JP4113954B2 - Cell culture substrate and cell sorting method using the substrate - Google Patents
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Description
本発明は、光応答性組成物により形成された光応答性表面を有する細胞培養基材、及び該細胞培養基材を使用した細胞の分別方法に関する。 The present invention relates to a cell culture substrate having a photoresponsive surface formed by a photoresponsive composition, and a cell sorting method using the cell culture substrate.
近年、身体を構成する細胞や組織がもつ潜在力を利用する新たな医療としての再生医学が期待されている。その再生医学分野において最も重要なのは、体外で培養された細胞や組織が生体内で正常に機能できるようにすることである。従って、その生体内での正常的な機能を発現するためには、培養細胞を培養床からその構造と機能を損なうことなく、細胞を分別回収する技術が強く要望されてきた。 In recent years, regenerative medicine as a new medical treatment utilizing the potential of cells and tissues constituting the body is expected. The most important thing in the field of regenerative medicine is to enable cells and tissues cultured outside the body to function normally in vivo. Therefore, in order to express the normal function in the living body, there has been a strong demand for a technique for separating and collecting cultured cells from the culture bed without losing the structure and function.
従来の細胞分別技術としては、フローサイトメトリー（FACS；蛍光表示式細胞分離システム）や磁気細胞分離システム（MACS）があり、これらは既に実用化されている。しかしながら、これらのフローサイトメトリーあるいは磁気細胞分離システムは、白血球あるいはリンパ球等の浮遊細胞を分別回収するためによく用いられてきたものの、神経細胞や足場依存性細胞の分別回収に適用する場合は、基質に接着した足場依存性細胞を浮遊状態にさせなければならず、そのとき、トリプシン等の酵素処理によって細胞接着因子や細胞外マトリックスが破壊される問題が生じる。特に、フローサイトメトリーでは、超音波ノズルによる細胞の物理的分離の過程において、細胞に与える損傷が相当大きい。 Conventional cell sorting techniques include flow cytometry (FACS; fluorescence display cell separation system) and magnetic cell separation system (MACS), which have already been put to practical use. However, these flow cytometry or magnetic cell separation systems have been often used to separate and collect floating cells such as leukocytes or lymphocytes, but when applied to the separate collection of neurons and anchorage-dependent cells. Then, the anchorage-dependent cells adhered to the substrate must be brought into a floating state, and at that time, there arises a problem that cell adhesion factors and extracellular matrix are destroyed by enzyme treatment such as trypsin. In particular, in flow cytometry, damage to cells is considerably large in the process of physical separation of cells by an ultrasonic nozzle.
一方、培養細胞の分離回収に酵素を用いない方法として、温度応答性の高分子化合物を培養基材として用いる方法が知られている（特許文献１参照）。また、温度応答性支持体を用いた細胞培養法により、細胞接着物質や膜タンパクを分解せず、その器官特異的機能を維持したまま細胞をシート状態で剥離・回収する手法が報告されている（非特許文献１参照）。
しかしながら、これらの方法では温度変化によって培養基材の接着制御を行うため、培養容器中の種々の細胞あるいは細胞群から、特定の細胞あるいは細胞群（コロニー）のみを回収しようとする場合において、個々の細胞あるいは細胞群毎にその脱着を制御することは極めて困難であった。
On the other hand, as a method not using an enzyme for separating and collecting cultured cells, a method using a temperature-responsive polymer compound as a culture substrate is known (see Patent Document 1). In addition, a cell culture method using a temperature-responsive support has been reported to detach and collect cells in a sheet state without degrading cell adhesion substances and membrane proteins and maintaining their organ-specific functions. (Refer nonpatent literature 1).
However, since these methods control the adhesion of the culture substrate by changing the temperature, when collecting only specific cells or cell groups (colony) from various cells or cell groups in the culture container, It was extremely difficult to control the detachment of each cell or cell group.
さらに短波長（300nm）の紫外光を照射することによって不可逆的に構造変化する色素材料を細胞培養基材に用いて、細胞のパターニングを光照射によって行った例も報告されている（非特許文献２参照）。
しかし、この研究はあくまで、培養基板の細胞親和性を細胞播種前に予めパターン化する手段の提供を目的としたものであり、このような短波長の紫外光の照射を要する培養基材を、細胞播種後の細胞選別に適用することは不可能である。
In addition, there has been reported an example in which a dye material whose structure is irreversibly changed by irradiation with ultraviolet light of a short wavelength (300 nm) is used as a cell culture substrate, and cell patterning is performed by light irradiation (non-patent literature). 2).
However, this research is only for the purpose of providing a means for previously patterning the cell affinity of the culture substrate before cell seeding, and a culture substrate that requires irradiation of such short-wavelength ultraviolet light, It is impossible to apply to cell sorting after cell seeding.
細胞を播種した後に光照射によって、細胞接着性及び／又は細胞増殖性を局所的に制御することができれば、培養細胞のパターニングの新たな手段を与えるだけでなく、細胞の分別回収などへの応用展開も可能であるが、従来技術によってそれを実現することは不可能である。 If cell adhesion and / or cell proliferation can be controlled locally by light irradiation after seeding cells, it will not only provide a new means for patterning cultured cells, but also can be applied to the selective collection of cells. Deployment is possible, but it is impossible to achieve it with the prior art.
本発明者等は、先に光照射によって細胞との接着性が変化する細胞接着性表面の形成材料、該材料により形成された細胞接着性表面を有する細胞培養装置、ならびに該装置を使用した細胞の培養・分別方法を発明し、特許出願をした（特許文献２参照）。
この発明は、上記従来技術の問題点を解消し、細胞の培養及び分別回収を、細胞に対するダメージを与えることなく、細胞の各器官の特異的機能を維持したまま簡単な方法で行う基本的な発明を開示するものである。しかしながら、特許文献２に記載された発明では、細胞接着性表面を形成する材料の種類によっては、光照射部位と非照射部位の細胞接着性に明確な差異が生じないことがある。また、細胞接着性表面を形成する際の成膜性や、膜強度等が不十分となることがあった。したがって、この発明を実用化するには、光応答性や細胞接着性等の特性や、細胞培養基材表面への成膜性、膜強度等が改善された細胞接着性表面の形成材料を開発することが求められていた。
The present inventors have previously made a cell-adhesive surface forming material whose adhesion to cells changes by light irradiation, a cell culture device having a cell-adhesive surface formed from the material, and a cell using the device Was invented and filed a patent application (see Patent Document 2).
The present invention solves the above-mentioned problems of the prior art, and performs basic culture and fractional collection by a simple method while maintaining specific functions of each organ of the cell without damaging the cell. The invention is disclosed. However, in the invention described in
したがって、本発明は、光応答性や細胞接着性等の特性、及び成膜性や膜強度等が改善された光応答性表面を有する細胞培養基材、すなわち、細胞を播種する前及び／又は後に光照射することにより、特定の領域においてその細胞接着性を局所的に亢進できる光応答性表面を有する細胞培養基材を提供することを目的とする。
また、本発明は、この細胞培養基材を使用した、特に足場依存性細胞や神経細胞等などの培養細胞から、細胞機能を損傷することなく、所望の細胞又は細胞群のみを選択的に分別回収する、あるいは所望のパターンに沿って培養するための簡便な手段を提供することを目的とする。
Therefore, the present invention provides a cell culture substrate having a photoresponsive surface with improved characteristics such as photoresponsiveness and cell adhesion, and film formability and film strength, that is, before seeding cells and / or An object of the present invention is to provide a cell culture substrate having a photoresponsive surface capable of locally enhancing cell adhesion in a specific region by light irradiation later.
In addition, the present invention selectively separates only desired cells or cell groups from cultured cells such as anchorage-dependent cells and nerve cells using this cell culture substrate without damaging cell functions. It aims at providing the simple means for collect | recovering or culture | cultivating along a desired pattern.
本発明者等は、上記課題を達成するために鋭意検討を行った結果、ニトロスピロピランとメチルメタクリレートとの共重合体からなる光応答性成分とポリエチレングリコールを含む光応答性組成物によって、細胞培養基材の光応答性表面を形成することにより上記課題が解決されることを発見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は次のような構成をとるものである。
１．ニトロスピロピランとメチルメタクリレートとの共重合体からなる光応答性成分とポリエチレングリコールを含む光応答性組成物により形成された光応答性表面を有することを特徴とする細胞培養基材。
２．前記ポリエチレングリコールの分子量が50,000〜200,000であることを特徴とする、１に記載の細胞培養基材。
３．１又は２に記載の細胞培養基材に細胞を播種する前及び／又は播種した後に、培養基材の光応答性表面の特定の領域を光照射し、光照射領域における所望の細胞以外の細胞との細胞接着性及び／又は細胞増殖性を亢進させることによって、所望の細胞以外の細胞を該表面に分別保持させ、所望の細胞を回収することを特徴とする、細胞の分別回収方法。
４．１又は２に記載の細胞培養基材に細胞を播種する前及び／又は播種した後に、培養基材の光応答性表面の特定の領域を光照射し、光照射領域における所望の細胞との細胞接着性及び／又は細胞増殖性を亢進させることによって、所望の細胞のみを該表面に分別保持させ、培養することを特徴とする、細胞の分別方法。
５．培養基材の光応答性表面に保持させる細胞を標識し、標識された細胞の位置情報に基づいて光照射を行うことを特徴とする、３又は４に記載の細胞の分別方法。
As a result of diligent studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have developed a cell culture using a photoresponsive component comprising polyethylene glycol and a photoresponsive component comprising a copolymer of nitrospiropyran and methyl methacrylate. The present invention has been completed by discovering that the above problems can be solved by forming a photoresponsive surface of a substrate.
That is, the present invention has the following configuration.
1. A cell culture substrate having a photoresponsive surface formed by a photoresponsive composition comprising a photoresponsive component comprising a copolymer of nitrospiropyran and methyl methacrylate and polyethylene glycol .
2. 2. The cell culture substrate according to 1, wherein the polyethylene glycol has a molecular weight of 50,000 to 200,000 .
3. Before and / or after seeding cells on the cell culture substrate according to 1 or 2, a specific region on the photoresponsive surface of the culture substrate is irradiated with light, and cells other than desired cells in the light irradiation region A method for separating and recovering cells, wherein cells other than the desired cells are separated and retained on the surface by enhancing cell adhesion and / or cell proliferation with the cells.
4). Before and / or after seeding cells on the cell culture substrate according to 1 or 2, a specific region of the photoresponsive surface of the culture substrate is irradiated with light, and cells with desired cells in the light irradiation region A method for sorting cells, wherein only desired cells are separated and retained on the surface by enhancing adhesion and / or cell proliferation, and cultured.
5. 5. The cell sorting method according to 3 or 4, wherein the cells to be held on the photoresponsive surface of the culture substrate are labeled, and light irradiation is performed based on positional information of the labeled cells.
本発明によれば、細胞を播種した後の光照射により、培養基材の光応答性表面の特定の領域に対して、数百ナノメートルの分解能で局所選択的に細胞接着性及び／又は細胞増殖性を亢進させることができ、成膜性や膜強度が改善された細胞培養基材を容易に得ることができる。そのため、従来技術では両立できなかった細胞の精密分離に加え、該分離において細胞外マトリックスや膜タンパク質を損なわず細胞の器官特異的機能の維持を同時に実現することが可能となる。また、従来の細胞のパターニングでは、細胞播種前の処理によって予め培養パターンが決まってしまうのに対し、細胞播種後に細胞を増殖させる領域を任意の２次元パターンで決めることができるため、従来にない細胞操作手段が提供できる。
本発明のポリアルキレングリコールを含む光応答性組成物により形成された光応答性表面は、適度の細胞接着性を有するために、光照射部位と非照射部位の細胞接着性の差異が顕著に表れ、細胞の分別回収や分別培養を簡単に行うことが可能となる。
According to the present invention, cell adhesion and / or cells can be locally and selectively resolved at a resolution of several hundred nanometers to a specific region of the photoresponsive surface of the culture substrate by light irradiation after seeding the cells. Proliferation can be enhanced, and a cell culture substrate with improved film formability and film strength can be easily obtained. Therefore, in addition to the precise separation of cells that could not be achieved with the prior art, it is possible to simultaneously maintain the organ-specific functions of the cells without damaging the extracellular matrix and membrane proteins. In addition, in the conventional cell patterning, the culture pattern is determined in advance by the process before cell seeding, whereas the area in which cells are to be propagated after cell seeding can be determined by an arbitrary two-dimensional pattern. Cell manipulation means can be provided.
Since the photoresponsive surface formed by the photoresponsive composition containing the polyalkylene glycol of the present invention has appropriate cell adhesiveness, the difference in cell adhesion between the light-irradiated site and the non-irradiated site is remarkably exhibited. Thus, it becomes possible to easily carry out fractional collection and fractional culture of cells.
本発明の細胞培養基材の光応答性表面を形成する光応答性組成物で使用される光応答性成分は、照射されることによって分子構造が変化し、その特性、特に分極率や溶媒親和性が変化する物質であって、光応答性を有するものであれば特に限定されることはなく、例えばアゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、及びロイコ色素から選ばれた光応答性成分を使用することができる。
これらの光応答性成分は、単独で、又は使用目的によっては、２種類以上を適宜組み合わせて使用することができる。これらの光応答性成分は、そのもの自体を使用するほか、これらの成分を含有するポリマー、或いはコポリマーとして使用することができる。
The photoresponsive component used in the photoresponsive composition forming the photoresponsive surface of the cell culture substrate of the present invention changes its molecular structure upon irradiation, and its characteristics, particularly polarizability and solvent affinity. There is no particular limitation as long as it is a substance whose properties change and has photoresponsiveness, for example, a photoresponsive component selected from azobenzene, diarylethene, spiropyran, spirooxazine, fulgide, and leuco dye. Can be used.
These photoresponsive components can be used alone or in appropriate combination of two or more depending on the purpose of use. These photoresponsive components can be used as such or as a polymer or copolymer containing these components.
光応答性成分をコポリマーとして使用する際に、コポリマーを構成する共重合モノマーとしては、任意の重合性二重結合を有するモノマーを使用することができる。好ましい共重合モノマーとしては、例えばメタクリル酸、アクリル酸、メタクリル酸又はアクリル酸のＣ1〜Ｃ8アルキルエステル、アクリロニトリル、アクリルアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアクリルアミド、酢酸ビニル、スチレン、α−メチルスチレン、及びビニルトルエン等が挙げられる。 When the photoresponsive component is used as a copolymer, a monomer having any polymerizable double bond can be used as a copolymerization monomer constituting the copolymer. Preferred copolymerizable monomers include, for example, methacrylic acid, acrylic acid, methacrylic acid or C1-C8 alkyl esters of acrylic acid, acrylonitrile, acrylamide, N, N-dimethylacrylamide, vinyl acetate, styrene, α-methylstyrene, and vinyltoluene. Etc.
光応答性成分がコポリマーである場合は、非置換もしくは置換のスピロピラン又はアゾベンゼンを含有する光応答性を示す重合性モノマーを含むことが好ましく、更にニトロ基により置換されたスピロピランを含有する重合性モノマーを含むことが特に好ましい。
また、共重合可能なモノマーとしては、メタクリル酸又はアクリル酸のＣ1−Ｃ8アルキルエステル及びスチレン系モノマーが好ましく、汎用性と透明性の側面からメチルメタクリレートがより好ましい。
When the photoresponsive component is a copolymer, it preferably contains an unsubstituted or substituted spiropyran or a polymerizable monomer showing photoresponsiveness containing azobenzene, and further contains a spiropyran substituted with a nitro group. It is particularly preferable that
The copolymerizable monomer is preferably a methacrylic acid or acrylic acid C1-C8 alkyl ester and a styrene monomer, and methyl methacrylate is more preferred from the viewpoint of versatility and transparency.
前記コポリマーにおいて、光応答性を示す色素を含有する重合性モノマーユニット数の、ポリマーを構成する全モノマーユニット数に対する割合は、0.1−100mol％、好ましくは1−10 mol％程度であり、より好ましくは3mol％程度である。 In the copolymer, the ratio of the number of polymerizable monomer units containing a dye exhibiting photoresponsiveness to the total number of monomer units constituting the polymer is about 0.1 to 100 mol%, preferably about 1 to 10 mol%, more preferably. Is about 3 mol%.
本発明で細胞培養基材の光応答性表面を形成するのに使用する光応答性組成物を構成するのもう一つの成分としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリペンタメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコール等のポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールを使用する。これらのポリアルキレングリコールの末端は、アルキル基、水酸基、アミノ基、エステル基等によって変性されていてもよい。 Another component constituting the photoresponsive composition used to form the photoresponsive surface of the cell culture substrate in the present invention includes polyethylene glycol, polypropylene glycol, polybutylene glycol, polypentamethylene glycol, Polyalkylene glycols such as polyhexamethylene glycol, preferably polyethylene glycol are used. The terminal of these polyalkylene glycols may be modified with an alkyl group, a hydroxyl group, an amino group, an ester group or the like.
ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコールとしては、分子量5,000−1,000,000、好ましくは分子量10,000−500,000、より好ましくは分子量50,000−200,000程度のものを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
また、このポリエチレングリコール等の末端は、光応答性組成物中の他の成分と化学的に結合されていても良い。あるいは、単に光応答性組成物中に混合されているだけでも良い。
Polyalkylene glycols such as polyethylene glycol may be those having a molecular weight of 5,000 to 1,000,000, preferably 10,000 to 500,000, more preferably 50,000 to 200,000, but are not limited thereto.
In addition, the end of the polyethylene glycol or the like may be chemically bonded to other components in the photoresponsive composition. Alternatively, it may be simply mixed in the photoresponsive composition.
本発明で使用する光応答性組成物中の前記光応答性成分の配合量は、特に制限されるものではないが、光応答性成分とポリエチレングリコールとの合計量の0.01−50重量％程度であり、好ましくは0.1−20重量％程度、より好ましくは5重量％程度である。
本発明のポリアルキレングリコールを含む光応答性組成物により形成された光応答性表面は、適度の細胞接着性を有するために、光照射部位と非照射部位の細胞接着性の差異が顕著に表れ、細胞の分別回収や分別培養を簡単に行うことが可能となる。また、ポリアルキレングリコールを含む光応答性組成物を使用することにより、成膜性や膜強度が改善された光応答性表面を有する細胞培養基材を容易に製造することができる。
The blending amount of the photoresponsive component in the photoresponsive composition used in the present invention is not particularly limited, but is about 0.01 to 50% by weight of the total amount of the photoresponsive component and polyethylene glycol. Yes, preferably about 0.1-20% by weight, more preferably about 5% by weight.
Since the photoresponsive surface formed by the photoresponsive composition containing the polyalkylene glycol of the present invention has appropriate cell adhesiveness, the difference in cell adhesion between the light-irradiated site and the non-irradiated site is remarkably exhibited. Thus, it becomes possible to easily carry out fractional collection and fractional culture of cells. In addition, by using a photoresponsive composition containing polyalkylene glycol, a cell culture substrate having a photoresponsive surface with improved film formability and film strength can be easily produced.
光応答性組成物をコーティングなどを目的として溶液とする場合、その溶剤は使用する光応答性組成物を溶解できるものであればよく、例えば、1、２−ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、クロロフォルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 When the photoresponsive composition is used as a solution for coating or the like, the solvent may be any solvent as long as it can dissolve the photoresponsive composition to be used. For example, 1,2-dichloroethane, tetrahydrofuran, chloroform, methyl ethyl ketone, acetic acid Although ethyl etc. are mentioned, it is not limited to these.
前記光応答性成分がコポリマーである場合、そのコポリマーの平均分子量（重量平均）は、成膜性があれば特に限定されるものではないが、通常2,000−500,000、好ましくは5,000−100,000程度である。コポリマーの平均分子量が2,000未満では成膜性が劣る恐れがあり、一方500,000を超えると、合成が困難である場合がある。 When the photoresponsive component is a copolymer, the average molecular weight (weight average) of the copolymer is not particularly limited as long as it has film-forming properties, but is usually about 2,000-500,000, preferably about 5,000-100,000. . If the average molecular weight of the copolymer is less than 2,000, the film formability may be poor, while if it exceeds 500,000, synthesis may be difficult.
また、前記光応答性組成物を用いて細胞培養基材に光応答性表面を形成するとき、上記光応答性成分を直接表面に導入する場合には、これら光応答性成分を、培養装置の基材表面に、例えばシランカップリング剤等を用いて化学的に、あるいは疎水性相互作用等を利用して物理的に結合させることができる。 Further, when forming the photoresponsive surface on the cell culture substrate using the photoresponsive composition, when the photoresponsive component is directly introduced into the surface, these photoresponsive components are added to the culture apparatus. It can be physically bonded to the surface of the substrate, for example, using a silane coupling agent or the like, or physically using a hydrophobic interaction or the like.
本発明で使用される用語「光応答性表面」とは、前記光応答性組成物からなり、足場依存性細胞や神経細胞などの細胞が接着する表面を意味する。該表面は、光照射された領域の細胞接着性及び／又は細胞増殖性が亢進することを特徴とする。 The term “photoresponsive surface” used in the present invention means a surface composed of the photoresponsive composition and to which cells such as anchorage-dependent cells and nerve cells adhere. The surface is characterized in that cell adhesion and / or cell proliferation of the region irradiated with light is enhanced.
本発明の細胞培養基材を作製するには、例えば前記光応答性組成物の溶液をガラス、改質ガラス、プラスチック、金属等の基板上にスピンコートまたはキャスト法にて成膜する。成膜後に熱処理を行うこともできるが、熱処理を行う場合は、室温−200℃、より好ましくは60−140℃の温度で、２、３時間の熱処理を行うことが望ましい。スピンコートまたはキャストに用いる溶液の濃度（光応答性成分とポリアルキレングリコールの合計量）は、フィルム形成ができれば特に限定されるものではないが、好ましくは0.01−10重量％、より好ましくは0.5−1重量％である。この範囲を逸脱すると、不純物による汚染や膜の不均一化が生じることがある。 In order to produce the cell culture substrate of the present invention, for example, the solution of the photoresponsive composition is formed on a substrate of glass, modified glass, plastic, metal or the like by spin coating or casting. Although heat treatment can be performed after the film formation, in the case of performing the heat treatment, it is desirable to perform the heat treatment for a few hours at a temperature of room temperature to 200 ° C., more preferably 60 to 140 ° C. The concentration of the solution used for spin coating or casting (total amount of photoresponsive component and polyalkylene glycol) is not particularly limited as long as film formation is possible, but is preferably 0.01-10 wt%, more preferably 0.5- 1% by weight. Beyond this range, contamination by impurities and non-uniform film formation may occur.
本発明の細胞培養基材を使用する細胞培養デバイスとしては、細胞培養が可能であれば特に制限されるものではなく、例えば、培養ディッシュ、細胞培養キュベット等が挙げられるが、定点観測が可能な形態がより好ましい。 The cell culture device using the cell culture substrate of the present invention is not particularly limited as long as cell culture is possible, and examples thereof include culture dishes and cell culture cuvettes, but fixed point observation is possible. A form is more preferable.
光応答性表面の特性を変化させるための照射光としては、紫外線、可視光などを挙げられる。波長域は、330−1000nm程度とすることができ、好ましくは350−800nm、より好ましくは波長360−600nmである。また、光照射エネルギーは、光応答性表面の特性を変化させることができ、かつ細胞に損傷を与えない範囲内であればよく、通常は0.1−10,000J/cm2、好ましくは1−1,000J/cm2、より好ましくは10−100J/cm2である。 Examples of irradiation light for changing the characteristics of the photoresponsive surface include ultraviolet rays and visible light. The wavelength range can be about 330-1000 nm, preferably 350-800 nm, more preferably 360-600 nm. The light irradiation energy may be within a range that can change the characteristics of the light-responsive surface and does not damage the cells, and is usually 0.1 to 10,000 J / cm 2 , preferably 1 to 1,000 J. / cm 2 , more preferably 10-100 J / cm 2 .
本発明で用いられる細胞は、ヒト細胞または動物細胞由来の足場依存性細胞、神経細胞などであり、例えば繊維芽細胞、上皮細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの細胞は必要に応じて単独で使用するか、又は複数組合せて使用することも可能である。 The cells used in the present invention are anchorage-dependent cells derived from human cells or animal cells, nerve cells, and the like, and examples include, but are not limited to, fibroblasts and epithelial cells. These cells can be used alone or in combination as required.
以下、本発明の細胞培養基材を用いた細胞の分別回収方法を図１を用いて説明する。
まず、該細胞培養基材の光応答性表面（１）に、細胞（２）を播種（３）する。この細胞の種類や活性を判定するための標識（４）を行い、所望しない細胞（２Ａ）の位置情報を取り込み（５）、これに基づく照射パターン（６）で２次元パターン光照射（７）を行うことで、所望しない細胞（２Ａ）が存在する領域にのみ光を照射すると、そこでの細胞接着性が亢進されて所望しない細胞（２Ａ）のみが光応答性表面（１）に接着する。所望の細胞（２Ｂ）が光応答性表面（１）に接着していないこの状態で培地ごと細胞を回収（８）すれば、所望の細胞（２Ｂ）のみが選択的に分別回収される。
Hereinafter, a method for sorting and collecting cells using the cell culture substrate of the present invention will be described with reference to FIG.
First, the cells (2) are seeded (3) on the photoresponsive surface (1) of the cell culture substrate. The label (4) for judging the type and activity of this cell is applied, the positional information of the undesired cell (2A) is taken in (5), and the irradiation pattern (6) based on this is used for two-dimensional pattern light irradiation (7) When light is irradiated only to the region where the undesired cells (2A) are present, cell adhesion there is enhanced and only the undesired cells (2A) adhere to the photoresponsive surface (1). If the cells are collected (8) together with the medium in this state where the desired cells (2B) are not adhered to the photoresponsive surface (1), only the desired cells (2B) are selectively collected separately.
次に、本発明における細胞培養基材を用いた細胞のパターニングの方法を図２を用いて説明する。
まず、該細胞培養基材の光応答性表面（９）に、予め２次元パターン光照射（１０）を行うことで、細胞接着性及び／又は細胞増殖性を照射パターン（１１）に沿って亢進させる。この該細胞培養基材の光応答性表面（９）に細胞（１２）を播種（１３）する。その後洗浄・培養（１４）することで、照射パターン（１１）に沿う領域の細胞（１２）を増殖させる。照射パターンに沿って複数種の細胞を共培養する場合には、照射パターン（１５）で２次元パターン光照射（１６）を行い、残りの領域の細胞接着性及び／又は細胞増殖性を亢進させ、他の種類の細胞（１７）を播種（１８）すると、既に先に播種した細胞（１２）が増殖している領域を避け、照射パターン（１５）に沿う領域に細胞（１７）が接着し、増殖する。
Next, a cell patterning method using the cell culture substrate in the present invention will be described with reference to FIG.
First, two-dimensional pattern light irradiation (10) is performed in advance on the light-responsive surface (9) of the cell culture substrate, thereby enhancing cell adhesion and / or cell proliferation along the irradiation pattern (11). Let Cells (12) are seeded (13) on the photoresponsive surface (9) of the cell culture substrate. Thereafter, the cells (12) in the region along the irradiation pattern (11) are grown by washing and culturing (14). When co-culturing a plurality of types of cells along the irradiation pattern, two-dimensional pattern light irradiation (16) is performed using the irradiation pattern (15) to enhance cell adhesion and / or cell proliferation in the remaining region. When other types of cells (17) are seeded (18), the cells (17) adhere to the regions along the irradiation pattern (15), avoiding the region where the previously seeded cells (12) are proliferating. ,Multiply.
該細胞培養基材の光応答性表面は、細胞播種後に光照射することによっても細胞にダメージを与えることなく、細胞接着性及び／又は細胞増殖性を局所的に亢進させられるので、この操作を複数回繰り返すことが可能であり、本発明にこの繰り返しの方法が含まれることは言うまでもない。この場合、逐次培養領域を指定しながら、複数種の細胞を任意のパターンに沿って共培養することができる。 The photoresponsive surface of the cell culture substrate can locally enhance cell adhesion and / or cell proliferation without damaging the cells even when irradiated with light after cell seeding. Needless to say, the method can be repeated a plurality of times, and the present invention includes this repeating method. In this case, a plurality of types of cells can be co-cultured along an arbitrary pattern while designating a sequential culture region.
また、本発明によれば、特に、トリプシン等の酵素を全く、あるいは十分量使用しないため、細胞接着物質であり、細胞機能の発現や保持に重要な働きをするＥＣＭ（細胞外マトリックス）や膜タンパク質を伴ったまま細胞を剥離回収することが可能である点が、極めて重要な利点である。 In addition, according to the present invention, an ECM (extracellular matrix) or membrane which is a cell adhesion substance and plays an important role in the expression and maintenance of cell functions, particularly because no or sufficient amount of an enzyme such as trypsin is used. It is a very important advantage that cells can be detached and collected with protein.
本発明においては、上記のように蛍光標識抗体を用いる手法のみでなく、種々の蛍光標識法を採用できる。これには、例えば、ルシフェラーゼ等の発光系を構成する酵素の遺伝子を細胞に導入する方法等が挙げられる。さらに、例えば、形態の違う細胞の分別においては、特に蛍光標識を行わなくとも顕微鏡観察下、光照射して、目的とする細胞のみを分別して回収することができる。 In the present invention, not only a technique using a fluorescently labeled antibody as described above but also various fluorescent labeling methods can be employed. This includes, for example, a method of introducing a gene of an enzyme constituting a luminescence system such as luciferase into a cell. Furthermore, for example, in the differentiation of cells having different forms, it is possible to separate and collect only the target cells by irradiating light under a microscope, without performing fluorescent labeling.
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
（製造例１：ニトロスピロピラン修飾ポリメチルメタクリレートの製造）
凍結脱気可能で密栓できる100mlフラスコ中で、精製したメチルメタクリレート950mg（9.5mmol；和光純薬製）をテトラヒドロフラン（THF）蒸留液1mlに溶解したあと、N-[3-{3',3'-ジメチル-6-ニトロスピロ(2H-1-ベンゾピラン-2,2'-インドリン)-1-イル-プロピオニル}-プロピル]-メタクリルアミド253.3mg（0.5mmol；文献Heterocycles, 51, 2639-2651 (1999)記載の製造方法により合成）とTHF1mlを入れて撹拌しながら完全に溶解した。また、開始剤AIBN（2、2-アゾビス（イソブチロニトリル）、和光特級）16.4mg（0.1mmol）を入れてTHF1mlにて溶解して、密封した状態で凍結脱気を5回行った。その後、オイルバス中、65℃で24時間加熱した。CHCl3を少量加えて薄めて、メタノール400mlに点滴ろ過した後、減圧ろ過して乾燥させることによってニトロスピロピラン修飾ポリメチルメタクリレートを得た。
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
(Production Example 1: Production of nitrospiropyran-modified polymethyl methacrylate)
In a 100 ml flask that can be frozen and degassed and sealed, 950 mg of purified methyl methacrylate (9.5 mmol; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in 1 ml of tetrahydrofuran (THF) distilled solution, and then N- [3- {3 ', 3' -Dimethyl-6-nitrospiro (2H-1-benzopyran-2,2'-indoline) -1-yl-propionyl} -propyl] -methacrylamide 253.3 mg (0.5 mmol; literature Heterocycles, 51, 2639-2651 (1999) Synthesis by the production method described) and 1 ml of THF were added and completely dissolved with stirring. Further, 16.4 mg (0.1 mmol) of an initiator AIBN (2,2-azobis (isobutyronitrile), Wako special grade) was added, dissolved in 1 ml of THF, and freeze deaeration was performed 5 times in a sealed state. Then, it heated at 65 degreeC for 24 hours in the oil bath. A small amount of CHCl 3 was added to dilute the solution, followed by instillation filtration into 400 ml of methanol, followed by filtration under reduced pressure and drying to obtain nitrospiropyran-modified polymethyl methacrylate.
（実施例１：細胞培養基材の作製）
上記製造例１で得られたニトロスピロピラン修飾ポリメチルメタクリレート0.5 wt%とポリエチレングリコール0.1wt%を含有する1，2-ジクロロエタン溶液を、ガラス基板（直径2.5cm）上にスピンコーティング（回転速度：1200rpm）して、１２０℃で２時間熱処理を行ったあと、室温まで放冷、７０％エタノール中に浸漬させたあと、減圧乾燥させて細胞培養基材を作製した。
細胞培養基材は、用いたポリエチレングリコールの重量平均分子量50,000、20,000、8,000、14,000に応じて４種類を作製し、それぞれ培養基材１−４とした。
比較のために、ポリエチレングリコールを含有しない以外は、上記と同様にして細胞培養基材を作製したところ、細胞接着性が高すぎて、十分な光応答性を確認するには至らなかった。
(Example 1: Production of cell culture substrate)
The 1,2-dichloroethane solution containing 0.5 wt% of nitrospiropyran-modified polymethyl methacrylate and 0.1 wt% of polyethylene glycol obtained in Production Example 1 above is spin-coated on a glass substrate (2.5 cm in diameter) (rotation speed: 1200 rpm) Then, after heat treatment at 120 ° C. for 2 hours, the mixture was allowed to cool to room temperature, immersed in 70% ethanol, and dried under reduced pressure to prepare a cell culture substrate.
Four types of cell culture substrates were prepared according to the weight average molecular weights of polyethylene glycol used, 50,000, 20,000, 8,000, and 14,000.
For comparison, a cell culture substrate was prepared in the same manner as described above except that it did not contain polyethylene glycol. As a result, cell adhesion was too high, and sufficient photoresponsiveness could not be confirmed.
（実施例２：細胞播種前の光照射による細胞接着性評価）
上記実施例で得られた培養基材１−４を各々細胞培養キュベットに装着し、細胞の播種前、このキュベットに培養基材の半分の領域をマスクした状態で、光照射装置（モデル名：LC６、浜松ホトニクス社製）からの放射光のうちバンドパスフィルターを介して得られる主波長365nm、強度は20mW/cm2の紫外光を照射した。その後、Balb/3T3細胞を1.0x105cell/dishの細胞濃度で播種し、１２時間培養した（培地：MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM EAGLE、SIGMA社製）。その後、PBS１mlで２回洗浄を行い、紫外光の照射部と非照射部での細胞接着性を倒立顕微鏡にて肉眼観察したところ、細胞接着性に明確な差異が認められた。
(Example 2: Cell adhesion evaluation by light irradiation before cell seeding)
Each of the culture substrates 1-4 obtained in the above examples was attached to a cell culture cuvette, and before seeding the cells, a light irradiation device (model name: Among the radiated light from LC6 (manufactured by Hamamatsu Photonics), ultraviolet light having a main wavelength of 365 nm and an intensity of 20 mW / cm 2 obtained through a bandpass filter was irradiated. Thereafter, Balb / 3T3 cells were seeded at a cell concentration of 1.0 × 10 5 cell / dish and cultured for 12 hours (medium: MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM EAGLE, manufactured by SIGMA). Thereafter, the cells were washed twice with 1 ml of PBS, and the cell adhesion between the irradiated part and the non-irradiated part was observed with an inverted microscope. As a result, a clear difference was observed in the cell adhesiveness.
（実施例３）
また、上記実施例１で得られた培養基材１を細胞培養キュベットに装着し、上記実施例２と同様な方法により処理を行い、CCDカメラ撮影視野内の細胞数を数え、細胞密度を求めた。その結果を図３に示した。
図３において、中央は光照射部位において１２時間培養した後の細胞密度を表し、右側は非照射部位において１２時間培養した後の細胞密度を表す。また、左側は光応答性表面を形成していない単なるガラス基板を使用して同様に培養した後の細胞密度を表す（下記、比較例参照）。
図３によれば、本発明の光応答性表面を形成した培養基材１では、光照射部位と非照射部位において培養後に顕著な細胞密度の差異が見られ、この差異を利用して所望の細胞又は細胞群を分別回収することが可能となる。
(Example 3)
In addition, the
In FIG. 3, the center represents the cell density after culturing for 12 hours at the light-irradiated site, and the right side represents the cell density after culturing for 12 hours at the non-irradiated site. Moreover, the left side represents the cell density after culturing in the same manner using a simple glass substrate on which no photoresponsive surface is formed (see the following comparative example).
According to FIG. 3, in the
（実施例４：細胞播種後の光照射による細胞接着性評価）
重量平均分子量100,000のポリエチレングリコールを用いて、スピンコーティングした膜を７０％エタノール中に浸漬させないこと以外は、上記実施例１と同様にして細胞培養基材を作製し、それを培養基材5とした。
この培養基材5を細胞培養キュベットに装着し、所望細胞の領域に対する紫外光照射を、細胞を播種してから5分後に行うこと、及びBalb/3T3細胞を0.5x105cell/dishの細胞濃度で播種する以外は、上記実施例２と同様にして処理を行い、細胞接着性を評価した。紫外光照射部と非照射部では、細胞接着性に明確な差異が認められた。また、実施例３と同様にして測定した細胞密度の結果を図4に示した。
図４によれば、本発明の光応答性表面を形成した培養基材５では、光照射部位と非照射部位において培養後に顕著な細胞密度の差異が見られ、この差異を利用して所望の細胞又は細胞群を分別回収することが可能となる。
(Example 4: Cell adhesion evaluation by light irradiation after cell seeding)
A cell culture substrate was prepared in the same manner as in Example 1 except that the spin-coated membrane was not immersed in 70% ethanol using polyethylene glycol having a weight average molecular weight of 100,000. did.
The
According to FIG. 4, in the
（比較例）
本発明の光応答性組成物をコーティングした細胞培養基材と対比するために、光応答性表面を形成していない単なるガラス基板を使用し、その表面で上記実施例２の培養条件で細胞培養を行い、そのガラス基板上での細胞接着性を倒立顕微鏡にて肉眼観察したところ、光照射部位と非照射部位での細胞接着性に有意の差はみられなかった。
また、CCDカメラ撮影視野内の細胞数を数え、細胞密度を求めた結果を図３の左側に示した。
(Comparative example)
In order to contrast with the cell culture substrate coated with the photoresponsive composition of the present invention, a simple glass substrate not forming a photoresponsive surface is used, and cell culture is performed on the surface under the culture conditions of Example 2 above. When the cell adhesion on the glass substrate was observed with an inverted microscope, there was no significant difference in cell adhesion between the light-irradiated site and the non-irradiated site.
In addition, the number of cells in the CCD camera field of view was counted and the cell density was obtained.
本発明によれば、細胞を播種した後の光照射により、培養基材の光応答性表面の特定の領域に対して、数百ナノメートルの分解能で局所選択的に細胞接着性及び／又は細胞増殖性を亢進させることができるため、従来技術では両立できなかった細胞の精密分離に加え、該分離において細胞外マトリックスや膜タンパク質を損なわず細胞の器官特異的機能の維持を同時に実現することが可能となる。また、従来の細胞のパターニングでは、細胞播種前の処理によって予め培養パターンが決まってしまうのに対し、細胞播種後に細胞を増殖させる領域を任意の２次元パターンで決めることができるため、従来にない細胞操作手段が提供できる。従って、本発明の光応答性組成物から形成された細胞培養基材及び、それを用いた所望細胞の選択的分別回収及びパターン培養の方法は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて極めて有用である。 According to the present invention, cell adhesion and / or cells can be locally and selectively resolved at a resolution of several hundred nanometers to a specific region of the photoresponsive surface of the culture substrate by light irradiation after seeding the cells. Proliferation can be enhanced, so in addition to precise separation of cells that could not be achieved with conventional technology, it is possible to simultaneously maintain the organ-specific functions of cells without damaging extracellular matrix and membrane proteins. It becomes possible. In addition, in the conventional cell patterning, the culture pattern is determined in advance by the process before cell seeding, whereas the area in which cells are to be propagated after cell seeding can be determined by an arbitrary two-dimensional pattern. Cell manipulation means can be provided. Therefore, a cell culture substrate formed from the photoresponsive composition of the present invention and a method for selective fractional collection and pattern culture of desired cells using the same are used in the fields of cell engineering, regenerative medicine, and bio-related industries. It is extremely useful in the field of tissue engineering.
１，９ 光応答性表面
２，２Ａ，２Ｂ，１２，１７ 細胞
３，１３，１８ 播種操作
４ 細胞の標識操作
５ 位置情報の取り込み操作
６，１１，１５ 照射パターン
７，１０，１６ ２次元パターン照射操作
８ 細胞回収操作
１４ 洗浄・培養操作
1,9
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