JP4116551B2 - 新規のターチオフェン‐3−カルボキシル酸化合物とその製造方法、該化合物をモノマーとした機能性電導性ターチオフェンポリマー、該ポリマーを利用したdnaハイブリダイゼーション検出方法、ならびにプローブdnaの製造方法 - Google Patents
新規のターチオフェン‐3−カルボキシル酸化合物とその製造方法、該化合物をモノマーとした機能性電導性ターチオフェンポリマー、該ポリマーを利用したdnaハイブリダイゼーション検出方法、ならびにプローブdnaの製造方法 Download PDFInfo
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工程に要する時間が長くなるので、工程の産業化には不都合である。
Physicochemical and Engineering Aspects, 2000, 175,147−152 Analytica Acta, 1997,350,51 −58 Anal,Chem.1994,66,3379−3383 Anal. Chem. 1996, 68, 2629−2634 Anal. Chem. 1994, 66, 3830−3833 Anal.Chem. 2000, 72, 1334−1341 Biointerfaces, 1998, 10, 199−204 J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 8299−8300 J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 7388−7389 Synthetic Metals, 1999, 100, 89−94
本発明の第2番目の目的は、上記3' −カルボキシル−5,2' ;5' ,2”−ターチオフェン化合物をモノマーとして製造される機能性電導性ターチオフェンポリマーを提供することである。
上記の目的等のために, 本発明の機能性電導性ターチオフェンポリマーは、3−ブロモターチオフェンを出発物質として3−シアノターチオフェンを製造した後、これを加水分解させて3' −カルボキシル−5,2' ;5' ,2”−ターチオフェン化合物を調製し、これをモノマーとして電気化学的に重合することにより製造される。
DNAは、二本鎖の二重螺旋構造からなっている。単鎖(single strand) のssDNAが互いに相補的な塩基配列を有する他のssDNAと結合して、二重鎖を形成することをハイブリダイゼーションと言う。DNAのハイブリダイゼーション検出は、固体の基材表面に固定化されている単鎖のプローブDNAが、これと相補的なターゲットDNAとハイブリダイズする時、ハイブリダイゼーション前後の差異を選り分ける技術である。
しかしながら、下記の実施例は本発明を例示するために記載されたものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
分光学的なデータは次のとおりである。
1H NMR(CDCl3):δ7.06-7.62(m, 7H) ;13C NMR δ:106.0, 115.8, 125.6, 127.5, 126.5, 127.7, 128.0, 128.6, 128.8, 133.4, 135.0, 136.7, 145.3
R, 及び赤外線分光法で該生成物の構造を確認した。
1H NMR (CDCl3) δ:7.04-7.59(m, 7H) 、7.59(br s, 1H); 13C NMR δ:125.0, 125.9, 126.9, 127.8, 128.4, 128.6, 130.2, 133.6, 135.9, 136.1, 143.8, 166.7
(カルボキシル基を有する電導性ポリマー( 3' −カルボキシル−5,2' ;5' ,2”−ターチオフェン) を利用した修飾電極の製作):3' −カルボキシル−5,2' ;5' ,2”−ターチオフェンモノマーをアセトニトリルに溶解させ、電気化学的な方法でガラス質炭素電極と金電極表面で該モノマーを重合させて電導性ターチオフェンポリマーを合成した。続いて、該ポリマーを修飾した[図1]。一般的に電導性ポリマーを電気化学的に合成するためには、モノマーを溶媒に溶かした後、モノマーが酸化される電圧を加えるか、サイクリックボルタンメトリー(cyclic voltammetry)を利用して電極面にポリマーを合成する技法を使用する。本発明では、電圧を0.0Vから+ 電圧方向に+1.5Vまで反復的に加えた。このとき、電圧走査速度は100mV/秒であった。+1.1V
〜+1.3Vで酸化電流が、+1.15Vで還元電流が流れた。0.0V〜+1.5Vの間で電圧範囲を循環させると、電流が増加した。このような電流増加現象は、電極面に電導性ポリマーが合成されたことを表す。電圧循環回数は、1回〜50回まで変化させた。図1は電圧循環5回のサイクリックボルタモグラムのパターンを表す。電極面に合成された電導性ポリマーは赤みがかった褐色を示した。
リン酸塩緩衝液中でターゲットDNA配列とのハイブリダイゼーション前後のインピーダンスを測定した。ターゲットDNAの塩基配列には、完全に相補的な配列B(3' −GAGGACACCTCTTCAGACG-5')、配列の中央に1塩基の誤対合を有する配列C(3' −GAGGACTCCTCTTCAGACG −5') 、末端2塩基の誤対合を有する配列D(3' −CTGGACACCTCTTCAGACG −5') 、および塩基配列が完全に非相補的な配列E(3' −CCTAGTCTACAGGTCACTA −5') がある(図3a、図3b、図3c)。図3aはプローブオリゴヌクレオチド( 電極表面の電導性ポリマーに固定化させる単鎖のDNA配列) を電極表面に固定させた後、インピーダンスを周波数100kHz〜10Hzの範囲で0.75 M NaClを含む pH7.0のリン酸塩緩衝溶液で測定し、以後にこの電極をターゲットDNA配列( プローブと反応すべ
き単鎖のDNA配列) と30分間反応させてから同一条件でインピーダンスを測定して表したものである。ターゲットDNA配列と反応した後、インピーダンス値が急激に減少した(図3aの(A)参照)。ハイブリダイゼーション前後のアドミタンスの測定(図3aの(B)参照)において顕著な差異が表れたことも容易に分かる。図3aの(A)において、y軸の抵抗値がハイブリダイゼーション後に減少するが、これは、ハイブリダイゼーション後に電導度が増大したことを意味する。
選択性は、完全に相補的な塩基配列と誤対合を有する塩基配列をどれほど良く区別できるかの問題である。本発明では、ハイブリダイゼーション前後に1kHzで測定したインピーダンスの対数値を比較することによりハイブリダイゼーション率を表したが、このハイブリダイゼーション率から特定配列に対する選択性を調べることが可能である。
b濃度:10ml中に110nmol。
c修飾電極上に固定化されたプローブに結合したオリゴヌクレオチドの量を表す。
1992年、オカハタ(Okahata) 研究チームは多様な10塩基長ヌクレオチドについて、QCMを利用したハイブリダイゼーション検出を行なった。この実験の場合、末端に2塩基の誤対合を有する配列では92%のハイブリダイゼーションが観察され、中央に1塩基の誤対合を有する配列では、約30%のハイブリダイゼーションが観察された(表2参照)。一方、本発明の結果では、表1に示されたように、14.3%のハイブリダイゼーションが観察された。従って、インピーダンスを利用したハイブリダイゼーション検出の場合、ターゲットDNA配列に対して選択的にハイブリダイゼーションを識別できることが分かる。以下の表2はプローブ固定化QCMと各種の10塩基長ヌクレオチドとの間の25℃におけるハイブリダイゼーション率を表す。
Claims (5)
- 3−ブロモターチオフェンをシアン化銅で処理して得られた3‐シアノターチオフェンを、KOH−エトキシエタノールで加水分解することを特徴とする、請求項1に記載の3’−カルボキシル−5,2’;5’,2”−ターチオフェンの製造方法。
- DNAハイブリダイゼーション検出方法であって、
3’−カルボキシル−5,2’;5’,2”−ターチオフェンを非水溶媒に溶解させる工程、
電気化学的な方法により電極表面でカルボキシル基を有する電導性ターチオフェンポリマーを合成して修飾する工程、
5’−末端をアミノ基で修飾したプローブDNAを、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)を利用して前記ポリマー上に固定化する工程、および
DNAハイブリダイゼーション前後にインピーダンスを測定する工程
からなる方法。 - 前記インピーダンス値の測定は、1kHzの周波数で行なわれることを特徴とする請求項4に記載のDNAハイブリダイゼーション検出方法。
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