JP2006141233A - Secretory protein relating to enlargement of fat cell - Google Patents

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寿幸 三上
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a disease marker useful for diagnosing and treating a disease followed by enlargement of fat cell. <P>SOLUTION: The disease marker for a disease followed by enlargement of fat cell comprises an antibody for recognizing protein having a polynucleotide with at least continuous 15 bases and/or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in a base sequence described in any of sequence numbers 1-25 or an antibody recognizing protein having an amino acid sequence described in any of sequence numbers 26-50. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断に有用な疾患マーカー及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、肥満症、II型糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化症等の脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断においてプライマー又は検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカー、かかる疾患マーカーを利用した当該疾患の検出方法（診断方法）、当該疾患の改善剤又は治療剤として有効な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法によって得られる改善剤又は治療剤に関する。   The present invention relates to a disease marker useful for diagnosis of a disease associated with fat cell hypertrophy and use thereof. More specifically, the present invention relates to a disease marker that can be effectively used as a primer or a detection probe in the diagnosis of diseases associated with fat cell hypertrophy, such as obesity, type II diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, etc. The present invention relates to a detection method (diagnostic method) of the disease using such a disease marker, a method of screening a substance effective as an ameliorating agent or therapeutic agent for the disease, and an improving agent or therapeutic agent obtained by the method.

肥満すなわち脂肪細胞の数の増加と脂肪細胞自身の肥大化が見られる状態は、一般に糖尿病や高血圧、動脈硬化、脳卒中、心筋梗塞などの病態を発症させる引き金となる共通の基盤と考えられている。脂肪蓄積および肥大化によりおこる病態の発症には脂肪細胞がつくるタンパク質が関与しており、脂肪組織に発現する補体、増殖因子等の生理活性を有する分泌タンパク質は、アディポサイトカイン（ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅ）と呼ばれている。これらの物質は、本来は脂肪細胞自身の代謝に重要な役割を果たすが、肥満などをきっかけに過剰分泌・分泌不全といった分泌制御の異常が生じて、病態の発症を引き起こす原因となる。
例えば、下村らは線溶系の重要な調節因子であるプラスミノーゲンアクティベータインヒビター１（ＰＡＩ−１）が、脂肪蓄積がおこると特に内臓脂肪で著しく発現量が増加して血中濃度も増加し、血管合併症の成因のひとつとなり得ることを明らかにした。
このように、脂肪細胞特異的に発現するタンパク質は、脂肪蓄積との関係から注目されており、3T3-L1脂肪細胞の培養上清を用いたプロテオーム解析（非特許文献１）やＤＮＡマクロアレイ法による解析が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、生体における脂肪蓄積および脂肪細胞の肥大化のモデルとなりうる、実際に肥大化を誘導した脂肪細胞において、有意に発現する分泌タンパク質は、全く知られていない。 Obesity, ie, an increase in the number of fat cells and an enlargement of the fat cells themselves, is generally considered to be a common basis that triggers the pathogenesis of diabetes, hypertension, arteriosclerosis, stroke, myocardial infarction, etc. . Proteins produced by adipocytes are involved in the pathogenesis of fat accumulation and hypertrophy, and secreted proteins with physiological activities such as complement and growth factors expressed in adipose tissue are called adipocytokines. It is. Although these substances originally play an important role in the metabolism of adipocytes themselves, abnormalities in secretion control such as hypersecretion / secretion failure occur as a result of obesity and the like, leading to the development of pathological conditions.
For example, Shimomura et al., Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1), which is an important regulator of the fibrinolytic system, significantly increases the expression level and increases the blood concentration especially in visceral fat when fat accumulation occurs. Clarified that it can be one of the causes of vascular complications.
As described above, proteins expressed specifically in adipocytes are attracting attention because of their relationship with fat accumulation. Proteome analysis using a culture supernatant of 3T3-L1 adipocytes (Non-patent Document 1) and DNA macroarray method Has been reported (Non-patent Document 2). However, secreted proteins that are significantly expressed in adipocytes that have actually induced hypertrophy, which can be models for fat accumulation and adipocyte hypertrophy in the living body, are not known at all.

一方、DNAsegment, Chr10, Johns Hopkins University 81 expressed（配列番号：26又は76に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献３を参照）、Niemann Pick type C2 protein （配列番号：27又は77に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献４を参照）、cyclophilin C（配列番号：28又は78に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献５及び６を参照）、arginin-rich protein, mutated in early stage tumors（配列番号：29又は79に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献７を参照）、interleukin 25（配列番号：30又は80に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献８を参照）、transmembrane protein 4 (配列番号：31又は81に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献９を参照)、proline synthetase co-transcribed (配列番号：32又は82に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１０を参照)、pleiotrophin (配列番号：33又は83に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献11を参照)、Expressed sequence AU018778 もしくは別名hypothetical protein MGC18894 (配列番号：34又は84に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号１２を参照)、a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif,1（ADAMTS１） (配列番号：35又は85に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１３を参照)、reticulocalbin 1(配列番号：36又は86に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１４を参照)、polydomain protein （配列番号：37又は87に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１５を参照、calreticulin(配列番号：38又は88に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１６を参照)、family with sequence similarity 3, member C(配列番号：39又は89に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１７を参照)、granulinもしくは別名epithelin (配列番号：40又は90に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１８を参照)、follistatin-like 1もしくはTGF beta-stimulated clone 36（TSC-36） (配列番号：41又は91に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献１９を参照)、vitamin D binding protein(配列番号：42又は92に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２０を参照)、nucleobindin 1 (配列番号：43又は93に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２１を参照)、retinoic acid receptor responder ( tazarotene induced ) 2 (配列番号：44又は94に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２２を参照)、arylsulfatase A (配列番号：45又は95に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２３を参照)、dermatopontinもしくは別名early quiescence-1 (EQ-1) (配列番号：46又は96に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２４を参照)、epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2又は別名fibulin-4 (配列番号：47又は97に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２５を参照)、immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat (配列番号：48又は98に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２６を参照)、olfactomedin-like 3 (配列番号：49又は99に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２７を参照)、及びtranscobalamin 2(配列番号：50又は100に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；非特許文献２８を参照)は、いずれも公知のタンパク質であるが、これらのタンパク質又はそのホモログが肥大化脂肪細胞から分泌されること、及び生活習慣病等の脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に関係することは、全く知られていなかった。   On the other hand, DNAsegment, Chr10, Johns Hopkins University 81 expressed (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 or 76; see Non-Patent Document 3), Niemann Pick type C2 protein (described in SEQ ID NO: 27 or 77) A protein comprising an amino acid sequence (see Non-patent Document 4), cyclophilin C (a protein comprising an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 28 or 78; see Non-Patent Documents 5 and 6), arginin-rich protein, mutated in early stage tumors (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 29 or 79; see Non-patent Document 7), interleukin 25 (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 30 or 80; see Non-patent Document 8) ), Transmembrane protein 4 (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 31 or 81; see Non-Patent Document 9), proline synthetase co-transcribed (described in SEQ ID NO: 32 or 82) A protein comprising a mino acid sequence (see Non-patent Document 10), pleiotrophin (a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 33 or 83; see Non-Patent Document 11), Expressed sequence AU018778 or alias hypothetical protein MGC18894 (sequence) No .: protein comprising the amino acid sequence described in 34 or 84; see SEQ ID NO: 12), a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif, 1 (ADAMTS1) (from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 35 or 85) Reticulocalbin 1 (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 36 or 86; see non-patent document 14), polydomain protein (amino acid described in SEQ ID NO: 37 or 87) Protein consisting of sequence; see Non-patent document 15, calreticulin (protein consisting of amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 or 88; non-patent document) 16), family with sequence similarity 3, member C (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 39 or 89; see Non-Patent Document 17), granulin or alias epithelin (described in SEQ ID NO: 40 or 90) A protein consisting of the amino acid sequence of; see non-patent document 18), follistatin-like 1 or TGF beta-stimulated clone 36 (TSC-36) (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 or 91; non-patent document 19), vitamin D binding protein (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 42 or 92; see non-patent document 20), nucleobindin 1 (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 43 or 93) ; See non-patent document 21), retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2 (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 44 or 94; see non-patent document 22), arylsulfatas e A (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 45 or 95; see Non-Patent Document 23), dermatopontin or alias quiescence-1 (EQ-1) (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 46 or 96) Non-patent document 24), epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 or alias fibulin-4 (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 47 or 97; Non-patent document 25 Reference), immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat (protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 48 or 98; see Non-Patent Document 26), olfactomedin-like 3 (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 49 or 99) And transcobalamin 2 (a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 50 or 100; see Non-Patent Document 28). Although it is a known protein, it has not been known at all that these proteins or homologues thereof are secreted from hypertrophic adipocytes and related to diseases associated with hypertrophy of adipocytes such as lifestyle-related diseases. .

Kratchmarova Iら、「モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス」、第1巻(第3号)、ｐｐ.２１３−２２２、（２００２年）Kratchmarova I et al., “Molecular and Cellular Proteomics”, Volume 1 (No. 3), pp. 213-222, (2002) Tsuruga, H.ら、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」、２７２巻、ｐｐ.２９３-２９７、(２０００年)Tsuruga, H. et al., “Biochemical and Biophysical Research Communications”, 272, pp.293-297, (2000) Okazaki Yら、Nature、第420巻(第6915号)、p.p563-73、2002年Okazaki Y et al., Nature, Volume 420 (No. 6915), p.p563-73, 2002 Crocker, A. Cら、J. Neurochem、第７巻、ｐｐ.６９−８０、1961年Crocker, A. C et al., J. Neurochem, Volume 7, pp. 69-80, 1961 Friedman J, Weissman I.ら、Cell、第66巻(第4号):p.p.799-806、1991年Friedman J, Weissman I. et al., Cell, 66 (No. 4): p.p.799-806, 1991 Friedman Jら、Am J Pathol、第144巻(第6号):p.p1247-56、1994年Friedman J et al., Am J Pathol, Volume 144 (No. 6): p.p1247-56, 1994 Shridhar, V.ら、Oncogene、第12巻: p.p.1931-1939、1996年Shridhar, V. et al., Oncogene, Volume 12: p.p.1931-1939, 1996 Tulin,E.E ら、J. Immunol.、第167巻 (第11号)、p.p.6338-47 、2001年Tulin, E.E et al., J. Immunol., 167 (No. 11), p.p.6338-47, 2001 Yokoyama-Kobayashiら、Gene、 第163巻:p.p.193-196, 1995年Yokoyama-Kobayashi et al., Gene, 163: p.p.193-196, 1995 Ikegawa, Sら、J. Hum. Genet.、第 44巻:p.p.337-342、1999年Ikegawa, S et al., J. Hum. Genet., 44: p.p.337-342, 1999 J Merenmies J ら、J Biol Chem.、 第265巻(第28号): p.p.16721-4、1990年J Merenmies J et al., J Biol Chem., 265 (28): p.p. 16721-4, 1990 Strausberg RLら、Proc Natl Acad Sci U S A.、第99巻(第26号):p.p.16899-903.、2002年Strausberg RL et al., Proc Natl Acad Sci U S A., Vol. 99 (No. 26): p.p. 16899-903., 2002 Kuno Kら、J Biol Chem.、第272巻(第1号):p.p.556-62.、1997年Kuno K et al., J Biol Chem., 272 (1): p.p.556-62., 1997 Ozawa Mら、J.Biol Chem.、第268巻(第1号):p.p.699-705、1993年Ozawa M et al., J. Biol Chem., 268 (1): p.p.699-705, 1993 Gilges Dら、Biochem J. 、第352巻 Pt 1:p.p.49-59、2000 年Gilges D et al., Biochem J., Volume 352 Pt 1: p.p.49-59, 2000 Burns, Kら、Nature 第367巻: p.p.476-480、1994年Burns, K et al., Nature 367: p.p.476-480, 1994 Zhu, Y.ら、Genomics 第80巻: p.p.144-150, 2002年Zhu, Y. et al., Genomics 80: p.p.144-150, 2002 Mol Genet Metab.、第75巻 (第1号): p.p.31-7、2002年Mol Genet Metab., Volume 75 (No. 1): p.p.31-7, 2002 Tanaka, M.ら、Int. Immun.第10巻:p.p.1305-1314, 1998年Tanaka, M. et al., Int. Immun. 10: p.p.1305-1314, 1998 Hirschfeld, J.ら 、Acta Path. Microbiol. Scand. 第47巻: p.p.160-168, 1959年Hirschfeld, J. et al., Acta Path. Microbiol. Scand. 47: p.p. 160-168, 1959 Miura, K.ら、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 第187巻:p.p.375-380、1992年Miura, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: p.p.375-380, 1992 Meder Wら、FEBS Lett.、第555巻(第3号):p.p.495-9、2003年Meder W et al., FEBS Lett., 555 (No. 3): p.p.495-9, 2003 Ohno Hら、Horm Metab Res.第28巻(第8号):p.p.397-9. 1996年Ohno H et al., Horm Metab Res. 28 (8): p.p.397-9. 1996 Superti-Furgaら、Genomics 第17巻: p.p.463-467、1993年Superti-Furga et al., Genomics Volume 17: p.p.463-467, 1993 Katsanis, N.ら、 Hum. Genet. 第106巻: p.p.66-72、 2000年Katsanis, N. et al., Hum. Genet. 106: p.p. 66-72, 2000 Nagasawa, A.ら、Genomics第44巻: p.p.273-279, 1997.Nagasawa, A. et al., Genomics Volume 44: p.p.273-279, 1997. Torrado, M.ら、Hum. Molec. Genet.第11巻: p.p.1291-1301, 2002年Torrado, M. et al., Hum. Molec. Genet. Volume 11: p.p.1291-1301, 2002 Quadros EVら、J. Biol. Chem.第261巻（第33号）: p.p. 15455-15460, 1986年Quadros EV et al., J. Biol. Chem. 261 (33): p.p. 15455-15460, 1986

本発明は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断及び治療に有用な疾患マーカーを提供することを目的とする。さらに本発明は該疾患マーカーを利用した脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出方法（診断方法）、該疾患の改善又は治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の改善又は治療に有用な薬物を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a disease marker useful for diagnosis and treatment of a disease associated with hypertrophy of adipocytes. Furthermore, the present invention is a method for detecting a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes (diagnostic method) using the disease marker, a method for screening a drug useful for improving or treating the disease, and useful for improving or treating the disease. The purpose is to provide new drugs.

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行った。
本発明者らは、既に、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患における、肥満形成とその病態発症のメカニズム解明の一環として、脂肪を蓄積する細胞系を用いて、in vitroにおける細胞レベルでの肥大化した脂肪細胞からの分泌タンパク質の調製方法を確立した。すなわち、脂肪を蓄積することにより体積が肥大化するという特徴を有するマウス前駆脂肪細胞：3T3-L1（Molecular & Cellular Proteomics, 1(3), p.p. 213-222; J. Biol. Chem., 269, p.p.19041（1994）; 第124回日本医学会シンポジウム記録集, 肥満の科学 p.p.110-121) を脂肪蓄積する状態に分化させて、さらに30日以上長期培養することで、上記疾患と同様に脂肪細胞が肥大化した状態の細胞を調製し、当該細胞に発現する分泌タンパク質を同定した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive studies.
As a part of elucidating the mechanism of obesity formation and its pathogenesis in a disease associated with adipocyte hypertrophy, the present inventors have already used fat-accumulating cell lines to enlarge cells at the cellular level in vitro. A method for preparing secreted proteins from cultured adipocytes was established. That is, mouse preadipocytes having the feature that the volume is enlarged by accumulating fat: 3T3-L1 (Molecular & Cellular Proteomics, 1 (3), pp 213-222; J. Biol. Chem., 269, pp19041 (1994); Proceedings of the 124th Symposium of the Japan Society of Medical Sciences, Science of Obesity pp110-121) Cells in an enlarged state were prepared, and secreted proteins expressed in the cells were identified.

更に、本発明者らは、肥大化した脂肪細胞の培養上清に含まれるタンパク質を単離し、構造決定を行った。その結果、従来は脂肪細胞の肥大化を伴う疾患との関連が明らかではなかった、配列番号：76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99及び100（配列番号：76〜100）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、長期培養した脂肪細胞の培養上清に特異的に分泌されていることがわかった。   Furthermore, the present inventors isolated a protein contained in the culture supernatant of enlarged fat cells and determined the structure. As a result, conventionally, the association with diseases associated with adipocyte hypertrophy was not clear, SEQ ID NOs: 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100 (SEQ ID NOs: 76 to 100), a protein cultured on a long-term cultured adipocyte It was found that it was secreted specifically by Kiyoshi.

従って、本発明者らは、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患において、配列番号：76〜100のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のヒトホモログ、及びこれらをコードするポリヌクレオチド（配列番号：51〜75のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド）のヒトホモログが、優れた疾患マーカーであるとの知見を得た。さらに、これらのポリヌクレオチドの発現、又はこれらのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現の制御を指標としたスクリーニング方法は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の予防、改善又は治療剤の探索に有用であるとの知見を得た。
本発明はかかる知見を基礎にして完成するに至ったものである。 Therefore, the present inventors have identified a human homologue of a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 76 to 100 and a polynucleotide encoding the same (SEQ ID NO: 51) in a disease associated with fat cell hypertrophy. It was found that a human homologue of a polynucleotide having a base sequence described in any of ˜75 is an excellent disease marker. Furthermore, screening methods using the expression of these polynucleotides or the control of the expression of proteins encoded by these polynucleotides as an index are useful for the prevention, improvement or search of therapeutic agents for diseases associated with adipocyte hypertrophy. The knowledge that it is.
The present invention has been completed based on this knowledge.

すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
〔１〕 配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の疾患マーカー；
〔２〕 脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出においてプローブ又はプライマーとして使用される〔１〕に記載の疾患マーカー；
〔３〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたRNA又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、〔１〕又は〔２〕に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のRNA又は該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、及び
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる測定結果に比して、以下の１）又は２）のいずれかであることを指標として、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患を判断する工程：
１）配列番号：１、2、3、4、5、6、7及び8のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからならなる疾患マーカーへの結合量が減少していること、
２）配列番号：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからならなる疾患マーカーへの結合量が増大していること。
〔４〕 配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を含有する、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の疾患マーカー；
〔５〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と〔４〕に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質又はその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、及び
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる測定結果に比して、以下の１）又は２）のいずれかであることを指標として、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患を判断する工程：
１）配列番号：26、27、28、29、30、31、32及び33のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体からなる疾患マーカーへの結合量が減少していること、
２）配列番号：34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体からなる疾患マーカーへの結合量が増大していること；
〔６〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞における配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における上記に対応するポリヌクレオチドの発現量と比較する工程、及び
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬の候補物質として選択する工程；
〔７〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞における配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質又はそのホモログの発現量と比較する工程、及び
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬の候補物質として選択する工程；
〔８〕 配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現量を制御する物質を有効成分とする、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善又は治療薬；及び
〔９〕 配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を制御する物質を有効成分とする、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善又は治療薬；
に関するものである。 That is, the present invention is as follows:
[1] SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, A disease marker for diseases associated with hypertrophy of adipocytes, comprising a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the base sequence according to any one of 23, 24 and 25 ;
[2] The disease marker according to [1], which is used as a probe or primer in detection of a disease associated with hypertrophy of adipocytes;
[3] A method for detecting a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker according to [1] or [2],
(B) a step of measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA using the disease marker as an index, and (c) obtained in (b) above. The measurement result of the subject to be examined is determined to be affected by a disease associated with hypertrophy of fat cells, using as an index the following 1) or 2) as compared with the measurement result obtained for a normal biological sample Steps to do:
1) a polynucleotide having at least 15 contiguous bases in the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 and / or a poly complementary to the polynucleotide Reduced binding to a disease marker consisting of nucleotides,
2) In the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 and 25 The amount of binding to a disease marker comprising a polynucleotide having at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide is increased.
[4] SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, A disease marker for diseases associated with hypertrophy of adipocytes, comprising an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of any of 48, 49, and 50;
[5] A method for detecting a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of binding a protein prepared from a biological sample of a subject and the disease marker according to [4],
(B) a step of measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker or a partial peptide thereof using the disease marker as an index, and (c) a measurement result of the subject obtained in (b) above is a normal living body. A step of determining the morbidity of a disease accompanied by hypertrophy of fat cells, using as an index one of the following 1) or 2) as compared with the measurement result obtained for the sample:
1) The amount of binding to a disease marker comprising an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, and 33 is decreased;
2) A protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50 Increased binding to a disease marker comprising an antibody to recognize;
[6] A method for improving a disease associated with adipocyte hypertrophy or screening for a therapeutic drug, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) Test substance and SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 Contacting with a cell capable of expressing a polynucleotide having the nucleotide sequence according to any one of 22, 23, 24 and 25 or a homologue thereof,
(b) SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, in cells contacted with the test substance Measure the expression level of a polynucleotide having the base sequence described in any one of 19, 20, 21, 22, 23, 24 and 25 or a homologue thereof, and correspond to the above in a control cell in which the expression level is not contacted with a test substance Comparing the expression level of the polynucleotide to be
(c) Based on the comparison result of (b) above, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, and 25, a test substance that changes the expression level of a polynucleotide having the base sequence according to any one of the above or a homologue thereof is used for diseases associated with hypertrophy of adipocytes. Selecting as a candidate substance for improvement or treatment;
[7] A method for screening a therapeutic agent for improving or treating a disease associated with fat cell hypertrophy, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) Test substance and SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 Contacting with a cell capable of expressing a protein having the amino acid sequence of any one of 47, 48, 49 and 50 or a homologue thereof,
(b) SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 in cells contacted with the test substance Measure the expression level of a protein having the amino acid sequence of any of 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50 or a homologue thereof, and the expression level corresponds to the above in a control cell not contacted with a test substance Comparing the expression level of the protein to be expressed or the homologue thereof, and
(c) Based on the comparison result of (b) above, SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50, a test substance that fluctuates the expression level of a protein having the amino acid sequence described in any one of Or selecting as a candidate for a therapeutic agent;
[8] SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, An agent for improving or treating a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes, comprising as an active ingredient a substance that regulates the expression level of a polynucleotide having the nucleotide sequence of any one of 23, 24 and 25 or a homologue thereof; and [9 ] SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, An agent for improving or treating a disease associated with hypertrophy of fat cells, comprising as an active ingredient a substance that controls the expression level of the protein having the amino acid sequence of any of 49 and 50 or a homologue thereof;
It is about.

本発明によって、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルである長期培養した3T3-L1細胞に特異的にその分泌量が変動するタンパク質(配列番号：26〜50のアミノ酸配列を有するタンパク質；以下本発明のタンパク質と称する場合がある)が明らかになった。かかるタンパク質、及びこれをコードするポリヌクレオチド（以下本発明のポリヌクレオチドと称する場合がある）は、糖尿病、肥満症、II型糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、脳卒中、肥満症、心筋梗塞、もしくは脂肪肝等の脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の遺伝子診断に用いられる疾患マーカー（プローブ、プライマー）として有用である。かかる疾患マーカーによれば前記疾患に罹患しているかどうか、及びその罹患の原因を明らかにすることができ（診断精度が向上）、これによってより適切な治療を施すことが可能となる。すなわち、本発明の疾患マーカーは脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の適切な治療のためのツールとして利用することができる。
また、上記ポリヌクレオチドの発現増大と上記疾患との関連性から、該ポリヌクレオチドの発現を抑制／誘導する物質は、上記脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の治療剤として有用であると考えられる。従って、本発明のポリヌクレオチドによれば、その発現の抑制／誘導を指標とすることによって、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の予防、改善ないし治療剤となり得る候補薬をスクリーニングし選別することが可能である。すなわち、本発明は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の治療剤などの開発技術をも提供する。 According to the present invention, a protein whose secretion amount varies specifically in 3T3-L1 cells cultured for a long time, which is a model of a disease associated with hypertrophy of adipocytes (a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 26 to 50; hereinafter (Sometimes referred to as the protein of the invention). Such a protein and a polynucleotide encoding the same (hereinafter sometimes referred to as the polynucleotide of the present invention) are diabetes, obesity, type II diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, stroke, obesity, It is useful as a disease marker (probe, primer) used for genetic diagnosis of diseases accompanied by hypertrophy of adipocytes such as myocardial infarction or fatty liver. According to such a disease marker, it is possible to clarify whether or not the disease is involved and the cause of the disease (diagnosis accuracy is improved), thereby enabling more appropriate treatment. That is, the disease marker of the present invention can be used as a tool for appropriate treatment of diseases associated with adipocyte hypertrophy.
In addition, from the relationship between the increased expression of the polynucleotide and the disease, a substance that suppresses / induces the expression of the polynucleotide is considered to be useful as a therapeutic agent for the disease accompanied by hypertrophy of the adipocytes. Therefore, according to the polynucleotide of the present invention, by using the suppression / induction of its expression as an index, it is possible to screen and select a candidate drug that can be used for the prevention, amelioration, or treatment of a disease associated with hypertrophy of adipocytes. Is possible. That is, the present invention also provides a development technique such as a therapeutic agent for a disease associated with fat cell hypertrophy.

以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、及び当該分野における慣用記号に従う。   Hereinafter, in the present specification, indications using abbreviations such as amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides, etc. are defined in IUPAC-IUB [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 ( 1984)], “Guidelines for the preparation of specifications including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Japan Patent Office), and conventional symbols in the field.

本明細書において「DNA」とは、２本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖DNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書においてDNAとは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む２本鎖DNA及びcDNAを含む１本鎖DNA（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖DNA（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれもが含まれる。   In the present specification, “DNA” is used to include not only double-stranded DNA but also each single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand constituting the DNA. The length is not particularly limited. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, double-stranded DNA including human genomic DNA and single-stranded DNA including cDNA (positive strand) and single-stranded DNA having a sequence complementary to the positive strand. (Complementary strand) and any of these fragments are included.

また、当該「DNA」には、特定の塩基配列で示される「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質(例えば、同族体、変異体、誘導体など)をコードする「DNA」が包含される（本明細書においては、これらを総括して上記特定の塩基配列で示される「DNA」の「ホモログ」ともいう。）。かかるホモログとしては、具体的には、後述する(1-1)項に記載のストリンジェントな条件で、前記特定塩基配列で示される「DNA」とハイブリダイズするものを挙げることができる。   The “DNA” includes not only “DNA” represented by a specific nucleotide sequence, but also proteins having biological functions equivalent to the proteins encoded by these (for example, homologues, mutants, derivatives, etc. (In the present specification, these are also collectively referred to as “homologues” of “DNA” represented by the above-mentioned specific base sequence). Specific examples of such homologs include those that hybridize with “DNA” represented by the specific base sequence under the stringent conditions described in (1-1) below.

例えば同族体をコードするDNA(ホモログ)としては、ヒトDNAに対応するマウスやラットなどの他生物種のDNAが例示できる。これらのDNA (ホモログ)は、HomoloGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/)により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にかけて一致する(Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す)配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)に入力して得られたUniGene Cluster ID(Hs.で示す番号)をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種DNAとヒトDNAとのホモログの相関を示したリストから、ヒトDNAに該当するマウスやラットなどの他生物種のDNAを選抜することができる。なお、DNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、又はイントロンを含むことができる。   For example, as a DNA (homolog) encoding a homologue, DNA of other species such as mouse and rat corresponding to human DNA can be exemplified. These DNAs (homologs) can be identified by HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/). Specifically, a specific human base sequence is matched with BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 5873-5877, 1993, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Get the accession number of the sequence (Score is the highest, E-value is 0 and Identity is 100%). The UniGene Cluster ID (number indicated by Hs.) Obtained by inputting the accession number into UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) is input into homologene. From the list showing the homologue between the other species DNA and the human DNA obtained as a result, DNA of other species such as mouse and rat corresponding to the human DNA can be selected. In addition, DNA does not ask | require distinction of a functional region, For example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron can be included.

本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、RNA及びDNAのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記DNAには、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAのいずれもが含まれる。また上記RNAには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。   In the present specification, “polynucleotide” is used to include both RNA and DNA. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. The RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.

本明細書において「タンパク質」又は「（ポリ）ペプチド」には、特定の塩基配列で示される「タンパク質」又は「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等である「タンパク質」又は「(ポリ)ペプチド」（例えば、同族体、変異体、誘導体など）が包含される。なお、本明細書において、これらを上記特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」又は「(ポリ)ペプチド」の「ホモログ」ともいう。例えば、上記同族体(ホモログ)としては、ヒトのタンパク質に該当するマウスやラットなどの他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/)により同定された遺伝子(ホモログ)の塩基配列から演繹的に同定することができる。また、上記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加及び挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、かかる変異体としては、変異のないタンパク質又は（ポリ）ペプチドと、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。   In this specification, “protein” or “(poly) peptide” includes not only “protein” or “(poly) peptide” represented by a specific base sequence, but also “protein” having biological functions equivalent to these. Or “(poly) peptide” (eg, homologues, variants, derivatives, etc.). In the present specification, these are also referred to as “protein” or “homolog” of “(poly) peptide” represented by the specific amino acid sequence. For example, examples of the homologue include proteins of other organisms such as mice and rats that correspond to human proteins, and these include homologs (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene). It can be identified a priori from the base sequence of the gene (homolog) identified by /). The mutants include naturally occurring allelic mutants, non-naturally occurring mutants, and mutants having amino acid sequences modified by artificial deletion, substitution, addition and insertion. Is done. Examples of such mutants include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous to a protein or (poly) peptide without mutation.

本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、又はFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。   As used herein, the term “antibody” includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or an antibody having an antigen binding property such as a Fab fragment or a fragment generated by a Fab expression library. Some are included.

さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患の有無若しくは罹患の程度を診断するために、また、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善、治療などに有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものであり、例えば、脂肪細胞の肥大化の亢進に関連して生体内での発現が変動する遺伝子又はタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチド及び抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチド及び抗体は、上記性質に基づいて、生体内、特に脂肪組織などで発現した前記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内、特に脂肪組織などで発現した前記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。   Further, in the present specification, the term “disease marker” is used for diagnosing the presence / absence of a disease associated with fat cell hypertrophy, and for the improvement or treatment of a disease associated with fat cell hypertrophy. It is used directly or indirectly to screen for useful candidate substances. For example, a gene or protein whose expression in a living body is variable in relation to increased fat cell hypertrophy is specifically identified. Included are (poly) (oligo) nucleotides and antibodies that can be recognized and bound. Based on the above properties, these (poly) (oligo) nucleotides and antibodies are used as probes for detecting the genes and proteins expressed in vivo, particularly in adipose tissue, and (oligo) nucleotides are used in vivo. In particular, it can be effectively used as a primer for amplifying the gene expressed in adipose tissue.

本発明は、前述するように、配列番号：76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99及び100（配列番号：76〜100）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、これらのタンパク質を総称して本タンパク質ともいう。）が、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなり得る、長期間培養した3T3-L1脂肪細胞において特異的に発現が変化していることを見出したことに基づくものである。   As described above, the present invention includes SEQ ID NOs: 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, A protein having the amino acid sequence described in any of 95, 96, 97, 98, 99 and 100 (SEQ ID NO: 76 to 100) (hereinafter, these proteins are also collectively referred to as the present protein) is an adipocyte. This is based on the finding that the expression is specifically changed in 3T3-L1 adipocytes cultured for a long period of time, which can be a model of a disease accompanied by hypertrophy of the cells.

従って、これらのタンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチド（配列番号：51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74及び75（配列番号：51〜75）のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド）のヒトホモログは、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。また、本発明のタンパク質及び本発明のポリヌクレオチド並びにそれらからの派生物（例えば、抗体など）は、上記脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の治療、並びに該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用することができる。さらに、個体又は脂肪組織における、本発明のタンパク質や本発明のポリヌクレオチドの発現の検出、又は該ポリヌクレオチドの変異又はその発現不全の検出は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の解明や診断に有効に利用することができる。
本明細書において、「脂肪細胞の肥大化を伴う疾患」としては、肥満症、II型糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞等の疾患や、メタボリックシンドロームを挙げることができる。
以下、本発明のタンパク質及び本発明のポリヌクレオチドについて、具体的な用途を説明する。 Accordingly, these proteins and polynucleotides encoding them (SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, Human homologue of 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 and 75 (polynucleotide having any one of the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 51 to 75) is used to elucidate diseases associated with hypertrophy of adipocytes It can be effectively used for diagnosis, prevention and treatment, and useful information and means in medicine and clinical science can be obtained by such use. Further, the protein of the present invention and the polynucleotide of the present invention and derivatives thereof (for example, antibodies, etc.) are used for the treatment of diseases associated with hypertrophy of the above-mentioned adipocytes and the development of drugs that are effectively used for the treatment. It can be suitably used. Furthermore, the detection of the expression of the protein of the present invention or the polynucleotide of the present invention, or the mutation of the polynucleotide or its expression deficiency in an individual or adipose tissue can be used to elucidate or diagnose diseases associated with adipocyte hypertrophy. It can be used effectively.
In the present specification, “diseases associated with fat cell hypertrophy” include diseases such as obesity, type II diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, stroke, myocardial infarction, and metabolic syndrome. Can do.
Hereinafter, specific uses of the protein of the present invention and the polynucleotide of the present invention will be described.

（１）脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の疾患マーカー及びその応用
(1-1) ポリヌクレオチド
本発明は、前述するように、配列番号：76〜100のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなり得る30日間培養した3T3-L1脂肪細胞において特異的に発現が変化しているという知見を発端に、これらをコードするポリヌクレオチドの発現の有無や発現の程度を検出することによって上記脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患の有無や罹患の程度が検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。すなわち、本発明は、被験者における上記ポリヌクレオチドの発現の有無又はその程度を検出することによって、被験者について脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患の有無又は罹患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用なポリヌクレオチドを提供するものである。 (1) Disease markers for diseases associated with adipocyte hypertrophy and their applications
(1-1) Polynucleotide As described above, the present invention is a 30-day culture in which the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 76 to 100 can be a model of a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes. Based on the knowledge that the expression specifically changes in 3T3-L1 adipocytes, the disease accompanied by hypertrophy of the above-mentioned adipocytes by detecting the presence or absence of expression of the polynucleotide encoding them It is based on the idea that the presence or absence and the degree of morbidity can be detected, and the diagnosis of the disease can be performed accurately. That is, the present invention is a tool that can diagnose the presence or degree of morbidity of a disease associated with hypertrophy of adipocytes in a subject by detecting the presence or absence or the degree of expression of the polynucleotide in the subject ( A polynucleotide useful as a disease marker) is provided.

本発明における配列番号：１〜25に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、公知であり、当業者にとって公知の方法で取得することができる。
すなわち配列番号1に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、chromosome 21 open reading frame 33 (C21orf33)として公知であり、その配列はGenbank Acc. No.: NM_004649に記載されている。そのマウスホモログである配列番号51に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、DNA segment, Chr10, Johns Hopkins University 81 expressedとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_138601.1に記載されている。
配列番号2に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、Niemann Pick type C2（NPC2)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_006432に記載されている。そのマウスホモログである配列番号52に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_023409.3に記載されている。
配列番号3に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、cyclophilin Cもしくはpeptidylprolyl isomerase C（Ppic)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_000943に記載されている。そのマウスホモログである配列番号53に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_008908.1に記載されている。
配列番号4に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、arginine-rich protein, mutated in early stage tumors（Armet)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_006010に記載されている。そのマウスホモログである配列番号54に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_029103に記載されている。
配列番号5に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、interleukin 25として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_019107に記載されている。そのマウスホモログである配列番号55に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_080837.1に記載されている。
配列番号6に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、transmembrane protein 4（Tmem4)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_014255に記載されている。そのマウスホモログである配列番号56に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_019953.1に記載されている。
配列番号7に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、proline synthetase co-transcribed(Prosc)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_007198に記載されている。そのマウスホモログである配列番号57に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_054057に記載されている。
配列番号8に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、pleiotrophin(Ptn)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_002825に記載されている。そのマウスホモログである配列番号58に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_008973.1に記載されている。
配列番号9に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、carboxylesterase 1 (monocyte/macrophage serine esterase 1) (CES1)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_001266に記載されている。そのマウスホモログである配列番号59に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はexpressed sequence AU018778もしくは別名hypothetical protein MGC18894として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_144930.1に記載されている。
配列番号10に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、disintegrin-like and metalloprotease(reprolysintype) with thrombospondin type 1 motif, 1（Adamts１）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_006988に記載されている。そのマウスホモログである配列番号60に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_009621に記載されている。
配列番号11に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、reticulocalbin 1（Rcn）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_002901に記載されている。そのマウスホモログである配列番号61に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_009037.1に記載されている。
配列番号12に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、complement component (3b/4b) receptor 1, including Knops blood group system (CR1), transcript variantとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_000573に記載されている。そのマウスホモログである配列番号62に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列は、polydomain protein（Polydom)として公知でありその配列はGenbank Acc.No.:NM_022814.1に記載されている。
配列番号13に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、calreticulin（Calr）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_004343に記載されている。そのマウスホモログである配列番号63に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_007591.2に記載されている。
配列番号14に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、family with sequence similarity 3, member C（Fam3C）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_014888に記載されている。そのマウスホモログである配列番号64に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_138587に記載されている。
配列番号15に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、granulin（Grn）もしくは別名epithelinとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_002087に記載されている。そのマウスホモログである配列番号65に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_008175.2に記載されている。
配列番号16に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、follistatin-like 1（Fstl1)もしくは別名TGF beta-stimulated clone 36（TSC-36）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_007085に記載されている。そのマウスホモログである配列番号66に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_008047に記載されている。
配列番号17に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、vitamin D binding proteinとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_000583に記載されている。そのマウスホモログである配列番号67に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:XM_132170.3に記載されている。
配列番号18に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、nucleobindin 1（Nucb)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_006184に記載されている。そのマウスホモログである配列番号68に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_008749.1に記載されている。
配列番号19に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、retinoic acid receptor responder(tazaroteneinduced) 2（Rarres2)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_002889に記載されている。そのマウスホモログである配列番号69に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_027852.1に記載されている。
配列番号20に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、arylsulfatase A（Arsa）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_000487に記載されている。そのマウスホモログである配列番号70に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_009713.1に記載されている。
配列番号21に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、dermatopontin（Dpt）もしくは別名early quiescence-1(EQ-1)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_001937に記載されている。そのマウスホモログである配列番号71に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_019759.1に記載されている。
配列番号22に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrixprotein 2（Efemp2)もしくは別名fibulin-4として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_016938に記載されている。そのマウスホモログである配列番号72に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbankAcc.No.:NM_021474.2に記載されている。
配列番号23に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat（Islr）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_005545に記載されている。そのマウスホモログである配列番号73に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_012043.2に記載されている。
配列番号24に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、olfactomedin-like 3（Olfml3）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_020190に記載されている。そのマウスホモログである配列番号74に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_133859.1に記載されている。
配列番号25に記載の塩基配列よりなる遺伝子は、transcobalamin 2（Tcn2)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NM_000355に記載されている。そのマウスホモログである配列番号75に記載の塩基配列よりなる遺伝子の配列はGenbank Acc.No.:NM_015749.1に記載されている。 The polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 1 to 25 in the present invention is known and can be obtained by methods known to those skilled in the art.
That is, the gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is known as chromosome 21 open reading frame 33 (C21orf33), and its sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_004649. The gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 51, which is a mouse homolog, is known as DNA segment, Chr10, Johns Hopkins University 81 expressed, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_138601.1 .
The gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is known as Niemann Pick type C2 (NPC2), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_006432. The gene sequence comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 52, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM — 023409.3.
The gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 is known as cyclophilin C or peptidylprolyl isomerase C (Ppic), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_000943. The gene sequence consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 53, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_008908.1.
The gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is known as arginine-rich protein, mutated in early stage tumors (Armet), and its sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_006010. The gene sequence comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 54, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM — 029103.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is known as interleukin 25, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_019107. The gene sequence consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 55, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM_080837.1.
The gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 6 is known as transmembrane protein 4 (Tmem4), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_014255. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 56, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM_019953.1.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is known as proline synthetase co-transcribed (Prosc), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_007198. The gene sequence consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 57, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_054057.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is known as pleiotrophin (Ptn), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_002825. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 58, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM_008973.1.
The gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is known as carboxylesterase 1 (monocyte / macrophage serine esterase 1) (CES1), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_001266. The sequence of the gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 59, which is the mouse homolog, is known as expressed sequence AU018778 or also known as hypothetical protein MGC18894, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM — 144930.1.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 is known as disintegrin-like and metalloprotease (reprolysintype) with thrombospondin type 1 motif, 1 (Adamts 1), and the sequence is described in Genbank Acc. No.:NM_006988 Yes. The gene sequence consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 60, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_009621.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 is known as reticulocalbin 1 (Rcn), and its sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_002901. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 61, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_009037.1.
The gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is known as complement component (3b / 4b) receptor 1, including Knops blood group system (CR1), transcript variant, and the sequence is described in Genbank Acc.No.:NM_000573 Are listed. The sequence of the gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 62, which is the mouse homolog, is known as polydomain protein (Polydom), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM — 022814.1.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 is known as calreticulin (Calr), and its sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_004343. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 63, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM_007591.2.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14 is known as family with sequence similarity 3, member C (Fam3C), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_014888. The gene sequence consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 64, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_138587.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 is known as granulin (Grn) or another name epithelin, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_002087. The gene sequence consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 65, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM_008175.2.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16 is known as follistatin-like 1 (Fstl1) or alias TGF beta-stimulated clone 36 (TSC-36), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_007085 Has been. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 66, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_008047.
The gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 17 is known as vitamin D binding protein, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_000583. The gene sequence consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 67, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: XM — 132170.3.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18 is known as nucleobindin 1 (Nucb), and its sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_006184. The gene sequence consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 68, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_008749.1.
The gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 is known as retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2 (Rarres2), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_002889. The gene sequence consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 69, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM — 027852.1.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20 is known as arylsulfatase A (Arsa), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_000487. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 70, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM_009713.1.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 21 is known as dermatopontin (Dpt) or alias early quiescence-1 (EQ-1), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_001937. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 71, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_019759.1.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 22 is known as epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 (Efemp2) or aka fibulin-4, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_016938 ing. The gene sequence consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 72, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM — 021474.2.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 23 is known as immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat (Islr), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_005545. The gene sequence consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 73, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_012043.2.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 24 is known as olfactomedin-like 3 (Olfml3), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_020190. The gene sequence consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 74, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NM_133859.1.
The gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 25 is known as transcobalamin 2 (Tcn2), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NM_000355. The gene sequence consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 75, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NM — 015749.1.

また、本発明のポリヌクレオチドは、後述の（３）項に記載するような脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の予防、改善又は治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール(疾患マーカー)としても有用である。   In addition, the polynucleotide of the present invention can be used in the screening of candidate substances useful for the prevention, amelioration, or treatment of diseases associated with adipocyte hypertrophy as described in (3) below. It is also useful as a screening tool (disease marker) for detecting changes in the expression of a gene having any of the nucleotide sequences described above.

本発明の疾患マーカーは、配列番号：１〜25のいずれかに記載の１又は複数の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とする。   The disease marker of the present invention comprises a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary thereto in one or more base sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25. And

ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、上記各配列番号に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又は上記各塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:T及びG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該正鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。   Here, a complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) is a full-length sequence of a polynucleotide consisting of the base sequence shown in each of the above SEQ ID Nos. Means a polynucleotide that is in a base-complementary relationship based on the base pair relationship such as A: T and G: C with respect to its partial sequence (for convenience, these are also referred to as “positive strands”) To do. However, such a complementary strand is not limited to the case where it forms a completely complementary sequence with the target base sequence of the positive strand, but has a complementary relationship such that it can hybridize with the target positive strand under stringent conditions. You may have. Here, the stringent condition is a nucleic acid that binds to a complex or a probe as shown in Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on the melting temperature (Tm). For example, as washing conditions after hybridization, the conditions of about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned. The complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Although there is no particular limitation, the more stringent hybridization conditions are about “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, and the more severe hybridization conditions are “0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”. Can do. Specifically, as such a complementary strand, a strand consisting of a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target positive strand, and at least 90%, preferably 95% homology with the positive strand A chain consisting of a base sequence having

また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列又はその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。   Further, the polynucleotide on the positive strand side has not only a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 to 25 or a partial sequence thereof, but also a complementary relationship to the nucleotide sequence of the complementary strand. The chain | strand which consists of a base sequence in can be included.

さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。   Furthermore, the above-mentioned normal-strand polynucleotide and complementary-strand (reverse strand) polynucleotide may each be used as a disease marker in a single-stranded form, or may be used as a disease marker in a double-stranded form.

本発明の脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の疾患マーカーは、具体的には配列番号：１〜25のいずれかに記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドもしくは該ポリヌクレオチドに由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列若しくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列若しくはその相補配列の塩基配列から任意に選択される、少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。   The disease marker for diseases associated with hypertrophy of adipocytes of the present invention may specifically be a polynucleotide comprising the base sequence (full-length sequence) described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25, It may be a polynucleotide comprising the complementary sequence. In addition, if the polynucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a polynucleotide derived from the polynucleotide is selectively (specifically) recognized, the above full-length sequence or its It may be a polynucleotide consisting of a partial sequence of a complementary sequence. In this case, examples of the partial sequence include a polynucleotide having at least 15 consecutive base lengths arbitrarily selected from the base sequence of the full-length sequence or its complementary sequence.

なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物又は生成物がこれらのポリヌクレオチドに由来するものであると判断できるものであればよい。   Here, “selectively (specifically)” means, for example, in Northern blotting, a polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a polynucleotide derived therefrom. This means that nucleotides can be specifically detected, and that in the RT-PCR method, a polynucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 to 25 or a polynucleotide derived therefrom is specifically generated. However, the present invention is not limited to this, as long as those skilled in the art can determine that the detection product or product is derived from these polynucleotides.

そのような本発明の疾患マーカーは、検出（認識）する対象のポリヌクレオチド（配列番号：１〜25）に応じて、配列番号：１〜25のいずれかに示される塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には配列番号：１〜25のいずれかに示される塩基配列をprimer 3又はベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマー又はプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマー又はプローブとして使用することができる。   Such a disease marker of the present invention is based on the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 25, depending on the polynucleotide to be detected (recognized) (SEQ ID NOs: 1 to 25), For example, it can be designed using primer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi) or vector NTI (manufactured by Infomax). Specifically, a primer or probe candidate sequence obtained by applying the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 to the primer 3 or vector NTI software, or at least a sequence partially containing the sequence Or it can be used as a probe.

本発明の疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。   The disease marker of the present invention only needs to have a length of at least 15 consecutive bases as described above. Specifically, the length can be appropriately selected and set according to the use of the marker. .

(1-2)プローブ又はプライマーとしてのポリヌクレオチド
本発明の疾患マーカーは、上記各ポリヌクレオチドの発現によって生じたRNA又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、又は該RNA又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。 (1-2) Polynucleotide as a probe or primer The disease marker of the present invention is a primer for specifically recognizing and amplifying RNA produced by the expression of each polynucleotide or a polynucleotide derived therefrom, or It can be used as a probe for specifically detecting RNA or a polynucleotide derived therefrom.

上記疾患マーカーを脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。   When the above disease marker is used as a primer in detection of a disease associated with hypertrophy of adipocytes (genetic diagnosis), it usually has a base length of 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp. It can be illustrated. When used as a detection probe, those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.

本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定のポリヌクレオチドを特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができ、これによって脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に関連する配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することができる。   The disease marker of the present invention can be used as a primer or probe according to a conventional method in known methods for specifically detecting a specific polynucleotide, such as Northern blotting, RT-PCR, in situ hybridization, etc. The presence or absence of expression or the expression level (expression level) of the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 relating to diseases associated with hypertrophy of adipocytes can be evaluated. it can.

測定対象となる「生体試料」としては、使用する検出方法の種類に応じて適宜選択することができる。該試料は、例えば、被験者の生体組織、特に脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製した前記生体組織から調製されるタンパク質もしくはtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。あるいは、生体試料として、被験者の血液、尿等の体液を用いることもできる。   The “biological sample” to be measured can be appropriately selected according to the type of detection method used. The sample may be obtained by, for example, using a protein or total RNA prepared from the biological tissue obtained by collecting a part of the biological tissue of the subject, particularly adipose tissue, using a biopsy, etc., according to a conventional method. Various polynucleotides prepared based on the RNA may be used. Alternatively, a body fluid such as blood or urine of a subject can be used as the biological sample.

また、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの生体組織における発現レベルは、DNAチップを利用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該DNAチップのプローブとして使用することができる(例えば、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, Eの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。本発明の疾患マーカーをプローブとするDNAチップを、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNA又はRNAとハイブリダイズさせることにより、本発明の疾患マーカー（プローブ）と標識DNA又はRNAとの複合体が形成される。該複合体を該標識DNA又はRNAの標識を指標として検出することにより、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの生体組織中での発現の有無又は発現レベル（発現量）が評価できる。   Moreover, the expression level in the biological tissue of the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 can be detected or quantified using a DNA chip. In this case, the disease marker of the present invention can be used as a probe of the DNA chip (for example, in the case of Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, E of Affymetrix, a polynucleotide having a length of 25 bp) Used as a probe). The disease marker (probe) of the present invention and the labeled DNA or RNA are hybridized with the labeled DNA or RNA prepared based on the RNA collected from the biological tissue with the DNA chip using the disease marker of the present invention as a probe. And a complex is formed. By detecting the complex using the label of the labeled DNA or RNA as an indicator, the presence or absence or expression level of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 in a biological tissue ( Expression level).

なお、上記DNAチップは、配列番号：１〜25のいずれかで示される塩基配列を有するポリヌクレオチドと結合し得る1種又は2種以上の本発明疾患マーカーを含んでいればよい。複数の疾患マーカーを含むDNAチップの利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の、発現の有無又は発現レベルの評価が可能である。   In addition, the said DNA chip should just contain the 1 type, or 2 or more types of disease marker of this invention which can couple | bond with the polynucleotide which has the base sequence shown by either of sequence number: 1-25. According to the use of a DNA chip containing a plurality of disease markers, the presence or absence of expression or the expression level of a plurality of genes can be evaluated simultaneously for one biological sample.

本発明の疾患マーカーは、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断、検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断は、被験者の脂肪組織と正常者の脂肪組織における配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。   The disease marker of the present invention is useful for diagnosis and detection (diagnosis of presence / absence and degree of morbidity) of diseases associated with hypertrophy of adipocytes. Specifically, the diagnosis of a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes using the disease marker has a base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 in a subject's adipose tissue and a normal adipose tissue This can be done by determining the difference in the expression level of the polynucleotide.

この場合、発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の脂肪組織と正常者の脂肪組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。   In this case, the difference in expression level is not only the difference between the presence / absence of expression but also the difference in expression level between the two even when both the adipose tissue of the subject and the adipose tissue of the normal subject are expressed. The cases above, preferably 3 times or more are included.

例えば、配列番号：26〜33に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のマウスホモログは、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなる3T3-L1細胞において、特異的に発現量が減少する。従って、配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドが、被験者の脂肪組織で特異的に減少していれば、好ましくは、該発現量が正常者の脂肪組織の発現量と比べて2倍以下に、より好ましくは3倍以下に減少していれば、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患が疑われる。
また、配列番号：34〜50に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のマウスホモログは、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなる3T3-L1細胞において、特異的に発現量が増大していた。従って、配列番号：9〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドが、被験者の脂肪組織で特異的に増大していれば、好ましくは、該発現量が正常者の脂肪組織の発現量と比べて2倍以上、より好ましくは3倍以上増大していれば、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患が疑われる。
これらの場合の脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出（診断）には、上記ポリヌクレオチドに対応するいずれかに記載の塩基配列（配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも15塩基長を有するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーが有用である。 For example, the expression level of a mouse homologue of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 26 to 33 specifically decreases in 3T3-L1 cells, which are a model of a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes. Therefore, if the polynucleotide having the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 is specifically reduced in the adipose tissue of the subject, preferably the expression level is expressed in the adipose tissue of the normal subject. If the amount is reduced to 2 times or less, more preferably 3 times or less, the morbidity of the disease accompanied by hypertrophy of adipocytes is suspected.
In addition, the expression level of the mouse homologue of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 34 to 50 was specifically increased in 3T3-L1 cells, which serve as a model for diseases accompanied by hypertrophy of adipocytes. Therefore, if the polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 25 is specifically increased in the adipose tissue of the subject, preferably the expression level is expressed in the adipose tissue of the normal subject. If the amount is increased by a factor of 2 or more, more preferably by a factor of 3 or more, the disease is suspected to be associated with hypertrophy of adipocytes.
In detection (diagnosis) of a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes in these cases, the base sequence according to any one of the polynucleotides described above (base sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 25) The disease marker of the present invention comprising a polynucleotide having a continuous length of at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto is useful.

本発明において脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出（診断）は、被験者の生体組織（生体試料）、特に脂肪組織における配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。検出（診断）の精度や正確性を高めるためには、上記遺伝子群の２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは上記遺伝子群のすべての遺伝子について、その発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することが望ましい。   In the present invention, the detection (diagnosis) of a disease associated with adipocyte hypertrophy is at least a gene having a base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 in a biological tissue (biological sample) of a subject, particularly an adipose tissue. It is performed by evaluating the presence or absence or expression level (expression level) of one expression. In order to improve the accuracy and accuracy of detection (diagnosis), the presence or absence of expression or the expression level (expression) of two or more genes, preferably a plurality of genes, more preferably all genes of the genes. It is desirable to evaluate the amount.

（1-3）抗体
本発明は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の疾患マーカーとして、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現産物（タンパク質）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。 (1-3) Antibody The present invention specifically uses a polynucleotide expression product (protein) having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 to 25 as a disease marker for a disease associated with hypertrophy of adipocytes. An antibody capable of being recognized is provided.

なお、配列番号：1に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：26で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：2に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：27で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：3に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:28で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：4に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:29で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：5に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:30で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：6に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:31で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：7に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:32で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：8に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:33で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：9に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:34で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：10に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:35で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：11に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:36で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：12に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:37で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：13に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:38で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：14に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:39で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：15に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:40で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：16に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:41で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：17に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:42で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：18に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:43で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：19に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:44で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：20に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:45で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：21に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:46で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：22に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:47で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：23に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:48で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：24に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:49で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：25に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号:50で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、例示することができる。   As a specific mode of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is used as a protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2. As a specific mode of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, the specific mode of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28. As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5. A specific embodiment of the protein is SEQ ID NO: A specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 6 is the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 is shown in SEQ ID NO: 7. A specific embodiment of the protein encoded by the indicated polynucleotide is a protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 32, and a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 8 is the sequence As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 9, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 is used as a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33. Encoded by the polynucleotide shown in 10. As a specific form of the protein, the protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 35 is used. As a specific form of the protein encoded by the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 11, the amino acid shown by SEQ ID NO: 36 is used. As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 12, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 is converted into the protein having the sequence by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 13. As a specific mode of the encoded protein, a protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 38 is shown, and as a specific mode of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 14, shown by SEQ ID NO: 39 A protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 is used. As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 17. As a specific mode of the protein encoded by the polynucleotide shown in FIG. 4, a specific mode of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 19 is the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43. Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 20, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 21. As a specific embodiment of the protein, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 is used. As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 22, the amino acid shown in SEQ ID NO: 47 is used. As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 23, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 is converted into the protein having the sequence by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 24. Specific aspects of the encoded protein Thus, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 is used, and a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 25 is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50. Can be exemplified.

本発明における配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、公知であり、当業者にとって公知の方法で取得することができる。
すなわち配列番号26に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はchromosome 21 open reading frame 33 (C21orf33)として公知であり、その配列はGenbank Acc. No.: NP_004640に記載されている。そのマウスホモログである配列番号76に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質は、DNA segment, Chr10, Johns Hopkins University 81 expressedとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_613067.1に記載されている。
配列番号27に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はNiemann Pick type C2として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_006423に記載されている。そのマウスホモログである配列番号77に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_075898.1に記載されている。
配列番号28に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はcyclophilin Cもしくはpeptidylprolyl isomerase Cとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_000934に記載されている。そのマウスホモログである配列番号78に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_032934.1に記載されている。
配列番号29に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はarginine-rich protein, mutated in early stage tumorsとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_006001に記載されている。そのマウスホモログである配列番号79に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_083379に記載されている。
配列番号30に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はinterleukin 25として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_061980に記載されている。そのマウスホモログである配列番号80に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_543027.1に記載されている。
配列番号31に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はtransmembrane protein 4として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_055070に記載されている。そのマウスホモログである配列番号81に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_064337.1に記載されている。
配列番号32に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はproline synthetase co-transcribedとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_009129に記載されている。そのマウスホモログである配列番号82に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_473398.1に記載されている。
配列番号33に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はpleiotrophinとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_002816に記載されている。そのマウスホモログである配列番号83に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_032999.1に記載されている。
配列番号34に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はcarboxylesterase 1 (monocyte/macrophage serine esterase 1) (CES1)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_001257に記載されている。そのマウスホモログである配列番号84に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はexpressed sequence AU018778もしくは別名hypothetical protein MGC18894として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_659179.1に記載されている。
配列番号35に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はdisintegrin-like and metalloprotease(reprolysintype) with thrombospondin type 1 motif, 1として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_008919に記載されている。そのマウスホモログである配列番号85に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_033751に記載されている。
配列番号36に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はreticulocalbin 1として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_002892に記載されている。そのマウスホモログである配列番号86に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_033063.1に記載されている。
配列番号37に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はpolydomain proteinとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_000564に記載されている。そのマウスホモログである配列番号87に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_073725.1に記載されている。
配列番号38に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はcalreticulinとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_004334に記載されている。そのマウスホモログである配列番号88に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_031617.1に記載されている。
配列番号39に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はfamily with sequence similarity 3, member Cとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_055703に記載されている。そのマウスホモログである配列番号89に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_613053に記載されている。
配列番号40に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はgranulinもしくは別名epithelinとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_002078に記載されている。そのマウスホモログである配列番号90に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_032201に記載されている。
配列番号41に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はfollistatin-like 1もしくは別名TGF beta-stimulated clone 36（TSC-36）として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_009016に記載されている。そのマウスホモログである配列番号91に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_032073に記載されている。
配列番号42に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はvitamin D binding proteinとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_000574に記載されている。そのマウスホモログである配列番号92に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:XP_132170.3に記載されている。
配列番号43に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はnucleobindin 1として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_006175に記載されている。そのマウスホモログである配列番号93に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_032775に記載されている。
配列番号44に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はretinoic acid receptor responder(tazaroteneinduced) 2として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_002880に記載されている。そのマウスホモログである配列番号94に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_082128.1に記載されている。
配列番号45に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はarylsulfatase Aとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_000478に記載されている。そのマウスホモログである配列番号95に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_033843に記載されている。
配列番号46に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はdermatopontinもしくは別名early quiescence-1(EQ-1)として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_001928に記載されている。そのマウスホモログである配列番号96に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_062733に記載されている。
配列番号47に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はepidermal growth factor-containing fibulin-like extra cellular matrixprotein 2もしくは別名fibulin-4として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_058634に記載されている。そのマウスホモログである配列番号97に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_067449に記載されている。
配列番号48に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はimmunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeatとして公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_005536に記載されている。そのマウスホモログである配列番号98に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_036173.1に記載されている。
配列番号49に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はolfactomedin-like 3として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_064575に記載されている。そのマウスホモログである配列番号99に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_598620.1に記載されている。
配列番号50に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はtranscobalamin 2として公知であり、その配列はGenbank Acc.No.:NP_000346に記載されている。そのマウスホモログである配列番号100に記載のアミノ酸配列よりなるタンパク質の配列はGenbank Acc.No.:NP_056564.1に記載されている。 The protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 26 to 50 in the present invention is known and can be obtained by methods known to those skilled in the art.
That is, the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 is known as chromosome 21 open reading frame 33 (C21orf33), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_004640. A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 76, which is a mouse homolog, is known as DNA segment, Chr10, Johns Hopkins University 81 expressed, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_613067.1 .
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27 is known as Niemann Pick type C2, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_006423. The sequence of the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 77, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NP_075898.1.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28 is known as cyclophilin C or peptidylprolyl isomerase C, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_000934. A protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 78, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_032934.1.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 is known as arginine-rich protein, mutated in early stage tumors, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_006001. A protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 79, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP — 083379.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30 is known as interleukin 25, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP — 061980. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 80, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_543027.1.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31 is known as transmembrane protein 4, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP — 055070. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 81, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP — 064337.1.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32 is known as proline synthetase co-transcribed, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_009129. A protein sequence comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 82, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_473398.1.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33 is known as pleiotrophin, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_002816. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 83, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_032999.1.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34 is known as carboxylesterase 1 (monocyte / macrophage serine esterase 1) (CES1), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_001257. The sequence of the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84, which is the mouse homolog, is known as expressed sequence AU018778 or alias hypothetical protein MGC18894, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_659179.1.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35 is known as disintegrin-like and metalloprotease (reprolysintype) with thrombospondin type 1 motif, 1, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_008919. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_033751.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36 is known as reticulocalbin 1, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_002892. A protein sequence comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NP_033063.1.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37 is known as polydomain protein, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_000564. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_073725.1.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 is known as calreticulin, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_004334. The protein sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_031617.1.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39 is known as family with sequence similarity 3, member C, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_055703. The sequence of the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 89, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_613053.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 is known as granulin or alias epithelin, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_002078. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 90, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_032201.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41 is known as follistatin-like 1 or alias TGF beta-stimulated clone 36 (TSC-36), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_009016. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 91, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_032073.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 42 is known as vitamin D binding protein, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_000574. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 92, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: XP — 132170.3.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43 is known as nucleobindin 1, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_006175. The sequence of the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 93, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NP_032775.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44 is known as retinoic acid receptor responder (tazaroteneinduced) 2, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_002880. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 94, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_082128.1.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45 is known as arylsulfatase A, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_000478. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 95, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_033843.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46 is known as dermatopontin or alias quiescence-1 (EQ-1), and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_001928. The protein sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP — 062733.
The protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 47 is known as epidermal growth factor-containing fibulin-like extra cellular matrix protein 2 or alias fibulin-4, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_058634. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 97, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP — 067449.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48 is known as immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_005536. A protein sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_036173.1.
The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49 is known as olfactomedin-like 3, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP — 064575. The protein sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 99, which is the mouse homologue, is described in Genbank Acc. No .: NP_598620.1.
A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50 is known as transcobalamin 2, and the sequence is described in Genbank Acc. No .: NP_000346. The sequence of the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 100, which is the mouse homolog, is described in Genbank Acc. No .: NP_056564.1.

本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、上記タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに、当該タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、更に好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。   The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using the above protein as an immunizing antigen or a monoclonal antibody thereof. Furthermore, an antibody having antigen-binding ability to a polypeptide consisting of at least continuous, usually 15 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids among the amino acid sequences constituting the protein is also included in the antibody of the present invention. It is.

これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記タンパク質、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。   Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the protein is synthesized using the protein expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method or according to a conventional method. Thus, a non-human animal such as a rabbit can be immunized and obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of monoclonal antibodies, spleen cells obtained by immunizing non-human animals such as mice with the above proteins expressed and purified in Escherichia coli or the like according to conventional methods, or oligopeptides having partial amino acid sequences of these proteins, and It can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion with myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).

抗体の作製に免疫抗原として使用される配列番号：26〜50のいずれかに記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明により提供されるポリヌクレオチドの配列情報（配列番号：１〜25）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。   A protein comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 to 50 used as an immunizing antigen for the production of an antibody is sequence information of the polynucleotide provided by the present invention (SEQ ID NOs: 1 to 25). ) Based on DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culture of a transformant and recovery of a protein from the culture. These operations are based on methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). Can be done.

具体的には、配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これら配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号：26〜50）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。   Specifically, a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing in a desired host cell a gene encoding a protein comprising any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 26 to 50 is prepared, and this is expressed in the host cell. By introducing and transforming, culturing the transformant, and recovering the target protein from the resulting culture, a protein as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention can be obtained. In addition, a partial peptide of a protein containing any one of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 26 to 50 is generally chemically synthesized according to the amino acid sequence information provided by the present invention (SEQ ID NOs: 26 to 50). It can also be produced by the method (peptide synthesis).

なお、本発明の配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質には、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列に関わるタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号：26〜50のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ改変前の元のタンパク質と免疫学的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。   In addition, the protein containing any one of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 26 to 50 of the present invention includes not only the protein related to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 to 50 but also homologues thereof. Is included. The homologue includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 26 to 50, and the original protein before modification. Mention may be made of proteins having immunologically equivalent activities.

なお、ここで配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の機能と同等の生物学的機能を有するタンパク質としては、各々対応するタンパク質と生化学的又は薬理学的機能において同等の機能を有するタンパク質を挙げることができる。また配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつ各対応するタンパク質に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。   Here, the function of the protein encoded by the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 (protein having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50) is equivalent. Examples of the protein having the above biological function include proteins having functions equivalent to those of the corresponding protein in terms of biochemical or pharmacological functions. Moreover, it is equivalent in immunological activity to the protein encoded by the polynucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 (protein having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50). Examples of the protein having the above activity include a protein having an ability to induce a specific immune reaction in an appropriate animal or its cells and specifically bind to an antibody against each corresponding protein.

なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／又は免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質が、置換前のタンパク質（配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の生物学的機能及び／又は免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。   The number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the biological function and / or immunological activity is maintained. Indicators that determine how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of biological function or immunological activity are computer programs well known to those skilled in the art, For example, it can be found using DNA Star software. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. In addition, the amino acid to be substituted is a protein obtained after the substitution (a protein encoded by a polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 (SEQ ID NOs: 26 to 50). As long as it retains the biological function and / or immunological activity of the protein having any amino acid sequence described in any of the above, from the viewpoint of retaining the structure of the protein, the polarity of the residue, the charge, It is preferably an amino acid having properties similar to that of the amino acid before substitution, such as solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and amphiphilicity, for example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp Amino acids classified as polar amino acids, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are amino acids classified as uncharged amino acids, and Asp and Glu are acidic amino acids relative to each other An amino acid is classified, also the amino acid Lys, Arg and His are classified as basic amino acids with each other. Therefore, it is possible to select an amino acid belonging to the same group them as indicators as appropriate.

また本発明の抗体は、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）又は当該タンパク質の相同物の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってもよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、各々対応する上記のタンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有し、配列番号：１〜25のいずれかで示される塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：26〜50のいずれかに示されるアミノ酸配列）において少なくとも連続する８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。   The antibody of the present invention is a protein encoded by a polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 (protein having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50) or It may be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of a homologue of the protein. The oligopeptide used for antibody induction does not need to have a functional biological activity, but desirably has the same immunogenic properties as the corresponding protein described above. Preferably, the amino acid sequence of the protein having such characteristics and encoded by a polynucleotide having the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 25 (amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 26 to 50) A polypeptide consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids can be exemplified.

かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。   Generation of antibodies against such polypeptides can also be performed by enhancing the immunological response using various adjuvants depending on the host. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pluronic polyol, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. There are active substances, human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.

本発明の抗体は配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）又は当該タンパク質の相同物に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク質（その相同物を含む）を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内における上記タンパク質（その相同物を含む）発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
上記抗体は、従って、被験者における上記タンパク質の発現の有無又はその程度を検出することによって、該被験者が脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に罹患しているか否か又はその疾患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
また上記抗体は、後述の(3-2)項に記載するような脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の予防、改善又は治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現変動を検出するためのスクリーニングツールとしても有用である。 The antibody of the present invention is a protein encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 (protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 26 to 50) or the protein Therefore, the above-mentioned protein (including homologues) expressed in the tissue of a subject can be specifically detected by using the antibody. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of expression of the protein (including homologues thereof) in a subject's tissue.
The antibody therefore diagnoses whether or not the subject is suffering from a disease associated with hypertrophy of adipocytes by detecting the presence or absence of the expression of the protein in the subject. This is useful as a tool (disease marker).
In addition, the antibody is described in SEQ ID NOs: 26 to 50 in screening of candidate substances useful for the prevention, amelioration, or treatment of diseases associated with adipocyte hypertrophy as described in (3-2) below. It is also useful as a screening tool for detecting any expression variation of a protein containing any amino acid sequence.

具体的には、患者の生体組織、特に脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従ってタンパク質を調製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、上記タンパク質を検出することができる。   Specifically, a part of a patient's biological tissue, particularly adipose tissue is collected with a biopsy or the like, and a protein is prepared therefrom according to a conventional method. For example, in the known detection method such as Western blotting or ELISA, the antibody Can be detected as a probe according to a conventional method.

脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断に際しては、被験者の脂肪組織における配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）のいずれか少なくとも１つの量と、正常な脂肪組織における当該タンパク質の量との違いを判定すればよい。この場合、タンパク質量の違いには、タンパク質のある／なし、あるいはタンパク質量の違いが2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。   When diagnosing a disease associated with hypertrophy of adipocytes, a protein encoded by a polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 in adipose tissue of a subject (any of SEQ ID NOs: 26 to 50) The difference between the amount of at least one of the proteins having the amino acid sequence described in the above and the amount of the protein in normal adipose tissue may be determined. In this case, the difference in protein amount includes the presence / absence of protein or the case where the difference in protein amount is 2 times or more, preferably 3 times or more.

具体的には、配列番号：26〜50に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなり得る30日間培養した3T3-L1脂肪細胞において発現変動（増減）を示したので、被験者の脂肪組織における該タンパク質の量が正常な脂肪組織の発現産物量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上変化することが判定されれば、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患が疑われる。
例えば、配列番号：26〜33に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなる3T3-L1細胞において、特異的に発現量が減少していた。従って、配列番号：26〜33のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、被験者の脂肪組織で特異的に減少していれば、好ましくは、該発現量が正常者の脂肪組織の発現量と比べて2倍以下、より好ましくは3倍以下に減少していれば、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患が疑われる。
また、配列番号：34〜50に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなる3T3-L1細胞において、特異的に発現量が増大していた。従って、配列番号：34〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、被験者の脂肪組織で特異的に増大していれば、好ましくは、該発現量が正常者の脂肪組織の発現量と比べて2倍以上、より好ましくは3倍以上に増大していれば、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患が疑われる。 Specifically, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 26 to 50 showed fluctuations in expression (increase / decrease) in 3T3-L1 adipocytes cultured for 30 days, which can be a model of disease accompanied by hypertrophy of adipocytes. Therefore, if it is determined that the amount of the protein in the adipose tissue of the subject changes by 2 times or more, preferably 3 times or more compared to the amount of the expression product of normal adipose tissue, the disease associated with hypertrophy of adipocytes is determined. Suspected of being affected.
For example, the expression level of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 26 to 33 was specifically reduced in 3T3-L1 cells, which are models of diseases accompanied by hypertrophy of adipocytes. Therefore, if the protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 26 to 33 is specifically decreased in the adipose tissue of the subject, preferably the expression level is the expression level of the normal adipose tissue If it is reduced to 2 times or less, more preferably 3 times or less, the disease associated with hypertrophy of adipocytes is suspected.
In addition, the expression level of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 34 to 50 was specifically increased in 3T3-L1 cells, which are models of diseases accompanied by hypertrophy of adipocytes. Therefore, if the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 to 50 is specifically increased in the adipose tissue of the subject, preferably the expression level is the expression level of the adipose tissue of the normal subject. If it is increased by 2 times or more, more preferably 3 times or more, the disease associated with hypertrophy of adipocytes is suspected.

（２）脂肪細胞の肥大化の蓄積を伴う疾患の検出方法（診断方法）
本発明は、前述した本発明疾患マーカーを利用した脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出方法（診断方法）を提供するものである。 (2) Disease detection method (diagnosis method) associated with accumulation of fat cell hypertrophy
The present invention provides a disease detection method (diagnostic method) associated with adipocyte hypertrophy utilizing the above-described disease marker of the present invention.

具体的には、本発明の検出方法は、被験者の生体組織、特に脂肪組織の一部をバイオプシなどで採取し、そこに含まれる脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に関連する配列番号：１〜25のいずれかで示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル（発現量）、又はこれらのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を検出し、その発現量又はそのタンパク質量を測定することにより、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患の有無又はその程度を検出（診断）するものである。また本発明の検出（診断）方法は、例えば脂肪細胞の肥大化を伴う疾患患者において、該疾患の改善のために治療剤を投与した場合における、該疾患の改善の有無又はその程度を検出（診断）することもできる。   Specifically, in the detection method of the present invention, a part of a biological tissue of a subject, in particular, adipose tissue is collected with a biopsy or the like, and SEQ ID NOs: 1 to 1 associated with a disease accompanied by hypertrophy of fat cells contained therein. Adipocytes by detecting the expression level (expression amount) of a polynucleotide having the base sequence shown by any of 25, or the protein encoded by these polynucleotides, and measuring the expression amount or the protein amount This is to detect (diagnose) the presence or absence of a disease associated with the enlargement of the disease. In addition, the detection (diagnostic) method of the present invention detects, for example, whether or not an improvement in the disease occurs when a therapeutic agent is administered for the improvement of the disease in a disease patient with hypertrophy of adipocytes ( Diagnosis).

ここで用いられる生体試料は、被験者の生体組織、特に脂肪組織、該組織から調製されるRNA若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチド、又は上記組織から調製されるタンパク質である。かかるRNA、ポリヌクレオチド又はタンパク質は、被験者の生体組織、特に脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製することができる。
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。 The biological sample used here is a biological tissue of a subject, particularly adipose tissue, RNA prepared from the tissue or a polynucleotide further prepared therefrom, or a protein prepared from the tissue. Such RNA, polynucleotide, or protein can be prepared according to a conventional method by collecting a part of a subject's living tissue, particularly adipose tissue with a biopsy or the like.
The diagnostic method of the present invention is specifically performed as follows according to the type of biological sample used as a measurement target.

(2-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
診断に用いる生体試料としてRNAを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は該RNA中の配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。 (2-1) When RNA is used as a biological sample to be measured When RNA is used as a biological sample used for diagnosis, the detection method (diagnostic method) of the present invention is represented by SEQ ID NOs: 1 to 25 in the RNA. This is carried out by detecting and measuring the expression level of a polynucleotide having any one of the nucleotide sequences described above.

本発明の脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出方法（診断方法）は、特に測定対象の生体試料としてRNAを利用して、該RNA中の配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、上記検出するポリヌクレオチドの塩基配列に応じて、前述する本発明の疾患マーカー（配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマー又はプローブとして用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。   The disease detection method (diagnostic method) associated with hypertrophy of adipocytes according to the present invention uses RNA as a biological sample to be measured, in particular, and the base according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 in the RNA This is performed by detecting and measuring the expression level of the polynucleotide having the sequence. Specifically, depending on the base sequence of the polynucleotide to be detected, the disease marker of the present invention described above (polynucleotide having at least 15 bases continuous in the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 and (Or a complementary polynucleotide thereof) as a primer or probe, and can be carried out by performing known methods such as Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, in situ hybridization analysis.

ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中の配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された標識疾患マーカー（DNA）とRNAとの二重鎖について、該疾患マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質など）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）又は蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。 When using the Northern blot method, by using the disease marker of the present invention as a probe, the presence or absence of expression of the polynucleotide having the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 in RNA and its expression The level can be detected and measured. Specifically, the disease marker of the present invention (complementary strand) radioisotopes (such as 32 P, 33 P: RI) or a fluorescent substance labeled with a, it, of the subject and transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method After hybridization with RNA derived from biological tissue, radiation detection of the signal derived from the labeled product of the disease marker (RI or fluorescent material) is performed on the double strand of the labeled disease marker (DNA) and RNA formed. Examples include a method of detecting and measuring using a detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film) or a fluorescence detector. In addition, using AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech), a disease marker (probe DNA) is labeled according to the protocol and hybridized with RNA derived from a subject's biological tissue, and then labeled with the disease marker. It is also possible to use a method in which a signal derived from a product is detected and measured with a multi-bioimager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).

RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、RNA中の配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製し、これを鋳型として標的のポリヌクレオチドの領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、予めRIや蛍光物質などで標識しておいたプライマーを用いて上記PCRを行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。   When using the RT-PCR method, by using the disease marker of the present invention as a primer, presence or absence of expression or expression of a polynucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 in RNA The level can be detected and measured. Specifically, a pair of primers prepared from the disease marker of the present invention (described above) is prepared so that a cDNA can be prepared from RNA derived from a biological tissue of a subject according to a conventional method, and a target polynucleotide region can be amplified using this as a template. A method for detecting the amplified double-stranded DNA obtained by hybridizing the cDNA (− strand) and the reverse strand binding to the + strand and performing PCR according to a conventional method. be able to. The detection of the amplified double-stranded DNA is a method of detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using a primer previously labeled with RI or a fluorescent substance. For example, a method may be used in which a double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled disease marker is used as a probe to hybridize with the probe to detect it. The produced labeled double-stranded DNA product can be measured with an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems). Also, prepare an RT-PCR reaction solution with SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems) according to the protocol, and react with ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) to detect the reaction product. You can also.

また、DNAチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをDNAプローブ（１本鎖又は２本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAをハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの検出、測定が可能なDNAチップを用いることもできる。かかるポリヌクレオチドの発現レベルを検出、測定することができるDNAチップとしては、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B,C, D, Eを挙げることができる。   In addition, when utilizing DNA chip analysis, a DNA chip on which the above-described disease marker of the present invention has been attached as a DNA probe (single strand or double strand) is prepared, and this is usually obtained from RNA derived from the biological tissue of the subject. Examples include a method in which a cRNA prepared by the method is hybridized, and a double-stranded DNA and cRNA formed are bound to a labeled probe prepared from the disease marker of the present invention and detected. Further, as the DNA chip, a DNA chip capable of detecting and measuring the expression level of the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 can also be used. Examples of DNA chips that can detect and measure the expression level of such polynucleotides include Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, and E from Affymetrix.

(2-2) 測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の検出方法（診断方法）は生体試料中に存在する、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を検出し、その量（レベル）を測定することによって実施される。より詳しくは、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を認識する抗体を疾患マーカーとして用いて、ウェスタンブロット法などの公知方法で、上記タンパク質を検出、定量する方法を挙げることができる。 (2-2) When using a protein as a measurement object When using a protein as a measurement object, the detection method (diagnostic method) of the present invention is present in any one of SEQ ID NOS: 1 to 25, which is present in a biological sample. It is carried out by detecting a protein (protein having an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 26 to 50) encoded by a polynucleotide having the base sequence described above and measuring the amount (level) thereof. More specifically, an antibody that recognizes a protein (protein having an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 26 to 50) encoded by a polynucleotide having the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 Can be used as a disease marker to detect and quantify the protein by a known method such as Western blotting.

ウェスタンブロット法は、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質などで標識した標識抗体（一次抗体に結合する標識抗体）を用いて、標識し、該放射性同位元素若しくは蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech 社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定することもできる。 Western blotting uses the above-mentioned antibody as a primary antibody and then a labeled antibody labeled with a radioisotope such as 125 I or a fluorescent substance (labeled antibody that binds to the primary antibody) as a secondary antibody. In addition, a signal derived from the radioisotope or fluorescent substance can be detected and measured with a radiation measuring device (BAS-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector. In addition, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech) was used for detection according to the protocol, and multi-bioimager STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech) Can also be measured.

(2-3)脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断
脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の診断は、具体的には、被験者の生体組織、特に脂肪組織における配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル、又は配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現産物であるタンパク質の量（レベル）を、上記と対応する正常な生体組織（特に、正常な脂肪組織における当該ポリヌクレオチドの発現レベル又は当該タンパク質の量（レベル）と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。 (2-3) Diagnosis of disease associated with adipocyte hypertrophy Specifically, diagnosis of a disease associated with adipocyte hypertrophy is any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 in a living tissue of a subject, particularly an adipose tissue. The expression level of the polynucleotide having the base sequence described in 1) or the amount (level) of the protein that is the expression product of the polynucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 is normal corresponding to the above It can be performed by comparing the expression level of the polynucleotide or the amount (level) of the protein in a normal biological tissue (particularly, normal adipose tissue) and determining the difference between the two.

この場合、正常な生体組織、特に脂肪組織から採取調製した、「正常な生体試料」（RNA又はタンパク質）が必要であるが、これらは脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に罹患していない人の生体組織、特に脂肪組織をバイオプシ等で採取することによって取得することができる。なお、ここでいう「脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に罹患していない人」とは、例えば、肥満指数（BMI：Body mass index）が25未満である、肥満ではないと診断された人をいう。なお、当該「脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に罹患していない人」を以下、本明細書では単に正常者という場合もある。以下、具体的な診断方法について、脂肪組織から採取調製した生体試料を例として記載する。   In this case, “normal biological samples” (RNA or protein) collected and prepared from normal biological tissues, particularly adipose tissues, are required, but these are not available for those who are not suffering from diseases associated with fat cell hypertrophy. It can be obtained by collecting a living tissue, particularly adipose tissue, with a biopsy or the like. As used herein, “a person not afflicted with a disease associated with fat cell hypertrophy” refers to, for example, a person diagnosed as having no obesity with a body mass index (BMI) of less than 25 Say. The “person who does not suffer from a disease associated with hypertrophy of fat cells” may be simply referred to as a normal person in the present specification. Hereinafter, a specific diagnostic method will be described by taking a biological sample collected and prepared from adipose tissue as an example.

被験者の脂肪組織と正常な脂肪組織（脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に罹患していない人の脂肪組織）とのポリヌクレオチドの発現レベル又はその発現産物（タンパク質）量（レベル）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な脂肪組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた上記ポリヌクレオチドの発現レベル、若しくはこれらのポリヌクレオチドの発現産物であるタンパク質の量（レベル）の平均値又は統計的中間値を予め求めておき、これを正常者のポリヌクレオチドの発現レベル又はその発現産物（タンパク質）の量（正常値）として、これらを被験者における測定レベル又は測定値と比較することができる。   Comparison of the expression level of the polynucleotide or the expression product (protein) amount (level) between the adipose tissue of the subject and normal adipose tissue (the adipose tissue of a person not suffering from a disease associated with hypertrophy of adipocytes) The measurement can be performed in parallel with the measurement of the biological sample of the subject and the biological sample of the normal person. When not performed in parallel, the expression level of the polynucleotide obtained by measurement under uniform measurement conditions using a plurality (at least 2, preferably 3 or more, more preferably 5 or more) of normal adipose tissue Alternatively, an average value or statistical intermediate value of the amount (level) of the protein that is the expression product of these polynucleotides is obtained in advance, and this is obtained as the expression level of the normal polynucleotide or the amount of the expression product (protein). As (normal values), these can be compared with the measurement level or measurement value in the subject.

被験者が、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に罹患しているかどうかの判断は、該被験者の脂肪組織における配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル、又はその発現産物（タンパク質）の量（レベル）、より具体的には配列番号：26〜50のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の量（レベル）が、正常者のそれらと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上の変動があるか（多いか又は少ないか）否かを指標として行うことができる。   The determination as to whether or not the subject suffers from a disease associated with adipocyte hypertrophy is the expression level of a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 to 25 in the subject's adipose tissue, or The amount (level) of the expression product (protein), more specifically, the amount (level) of the protein having the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 26 to 50 is 2 compared with those of normal subjects. It can be performed as an index whether or not there is a fluctuation of more than twice, preferably more than 3 times (more or less).

具体的には、被験者において、上記ポリヌクレオチドのうち配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル、又はその発現産物（タンパク質）の量（レベル）が、正常者の上記に対応するポリヌクレオチドの発現レベル又は発現産物の量（レベル）に比べて多い場合には、該被験者について脂肪細胞の肥大化を伴う疾患への罹患が疑われる。   Specifically, in the subject, the expression level of the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 or the amount (level) of the expression product (protein) is normal among the polynucleotides described above. If the expression level of the polynucleotide corresponding to the above or the amount (level) of the expression product is large, the subject is suspected of suffering from a disease associated with hypertrophy of adipocytes.

なお、上記方法のうち、(2-1)生体試料としてRNAを利用して脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を検出（診断）する場合、すなわちポリヌクレオチドの発現の有無又は発現レベル（発現量）から脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を検出（診断）する場合は、検出（診断）の精度や正確性を高めるために、配列番号：１〜25に示されるポリヌクレオチドのうち2以上、好ましくは複数個のポリヌクレオチド、より好ましくは上記ポリヌクレオチド群のすべてについて、発現の有無又は発現のレベル（発現量）を評価し、その結果から脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を検出（診断）することが望ましい。   Of the above methods, (2-1) When RNA is used as a biological sample to detect (diagnose) a disease associated with hypertrophy of adipocytes, that is, whether or not the polynucleotide is expressed or the expression level (expression level) When detecting (diagnosis) a disease associated with hypertrophy of adipocytes from 2 or more of the polynucleotides shown in SEQ ID NOs: 1 to 25, preferably in order to increase the accuracy and accuracy of detection (diagnosis), preferably To evaluate the presence or level of expression or the level of expression (expression level) of a plurality of polynucleotides, more preferably all of the above-mentioned polynucleotide group, and detect (diagnose) a disease accompanied by hypertrophy of the fat cells from the results. Is desirable.

また、前記(2-2)測定対象物としてタンパク質を利用して脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を検出（診断）する場合も、上記と同様に、生体試料について、配列番号：１〜25に示されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（具体的には配列番号：26〜50のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）のうちの2以上、好ましくは複数個のレベルを評価し、その結果から脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を検出（診断）することが望ましい。   Also, in the case of detecting (diagnosing) a disease associated with fat cell hypertrophy using the protein as the measurement object (2-2), the biological sample is represented by SEQ ID NOs: 1 to 25 in the same manner as described above. Evaluate two or more levels, preferably multiple levels, of proteins having the amino acid sequence encoded by the indicated polynucleotide (specifically, proteins having the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 26 to 50) From the results, it is desirable to detect (diagnose) a disease associated with fat cell hypertrophy.

複数個のポリヌクレオチド又はタンパク質について評価を行う場合には、個々のポリヌクレオチド又はタンパク質での評価をスコア化し、総合的に脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を診断することが可能である。すなわち、上記のポリヌクレオチド又はタンパク質4個のポリヌクレオチド又はタンパク質について評価を行い、うち２個以上のポリヌクレオチド又はタンパク質について上記基準に基づいて脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の病態が疑われると評価される場合は、該疾患である可能性が高いと診断できる。なお、この場合、評価するポリヌクレオチド又はタンパク質の数、スコアあるいは診断基準は限定されない。   In the case of evaluating a plurality of polynucleotides or proteins, it is possible to score evaluations of individual polynucleotides or proteins and diagnose a disease accompanied by fat cell hypertrophy comprehensively. That is, the above-described polynucleotide or protein is evaluated for four polynucleotides or proteins, and two or more polynucleotides or proteins are evaluated as suspected of having a disease state associated with hypertrophy of adipocytes based on the above criteria. If so, it can be diagnosed that the disease is highly likely. In this case, the number, score or diagnostic criteria of the polynucleotide or protein to be evaluated is not limited.

（３）候補薬のスクリーニング方法
（3-1）ポリヌクレオチドの発現を指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現を制御する（減少させる／増大させる）物質をスクリーニングする方法を提供する。 (3) Screening Method for Candidate Drug (3-1) Screening Method Using Polynucleotide Expression as an Index The present invention controls the expression of a polynucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 Methods of screening for (decrease / increase) substances are provided.

本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを発現し得る細胞を挙げることができる。かかる細胞としては、具体的には、マウス3T3-L1細胞、又はマウスNIH3T3細胞（ American Type Culture Collection http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm から入手可能）などを挙げることができる。好ましくはマウス3T3-L1細胞が挙げられる。また、かかる細胞としては、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドのホモログ、すなわち当該ポリヌクレオチドのヒト以外の生物種における同族体又は変異体をコードするポリヌクレオチドを発現し得る細胞を用いることもできる。例えば、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するヒトポリヌクレオチドに対応するラットホモログ(ポリヌクレオチド)やマウスホモログ(配列番号：51〜75のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド)を内在的に発現している細胞を用いることができる。さらに本発明のスクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
また、細胞として、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログを導入した遺伝子導入細胞を用いることもできる。該遺伝子導入に用いられる宿主細胞、すなわちCOP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、BHK、CHO等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、CV1、Vero等のサル由来細胞、HeLa、293等のヒト由来細胞、及びSf9、Sf21、High Five等の昆虫由来細胞などが例示される。 Examples of the cells used in the screening of the present invention include cells capable of expressing the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 regardless of endogenous or exogenous. Specific examples of such cells include mouse 3T3-L1 cells or mouse NIH3T3 cells (available from American Type Culture Collection http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm). . Preferably, mouse 3T3-L1 cells are used. In addition, as such cells, a polynucleotide homologue of a polynucleotide having the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 25, that is, a polynucleotide encoding a homologue or a variant of a non-human species of the polynucleotide. Cells that can be expressed can also be used. For example, a rat homolog (polynucleotide) or mouse homolog corresponding to a human polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 (having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 51 to 75) A cell in which the polynucleotide) is endogenously expressed can be used. Furthermore, the category of cells used in the screening of the present invention includes tissues that are aggregates of cells.
In addition, as a cell, a gene-introduced cell into which a polynucleotide having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homologue thereof is introduced can also be used. Host cells used for the gene transfer, that is, mouse-derived cells such as COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1, NIH3T3, ST2, rat-derived cells, hamster-derived cells such as BHK, CHO, COS1, COS3, Examples include monkey-derived cells such as COS7, CV1, and Vero, human-derived cells such as HeLa and 293, and insect-derived cells such as Sf9, Sf21, and High Five.

被験物質（候補物質）となりえるものとしては、制限されないが、核酸(配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む)、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織及び／又は細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、ポリヌクレオチドライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物、及びこれらの混合物などが挙げられるが、これに制限されない。   Examples of substances that can be test substances (candidate substances) include, but are not limited to, nucleic acids (including antisense oligonucleotides of polynucleotides having the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 25), peptides, proteins, organics Specifically, the screening is performed by bringing a sample (test sample) containing these test substances into contact with the tissue and / or cells. Examples of the test sample include, but are not limited to, a cell extract containing a test substance, an expression product of a polynucleotide library, a synthetic low molecular compound, a synthetic peptide, a natural compound, and a mixture thereof.

本発明スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ所望ポリヌクレオチドを発現できる培養条件(温度、pH、培地組成など)を選択するのが好ましい。   In the screening of the present invention, the conditions for bringing the test substance into contact with the cells are not particularly limited, but the culture conditions (temperature, pH, medium composition, etc.) that allow the cells to die and express the desired polynucleotide are selected. preferable.

実施例に示すように、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなり得る長期培養した3T3-L1細胞では、配列番号：51〜75のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が発現している。この知見から、配列番号：51〜75のいずれかに記載の塩基配列を有する１又は複数のポリヌクレオチドの発現レベルの上昇（ポリヌクレオチド発現の誘導・増大）は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患と関連していると考えられる。本発明のスクリーニング方法には、これらポリヌクレオチドの発現レベルの上昇（ポリヌクレオチド発現の誘導・増大）もしくは減少（ポリヌクレオチドの発現の抑制）を指標として、当該ポリヌクレオチドの発現を制御する物質(発現量を変動させる物質)を探索する方法が包含される。本発明のスクリーニング方法によって、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の予防、改善ないし治療剤の有効成分となる候補物質が提供できる。   As shown in the Examples, 3T3-L1 cells cultured for a long time that can be a model of a disease accompanied by adipocyte hypertrophy are encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 51 to 75 Protein is expressed. From this finding, an increase in the expression level of one or a plurality of polynucleotides having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 51 to 75 (induction / increase in polynucleotide expression) is a disease associated with hypertrophy of adipocytes. It seems to be related. In the screening method of the present invention, a substance (expression) that controls the expression of the polynucleotide using an increase (induction or increase in polynucleotide expression) or decrease (inhibition of polynucleotide expression) as an index. Methods for searching for substances that vary in quantity are included. The screening method of the present invention can provide a candidate substance that becomes an active ingredient of a preventive, ameliorating or therapeutic agent for a disease associated with fat cell hypertrophy.

すなわち、本発明のスクリーニング方法は、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルの上昇(発現誘導)又は減少（発現抑制）が、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患と関連することを利用するものである。よって、該脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の緩和／抑制作用を有する（脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルの変動が指標とされる。   That is, according to the screening method of the present invention, the increase (expression induction) or decrease (expression suppression) of the expression level of the polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homolog thereof is It takes advantage of the fact that it is associated with diseases that are enlarged. Therefore, SEQ ID NOs: 1 to 25 are used for searching for a substance having an action of alleviating / suppressing a disease associated with fat cell hypertrophy (providing an improvement / treatment effect for a disease associated with fat cell hypertrophy). The change in the expression level of the polynucleotide having the base sequence described in any of the above or a homologue thereof is used as an index.

以上のように、本発明のスクリーニング方法は、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルを制御（発現誘導・抑制）する物質を探索するものであり、斯くして得られる物質を脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補化合物として提供するものである。   As described above, the screening method of the present invention searches for a substance that controls (expression induction / suppression) of the expression level of a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homologue thereof. Thus, the substance thus obtained is provided as a candidate compound that becomes an active ingredient of a ameliorating agent or therapeutic agent for diseases associated with hypertrophy of fat cells.

本発明のスクリーニング方法に従う候補物質の選別は、具体的には配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログを発現している細胞を用いる場合は、被験物質(候補物質)を添加した細胞における上記各ポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルが被験物質(候補物質)を添加しない細胞における同ポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルに比して低くなること／高くなることをもって、行うことができる。また、本発明のポリヌクレオチド又はそのホモログの発現に発現誘導物質［例えば変性LDL（アセチル処理）等］を刺激剤として必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質によって誘導される発現が候補物質の存在によって制御されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の本発明のポリヌクレオチド又はそのホモログの発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞(正のコントロール)に比して低くなること／高くなることをもって行うことができる。   The selection of candidate substances according to the screening method of the present invention is specifically a test substance when using a cell expressing a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homologue thereof. The expression level of each of the above-mentioned polynucleotides or homologs thereof in cells to which (candidate substance) is added is lower / higher than the expression level of the same polynucleotides or homologues in cells to which no test substance (candidate substance) is added. It can be done with things. In addition, when a cell that requires an expression inducer [for example, denatured LDL (acetylated), etc.] as a stimulant for expression of the polynucleotide of the present invention or a homologue thereof, the expression induced by the expression inducer is a candidate substance. That is, the expression of the polynucleotide of the present invention or a homologue thereof in a cell contacted with a candidate substance in the presence of an expression inducer is a control cell that does not contact the candidate substance in the presence of the expression inducer (positive cell). The control can be carried out with lowering / higher than

上記いずれかのポリヌクレオチド又はそのホモログの発現を制御する物質のうち、発現を抑制（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞の配列番号：１〜25のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなることを指標にして行うことができる。また、これら配列番号：１〜25のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞における本発明のポリヌクレオチド又はそのホモログの発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。   Among substances that control the expression of any of the above polynucleotides or homologues thereof, specifically, a test substance is added to search for a substance that controls expression to be suppressed (reduction in expression level, suppression of expression induction). The expression level of the polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homologue thereof is lower than that of the cells to which the test substance is not added. it can. In addition, when using a cell that requires an expression inducer for the expression of a polynucleotide comprising any one of these nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 25, in a cell contacted with a test substance in the presence of the expression inducer Using the test substance as a candidate substance, the expression of the polynucleotide of the present invention or a homologue thereof is lower than that of a control cell (positive control) not contacted with the test substance in the presence of an expression inducer. Can be sorted.

また、上記いずれかのポリヌクレオチド又はそのホモログの発現を制御する物質のうち、発現を上昇（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞の配列番号：１〜25のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して高くなることをもって、行うことができる。また、これら配列番号：１〜25のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのホモログの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞における本発明のポリヌクレオチド又はそのホモログの発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。   In addition, among substances that control the expression of any of the above-mentioned polynucleotides or homologues thereof, the search for a substance that controls the expression to increase (increased expression level, enhanced expression induction) is specifically performed as a test substance. When the expression level of the polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homologue thereof is higher than that of cells not added with the test substance, it can. In addition, when using a cell that requires an expression inducer for expression of a polynucleotide comprising any one of these nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homologue thereof, the test substance is brought into contact in the presence of the expression inducer. Using the test substance as an index, the expression of the polynucleotide of the present invention or its homologue in the cells is higher than that of a control cell (positive control) that was not contacted with the test substance in the presence of an expression inducer. Can be selected as a candidate substance.

このようなポリヌクレオチド又はそのホモログの発現レベルの検出及び定量は、前述した細胞から調製したRNA又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと本発明疾患マーカーとを用いて、前記(2-1)項に記述したように、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法や、DNAチップなどを利用して実施できる。指標とするポリヌクレオチド発現レベルの変動(発現の抑制・減少又は誘導・増大)の程度としては、被験物質(候補物質)を添加した細胞における本発明のポリヌクレオチド又はこれらのホモログの発現が、被験物質(候補物質)を添加しない対照細胞での発現量と比較して10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上の変動(減少又は増大)を例示することができる。   The detection and quantification of the expression level of such a polynucleotide or a homologue thereof can be carried out using the RNA prepared from the cells described above or a complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker of the present invention (2-1). As described in the section, it can be carried out using a known method such as Northern blotting or RT-PCR, or a DNA chip. As the degree of fluctuation in the expression level of the polynucleotide used as an indicator (suppression / decrease or induction / increase in expression), the expression of the polynucleotide of the present invention or a homologue thereof in cells to which the test substance (candidate substance) has been added is determined. A variation (decrease or increase) of 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more can be exemplified as compared with the expression level in a control cell to which no substance (candidate substance) is added.

また、本発明のポリヌクレオチド又はこれらのホモログの、発現レベルの検出及び定量は、各ポリヌクレオチドの発現を制御する遺伝子領域(発現制御領域)に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによっても実施できる。本遺伝子の発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。この意味において、本発明でいう配列番号：１〜25のいずれかで示される塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの概念には、該ポリヌクレオチドの発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。   In addition, the detection and quantification of the expression level of the polynucleotide of the present invention or a homologue thereof is performed by a fusion gene in which a marker gene such as a luciferase gene is connected to a gene region (expression control region) that controls the expression of each polynucleotide. It can also be carried out by measuring the activity of a marker gene-derived protein using a cell line into which is introduced. The screening method for the expression control substance of this gene includes a method of searching for a target substance using the expression level of the marker gene as an index. In this sense, the concept of a polynucleotide having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 25 or a homolog thereof according to the present invention includes a fusion gene between the expression control region of the polynucleotide and a marker gene. It is.

上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子を例示できる。ここで本発明のポリヌクレオチド又はそのホモログの発現制御領域としては、例えば該ポリヌクレオチドの転写開始部位上流約１kb、好ましくは約2kbを用いることができる。融合遺伝子の作成、及びマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。   The marker gene is preferably a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction. Specifically, reporter genes such as chloramphenicol acetyltransferase gene, β-glucuronidase gene, β-galactosidase gene, and aequorin gene can be exemplified in addition to the above luciferase gene. Here, as the expression control region of the polynucleotide of the present invention or a homologue thereof, for example, about 1 kb, preferably about 2 kb upstream of the transcription start site of the polynucleotide can be used. Creation of a fusion gene and measurement of activity derived from a marker gene can be performed by known methods.

本発明のスクリーニング方法において、スクリーニングの精度や正確性を高めるためには、本発明のポリヌクレオチド又はそのホモログの２以上、好ましくは複数個のポリヌクレオチド、より好ましくは本発明のポリヌクレオチド（又はそのホモログ）のすべてについて被験物質による遺伝子発現レベルを評価し、候補物質を選別することが望ましい。複数個のポリヌクレオチドについて評価する場合には、個々のポリヌクレオチドでの評価をスコア化し、総合的に候補物質を選別することが可能である。例えば、一つの被験物質を用いて、上記のポリヌクレオチドのすべてについて評価を行い、該被験物質がそのうちの2個以上のポリヌクレオチドに関して脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補化合物であると上記基準から評価される場合、該被験物質は候補化合物である可能性が高いと判断できる。この場合、評価する遺伝子数、スコアあるいは判断基準は限定されない。   In the screening method of the present invention, in order to improve the accuracy and accuracy of screening, two or more, preferably a plurality of polynucleotides of the polynucleotide of the present invention or a homolog thereof, more preferably a polynucleotide of the present invention (or its It is desirable to evaluate the gene expression level of the test substance for all of the homologs) and select candidate substances. In the case of evaluating a plurality of polynucleotides, it is possible to score evaluations for individual polynucleotides and select candidate substances comprehensively. For example, using one test substance, all of the above polynucleotides are evaluated, and the test substance is effective for an agent for improving or treating a disease associated with hypertrophy of adipocytes with respect to two or more polynucleotides. When it is evaluated from the above criteria that the compound is a candidate compound, it can be determined that the test substance is likely to be a candidate compound. In this case, the number of genes to be evaluated, the score, or the judgment criterion is not limited.

以上のスクリーニング方法により、被験物質から選別される物質は、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現制御剤として位置づけることができる。これらの物質は、生体内において配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現を制御することによって、脂質顆粒の蓄積の亢進を抑制し、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）し得ると考えられる。よって、これらの物質は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。   The substance selected from the test substance by the above screening method can be positioned as an expression control agent for the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25. These substances suppress the increase in lipid granule accumulation and increase fat cell hypertrophy by controlling the expression of the polynucleotide having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 in vivo. It is considered that the accompanying diseases can be alleviated and suppressed (improved and treated). Therefore, these substances are promising candidate substances for drugs that alleviate or suppress (improve or treat) diseases associated with fat cell hypertrophy.

斯くして選抜取得される被験物質は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。   Thus, the test substance selected and acquired is a promising candidate substance for a drug that alleviates or suppresses (improves or treats) a disease associated with fat cell hypertrophy.

(3-2)タンパク質の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号：26〜50のいずれか記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を制御する（減少させる／増大させる）物質をスクリーニングする方法を提供する。 (3-2) Screening method using protein expression level as an indicator The present invention screens a substance that controls (reduces / increases) the expression of a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 26-50. Provide a way to do it.

本発明スクリーニングに用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、配列番号：１〜25のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドのいずれかを発現し、発現産物としての配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログを有する培養細胞全般を挙げることができる。ここで配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの発現は、遺伝子産物であるタンパク質を公知のウェスタンブロット法にて検出することにより、容易に確認することができる。該細胞としては、具体的には、前記(3−1)項に記載したような、マウス3T3-L1細胞、又は本発明のポリヌクレオチドの１又は複数を導入した株化細胞などが挙げられる。また当該細胞の範疇には、その細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分なども含まれる。   As a cell used for the screening of the present invention, regardless of whether it is endogenous or exogenous, any one of the polynucleotides containing any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 25 is expressed, and SEQ ID NO: 26 as an expression product. Examples include general cultured cells having a protein containing any one of the amino acid sequences described in -50 or a homologue thereof. Here, the expression of the protein containing any one of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 26 to 50 or homologs thereof can be easily confirmed by detecting the protein that is the gene product by a known Western blot method. it can. Specific examples of the cells include mouse 3T3-L1 cells as described in the above section (3-1), or established cell lines into which one or more of the polynucleotides of the present invention have been introduced. The category of the cell includes its cell membrane fraction, cytoplasm fraction, cell nucleus fraction, and the like.

本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（本発明のポリヌクレオチドのアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質又はこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞や細胞膜画分と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。   Test substances (candidate substances) to be screened by the screening method of the present invention are not limited, but include nucleic acids (including antisense nucleotides of the polynucleotide of the present invention), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, etc. Specifically, the screening is carried out by bringing these test substances or a sample containing them (test sample) into contact with the cells or cell membrane fraction. Examples of such test samples include, but are not limited to, cell extracts containing test substances, gene library expression products, synthetic low-molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.

実施例に示すように、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルとなり得る3T3-L1細胞において、特異的に配列番号：26〜50のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質のマウスホモログが発現変動している。この知見から、これら本発明のポリヌクレオチド及び本発明のタンパク質の発現亢進は脂肪細胞の肥大化を伴う疾患と関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、これら配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の発現レベルを指標として、その発現量を変動させる物質を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の緩和／抑制作用を有する（脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。   As shown in the Examples, in 3T3-L1 cells, which can be a model of a disease associated with adipocyte hypertrophy, the expression of a mouse homologue of a protein having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 to 50 varies specifically. ing. From this finding, it is considered that the increased expression of the polynucleotide of the present invention and the protein of the present invention is associated with a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes. Therefore, the screening method of the present invention includes a method of searching for a substance that changes the expression level using the expression level of a protein containing any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 to 50 as an index. By this screening method, a candidate substance having an action of alleviating / suppressing a disease associated with fat cell hypertrophy (providing an improvement / treatment effect for a disease associated with fat cell hypertrophy) can be provided.

すなわち本発明のスクリーニング方法は、配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の発現量を変動させる物質を探索することによって、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補物質を提供するものである。   That is, the screening method of the present invention searches for a substance that varies the expression level of a protein containing any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 26 to 50, thereby improving a disease associated with fat cell hypertrophy or The present invention provides a candidate substance that becomes an active ingredient of a therapeutic agent.

候補物質の選別は、具体的には配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログを発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における前記本発明タンパク質の量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して変動する（低くなる／高くなる）ことを指標として、行うことができる。また、これら配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの発現・産生に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質［例えばインシュリン、デキサメタゾン、3-イソブチル-1-メチルキサンチン、プロスタグランジンJ2活性を有する物質等］によって誘導される当該タンパクの産生が被験物質の存在によって制御されること、すなわち発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の本発明のタンパク質又はそのホモログの発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して変動する（低くなる／高くなる）ことを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。   Specifically, the candidate substance is selected by adding a test substance (candidate substance) when cells expressing or producing a protein containing any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 26 to 50 or homologs thereof are used. The amount (level) of the protein of the present invention in the treated cells is changed (lowered / increased) compared to the amount (level) of cells to which the test substance (candidate substance) is not added. Can do. In addition, when using a cell that requires an expression inducer for the expression / production of a protein containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homologue thereof, an expression inducer [for example, insulin, dexamethasone, The production of the protein induced by 3-isobutyl-1-methylxanthine, a substance having prostaglandin J2 activity, etc.] is controlled by the presence of the test substance, that is, the test substance is contacted in the presence of the expression inducer. That the expression of the protein of the present invention or homologue thereof in the cultured cells fluctuates (becomes lower / higher) than the control cells (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the expression inducer. As an index, the test substance can be selected as a candidate substance.

用いられる細胞としては、例えば結腸由来細胞であるCaco-2細胞、HT-29細胞又はCOLO 205 細胞等が挙げられる。   Examples of the cells used include Caco-2 cells, HT-29 cells, and COLO 205 cells, which are colon-derived cells.

上記いずれかのタンパク質の発現を制御する物質のうち、発現を低下（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する候補物質の選別は、具体的には配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログを発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して低くなることを指標として、行うことができる。また、これら配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞のタンパク質又はそのホモログの発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。   Among the substances that control the expression of any of the above proteins, the selection of candidate substances that control the expression to be decreased (reduction of expression level, suppression of expression induction) is specifically performed by SEQ ID NOs: 26-50. When using a cell that expresses and produces a protein containing the amino acid sequence described in any one or a homolog thereof, the amino acid described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50 in a cell to which a test substance (candidate substance) is added It can be performed using as an indicator that the amount (level) of a protein containing a sequence or a homologue thereof is lower than the amount (level) of a cell to which a test substance (candidate substance) is not added. In addition, when using a cell that requires an expression inducer for the expression of the protein comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homologue thereof, the test substance is contacted in the presence of the expression inducer. Using the test substance as a candidate substance, the expression of the protein of the cells or homologs thereof is lower than that of a control cell (positive control) not contacted with the test substance in the presence of an expression inducer. Can be sorted.

上記いずれかのタンパク質の発現を制御する物質のうち、発現を上昇（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する候補物質の選別は、具体的には配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログを発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して高くなることを指標として、行うことができる。また、これら配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞のタンパク質の発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。   Among the substances that control the expression of any of the above proteins, the selection of candidate substances that are controlled to increase expression (increased expression level, enhanced expression induction) is specifically shown in SEQ ID NOs: 26-50. When using a cell that expresses and produces a protein containing the amino acid sequence described in any one or a homolog thereof, the amino acid described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50 in a cell to which a test substance (candidate substance) is added It can be performed using as an indicator that the amount (level) of a protein containing a sequence or a homologue thereof is higher than the amount (level) of a cell to which a test substance (candidate substance) is not added. In addition, when using a cell that requires an expression inducer for the expression of the protein comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homologue thereof, the test substance is contacted in the presence of the expression inducer. Selecting the test substance as a candidate substance using as an index that the expression of the protein in the cells to be expressed is higher than that of a control cell (positive control) that was not contacted with the test substance in the presence of an expression inducer Can do.

本発明のスクリーニング方法にかかる配列番号：26〜50に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの産生量は、前述したように、例えば抗体に関する本発明疾患マーカー(例えば配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログを認識する抗体)を用いたウェスタンブロット法などの公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器(BAS-1800II：富士フィルム社製など)、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を利用して、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。 As described above, the production amount of the protein comprising any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homologue thereof according to the screening method of the present invention is, for example, the disease marker of the present invention relating to antibodies (for example, SEQ ID NO: 26 The protein having an amino acid sequence described in any of -50 or an antibody recognizing a homologue thereof) can be quantified according to a known method such as Western blotting. Western blotting uses the disease marker of the present invention as a primary antibody, and then binds to a primary antibody labeled with a radioisotope such as 125 I, a fluorescent substance, an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), etc. as a secondary antibody. It can be carried out by labeling with an antibody and measuring signals derived from these labeling substances with a radiation measuring instrument (BAS-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector or the like. In addition, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, ECL Plus Western Blotting Detction System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) is used for detection according to the protocol, and multibioimager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) is used. It can also be measured.

(3-3) タンパク質の機能（活性）を指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号：26〜50のいずれかに記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の機能（活性）を指標として、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の治療又は予防薬をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程(a)、(b)及び(c)を含む： (3-3) Screening Method Using Protein Function (Activity) as an Index The present invention uses the function (activity) of a protein containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 to 50 as an index, Provided is a method of screening for a therapeutic or prophylactic agent for a disease associated with fat cell hypertrophy.
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):

（ａ）被験物質を 配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログに接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じる配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を測定し、該機能又は活性を被験物質を接触させない場合の配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの機能又は活性と比較する工程、及び
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの機能又は活性の変動をもたらす被験物質を選択する工程。 (A) contacting the test substance with a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homologue thereof,
(B) measuring the function or activity of the protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 26 to 50 or the homologue thereof generated due to the step (a), and determining the function or activity as a test substance A step of comparing the function or activity of the protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homolog thereof, or (c) the comparison result of (b) above, : A step of selecting a test substance that causes a change in the function or activity of a protein comprising the amino acid sequence of any of 26 to 50 or a homologue thereof

本発明のスクリーニング方法おいては、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの公知の機能・活性に基づく如何なる機能・活性測定方法をも利用することができる。すなわち、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの公知の機能・活性測定系に被験物質を添加し、当該配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の公知の機能・活性を制御（亢進・抑制・促進・阻害）する被験物質を、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に対して改善／治療効果を有する候補物質として選択するスクリーニング方法であれば、本発明のスクリーニング方法の範疇に含まれる。   In the screening method of the present invention, any function / activity measurement method based on a known function / activity of a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 to 50 or a homologue thereof can be used. . That is, a test substance is added to a known function / activity measurement system of a protein containing the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homologue thereof, and the sequences described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50 Screening for selecting test substances that control (enhance, suppress, promote, or inhibit) known functions and activities of proteins containing amino acid sequences as candidate substances that have an improvement / therapeutic effect on diseases associated with hypertrophy of adipocytes The method is included in the category of the screening method of the present invention.

前記本発明のスクリーニングは、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログを含む水溶液、細胞又は該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させることにより行うことができる。すなわち、配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログを含む水溶液としては、通常の水溶液の他、これらのタンパク質を含む細胞溶解液、細胞破砕液、核抽出液あるいは細胞の培養上清などを例示することができる。   In the screening of the present invention, a test substance is contacted with an aqueous solution, a cell or a cell fraction prepared from the protein containing the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homolog thereof, and the cell. Can be performed. That is, as an aqueous solution containing the protein containing the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 26 to 50 or a homologue thereof, in addition to normal aqueous solutions, cell lysates, cell disruptions, and nuclear extracts containing these proteins Or the culture supernatant of a cell etc. can be illustrated.

また、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、配列番号：26〜50のいずれかに記載のタンパク質又はそのホモログを発現し得る細胞を挙げることができる。該細胞としては、3T3-L1細胞、又は配列番号：26〜50のいずれかに記載のポリヌクレオチド又はそのホモログを導入した株化細胞などを用いることができる。
また本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞画分とは、上記細胞に由来する各種の画分を意味し、これには、例えば細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれる。
前記スクリーニングにおいて用いられる配列番号：26〜50に記載のタンパク質又はそのホモログは公知のタンパク質であり、前記（1-3）に記述したように、本発明により提供されるポリヌクレオチドの配列情報（配列番号1〜25及び51〜75）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養、及び必要に応じて培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。 Moreover, as a cell used for the screening method of this invention, the cell which can express the protein in any one of sequence number: 26-50 or its homologues can be mentioned regardless of endogenous and foreign nature. As the cells, 3T3-L1 cells, cell lines introduced with the polynucleotide described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50 or homologs thereof, and the like can be used.
The cell fraction used in the screening method of the present invention means various fractions derived from the cells, and includes, for example, a cell membrane fraction, a cytoplasm fraction, a cell nucleus fraction, and the like.
The protein described in SEQ ID NO: 26 to 50 or its homologue used in the screening is a known protein, and as described in (1-3) above, the sequence information (sequence) of the polynucleotide provided by the present invention Obtained by DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culture of transformed cells, and, if necessary, recovery of protein from the culture based on the numbers 1-25 and 51-75) Can do. These operations are based on methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). Can be done.

実施例に示すように、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患のモデルである3T3-L1細胞で、特異的に配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が発現変動している。この知見から、本タンパク質の機能（活性）亢進は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患と関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、これら配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の機能（活性）を指標として、該タンパク質の機能（活性）を制御する物質を探索する方法が包含される。本発明スクリーニング方法によれば、配列番号：26〜50のいずれか記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の機能又は活性を制御する物質を探索でき、かくして脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の緩和／抑制作用を有する（脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に対して改善／治療効果を発揮する）候補物質が提供される。   As shown in the examples, in 3T3-L1 cells, which are models of diseases associated with hypertrophy of adipocytes, a protein containing the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 26 to 50 was specifically expressed and varied. Yes. From this finding, it is considered that the enhancement of the function (activity) of this protein is related to a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes. Therefore, the screening method of the present invention searches for a substance that controls the function (activity) of the protein using the function (activity) of the protein containing the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 26 to 50 as an index. Methods are encompassed. According to the screening method of the present invention, it is possible to search for a substance that controls the function or activity of a protein comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 to 50, thus alleviating / suppressing a disease associated with fat cell hypertrophy. Candidate substances (providing improvement / treatment effects for diseases associated with hypertrophy of adipocytes) are provided.

本発明タンパク質の機能（活性）制御の１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を抑制（低下）させる方向に制御する物質の探索は、例えば配列番号：１〜25のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのホモログを含む水溶液、細胞又は該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞又は細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して低くなることを指標として行うことができる。   As one embodiment of the control of the function (activity) of the protein of the present invention, the search for a substance that controls the function (activity) of the protein in the direction of suppressing (decreasing), for example, the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 The function (activity) of the at least one protein obtained when a test substance is brought into contact with an aqueous solution, a cell, or a cell fraction prepared from the cell containing a polynucleotide containing the same or a homologue thereof, does not add a test substance It can be carried out using as an index a decrease in the function (activity) of the corresponding protein in the aqueous solution, cell or cell fraction of the control.

また本発明タンパク質の機能（活性）制御のもう１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を亢進（上昇、増加）させる方向に制御する物質の探索は、例えば配列番号：26〜50のいずれかに記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログを含む水溶液、細胞又は該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞又は細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して高くなることを指標として行うことができる。
すなわち本発明のスクリーニング方法は、配列番号：26〜50のいずれかに記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を制御する物質を探索することによって、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補物質を提供するものである。
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質(候補物質)は、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質又はこれらを含む試料(被験試料)を上記水溶液、細胞又は細胞画分と接触させることにより行われる。被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。 Moreover, as another embodiment of the control of the function (activity) of the protein of the present invention, the search for a substance that controls the function (activity) of the protein in the direction of enhancing (increasing or increasing) is performed, A function (activity) of at least one protein obtained when the test substance is contacted with an aqueous solution, a cell or a cell fraction prepared from the protein comprising any one of the amino acid sequences described above or a homologue thereof ) Is higher than the function (activity) of the corresponding protein in the control aqueous solution, cell or cell fraction to which the test substance is not added.
That is, the screening method of the present invention enlarges adipocytes by searching for a substance that controls the function or activity of a protein containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 26 to 50 or a homologue thereof. The candidate substance used as the active ingredient of the ameliorating agent or therapeutic agent of the disease accompanying this is provided.
The test substance (candidate substance) to be screened by the screening method of the present invention includes, but is not limited to, an antibody to a nucleic acid, peptide, protein (protein containing any one of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 26 to 50). ), Organic compounds, inorganic compounds, and the like. Specifically, the screening of the present invention is carried out by bringing these test substances or samples containing them (test samples) into contact with the aqueous solutions, cells or cell fractions. Examples of the test sample include, but are not limited to, a cell extract containing the test substance, an expression product of a gene library, a synthetic low molecular weight compound, a synthetic peptide, and a natural compound.

かくして選抜取得される被験物質は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補となる。   Thus, the test substance selected and acquired is a promising candidate for a drug that alleviates or suppresses (improves or treats) a disease associated with fat cell hypertrophy.

なお、上記(3-1)〜(3-3)に記載するスクリーニング方法は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善又は治療剤の候補物質を選別するのみならず、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の既存の若しくは新規な改善又は治療剤（候補薬）が、配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドの発現を制御するか否か、あるいは配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現若しくは機能・活性を制御するか否かを評価、確認するためにも用いることができる。すなわち本発明のスクリーニング方法の範疇には、候補物質の探索のみならず、このような評価あるいは確認を目的とするものも含まれる。   The screening methods described in the above (3-1) to (3-3) not only improve diseases associated with fat cell hypertrophy or select candidate substances for therapeutic agents, but also enlarge fat cells. Whether an existing or novel amelioration or therapeutic agent (candidate drug) for a disease associated therewith controls the expression of a polynucleotide comprising the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 25, or SEQ ID NO: 26 It can also be used for evaluating and confirming whether to control the expression, function, or activity of a protein comprising the amino acid sequence described in any of -50. That is, the category of the screening method of the present invention includes not only searching for candidate substances but also those for the purpose of such evaluation or confirmation.

上記(3-1)〜(3-3)に記載する本発明のスクリーニング方法によって選択された制御物質又は候補物質は、さらに脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の動物モデルとして周知である動物モデル（例えば、ｄB/ｄBマウスモデル、高脂肪食マウスモデル等が挙げられる）、正常動物を用いた薬効試験、安全性/体内動態試験、さらに脂肪細胞の肥大化を伴う疾患に罹患した患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善又は治療剤を選別取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）又は遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。   The control substance or candidate substance selected by the screening method of the present invention described in (3-1) to (3-3) above is an animal model that is well known as an animal model of a disease associated with hypertrophy of adipocytes ( (For example, a dB / dB mouse model, a high-fat diet mouse model, etc.), drug efficacy tests using normal animals, safety / pharmacokinetic tests, and clinical trials for patients suffering from diseases involving adipocyte hypertrophy By conducting these tests, it is possible to select and obtain a therapeutic agent or a therapeutic agent for diseases that are associated with more practical fat cell hypertrophy. The substances thus selected can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation) or genetic manipulation based on the structural analysis results.

（４）脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善・治療剤
本発明は、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善・治療剤を提供するものである。 (4) Agent for improving / treating disease associated with hypertrophy of fat cells The present invention provides an agent for improving / treating disease associated with hypertrophy of fat cells.

本発明は配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドがコードするタンパク質（配列番号：26〜50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の発現が脂肪細胞の肥大化を伴う疾患と関連しているという新たな知見から、(1)配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現を変動させる（制御する）物質が、上記疾患の改善又は治療に有効であるという考えに基づくものである。すなわち、本発明の脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善・治療剤は配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現を変動させる物質を有効成分とするものである。   In the present invention, the expression of the protein encoded by the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 (protein having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 26 to 50) is adipocyte. From the new finding that it is associated with a disease involving hypertrophy, (1) a substance that varies (controls) the expression of a polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 is It is based on the idea that it is effective in improving or treating a disease. That is, the agent for improving / treating a disease associated with fat cell hypertrophy according to the present invention comprises a substance that varies the expression of a polynucleotide having the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 25 as an active ingredient. is there.

当該有効成分となる配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現制御物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って化学・生化学的手法により、若しくは工業的に製造されたものであってもよい。   The expression control substance of the polynucleotide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 as the active ingredient relates not only to the substance selected using the above screening method but also to the selected substance. It may be produced by chemical / biochemical techniques or industrially according to conventional methods based on the information.

かかる発現制御物質（発現抑制（減少）物質、あるいは発現誘導（増大）物質）は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与又は非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ〜数百ｍｇ程度を、１日１回ないし数回に分けて投与することができる。   Such expression control substances (expression suppression (decrease) substances or expression induction (increase) substances) may be used as they are or pharmaceutically acceptable carriers (excipients, extenders, binders, lubricants, etc.). Included) and conventional additives and the like, and can be prepared as a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition is prepared in a form to be prepared (tablet, pill, capsule, powder, granule, syrup or the like; oral injection, instillation, external preparation, nasal drop, eye drop, inhalant, Oral administration or parenteral administration can be performed depending on a suppository or the like. The dosage varies depending on the type of active ingredient, administration route, administration subject or patient's age, body weight, symptoms, etc., and cannot be defined unconditionally, but the daily dosage is several mg to 2 g, preferably several tens mg to several About 100 mg can be administered once to several times a day.

上記有効成分とする物質がDNAによりコードされるものの場合、該DNAをポリヌクレオチド治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上記有効成分が配列番号：１〜25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組み込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、もとより本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。 In the case where the substance as the active ingredient is encoded by DNA, it may be possible to incorporate the DNA into a polynucleotide therapeutic vector and perform gene therapy. Furthermore, when the active ingredient is an antisense oligonucleotide of a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25, gene therapy is performed as it is or by incorporating it into a gene therapy vector. You can also In these cases, the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but those skilled in the art can appropriately select them.
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to these Examples at all.

プロテオーム解析
（１）3T3-L1からの分泌タンパク質の調製
マウス3T3-L1 繊維芽細胞は ダルベッコ改変イーグル培地Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md) に10%ウシ血清(GIBCO BRL, Gaithersburg, Md), 2mM L−グルタミン, ペニシリン100U/L, ストレプトマイシン100mg/L (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md)を添加して、37℃, 5% 二酸化炭素で10cmシャーレにて培養した。細胞はコンフルエントになった後、2日間そのまま保持した。その後、分化誘導培地におき換えた。分化誘導培地は、ダルベッコ改変イーグル培地,10% ウシ胎児血清, 0.5mM 1-メチル-3-イソブチルキサンチン, 0.25μM デキサメサゾン, 10μg/ml インスリンを用いた。 さらに2日後、培地をダルベッコ改変イーグル培地,10% ウシ胎児血清に取り替えた。細胞はそのまま分化させ、分化8日目と30日目に分泌タンパク質の採取を行った。 分泌タンパク質の採取は、まず培地中の血清タンパクを除くため10mlのPBSで6回洗浄した後、血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地で37℃, 5%二酸化炭素の条件で培養し、一晩（16h〜18h）培養した後、その培養液を採取した。採取液はアミコンウルトラ-15,10K(ミリポア社)でメーカー推奨条件にて限外ろ過濃縮し、分泌タンパク質液（試料）とした。 Proteome analysis (1) Preparation of secreted protein from 3T3-L1 Mouse 3T3-L1 fibroblasts were added to Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md) with 10% bovine serum (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md). ), 2 mM L-glutamine, penicillin 100 U / L, streptomycin 100 mg / L (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md) was added, and the cells were cultured in a 10 cm dish at 37 ° C., 5% carbon dioxide. The cells were kept intact for 2 days after becoming confluent. Thereafter, the medium was replaced with a differentiation induction medium. As a differentiation induction medium, Dulbecco's modified Eagle medium, 10% fetal bovine serum, 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 0.25 μM dexamethasone, and 10 μg / ml insulin were used. Two more days later, the medium was replaced with Dulbecco's modified Eagle medium, 10% fetal bovine serum. Cells were differentiated as they were, and secreted proteins were collected on the 8th and 30th days of differentiation. In order to remove the secreted protein, it was first washed 6 times with 10 ml of PBS to remove the serum protein in the medium, then cultured in Dulbecco's modified Eagle medium without serum at 37 ° C and 5% carbon dioxide overnight ( 16h-18h) After culturing, the culture solution was collected. The collected solution was Amicon Ultra-15, 10K (Millipore) and concentrated by ultrafiltration under the manufacturer's recommended conditions to obtain a secreted protein solution (sample).

（２）タンパク質の電気泳動
（１）で得られた試料はSDS サンプルバッファー（第一化学製）と１：１（v/v）で混合し、5分間90℃の熱処理により完全に変性溶解させた。10cmシャーレ3枚から調製したそれぞれの試料全量をSDS-PAGEで粗分画した。泳動は、10-20% レディーゲルJ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) と電気泳動装置ミニプロティアン3 (Bio-Rad)を用いて、メーカー推奨条件で行い、引き続きCBB染色した。染色後、解剖用のメスでバンドパターンを目印に分子量ごとに9分割した。
（３）タンパク質のトリプシン消化
切り取ったゲルは定法により還元アルキル化後In-gel消化した。すなわち、0.1mM重炭酸アンモニウム / アセトニトリル(50:50)をゲルが完全に浸る量加え、３０分間軽く攪拌してゲルの洗浄とバッファー置換を行った。洗浄は2回行った。洗浄液を丁寧に取り除き10mM ジチオスレイトール/0.1M 重炭酸アンモニウムをゲルが完全に浸る量だけ加えて、５６℃で１時間還元処理した。ジチオスレイトール液を捨てて、55mMヨードアセトアミド/0.1M 重炭酸アンモニウムを十分な量加え、暗所・室温で緩やかに攪拌しながら１時間アルキル化処理した。その後、0.1mM 重炭酸アンモニウム / アセトニトリル(50:50)をゲルが完全に浸る量加え、３０分間軽く攪拌してゲルの洗浄とバッファー置換を行った。洗浄とバッファー置換は2回を行った。その後、ゲルはスピードバックで乾燥させた。完全に乾燥したゲルに100ng/uLトリプシン液（0.1mM 重炭酸アンモニウム）5μLを添加して、軽くスピンダウンした後、純水5μLを加えて、再度スピンダウンした。さらに50mM 重炭酸アンモニウム 10μLを加えて、37℃で一晩処理した。ゲルが浸らない場合には50mM 重炭酸アンモニウムを追加して調節した。ペプチドの抽出には、５％ギ酸40uL / アセトニトリル 40uL を加え、30分間ゆっくりと攪拌・抽出を2回行った後、プールした抽出液をスピードバック乾燥してＭＳ用試料とした。サンプルの分析は、イオントラップ型LC-MS（LCQ；サーモクエスト）でおこなった。上記サンプルを全量、HPLC（HP1100；アジレント）にアプライし、PepMapC18（内径75μm、長さ15cm；LCパッキング）で分離しながら、LC-MS/MS解析をおこないMS/MSスペクトルを取得した。HPLCの条件は、流速0.2μl/min、A液；0.1%酢酸、B液；0.1%酢酸/エタノールでおこなった。
MS/MSスペクトルからのタンパク質同定には、マスコット 検索エンジン（マトリクスサイエンス社製）を用い、NCBI等の公共の遺伝子・タンパク質配列データベースに対し検索を行うことにより実施した。
（４）質量分析によるタンパク質の同定
LC-MS/MS 分析はLCQ ion-trap mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA) と nano-HPLC (Agilent 1100 Pump modified with a pre-column splitter, Agilent Technologies, Palo Alto CA) および nanospray sourceをon-lineで用いた。1 μL のペプチド液をnanoLC column (PepMap C18, 75 μm x 150 mm, LC packings, Amsterdam, Holland)で分離した。 溶出条件は移動相A （0.1% 酢酸水）と移動相B(0.1% 酢酸 アセトニトリル)のリニアグラジエント 5-100% / 120分, 0.2 μL/minで行った。The LCQ は、data-dependent MS/MS モードにてfull-MS scan (m/z 400-2000)、 続くMS/MS scansはcollision energy level 35%で行った。 取得したスペクトルはNCBI nonredundant databaseに対してマスコット 検索エンジン（マトリクスサイエンス社製） を用いて検索した。MASCOT search 結果では、各ペプチドのpositive score 20以上のものを用いた。分泌シグナル解析にはPSORT（ http://psort.nibb.ac.jp ）を用いた。結果を表１に示す。 (2) Protein electrophoresis The sample obtained in (1) is mixed with SDS sample buffer (Daiichi Kagaku) at 1: 1 (v / v) and completely denatured and dissolved by heat treatment at 90 ° C for 5 minutes. It was. The total amount of each sample prepared from three 10 cm dishes was roughly fractionated by SDS-PAGE. Electrophoresis was performed using 10-20% Ready Gel J (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) and electrophoresis apparatus Mini-Protean 3 (Bio-Rad) under the conditions recommended by the manufacturer, followed by CBB staining. After staining, the band pattern was divided into 9 parts for each molecular weight using a scalpel knife as a landmark.
(3) Trypsin digestion of protein The cut gel was subjected to reductive alkylation by an ordinary method, followed by In-gel digestion. That is, 0.1 mM ammonium bicarbonate / acetonitrile (50:50) was added in such an amount that the gel was completely immersed, and the gel was washed and the buffer was replaced by gently stirring for 30 minutes. Washing was performed twice. The washing solution was carefully removed and 10 mM dithiothreitol / 0.1 M ammonium bicarbonate was added in an amount sufficient for the gel to soak and reduced at 56 ° C. for 1 hour. After discarding the dithiothreitol solution, a sufficient amount of 55 mM iodoacetamide / 0.1M ammonium bicarbonate was added, and alkylated for 1 hour with gentle stirring in the dark at room temperature. Thereafter, 0.1 mM ammonium bicarbonate / acetonitrile (50:50) was added in such an amount that the gel was completely immersed, and the gel was washed and the buffer was replaced by gently stirring for 30 minutes. Washing and buffer replacement were performed twice. The gel was then dried with a speed bag. To the completely dried gel, 5 μL of 100 ng / uL trypsin solution (0.1 mM ammonium bicarbonate) was added and lightly spun down. Then, 5 μL of pure water was added and the spin down was performed again. Further, 10 μL of 50 mM ammonium bicarbonate was added and treated overnight at 37 ° C. If the gel did not soak, it was adjusted by adding 50 mM ammonium bicarbonate. For extraction of peptides, 40 uL of 5% formic acid / 40 uL of acetonitrile was added, and after slowly stirring and extracting twice for 30 minutes, the pooled extracts were speed-back dried to obtain MS samples. Sample analysis was performed by ion trap LC-MS (LCQ; ThermoQuest). The entire amount of the sample was applied to HPLC (HP1100; Agilent), and LC-MS / MS analysis was performed while separating with PepMapC18 (inner diameter 75 μm, length 15 cm; LC packing) to obtain an MS / MS spectrum. The HPLC conditions were as follows: flow rate 0.2 μl / min, solution A; 0.1% acetic acid, solution B; 0.1% acetic acid / ethanol.
Protein identification from MS / MS spectra was performed by searching a public gene / protein sequence database such as NCBI using a mascot search engine (Matrix Science).
(4) Protein identification by mass spectrometry
LC-MS / MS analysis was performed using LCQ ion-trap mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA), nano-HPLC (Agilent 1100 Pump modified with a pre-column splitter, Agilent Technologies, Palo Alto CA) and nanospray source. Used with -line. 1 μL of the peptide solution was separated with a nanoLC column (PepMap C18, 75 μm × 150 mm, LC packings, Amsterdam, Holland). Elution conditions were as follows: mobile phase A (0.1% acetic acid aqueous solution) and mobile phase B (0.1% acetic acid acetonitrile) linear gradient 5-100% / 120 min, 0.2 μL / min. The LCQ was performed in data-dependent MS / MS mode with full-MS scan (m / z 400-2000), followed by MS / MS scans at a collision energy level of 35%. The acquired spectrum was searched against the NCBI nonredundant database using a mascot search engine (Matrix Science). In the MASCOT search results, peptides with a positive score of 20 or more were used. PSORT (http://psort.nibb.ac.jp) was used for the secretion signal analysis. The results are shown in Table 1.

Figure 2006141233
Figure 2006141233

ここで、表１中の配列番号は、本明細書配列表における配列番号に相当する。「タンパク質量のスコア」とは、そのタンパク質タンパクのトリプシン消化断片ペプチドのうち、スペクトルが観測されたものの数を示す。トリプシンでリジン残基とアルギニン残基のｃ末端側で特異的に切断すると、タンパク質から生成するペプチド断片の数は、当該タンパク質のアミノ酸配列に依存して固有の値となる。さらに、同じタンパク質であれば、存在量が多い方が当該タンパク質由来のペプチドのスペクトルも数多く観測されることがわかった。従って、同定されたタンパク質の量的な変動のパラメータとして、前記スコアを用い、脂肪細胞の肥大化により発現量が変動するタンパク質として、表１に記載のタンパク質を選抜した後に、スペクトルのイオン強度を比較することにより、量的変化を確認した。   Here, the SEQ ID NO in Table 1 corresponds to the SEQ ID NO in the Sequence Listing of the present specification. “Score of protein amount” indicates the number of tryptic digested peptide fragments of the protein that have a spectrum observed. When trypsin specifically cleaves the lysine residue and arginine residue at the c-terminal side, the number of peptide fragments generated from the protein becomes a unique value depending on the amino acid sequence of the protein. Furthermore, it was found that if the amount of the protein is the same, a larger amount of the spectrum of peptides derived from the protein is observed. Therefore, after selecting the proteins listed in Table 1 as proteins whose expression level varies due to fat cell hypertrophy using the score as a parameter for quantitative variation of the identified proteins, the ionic strength of the spectrum is selected. A quantitative change was confirmed by comparison.

脂肪細胞の肥大化を伴う疾患治療薬のスクリーニング
（１）細胞培養
マウス3T3-L1 繊維芽細胞は ダルベッコ改変イーグル培地Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md) に10%ウシ血清(GIBCO BRL, Gaithersburg, Md), 2mM L−グルタミン, ペニシリン100U/L, ストレプトマイシン100mg/L (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md)を添加して、37℃, 5% 二酸化炭素で10cmシャーレにて培養する。細胞はコンフルエントになった後、2日間そのまま保持する。その後、分化誘導培地におき換えた。分化誘導培地は、ダルベッコ改変イーグル培地,10% ウシ胎児血清, 0.5mM 1-メチル-3-イソブチルキサンチン, 0.25μM デキサメサゾン, 10μg/ml インスリンを用いる。 さらに2日後、培地をダルベッコ改変イーグル培地,10% ウシ胎児血清に取り替える。
次に、被験物質もしくは培養溶媒（対照の場合）、および必要に応じて０．５％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）を添加し、５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養する。
（２）ポリヌクレオチド発現量によるスクリーニング
RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、それぞれ培養混合物よりtotalRNAを調製、さらにｃDNAを調製する。調製したサンプルをノーザンブロット法あるいはRT‐PCR法で分析し、配列番号：１〜２５のいずれかに記載の塩基配列を有するポリペプチドの発現レベルを定量する。
具体的には、抽出したRNAサンプルは、１％ホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動法にて泳動した後、Hybond-N+メンブレン（Amersham）に転写する。メンブレンのプレハイブリダイゼーションは、Rapid-hyb buffer(Amersham)を用いて65℃で2時間行い、その後、α−32P標識プローブを加えてハイブリダイゼーションを65℃で16時間行う。配列番号１〜２５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを特異的に認識するプローブは、Bca Best Labeling Kit(Takara)を用いて、マウス由来cDNAからランダムプライム法により作製する。プローブの標識には、1.85MBqの[α−32P]dCTP（Amersham）を用いる。メンブレンの洗いは、SSC with 0.1％ SDSにより行う。SSCの濃度は、2ｘ、1ｘ、0.1ｘの順で洗いを繰り返す毎にその濃度を下げていく。メンブレンのオートラジオグラフィーには、BAS2000 image analyzer(Fuji)を用いる。
前記ポリヌクレオチドの発現量が、対照における発現量と比較して1.5倍以上変動する被験物質（発現制御物質）を、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の治療薬候補物質として選択することができる。
（３）タンパク質発現量によるスクリーニング（ウェスタンブロット法）
（１）の細胞をRIPA buffer[50mM NaCl, 1%(vol/vol) nonidet P-40, 0.5%(vol/vol) deoxycholate, 0.1%(vol/vol) SDS, 50mM Tris-Cl ph8.0, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM Na3VO4, 1mM DTT, 10mM NaF, 30mM NaPPi, 15μｇ/ml Aprotinin, 10μｇ/ml Leupeptin]にて溶解し、遠心上清をタンパク質抽出サンプルとする。抽出したサンプルは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて泳動した後、ニトロセルロースメンブレン（Advantec）に転写する。1次抗体に配列番号：１〜２５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のポリクローナルラビット抗体（Genes Dev, 11:2052-2065, 1997）、2次抗体に抗-ラビットIgG HRP標識ヤギ抗体（Santa cruz）を用いる。抗原抗体反応は、ECL Western Blotting Detection Reagents(Amersham)を用いてHyperfilm ECL(Amersham)上に検出する。前記タンパク質の発現量が、対照における発現量と比較して1.5倍以上変動する被験物質（発現制御物質）を、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の治療薬候補物質として選択することができる。 Screening for drugs for treating diseases associated with adipocyte hypertrophy (1) Cell culture Mouse 3T3-L1 fibroblasts were added to Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md) with 10% bovine serum (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md), 2 mM L-glutamine, penicillin 100 U / L, streptomycin 100 mg / L (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md) is added, and cultured in a 10 cm dish at 37 ° C., 5% carbon dioxide. Cells are kept intact for 2 days after confluence. Thereafter, the medium was replaced with a differentiation induction medium. As the differentiation induction medium, Dulbecco's modified Eagle medium, 10% fetal bovine serum, 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 0.25 μM dexamethasone, and 10 μg / ml insulin are used. Two more days later, the medium is replaced with Dulbecco's modified Eagle medium, 10% fetal bovine serum.
Next, a test substance or a culture medium (in the case of a control) and, if necessary, 0.5% dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as DMSO) are added and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . .
(2) Screening by polynucleotide expression level
Using RNeasy Mini Kit (QIAGEN), total RNA is prepared from each culture mixture, and cDNA is further prepared. The prepared sample is analyzed by Northern blotting or RT-PCR, and the expression level of the polypeptide having the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 is quantified.
Specifically, the extracted RNA sample is electrophoresed by 1% formaldehyde-denatured agarose gel electrophoresis, and then transferred to a Hybond-N + membrane (Amersham). Pre-hybridization of the membrane is performed at 65 ° C. for 2 hours using Rapid-hyb buffer (Amersham), and then α- 32 P-labeled probe is added and hybridization is performed at 65 ° C. for 16 hours. A probe that specifically recognizes the polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 is prepared from mouse-derived cDNA by the random prime method using Bca Best Labeling Kit (Takara). 1.85 MBq [α- 32 P] dCTP (Amersham) is used for labeling the probe. Wash the membrane with SSC with 0.1% SDS. The concentration of SSC is lowered every time washing is repeated in the order of 2x, 1x, and 0.1x. BAS2000 image analyzer (Fuji) is used for autoradiography of the membrane.
A test substance (expression control substance) in which the expression level of the polynucleotide varies by 1.5 times or more compared to the expression level in the control can be selected as a therapeutic drug candidate substance for a disease associated with hypertrophy of adipocytes.
(3) Screening by protein expression level (Western blotting)
The cells in (1) were treated with RIPA buffer [50 mM NaCl, 1% (vol / vol) nonidet P-40, 0.5% (vol / vol) deoxycholate, 0.1% (vol / vol) SDS, 50 mM Tris-Cl ph8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM DTT, 10 mM NaF, 30 mM NaPPi, 15 μg / ml Aprotinin, 10 μg / ml Leupeptin], and the centrifuged supernatant is used as a protein extraction sample. The extracted sample is electrophoresed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and then transferred to a nitrocellulose membrane (Advantec). A polyclonal rabbit antibody (Genes Dev, 11: 2052-2065, 1997) of a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 25 as a primary antibody, and an anti-rabbit IgG HRP-labeled goat antibody as a secondary antibody (Santa cruz) is used. Antigen-antibody reaction is detected on Hyperfilm ECL (Amersham) using ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham). A test substance (expression control substance) in which the expression level of the protein fluctuates by 1.5 times or more compared to the expression level in the control can be selected as a therapeutic drug candidate substance for a disease associated with hypertrophy of adipocytes.

Claims (9)

配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の疾患マーカー。   SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 26. A disease marker for diseases associated with hypertrophy of adipocytes, comprising a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the base sequence according to any of 25 and 25. 脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出においてプローブ又はプライマーとして使用される請求項１に記載の疾患マーカー。   The disease marker according to claim 1, which is used as a probe or a primer in detection of a disease associated with fat cell hypertrophy. 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたRNA又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、請求項１又は請求項２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のRNA又は該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、及び
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる測定結果に比して、以下の１）又は２）のいずれかであることを指標として、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患を判断する工程：
１）配列番号：１、2、3、4、5、6、7及び8のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからならなる疾患マーカーへの結合量が減少していること、
２）配列番号：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからならなる疾患マーカーへの結合量が増大していること。 A method for detecting a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom with the disease marker according to claim 1 or 2;
(B) a step of measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA using the disease marker as an index, and (c) obtained in (b) above. The measurement result of the subject to be examined is determined to be affected by a disease associated with hypertrophy of fat cells, using as an index the following 1) or 2) as compared with the measurement result obtained for a normal biological sample Steps to do:
1) a polynucleotide having at least 15 contiguous bases in the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 and / or a poly complementary to the polynucleotide Reduced binding to a disease marker consisting of nucleotides,
2) In the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 and 25 The amount of binding to a disease marker comprising a polynucleotide having at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide is increased. 配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を含有する、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の疾患マーカー。   SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 And a disease marker for diseases associated with hypertrophy of fat cells, comprising an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of any one of 50 and 50. 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項４に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質又はその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、及び
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる測定結果に比して、以下の１）又は２）のいずれかであることを指標として、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の罹患を判断する工程：
１）配列番号：26、27、28、29、30、31、32及び33のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体からなる疾患マーカーへの結合量が減少していること、
２）配列番号：34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体からなる疾患マーカーへの結合量が増大していること。 A method for detecting a disease accompanied by hypertrophy of adipocytes, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of binding a protein prepared from a biological sample of a subject and the disease marker according to claim 4;
(B) a step of measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker or a partial peptide thereof using the disease marker as an index, and (c) a measurement result of the subject obtained in (b) above is a normal living body. A step of determining the morbidity of a disease accompanied by hypertrophy of fat cells, using as an index one of the following 1) or 2) as compared with the measurement result obtained for the sample:
1) The amount of binding to a disease marker comprising an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, and 33 is decreased;
2) A protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50 The amount of binding to the disease marker comprising the antibody to be recognized is increased. 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞における配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における上記に対応するポリヌクレオチドの発現量と比較する工程、及び
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬の候補物質として選択する工程。 A method for screening a drug for improving or treating a disease accompanied by hypertrophy of fat cells, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) Test substance and SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 Contacting with a cell capable of expressing a polynucleotide having the nucleotide sequence according to any one of 22, 23, 24 and 25 or a homologue thereof,
(b) SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, in cells contacted with the test substance Measure the expression level of a polynucleotide having the base sequence described in any one of 19, 20, 21, 22, 23, 24 and 25 or a homologue thereof, and correspond to the above in a control cell in which the expression level is not contacted with a test substance Comparing the expression level of the polynucleotide to be
(c) Based on the comparison result of (b) above, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, and 25, a test substance that changes the expression level of a polynucleotide having the base sequence according to any one of the above or a homologue thereof is used for diseases associated with hypertrophy of adipocytes. Selecting as a candidate substance for improvement or treatment. 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞における配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質又はそのホモログの発現量と比較する工程、及び
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善もしくは治療薬の候補物質として選択する工程。 A method for screening a drug for improving or treating a disease accompanied by hypertrophy of fat cells, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) Test substance and SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 Contacting with a cell capable of expressing a protein having the amino acid sequence of any one of 47, 48, 49 and 50 or a homologue thereof,
(b) SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 in cells contacted with the test substance Measure the expression level of a protein having the amino acid sequence of any of 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50 or a homologue thereof, and the expression level corresponds to the above in a control cell not contacted with a test substance Comparing the expression level of the protein to be expressed or the homologue thereof, and
(c) Based on the comparison result of (b) above, SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50, a test substance that fluctuates the expression level of a protein having the amino acid sequence described in any one of Or the process of selecting as a candidate substance of a therapeutic agent. 配列番号：１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそのホモログの発現量を制御する物質を有効成分とする、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善又は治療薬。
SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 And a drug for improving or treating a disease associated with hypertrophy of adipocytes, comprising as an active ingredient a substance that controls the expression level of a polynucleotide having the base sequence of any one of 25 and 25 or a homologue thereof.
配列番号：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を制御する物質を有効成分とする、脂肪細胞の肥大化を伴う疾患の改善又は治療薬。
SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 And an agent for improving or treating a disease associated with hypertrophy of fat cells, comprising as an active ingredient a substance that controls the expression level of the protein having the amino acid sequence of any one of 50 and 50 or a homologue thereof.
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