing the NFATC1 antisense (RT3 / NFATC1-AS cells) ^TM Using gene expression system (Clontech), attached user manual and “Molecular Cloning, a laboratory manual 3 ^rd edition "J. Sambrook, DW. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).
[0143]
RAW264 cells, RT3 cells (RT3 into which only pTet-On plasmid was introduced) under the conditions of 20μM doxycycline (indicated by DOX in the figure) (DOX +) or no addition (DOX-) 72 hours after addition of GST / ODF fusion protein Cell fractions) and RT3 / NFATC1-AS cells, and Western blot analysis using anti-NF-ATc1 antibody 7A6 (Santa Cruz) and anti-β-actin antibody AC-74 (Sigma) went. In Western blot analysis using anti-NF-ATc1 antibody, 10 μg of protein fraction was used. In Western blot analysis using an anti-β-actin antibody, each 5.7 μg protein fraction was used. In RT3 / NFATC1-AS cells, a decrease in NFATC1 (protein) was observed, confirming suppression of NFATC1 expression (FIG. 5a).
[0144]
The number of osteoclasts (TRAP positive MN cells) differentiated from RAW264 cells, RT3 cells and RT3 / NFATC1-AS cells under the same conditions as above were counted in the same manner as in Example 7. The result is shown in FIG. The figure shows the ratio (%) with respect to the number of osteoclasts (100%) in untransformed RAW264 cells in doxycycline-free (DOX-). The result is an average of three times. The number of osteoclasts differentiated by the addition of GST / ODF fusion protein was similar to that of untransformed RAW264 cells in RT3 cells transfected only with pTet-On plasmid, but in RT3 / NFATC1-AS cells The number of osteoclasts was significantly reduced.
[0145]
As described above, from Example 9 above, it is shown that the differentiation of osteoclasts is suppressed by using cyclosporin A to prevent NFATC1 nuclear translocation and inhibit the function of NFATC1. (Note that NFATC1 does not function unless it is transferred to the nucleus.) In addition, from Example 10 above, it was shown that osteoclast differentiation is suppressed by suppressing the expression of NFATC1 with the antisense nucleotide of the NFATC1 gene. These results demonstrate that osteoclast differentiation can be suppressed by suppressing the function or activity of NFATC1 or by suppressing the expression of the NFATC1 gene. That is, from the results of Examples 9 and 10 above, by inhibiting the expression of the NFATC1 gene, or by suppressing the function or activity of NFATC1, a bone metabolic disorder that occurs in association with increased osteoclast differentiation Can be improved or treated.
[0146]
Example 11 Screening for NFATC1 gene and / or CICC4 gene expression inhibitor
Mouse RAW264 cells are cultured under the same conditions as in Example 1. Count 5x10 RAW264 cells ^Three /cm ² Seed the plate at 37 ° C, CO ₂ Incubate overnight at 5% concentration. The next day, the medium is replaced with a medium containing the final concentration of 100 ng / ml of the ODF protein described in Reference Example 1, and test substance-containing solutions prepared at concentrations of 100 μM, 10 μM, and 1 μM are added, respectively, at 37 ° C., CO ₂ Incubate at 5% concentration for 2 days. Here, as a control experiment, cells to which no test substance is added are also cultured in the same manner (control). Using the RNA extracted from each of these cultured cells, the expression level of the NFATC1 gene and / or CICC4 gene is examined by the method described in Example 3. The test substance added to the culture system in which the expression level of the NFATC1 gene and / or CICC4 gene is reduced by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more from the expression level of the control is compared with the control. Select candidate compounds to alleviate or suppress (improve, treat).
[0147]
【The invention's effect】
According to the present invention, genes (NFATC1 gene and CICC4 gene) whose expression is specifically increased in diseases of abnormal bone metabolism associated with increased differentiation and activation of osteoclasts, for example, diseases such as arthritis and osteoporosis, are obtained. It was revealed. Such a gene is useful as a marker gene (probe, primer) used for genetic diagnosis of diseases of abnormal bone metabolism associated with increased osteoclast differentiation / activation. According to such marker genes, it is possible to clarify whether or not the bone metabolic disorder is a disease associated with increased osteoclast differentiation / activation (the diagnostic accuracy is improved), and this is more appropriate. It becomes possible to perform various treatments. That is, it can be used as a tool for appropriate treatment of bone metabolic disorder.
[0148]
In addition, because of the relationship between increased expression of the above-mentioned gene and increased osteoclast differentiation / activation and associated bone metabolic disorder, a compound that suppresses the expression of the gene is used as a therapeutic agent for the above-mentioned bone metabolic disorder. It seems useful. Therefore, according to the gene of the present invention, a candidate drug that can be used as a therapeutic agent for a bone metabolic disorder caused in association with increased osteoclast differentiation / activation by using suppression or decrease in its expression as an index. Screening selection is possible. That is, the present invention is useful for the development of a therapeutic agent for diseases of abnormal bone metabolism associated with increased osteoclast differentiation / activation.
[0149]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1a shows the relationship between the number of RAW264 cells seeded in a 24-well plate and the number of osteoclasts (TRAP positive MN cells) 96 hours after addition of GST / ODF fusion protein in Example 7. It is a figure which shows a result. The figure shows RAW264 cells 2.5 x 10 ^Four It is expressed as a ratio (%) to the number of osteoclasts (100%) in the case of individual. The result is an average of three times. FIG. 1b is a diagram showing the morphology of RAW264 cells in Example 7 after 96 hours addition of GST / ODF fusion protein under low-density culture conditions and high-density culture conditions. The left is under low-density culture conditions (2.5 × 10 ^Four RAW264 cells at the time of seeding RAW264 cells. On the right is a high-density culture condition (2 x 10 ^Five RAW264 cells when seeded with individual RAW264 cells.
FIG. 2a shows the expression of NFATC1 (protein) and β-actin (protein) in untreated RAW264 cells and

RAW264 cells

24, 48, 72 and 96 hours after addition of GST / ODF fusion protein in Example 8. It is a figure which shows the result of having investigated by Western blot analysis. Note that 0 hour refers to untreated RAW264 cells. FIG. 2b shows the relationship between the number of RAW264 cells seeded in a 10 cm culture dish and the appearance of NFATC1 (protein) and β-actin (protein) 24 hours after addition of the GST / ODF fusion protein in Example 8. It is a figure which shows the result investigated by blot analysis.
FIG. 3 shows the concentration of cyclosporin A (CsA) added to RAW264 cells and the number of osteoclasts (TRAP positive MN cells) 96 hours after addition of GST / ODF fusion protein in Example 9. It is a figure which shows the result of having investigated the relationship. The figure shows the ratio (%) to the number of osteoclasts (100%) in the case of Control (CsA: 0 ng / ml). The result is an average of three times.
FIG. 4 shows the concentration of cyclosporin A (CsA) added to RAW264 cells and NFATC1 (protein) and retinoblastoma (protein) in RAW264 cells 72 hours after addition of GST / ODF fusion protein in Example 9. It is a figure which shows the result of having investigated the relationship with the appearance of (beta) -actin (protein) by Western blot analysis. In the figure, total indicates the total protein fraction, nuclear indicates the nuclear fraction, and cytoplasm indicates the cytoplasmic fraction.
FIG. 5a shows NFATC1 in RAW264 cells, RT3 cells and RT3 / NFATC1-AS cells in Example 10 under the conditions of doxycycline (indicated by DOX) (DOX +) and no addition (DOX−). It is a figure which shows the result of having investigated the appearance of (protein) and (beta) -actin (protein) by Western blot analysis. FIG. 5b shows osteoclasts differentiated from RAW264 cells, RT3 cells, and RT3 / NFATC1-AS cells under the conditions of doxycycline addition (DOX +) and no addition (DOX−) in Example 10 (TRAP positive MN cells). It is a figure which shows the result of having investigated the number. The figure shows the percentage (%) of osteoclasts (100%) in untransformed RAW264 cells in the absence of doxycycline (DOX-). The result is an average of three times.

Claims

被験者から採取した骨組織におけるIn bone tissue taken from the subject NF-ATc isoform a NF-ATc isoform a 遺伝子またはGene or Chloride intracellular channel 4Chloride intracellular channel 4 遺伝子の遺伝子発現レベル、若しくはThe gene expression level of the gene, or NF-ATc isoform aNF-ATc isoform a 遺伝子またはGene or Chloride intracellular channel 4Chloride intracellular channel 4 遺伝子の発現産物であるタンパク質の量を、正常な骨組織における上記に対応する遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量と比較し、両者の違いを測定する工程を有する、被験者について骨代謝異常疾患を検出する方法。Compare the amount of the protein, which is the gene expression product, with the corresponding gene expression level or the amount of protein in normal bone tissue, and measure the difference between the two, and detect a bone metabolic disorder in a subject. Method.

配列番号５に記載のNF-ATc isoform aのアミノ酸配列よりなるタンパク質、または配列番号６に記載のChloride intracellular channel 4のアミノ酸配列よりなるタンパク質を認識する抗体を有する、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の疾患マーカー。 Differentiation and activation of osteoclasts having an antibody that recognizes a protein consisting of the amino acid sequence of NF-ATc isoform a described in SEQ ID NO: 5 or a protein consisting of the amino acid sequence of Chloride intracellular channel 4 described in SEQ ID NO: 6 A disease marker for diseases of abnormal bone metabolism related to the increase of aging.

破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の検出においてプローブとして使用される請求項２記載の疾患マーカー。The disease marker according to claim 2, which is used as a probe in the detection of a disease of abnormal bone metabolism associated with increased osteoclast differentiation / activation.

下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の判断指標の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項２または３に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、被験者の骨組織におけるNF-ATc isoform a遺伝子またはChloride intracellular channel 4遺伝子の発現産物の量を、正常な骨組織における上記に対応する発現産物の量と比較する工程。A method for detecting a determination index of a bone metabolic disorder related to increased osteoclast differentiation / activation, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding a protein prepared from a biological sample of a subject and the disease marker according to claim 2 or 3 ,
(B) measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) Based on the measurement results of (b), the amount of the expression product of the NF-ATc isoform a gene or the Chloride intracellular channel 4 gene in the bone tissue of the subject is the amount of the expression product corresponding to the above in the normal bone tissue. Step to compare with.