JP4116551B2

JP4116551B2 - 新規のターチオフェン‐３−カルボキシル酸化合物とその製造方法、該化合物をモノマーとした機能性電導性ターチオフェンポリマー、該ポリマーを利用したｄｎａハイブリダイゼーション検出方法、ならびにプローブｄｎａの製造方法

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Publication number: JP4116551B2
Application number: JP2003528801A
Authority: JP
Inventors: シム、ユン−ボー
Original assignee: プサンナショナルユニバーシティーインダストリー−ユニバーシティーコーポレーションファウンデーション
Priority date: 2001-09-12
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2022-09-11
Also published as: WO2003024954A1; EP1425275B1; DE60223821D1; EP1425275A1; EP1425275A4; DE60223821T2; JP2008201782A; US7161013B2; KR100497676B1; KR20030023527A; US20050064415A1; JP2005507389A

Description

本発明は、ＤＮＡバイオセンサ及び電気化学的バイオセンサ分野で新規の電導性ポリマーを用いるインピーダンス測定を通じた新規のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法に関するものであって、より詳しくは、新規の３’−カルボキシル−５，２’；５’，２”−ターチオフェン化合物を製造する工程、該化合物をモノマーとして、ガラス質炭素電極上で電気化学的重合を通じて機能性電導性ターチオフェンポリマーを製造する工程、このように製造したポリマーにプローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) を固定化する工程、およびターゲットＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) のハイブリダイゼーション前後のインピーダンスを測定する工程からなる新規のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法に関するものである。

近年、生物工学及び医学診断分野では、持続的でありながら、選択的に生物分子等を検出できる装置が要求されて来た。特に、核酸の電気化学的検出に対する最近の傾向は、ＤＮＡハイブリダイゼーション、薬物及び発癌物質とＤＮＡとの相互作用ならびにＤＮＡ損傷を含む特別なＤＮＡ相互作用に基づいた電気化学的バイオ検出器またはバイオセンサの開発に焦点が合わされている。これらセンサの中で、多様なＤＮＡセンサがＤＮＡ配列、毒性化合物及び微量有機化合物を検出するために使用されてきている。特に、ゲノムに対して幅広く適用可能である点から、ＤＮＡ配列についてのハイブリダイゼーション検出が、最も信頼できる方法のうちの１つとして認識されている。

一方、このようなＤＮＡハイブリダイゼーション検出と関連して、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法としては、例えば固定されているプローブＤＮＡに蛍光物質( 染料) で標識されたターゲットＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) をハイブリダイズさせた後に光学的な方法で蛍光強度を測定する方法が報告されている（非特許文献１〜３を参照のこと）。

また、指示薬の酸化還元を測定してＤＮＡハイブリダイゼーションを検出する方法も報告されている（非特許文献４〜６を参照のこと）。該方法は、固定されているプローブＤＮＡをターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせる工程と、ハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡの内部に指示薬(indicator) が挿入（インターカレート）されるように指示薬と反応させる工程とからなる。

さらに他の従来のＤＮＡハイブリダイゼーション検出技術の例として、プローブＤＮＡを電極表面に固定化させた後、水晶発振子微量天秤(Quartz Crystal Microbalance; QCM)を利用してターゲットＤＮＡと反応する時の周波数の変化を測定する方法がある（非特許文献７〜８を参照のこと）。

さらに他の例として、電導性ポリマー( ポリピロールプローブ) にプローブＤＮＡを固定させた後、ターゲットＤＮＡと反応する時、電導性ポリマー自体の酸化還元波の電位移動(shift) と電流大きさの変化を測定する方法がある（非特許文献９〜１０を参照のこと）。

しかし、ターゲットＤＮＡを指示薬で標識する場合には、試料の準備が煩雑であるという不利点がある。さらに、ハイブリダイゼーション後に指示薬を挿入させる場合には試験
工程に要する時間が長くなるので、工程の産業化には不都合である。

また、上述の光学的方法またはＱＣＭを用いる方法の場合、測定装備が大型かつ高価であるので、専門管理者が必要であると同時に携帯用には適さない。酸化還元指示薬を使用する電気化学的な方法では、ハイブリダイゼーションの程度が指示薬の感度に依存するので、感度と選択性において問題がある。

そして、ポリマーの酸化還元波を測定する方法の場合、該方法は携帯用センサとして適用できない。
Physicochemical and Engineering Aspects, 2000, 175,147−152 Analytica Acta, 1997,350,51 −58 Anal,Chem.1994,66,3379−3383 Anal. Chem. 1996, 68, 2629−2634 Anal. Chem. 1994, 66, 3830−3833 Anal.Chem. 2000, 72, 1334−1341 Biointerfaces, 1998, 10, 199−204 J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 8299−8300 J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 7388−7389 Synthetic Metals, 1999, 100, 89−94

従って、ＤＮＡハイブリダイゼーションを指示薬を使用せずに直接検出可能なため実験に要する時間を短縮し、ＤＮＡハイブリダイゼーションが生じたか否かを短時間で容易に確認可能なため専門管理者でない一般人が誰でも容易にＤＮＡハイブリダイゼーションを確認できる、携帯用ＤＮＡセンサを開発することが切実に要求されている。

ここで、本発明者らは、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション検出における上述の問題点等を解決しようと真摯かつ広範囲に研究を進行し、その結果、新規のターチオフェン−３−カルボキシル酸化合物をモノマーとして製造される機能性電導性ターチオフェンポリマーを利用して、ＤＮＡハイブリダイゼーション前後のインピーダンスを測定する場合、直接的にＤＮＡハイブリダイゼーションを検出できることを見出し、本発明の完成に至った。

従って、本発明の第１番目の目的は、新規の３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物を提供することである。
本発明の第２番目の目的は、上記３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物をモノマーとして製造される機能性電導性ターチオフェンポリマーを提供することである。

本発明の第３番目の目的は、上記ポリマーにプローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) を固定化させた後、ＤＮＡハイブリダイゼーション前後のインピーダンス測定を測定することによりＤＮＡハイブリダイゼーションを検出する新規な方法を提供することである。

本発明の第４番目の目的は、プローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) を製造する方法を提供することである。

（発明の構成及び作用）
上記の目的等のために, 本発明の機能性電導性ターチオフェンポリマーは、３−ブロモターチオフェンを出発物質として３−シアノターチオフェンを製造した後、これを加水分解させて３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物を調製し、これをモノマーとして電気化学的に重合することにより製造される。

また、本発明のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法は、前記ターチオフェン化合物を用いてガラス質炭素電極上に電気化学的重合を通じて作製した機能性電導性ターチオフェンポリマーによって該炭素電極を修飾する工程と、上記電導性ポリマーにプローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) を固定化する工程と、ターゲットＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) のハイブリダイゼーション前後のインピーダンスを測定する工程とからなる。

本発明のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法に使用されるプローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) は、ＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) の５' 末端に、アミンが結合されたアルキル基を結合させることにより製造される。

以下、本発明を一層詳しく説明する。
ＤＮＡは、二本鎖の二重螺旋構造からなっている。単鎖(single strand) のｓｓＤＮＡが互いに相補的な塩基配列を有する他のｓｓＤＮＡと結合して、二重鎖を形成することをハイブリダイゼーションと言う。ＤＮＡのハイブリダイゼーション検出は、固体の基材表面に固定化されている単鎖のプローブＤＮＡが、これと相補的なターゲットＤＮＡとハイブリダイズする時、ハイブリダイゼーション前後の差異を選り分ける技術である。

本発明のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法は、機能性電導性特性を有するターチオフェンポリマーを使用してハイブリダイゼーション前後のインピーダンスの差異を測定することにより、電気化学的にＤＮＡハイブリダイゼーションを検出する。

本発明による新規の３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物は、式１の構造を有する。

本発明の機能性電導性ターチオフェンポリマーは、３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物をモノマーとして用いて製造される。該ターチオフェンポリマーは、その化学構造上の特性に因り電導性を有する。

詳細には、本発明の機能性電導性ターチオフェンポリマーは以下のように製造される。最初に、出発物質である３−ブロモターチオフェンをシアン化銅（ＣｕＣＮ）と反応させて下式の構造を有する３−シアノターチオフェンを得る。

こうして得た３−シアノターチオフェンは、融点が８３℃であり、分子量は272.9736 g/molである。続いて、３−シアノターチオフェンを水酸化カリウム- エトキシエタノール存在下で加水分解し、式１の構造を有する３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物を得る。３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物の融点は１９３℃であり、分子量は292.4002 g/molである。本発明の機能性電導性ターチオフェンポリマーは式３の構造を有する。

該ターチオフェンポリマーを、上記の３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物をモノマーとしてサイクリックボルタンメトリー(cyclic voltammetry)を利用して電極表面にポリマーを合成する電気化学的技法を通じて得る。また、本発明の電導性ポリマーは赤みがかった褐色を有する。

一方、上記の機能性電導性ポリマーを利用したＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法は、３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン化合物を非水溶媒に溶解する工程と、電気化学的な方法で電極表面上にカルボキシル基を有する電導性ターチオフェンポリマーを合成して修飾させる工程と、1 −エチル−３−( ３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を利用して５' 末端をアミノ基で修飾したプローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) を前記ポリマーに固定する工程と、ＤＮＡハイブリダイゼーションの前後にインピーダンスを測定する工程とからなることを特徴とする。

この時、電極はガラス質炭素電極と金電極である。このような電極の表面にサイクリックボルタンメトリー法を利用して電気化学的にターチオフェンポリマーを合成して修飾させ、プローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) を該ポリマーのカルボキシル基に化学的に結合させる。本発明のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法に使用されるプローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) はターゲットＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) に対応するものなどであり、好ましくは、１９塩基長のオリゴヌクレオチドが使用される。プローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) は、任意の長さの塩基配列を有するＤＮＡの５' 末端に炭素数３〜１０、好ましくは炭素数６のアルキル基を結合し、次いで、1 −エチル−３−( ３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を利用して該アルキル基にアミンを連結させて５' 末端をアミノ基に変えることにより製造した、５' 末端がアミノ基で修飾されたＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) である。

該ＤＮＡの具体的な一例としては、NH₂−C₆−5'−CTCCTGTGGAGAAGTCTGC-3'がある。インピーダンスの測定は１０Ｈｚ〜１００ｋＨｚの範囲の周波数で行なわれるが、好ましくは、約１ｋＨｚの周波数で測定するのが効果的である。

本発明に従ってＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するために、鎌状赤血球貧血症患者のＤＮＡ塩基配列を使用する。最初に、該ＤＮＡ塩基配列の単鎖プローブを電極表面に固定化する。続いて、該単鎖プローブに相補的なターゲットＤＮＡ塩基配列（配列Ｂ：3'−GAGGACACCTCTTCAGACG −5'、配列Ｃ:3' −GAGGACTCCTCTTCAGACG −5'、配列Ｄ:3' −CTGGACACCTCTTCAGACG −5'、配列Ｅ：3'−CCTAGTCTACAGGTCACTA −5') をそれぞれリン酸塩緩衝液中でハイブリダイゼーションさせる。最後に、ハイブリダイゼーション前後のインピーダンスを測定する。ハイブリダイゼーション前後に測定したインピーダンスの対数値の差異を計算する。ターゲットＤＮＡ塩基配列には、完全に相補的な配列Ｂ(3' −GAGGACACCTCTTCAGACG −5') と、中央に１塩基の誤対合を有する配列Ｃ(3' −GAGGACTCCTCTTCAGACG −5') と、末端に２塩基の誤対合を有する配列Ｄ(3' −CTGGACACCTCTTCAGACG −5') と、塩基配列が完全に非相補的な配列Ｅ(3' −CCTAGTCTACAGGTCACTA −5') とが含まれる。

以降、本発明を実施例及び図面を参照して詳しく説明する。
しかしながら、下記の実施例は本発明を例示するために記載されたものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

（カルボキシル基を有する３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェンモノマーの合成）

（３−シアノターチオフェンの合成）：１０ｍｍｏｌの３−ブロモターチオフェンを１５ｍｍｏｌのシアン化銅が含まれた無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）で４時間還流させた。黒い混合物を室温で冷却させた後、塩化鉄（１０ｇ）を溶解した塩酸溶液（２０ｍｌ，２．０Ｍ）と混合して６０〜７０℃で３０分間維持した。有機抽出物を塩酸（２０ｍｌ，６Ｍ）、蒸留水、飽和重炭酸ナトリウム溶液、および塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。収得した暗黄色固体を有機溶媒で再結晶した。生成物の融点は８３℃であり、質量分析器を利用して分子量を測定した結果、272.9736g/mol であった。¹³C NMR ，¹H N MR 及び赤外線分光法で該生成物の構造を確認した。
分光学的なデータは次のとおりである。
¹H NMR(CDCl₃)：δ7.06-7.62(ｍ, 7H) ；¹³C NMR δ：106.0, 115.8, 125.6, 127.5, 126.5, 127.7, 128.0, 128.6, 128.8, 133.4, 135.0, 136.7, 145.3

（３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェンの合成）：１０ｍｍｏｌの３−シアノターチオフェンと１７．８ｍｍｏｌの水酸化カリウムをエトキシエタノール- 水（５：１）溶液で５時間還流させた。反応混合物を過剰の塩酸（１２Ｍ）で酸性化し、黄色沈澱が生じるまで混合物を冷却した。該沈澱物を漉し、蒸留水で洗浄し、有機溶媒で再結晶して題記の生成物を固体として得た。固体の融点は、１９３℃であり、質量分析器を利用して分子量を測定した結果、292.4002g/mol であった。¹³C NMR, ¹H NM
R, 及び赤外線分光法で該生成物の構造を確認した。

分光学的なデータは、次のとおりである。
¹H NMR (CDCl₃) δ：7.04-7.59(m, 7H) 、7.59(br ｓ, 1H); ¹³C NMR δ：125.0, 125.9, 126.9, 127.8, 128.4, 128.6, 130.2, 133.6, 135.9, 136.1, 143.8, 166.7

（ＤＮＡセンサの製作）
（カルボキシル基を有する電導性ポリマー( ３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン) を利用した修飾電極の製作）：３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェンモノマーをアセトニトリルに溶解させ、電気化学的な方法でガラス質炭素電極と金電極表面で該モノマーを重合させて電導性ターチオフェンポリマーを合成した。続いて、該ポリマーを修飾した［図１］。一般的に電導性ポリマーを電気化学的に合成するためには、モノマーを溶媒に溶かした後、モノマーが酸化される電圧を加えるか、サイクリックボルタンメトリー(cyclic voltammetry)を利用して電極面にポリマーを合成する技法を使用する。本発明では、電圧を０．０Ｖから＋電圧方向に＋１．５Ｖまで反復的に加えた。このとき、電圧走査速度は１００ｍＶ／秒であった。＋１．１Ｖ
〜＋１．３Ｖで酸化電流が、＋１．１５Ｖで還元電流が流れた。０．０Ｖ〜＋１．５Ｖの間で電圧範囲を循環させると、電流が増加した。このような電流増加現象は、電極面に電導性ポリマーが合成されたことを表す。電圧循環回数は、１回〜５０回まで変化させた。図１は電圧循環５回のサイクリックボルタモグラムのパターンを表す。電極面に合成された電導性ポリマーは赤みがかった褐色を示した。

（プローブオリゴヌクレオチドの固定化）：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を利用して５' 末端をアミノ基で修飾したプローブオリゴヌクレオチド配列(NH₂−C₆−5'−CTCCTGTGGAGAAGTCTGC-3') を電極に固定した。ここで使用したＥＤＡＣはカルボキシル基にアミノ基を結合させるための触媒である。図１の手順によって電極表面に電気化学的に合成された電導性ポリマーは、カルボキシル基を有している。該電導性ポリマーに、５' 末端をアミノ基で修飾したプローブオリゴヌクレオチドを結合させてＤＮＡセンサを製作した。図１の手順によって合成された電導性ポリマーでコーティングされた電極を、ＥＤＡＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）と５' 末端がアミノ基で修飾されたプローブオリゴヌクレオチド（１１μＭ）が入っているリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）に浸した後、常温で１０時間反応させてＤＮＡセンサを製作した。該ＤＮＡセンサでは、電導性ポリマーのカルボキシル基がプローブオリゴヌクレオチドのアミノ基に結合された。これと類似な方法として、特定の疾病と関連のあるプローブＤＮＡ( または、オリゴヌクレオチド) を電導性ポリマーに結合させることにより、疾病に関連のあるＤＮＡの検出センサの開発が可能になる。

（インピーダンスの測定）
リン酸塩緩衝液中でターゲットＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション前後のインピーダンスを測定した。ターゲットＤＮＡの塩基配列には、完全に相補的な配列Ｂ(3' −GAGGACACCTCTTCAGACG-５')、配列の中央に１塩基の誤対合を有する配列Ｃ(3' −GAGGACTCCTCTTCAGACG −5') 、末端２塩基の誤対合を有する配列Ｄ(3' −CTGGACACCTCTTCAGACG −5') 、および塩基配列が完全に非相補的な配列Ｅ(3' −CCTAGTCTACAGGTCACTA −5') がある（図３ａ、図３ｂ、図３ｃ）。図３ａはプローブオリゴヌクレオチド( 電極表面の電導性ポリマーに固定化させる単鎖のＤＮＡ配列) を電極表面に固定させた後、インピーダンスを周波数１００ｋＨｚ〜１０Ｈｚの範囲で０．７５ＭＮａＣｌを含むｐＨ７．０のリン酸塩緩衝溶液で測定し、以後にこの電極をターゲットＤＮＡ配列( プローブと反応すべ
き単鎖のＤＮＡ配列) と３０分間反応させてから同一条件でインピーダンスを測定して表したものである。ターゲットＤＮＡ配列と反応した後、インピーダンス値が急激に減少した（図３ａの（Ａ）参照）。ハイブリダイゼーション前後のアドミタンスの測定（図３ａの（Ｂ）参照）において顕著な差異が表れたことも容易に分かる。図３ａの（Ａ）において、ｙ軸の抵抗値がハイブリダイゼーション後に減少するが、これは、ハイブリダイゼーション後に電導度が増大したことを意味する。

図3bは、非相補的なターゲット配列Ｅとのハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション前後に測定したインピーダンスの対数値の差異を表したグラフである。図３ｂに見られるように、その差異値は０に近い。これは、ハイブリダイゼーションが全く起こらなかったためハイブリダイゼーション後にインピーダンスの変化がなかったことを意味する。しかし、この電極を再び完全に相補的なターゲットＤＮＡ配列Ｂとハイブリダイゼーションさせると、顕著な差異値が表れた（図３ｂ）。これは、ハイブリダイゼーションが起きたためハイブリダイゼーション後にインピーダンス値に顕著な差異が生じたことを意味する。従って、完全に相補的なターゲットＤＮＡ配列Ｂと完全に非相補的な配列Ｅをはっきり区別することができた。

図３ｃは、中央に一塩基の誤対合を有する配列Ｃ（図３ｃの上側グラフ参照）と末端に二塩基の誤対合を有する配列Ｄ（図３ｃの下側グラフ参照）に対するハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション前後に測定したインピーダンスの対数値の差異を表したグラフである。それぞれの配列に対して３回ずつ反復実験した結果を表した。この二つの場合、ハイブリダイゼーション後のインピーダンスの変化はわずかであったが、完全に相補的な配列（配列Ｂ）とは比較可能であった。よって、インピーダンス測定を利用して完全に相補的な塩基配列と誤対合を有する塩基配列を区別することができた。

図３から分かるように、ターゲットＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション後のインピーダンスの変化は約１ｋＨｚで最大であり、本発明のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法は、誤対合を有する塩基配列に対して従来の方法より卓越した選択性を有していた。従って、本発明のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法は、特定の周波数、例えば約１ｋＨｚにおけるインピーダンスの測定により、ハイブリダイゼーションが起きたかどうかを簡単に確認することができる。

（実験結果）
選択性は、完全に相補的な塩基配列と誤対合を有する塩基配列をどれほど良く区別できるかの問題である。本発明では、ハイブリダイゼーション前後に１ｋＨｚで測定したインピーダンスの対数値を比較することによりハイブリダイゼーション率を表したが、このハイブリダイゼーション率から特定配列に対する選択性を調べることが可能である。

実験結果は、下記表１のとおりである。

^aプローブオリゴヌクレオチドNH_２−C _６−５' −CTC −CTG −TGG −AGA −AGT −CTG −C-３はポリターチオフェンで修飾されたガラス炭素電極上に固定化された。
^ｂ濃度：１０ｍｌ中に１１０ｎｍｏｌ。
^ｃ修飾電極上に固定化されたプローブに結合したオリゴヌクレオチドの量を表す。

（従前のデータとの比較）
1992年、オカハタ(Okahata) 研究チームは多様な10塩基長ヌクレオチドについて、ＱＣＭを利用したハイブリダイゼーション検出を行なった。この実験の場合、末端に２塩基の誤対合を有する配列では９２％のハイブリダイゼーションが観察され、中央に１塩基の誤対合を有する配列では、約３０％のハイブリダイゼーションが観察された（表２参照）。一方、本発明の結果では、表１に示されたように、１４．３％のハイブリダイゼーションが観察された。従って、インピーダンスを利用したハイブリダイゼーション検出の場合、ターゲットＤＮＡ配列に対して選択的にハイブリダイゼーションを識別できることが分かる。以下の表２はプローブ固定化ＱＣＭと各種の10塩基長ヌクレオチドとの間の２５℃におけるハイブリダイゼーション率を表す。

^a Ｍ１３ファージＤＮＡに比べて相対的に分子量の小さいは、Ｍ１３パージＤＮＡと比較して、低分子量のオリゴヌクレオチドの検出に対する高感度を得るために、比較的多量(847ng, 280 pmol, 電極の約６５％をコーティング) の HS-^5'PdGGGAATTCGT ^3'をＱＣＭ上に固定化した。
^ｂ濃度：１０ｍｌ中に４００ｎｇ（１３０ｐｍｏｌ）。プローブと相補的な配列は下線で示した。
^ｃＱＣＭ上に固定化されたプローブに結合したオリゴヌクレオチドの量を表す。

本発明によれば、従来の技術とは異なり、指示薬を使用せずに、インピーダンスの変化を利用してＤＮＡハイブリダイゼーションを検出可能な方法が提供されるので、特定の周波数の範囲でインピーダンスを測定する小形センサ・システムの製作が可能である。該システムは、臨床上の試験および疾患の診断のための携帯用ＤＮＡ配列ハイブリダイゼーション確認用センサに応用され得る。

また、本発明のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法は、誤対合を有する配列に対する相補的配列の選択性が非常に優れている。

３’−カルボキシル−５，２’；５’，２”−ターチオフェン化合物モノマーの電気化学的重合のためのサイクリックボルタモグラム(voltammogram)パターンを表す図。プローブオリゴヌクレオチドの固定化とターゲット配列のハイブリダイゼーションを表す図式。室温でリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中の、開放回路電圧におけるハイブリダイゼーション前後のインピーダンス（Ａ）とアドミタンス（Ｂ）を示すグラフ。非相補的ターゲット配列Ｅおよび相補的ターゲット配列Ｂそれぞれとのハイブリダイゼーション前後におけるインピーダンス差異値を示すグラフ。中央に塩基の誤対合を有する配列および末端に塩基の誤対合を有する配列それぞれとのハイブリダイゼーション前後におけるインピーダンス差異値を示すグラフ。

Claims

式１の構造を有する３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェン。
３−ブロモターチオフェンをシアン化銅で処理して得られた３‐シアノターチオフェンを、ＫＯＨ−エトキシエタノールで加水分解することを特徴とする、請求項１に記載の３’−カルボキシル−５，２’；５’，２”−ターチオフェンの製造方法。
３' −カルボキシル−５，２' ；５' ，２”−ターチオフェンをモノマーとしてサイクリックボルタンメトリー法を利用して電極表面にポリマーを合成する電気化学的技法を通じて得られる式３の機能性電導性ターチオフェンポリマー。
ＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法であって、
３’−カルボキシル−５，２’；５’，２”−ターチオフェンを非水溶媒に溶解させる工程、
電気化学的な方法により電極表面でカルボキシル基を有する電導性ターチオフェンポリマーを合成して修飾する工程、
５’−末端をアミノ基で修飾したプローブＤＮＡを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を利用して前記ポリマー上に固定化する工程、および
ＤＮＡハイブリダイゼーション前後にインピーダンスを測定する工程
からなる方法。
前記インピーダンス値の測定は、１ｋＨｚの周波数で行なわれることを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法。