JP4065554B2 - 抗体の調製 - Google Patents
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Description
抗体、すなわち免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で結ばれた2つの重鎖と、Y字型になるようにジスルフィド結合で各々の重鎖に結合している2つの軽鎖とから成る。抗体の2つの“腕(アーム)“は、抗原との結合に関与し、ポリペプチド構造が変化する領域を含む。これらの“腕“はFab′断片(断片−抗原−結合)、または2つのFab′の腕がジスルフィド結合で結ばれていることを表すためにF(ab)2と呼ばれている。抗体の“尾部“つまり中心軸には、ペプチドの固定された、すなわち不変の配列が見られ、Fc断片(断片−結晶)といわれている。モノクロナール抗体は初め、KohlerとMilstein(Nature,256,495−497(1975))により発見された。この様なモノクロナール抗体は診断薬として、あるいは治療用として広く使われている。
各重鎖の一方の末端には、可変部があり、複数の定常部がそれに続く。各軽鎖の一方の末端には可変部が、他方の末端には定常部がある。軽鎖の可変部は重鎖の可変部と並んでおり、また定常部は重鎖の最初の定常部(CH1)と並んでいる。軽鎖および重鎖の定常部は抗体の抗原に対する結合に直接は関与しない。軽鎖の定常部と重鎖のCH1ドメインは各Fab′断片の50%を占める。
軽鎖と重鎖の各対から成る可変部は抗原との結合部位を形成する。軽鎖と重鎖の可変部は同一の一般構造を有し、各ドメインは4つのフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存されていて、3つの相補性決定領域(CDR)によって連結されている(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services(1987))。4つのフレームワーク領域はたいてい、βシート構造を形成し、CDRはループ上の連結部を形成する。CDRがβシート構造の一部を形成する場合もある。CDR同士はフレームワーク領域によって非常に接近しており、他のドメインのCDRと共に抗原結合サイトの形成に寄与している。
ヒトCD3抗原は少なくとも4つの不変ポリペプチド鎖から成り、各ポリペプチド鎖はT細胞の表面上のT細胞受容体と非共有結合で結合する。そして、現在一般的にCD3抗原複合体と呼ばれている。その複合体はT細胞受容体による抗原認識に応答したT細胞活性化に関与することが示唆されている。
すべてのCD3モノクロナール抗体はIL−1(インターロイキン1)やIL−2(インターロイキン2)のような二次増殖刺激剤に対するT細胞の感受性を高めるために使用される。さらに、CD3モノクロナール抗体の中には、それ自身がT細胞に対して増殖促進活性を有するものもある。この性質はアイソタイプ依存性で、CD3抗原のFc部と補助細胞の表面にあるFc受容体との相互作用に起因する。
齧歯類のCD3抗体は、T細胞の抗原に対する反応を抑制、促進、再促進することにより免疫反応に影響を与えるために利用される。従って、それらはヒトの免疫抑制剤として治療に用いることができる可能性がかなり高い。例えば、腎臓、肝臓、心臓の他家移植後の拒否反応に対する治療のために使用できる。しかし、それらの価値は2つの主要な要因に左右される。1つは、抗体の異物的な性質により引き起こされる抗グロブリン反応である。2つは、患者に抗体を初めて投与した際に起こる“一次反応“症候群である。症状としては、熱、悪寒から肺炎にまで渡る苦痛を伴い、稀に死を招くこともあるが、これは、CD3抗体によって誘導されたT細胞活性化に伴って循環サイトカインのレベルが上昇することに起因する。この現象はT細胞表面のCD3抗原と補助細胞とのFc受容体を通したクロスリンクを必要とする。このような増殖はCD3抗体のF(ab′)2断片を用いても起こらない。
最初の問題は、抗体の可変部の遺伝子を再編成、あるいは”人体と適応”させ、そしてそれらを関連したヒトの定常部遺伝子と共に発現させることによって対処することができる。これにより、抗グロブリン反応が起こり得ないくらいの低レベルまで、モノクロナール抗体の非ヒト部分の割合が下げることができる。CD3抗原複合体に対する結合性を持つこのような再編成された抗体については英国特許出願第9121126.8号(GB2249310Aとして公開された)およびその対応出願(欧州特許出願第91917169.4、日本特許出願第516117/91号および米国特許出願第07/862543号)に記載されている。
しかし、これら抗体が治療に使用されても、一次反応の問題は残ったままである。ある場合には抗体の脱グリコシル化により、in vitroで抗体のFc受容体に対する結合力が低下したと記載されている。しかし、この現象がすべての抗体で、特にin vivoでも起こるのかを予想することはできず、また脱グリコシル化によって、他の好ましくない効果を引き起こす新規なFc結合特性を含む新規な予想できない性質が抗体に与えられる可能性もある。またFc結合性とは関連のない好ましくない特徴を抗体に与えてしまう可能性もある。
さらに極めて重要なことは、脱グリコシル化によって、一次反応へ寄与するような好ましくない特徴と共に、Fc結合性の好ましい特徴まで失ってしまわないことである。
しかし、本発明ではIgGサブクラスの脱グリコシル化CD3抗体の産生が可能であることを見いだした。この抗体は驚くべきことに、Fcへの結合能力をある程度残しており、その抗原結合特異性および免疫抑制活性を保持したまま、in vitroではT細胞の分化を誘導せず、そしてin vivoでサイトカイン放出のレベルを下げることができる。
従って、本発明は、CD3抗原複合体への結合親和力を有する脱グリコシル化IgG抗体を提供する。
脱グリコシル化という用語は通常の意味で用いられ、発明された抗体はグリコシル化されていないことを示す。本発明は、ヒト以外のCD3抗原複合体、例えば様々な他の哺乳類CD3抗原への結合親和性を有する抗体に適用して家畜病治療に用いることもできるが、発明の主な価値は、脱グリコシル化抗体が、ヒトに対して適用できるように、ヒトCD3抗原複合体と親和性を持つことであり、次の記載では特にその内容に注目している。
CD3抗原についてのさらなる論議は、第一回国際ワークショップや、ヒト白血球分化抗原会議の報告にも見られ、CD3抗原に対するグリコシル化された様々な抗体についての記述も、このシリーズのワークショップおよび会議(特に第3回、第4回)の報告(オックスフォード社出版)にも見られる。そのような抗体の具体的な例としては、Van Ller ら、Euro J.Immunol.,1987,17,1599−1604、Alegreら.,J.Immunol.,1991,140,1184、およびSmithら,ibid,1986,16,478,の中に記載されたものも含まれ、Smithの文献は、IgG1抗体UCHT1およびその派生体に関している。しかし、本発明の、脱グリコシル抗体の基本的特徴として特に興味深いのは、抗体OKT3とYTH12.5.14.2に含まれるCDRである。抗体OKT3はChatenaudら.,Transplantion,1991,51,334およびNew England Journal of Medicine paper,1985,313,339、さらに、欧州特許出願第0018795号と米国特許出願第4,361,539号中に記載されている。抗体YTH12.5.14.2(今後YTH12.5とする)については、Clark ら.,Eurorean J.Immunol.,1989,19,381−388に述べられており、そして、再構成されたYTH12.5抗体は、英国特許出願第9121126.8号とその対応出願の主題となっており、この出願にはこの抗体に存在するCDRについて詳細に記載されている。
、上述の出願に記載されているCDRを1つ若しくは複数含んでいる脱グリコシル抗体は特に興味深い。従って、本発明の抗体は下記のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのCDRをもつことが好ましい。
およびこれらの保存的に修飾された派生体である。
“保存的に修飾された派生体“とは当該技術分野においてよく知られており、抗体−抗原の親和力に本質的に影響を与えることのない変化を有する派生体を意味する。
CDRは、重鎖可変部のフレームワーク領域中((a),(b),(c)の場合)および軽鎖可変部のフレームワーク領域中((d),(e),(f)の場合)に位置している。抗体はさらに定常部も含んでいる。
好ましい態様では、脱グリコシル抗体は、上述アミノ酸配列(a),(b),(c)に相当する、若しくはそれらの保存的に修飾された派生体に相当する3つのCDR,および/あるいは、アミノ酸配列(d),(e),(f)に相当する、若しくはそれらの保存的に修飾された派生体に相当する3つのCDRを有するが,最も重要なのは重鎖CDR(a),(b),(c)である。
従って、CD3抗原に対する結合親和性を有する好ましい脱グリコシル抗体は、少なくとも1つ、特に3つのCDRがアミノ酸配列:
および、これらの保存的に修飾された派生体から選択された重鎖、および/または、少なくとも1つ、特に3つのCDRがアミノ酸配列:
およびこれらの保存的に修飾された派生体から選択される軽鎖を有する。
本発明の脱グリコシル抗体は、前述のような好ましいCDRを含んでいる場合、都合のいいことに、特異的な重鎖CDRを1つ以上と特異的な軽鎖CDRを1つ以上を両方とも有している。CDR(a),(b),(c)は重鎖中で次のように配列される。リーダー配列から定常部(N末端からC末端へ)の方向へ、フレームワーク領域1/(a)/フレームワーク領域2/(b)/フレームワーク領域3/(c)/フレームワーク領域4。また、CDR(d),(e),(f)は軽鎖中で次のように配列される。リーダー配列から定常部(N末端からC末端へ)の方向へ、フレームワーク領域1/(d)/フレームワーク領域2/(e)/フレームワーク領域3/(f)/フレームワーク領域4。そこで3つの配列が全て存在する場合には、重鎖CDRはリーダー配列から定常部の方向へ、(a),(b),(c)と並び、軽鎖CDRはリーダー配列から定常部の方向へ、(d),(e),(f)と並ぶのが好ましい。
しかし、本発明の脱グリコシル抗体が、前述のような配列とはまったく異なるCDRを含んだり、あるいは全く異なることはないとしても、重鎖や特に軽鎖が、各々(a),(b),(c)という配列のCDR、(d),(e),(f)という配列のCDRのうち、たった1つまたは2つしか持たない可能性もあり得ることを認識しておく必要がある。しかし、本発明の脱グリコシル抗体に上述の6つのCDR全てが存在することが必要とされているわけではないが、大半の好ましい抗体中には通常存在するであろう。従って、特に好ましい脱グリコシル抗体は、アミノ酸配列(a),(b),(c)若しくはこれらの保存的に修飾された派生体から成る3つのCDRを持つ重鎖、及び、アミノ酸配列(d),(e),(f)若しくはこれらの保存的に修飾された派生体から成る3つのCDRを持つ軽鎖を有し、そして、重鎖CDRはリーダー配列から定常部の方向へ、(a),(b),(c)と並び、軽鎖CDRはリーダー配列から定常部の方向へ、(d),(e),(f)と並ぶ。
CDRは可変フレームワーク領域、および/または、定常部とは異なった起源を持っていてもよい。そして、CDRは通常、ラット若しくはマウス由来であるので、本発明がラットやマウス由来のそのような領域を持った抗体を包含しても、ヒトでの抗グロブリン反応が起こらないという利点がある。
さらに通常が、CDRは、例えばヒトのキメラ抗体の一部の様に可変フレームワーク領域と同じ起源であっても、定常フレームワーク領域とは起源が異なるか、または、より一般には、可変フレームワーク領域とも起源が異なる。
上述の望ましいCDRはラットCD3抗体より得られる。従って、可変部フレームワーク領域は様々な形態を取り得るが、齧歯類(例えばラットやマウス)のもの、または齧歯類由来のものが都合よく、ヒトのものまたはヒト由来のものであるのがより望ましい。1つの可能性として、抗体の定常部はヒトのものまたはヒト由来のもののままで、可変部フレームワーク領域はYTH12.5ハイブリドーマのものに相当するものを持たせることもできる。しかし、本発明の抗体は、好ましくは可変部フレームワーク領域も、さらに後述するように定常部フレームワーク領域もヒト由来のものに近付けた方が良い。
従って、本発明はさらに、ヒトCD3抗原に結合親和性を有し、且つ、可変部フレームワーク領域、および/または、定常部フレームワーク領域がヒトのものまたはヒト由来のものである脱グリコシル抗体を含む。
ヒトの可変部フレームワーク領域の配列のあるものは、望ましいCDR配列を繋ぎ合わせるのに好ましい。なぜなら、そのような配列中においてはCDRの3次元構造がより保持され、且つ、抗体が抗原に対して高い結合親和性を維持するであろうからである。そのような可変部フレームワーク領域における望ましい特徴は、主要なアミノ酸が存在していることであり、それらのアミノ酸はCD3抗原に対する抗体の親和性と特異性を確実にするため、CDRループ構造、すなわち、軽鎖にとって望ましいλ型の構造を維持する。
上述のCDRとの結合に特に適するヒト可変フレームワーク領域は、英国特許出願第9121126.8号で既に同定されている。重鎖可変(V)領域フレームワークは、ヒトVHIII型遺伝子VH26.D.J.によりコードされており、B細胞ハイブリドーマ細胞系18/2(Genbank コード:Huminghat,Dersimonian ら.,Journal of Immunology,139,2496−2501)に由来する。軽鎖可変領域フレームワークは、ヒトVLλ型VI遺伝子SUT(Swissprot コード;LV6CsHum,Solomonら.,In Glennerら(Eds)、Amyloidosis,Plenum Press N.Y.,1986,p.449)にコードされている。
従って、ラットCD3抗体の重鎖の1つ、或いはそれ以上の好ましいCDRは好ましくはヒトの可変部領域フレームワークに存在し、この領域の配列は、リーダー配列から定常領域へ向かい、次のようなものである。CDRは、前述のような(a),(b),(c)、それらの保存的に修飾された派生体、若しくは別の選択可能なCDRを示す。
3つの望ましいCDRをすべて含む脱グリコシル抗体においては、重鎖可変部は下記の配列:
より成る。
同様にラットCD3抗体の軽鎖の1つ、或いはそれ以上の好ましいCDRは好ましくはヒトの可変部領域フレームワークに存在し、この領域の配列は、リーダー配列から定常領域へ向かい、次のようなものである。CDRは、前述のような(d),(e),(f)、それらの保存的に修飾された派生体、若しくは別の選択可能なCDRを示す。
3つの望ましいCDRをすべて含む脱グリコシル抗体においては、軽鎖可変部は下記の配列:
より成る。
可変部は、例えば上述のように1つ若しくは複数の好ましいCDRを含むが、好ましくはヒト抗体由来の可変フレームワーク領域を有する人体に適応した形で、適切な定常部に結合している。
重鎖と軽鎖の定常部は、任意の異なるタイプの抗体(IgG抗体であることを条件とする)に基づくことができる。しかし、それらは、ラットやマウスのものまたはそれらの由来のものでもよいが、ヒトのものまたはヒト由来のもののほうが望ましい。軽鎖の定常部はλ型のものが好ましく、重鎖の定常部はIgGアイソタイプ、特に脱グリコシル化に適切に影響を与えるように修飾を受けたIgG1が望ましい。IgGアイソタイプのヒト定常部は全て、297番目のアスパラギンがグリコシル化されていることが知られており、該アスパラギンは、次のようなNグリコシル化モチーフ:アスパラギン297−X298−セリン299若しくはスレオニン299(Xはプロリン以外のどんな残基でもよい):の一部を構成している。よって、本発明の抗体は、このような定常部中の297番目のアスパラギンをグリコシル化されない他のアミノ酸と置換することにより、脱グリコシル化される。アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基を利用できるが、アラニンが最も望ましい。
別法として、Nグリコシル化モチーフの他の残基のうち1つを変えることによって、297番目のアスパラギンのグリコシル化を防ぐことができる。例えば298番目の残基をプロリンと置換する、或いは、299番目の残基をセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸と置換することが考えられる。この部位特異的突然変異誘発を行うにあたっての方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば部位特異的突然変異誘発キット(例えばアマシャム社から市販されているもの)を利用して行うことができる。この方法については後にさらに例示する。
CDRの1つのアミノ酸を同様の性質を有する他のアミノ酸と置換させても、例えば、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基と置換させた場合でも、置換を起こされたペプチドやタンパク質の性質や構造を実質的には変化させないであろうことは当該技術分野においてよく知られている。従って、本発明の脱グリコシル化抗体には、その内部においてCDRの結合親和性や結合特異性を実質的に変化させることのない置換を起こさせた特定のアミノ酸配列を持つ望ましいCDRを有する抗体も含まれる。また、活性を保持したまま、CDRのアミノ酸配列中に欠失を起こさせたり、N末端やC末端の一方、あるいは両方に配列を延長させたりすることも可能である。
本発明の好ましい脱グリコシル化抗体は、105/モル若しくはそれ以上、例えば1012/モルもの抗原に対する親和定数を有するものである。異なる親和力を持つリガンドは、異なった利用に適している。よって、例えば親和力が106、107、108/モルやそれ以上で最適な場合もあるかもしれない。しかし、親和力106〜108/モルの抗体が最適である場合が多い。
都合良くは、本抗体は他の抗原と強い結合親和力を示すことがない。抗体の結合親和力および抗体特異性は後述の実施例の欄で記述されているような分析法(エフェクター細胞再標的分析法)、またはELISAや他の免疫分析法で測定することができる。
本発明の抗体は、2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖を持つY字型の脱グリコシル化IgG CD3抗体であり得、従って、CD3抗原に対する親和力を持つ各抗原結合部位が2箇所あり得る。または、本発明は一方のアームのみがCD3抗原に対する親和力を持つ抗体にも適用できる。そのような抗体は様々な形を取り得る。従って、抗体のもう片方のアームはCD3以外の抗原に対する結合親和力をもち、このような抗体は、例えば米国特許第4,474,893号及び欧州特許出願第87907123.1号と第87907124.9号に記載されているように、2種の抗原に特異的な抗体(二価抗体)である。また、1つのアームのみが結合親和力を示す抗体もあり、そのような抗体は、”単価”(monovalent)と言われる。
単価抗体(或いは、抗体断片)は様々の方法で調製することができる。GlennieとStevenson(Nature,295,712−713,(1982))は、酵素を用いた切断によって単価抗体を調製する方法を記載している。Stevensonらは、酵素処理で生産されたFab′とFc断片を化学的に架橋させて単価抗体を調製する第二の方法を記載している。(Anticancer Drug Design,3,219−230(1989))。これらの方法では、得られた単価抗体は片方のFab′アームを欠いている。第三の単価抗体調製法は、欧州特許出願第131424号に記載されている。この方法では、抗体のY字型は保持されるが、2つのFab′部のうち一方だけが抗原に結合する。この方法は、不適切な軽鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマに導入するもので、その軽鎖は抗体の重鎖と結合して混合生成物が生成されるが、該混合生成物の1つとして単価抗体が得られる。
しかし、さらに好ましくは本発明の単価脱グリコシル化抗体は下記の方法で調製される。この方法では適切な発現系、例えば、後述するような細胞系に、重鎖と軽鎖をコードする遺伝子、および重鎖の可変部領域および第一定常部領域を欠いた欠損重鎖をコードする遺伝子(すなわちこれらの各部のエキソンを欠く遺伝子)を導入する。この結果、該細胞系の生成物として次のものが混在したものが得られる。
(a)完全に2価抗体である抗体;
(b)2つの欠損重鎖(つまりFc断片)のみから成る抗体断片;および
(c)欠損重鎖と通常の重鎖に結合した軽鎖からなる、CD3抗原に対して単価な抗体断片。
上記(c)の抗体断片は、Fab′アームを1つだけ持つため、単価である。この方法によってこのような断片の形で単価抗体を生成することは、多くの理由から好ましい。すなわち、得られた抗体断片は、細胞系で生成された抗体混合物から精製することが容易である。なぜなら、例えば、分子量に基づいて簡単に分離できるからである。欧州特許出願第131424号の方法では生成された単価抗体は大きさや外見が2価抗体と似た性質を示すので、このような分離は不可能である。
また、新しい方法による単価抗体断片の生成では、より容易に調節可能な条件を用いるので、複雑な反応生成物の分離を要する酵素処理/化学的結合法ほど偶発的な方法ではない。さらなる利点は、使用する細胞系は単価抗体断片を生成し続けるため、酵素処理/化学的結合法のように合成操作を継続して行う必要がない点である。
本発明における脱グリコシル化抗体は自然界には存在せず、一般的にこの抗体は多数の方法で人工的に作ることができる。しかし、抗体に存在する重鎖と軽鎖の定常部と可変部の適切な遺伝子構築物を別々に得て、適した発現系に挿入するのが最も都合がよい。
望みの構造をしたリガンドの可変部をコードする遺伝子を生成し、部位特異的突然変異誘発を受けた抗体の定常部をコードする遺伝子と共有結合させる。これらの定常部遺伝子は、ハイブリドーマcDNAまたは染色体DNAより得られ、脱グリコシル化された定常部を生成するために(部位特異的な)突然変異誘発を受けている。可変部をコードする遺伝子は、本明細書中のCDRの同定に使用された遺伝子合成技術により作ることもできる。DNAの適切なクローニングベクターとしては様々なタイプのものを使用できる。
機能するCD3リガンドを生産するための、細胞系の培養におけるこれらの遺伝子の発現は、適切な原核細胞、または、真核細胞系、特にミエローマ細胞系のような不死化哺乳類細胞[例えば、YB2/3.01/Ag20(いかY0と呼ぶ)ラットミエローマ細胞や、チャイニーズハムスター卵巣細胞(植物細胞の使用も興味深い)]を様々な抗体領域を含む発現ベクターを用いて形質転換し、形質転換した細胞系を培養して望みの抗体を生産させることによって、最も都合よく得ることができる。本発明のリガンドを製造するために使用されるこのような一般的技術は、遺伝子工学の非常に重要な分野においてよく知られており、Sambrook,Fritsh,Maniatisらによる、“Molecular Cloning“(Cold Spring Harbor Laboratory、1989(第2版))などの刊行物に記載されている。これらの技術については、本明細書中の実施例においてさらに詳述する。
従って、本発明は、抗体の発現に影響を与えるために、抗体を発現できる細胞を培養する工程からなるCD3抗原に対する結合親和力を有する脱グリコシル化IgG抗体の調製法を含む。本発明は、本発明の脱グリコシル化抗体を発現可能な細胞系も含む。
そのような細胞系の中で望ましいのは、前述の望ましいCDRをコードするDNA配列を含むものである。前述のCDR(a)〜(f)をコードする塩基配列のグループは、以下にそれぞれ(a)〜(f)で示されている。しかし、遺伝子コードの縮重により、コードされるCDRのアミノ酸配列は変えることなく塩基配列のみが異なっている変異体も得られることは認識されるであろう。
そのような細胞系は特に、次のような配列からなる長いDNA配列を有する:
(1)ヒト重鎖の可変フレームワーク領域および(a),(b),(c)のうちの1つまたは複数を発現するDNA;
(2)ヒト軽鎖の可変フレームワーク領域および(d),(e),(f)のうちの1つまたは複数を発現するDNA。
その様なDNA配列の具体例としては、下記に示したような:
(1)前述のヒトVHIII型遺伝子VH26.D.J.にコードされる重鎖フレームワーク領域中に配列された(a),(b),(c)をコードしている配列;および
(2)ヒトVLλ型遺伝子SUTにコードされる軽鎖フレームワーク領域中に配列された(d),(e),(f)をコードしている配列;
がある。CDR配列(a),(b),(c),(d),(e),(f)には下線が引いてある。
もちろん、細胞系は重鎖と軽鎖の定常部を発現するDNA配列をも含んでいる。
本発明の、人体に適応させた脱グリコシル化抗体は治療用に用いることができる。特に、人体に適応し、且つヒトCD3抗原に特異性を持つような脱グリコシル化抗体は、免疫抑制のために適用できるという価値がある。特に、免疫抑制が持続性ではなく一過性のものであることが望まれ、従って、T細胞を完全に破壊するのではなくCD3抗原−TCR複合体による抗体防御によって機能させないようにすることが強く望まれる移植拒絶反応の場合の免疫抑制のために有用である。さらに、脱グリコシル化C3抗体は、治療剤の有効性がエフェクタ−細胞のFcを介した死またはFc受容体発現細胞の非特異的な死のそれぞれによって低下する可能性がある癌の治療において、特に(エフェクタ−細胞の最標的のための)2価抗体を作成したり、抗体−毒素結合体を生成したりするといったように、他の分野においても利用できる可能性を秘めている。
さらなる観点として、本発明は、癌患者、特に白血病患者を治療するための方法、または、例えば、移植拒絶反応が起こった場合に本発明の脱グリコシル化抗体を治療に有効な量だけ投与するといったような、免疫抑制のための方法を含む。
本発明の脱グリコシル化抗体は、生理学的に許容できる希釈剤または担体と共に患者に投与することによって処方することもできる。本発明の抗体を、無菌で発熱原を含まない希釈剤または担体と共に、注射によって投与するのが望ましい。処方の目安としては、抗体の適切な量を、例えば10日間にわたって毎日約1〜10mgを投与するのが望ましい。しかし、最初の用量に対する反応が低下したら、個々の患者の必要に応じて、より多量の抗体、例えば毎日100mgずつの抗体を投与することも可能である。家畜の場合は、同様にg/kgの単位で投与する。
本発明は、下記の実施例、および、以下に列記する実施例の解説図によって説明される。
図1−8:これらの図は、CD3抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる4人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体CDw52の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
図9−12:これらの図は、脱グリコシル化CD3抗体とグリコシル化CD3抗体を、混合リンパ球反応で比較したものである。マウスCD8抗原に特異的な脱グリコシル化抗体がネガティブコントロールとして含まれている。
図13&14:これらの図は、グリコシル化IgG型のCD3抗体と脱グリコシル化IgG型のCD3抗体の,エフェクター細胞再標的分析を比較した結果を示してある。CDw52抗体の結果が、ネガティブコントロールとして含まれている。
実施例
実施例1:ヒト可変フレームワーク領域に、YTH12.5ラット抗体由来のCDRを含んだヒトCD3抗原に特異的な脱グリコシル化抗体の調製
ヒトCD3抗原に特異的なYTH12.5ラット抗体のV領域遺伝子のクローニングと再編成は、Routledgeら.,1991,Eur.J.Immunol.,21,2717及び英国特許出願第9121126.8号とその対応出願に記載されている。YTH12.5は、CD3抗原複合体に特異的なIgG2bモノクローナル抗体を分泌している、ラットハイブリドーマ細胞系である。
簡単には、Orlandiら.,1989,PNAS USA,86,3833 の複製連鎖反応(PCR)を用いる方法に基づいて行った。VH遺伝子(重鎖可変部遺伝子)は、オリゴヌクレオチドプライマーVH1FORとVH1BACKを用いて単離した。PCR産物を、ベクター、M13−VHPCR1に挿入し、このベクターに6オリゴヌクレオチドプライマーを用いて部位特異的突然変異誘発を起こした。VH遺伝子(軽鎖可変部遺伝子)は、公知のVLλ塩基配列に基づいてデザインされたプライマーを用いて単離した。遺伝子を、M13−VKPCRに、ヒトλ軽鎖定常部遺伝子と共に、挿入した。このベクターにおいて、5オリゴヌクレオチドを用い、VLフレームワーク領域の突然変異誘発を行った。人体に適応させたVL遺伝子を発現ベクターpHβApr−1に挿入した。
再編成されたCD3VH3遺伝子が種々の異なる免疫グロブリンH鎖の定常部遺伝子と共に発現されるように、ベクター(p316)を作成した。このベクターはpHβApr−gptベクター(Gunningら.,1987,P.N.A.S.USA,85,7719−7723)に基づいている。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhft)遺伝子およびSV40の発現シグナル(Page&Sydenham,1991,Biotechnology,9,64)をもつDNAの1.65Kb断片を、pHβApr−gptのユニークなEcoRI部位へ挿入した。次ぎに、再編成されたCD3−VH遺伝子をコードする700bpのHindIII−BamHIDNA断片を、ベクターのβアクチンプロモーターの下流で制御を受けているマルチクローニングサイトに挿入した。任意のH鎖定常部遺伝子を(ゲノムの配置と一致するように)CD3−VH遺伝子の下流のユニークなBamHI部位に挿入した。
脱グリコシル化ヒトIgG定常部は、後述するようにTakahashiら(1982,Cell,29,671−679)により記載されている、野性型Glm(1,17)遺伝子に由来している。この遺伝子をベクター、M13 tg131にクローン化し、このベクターの297番目のアミノ酸残基をアスパラギンからアラニンへ変えるため、部位特異的突然変異誘発(Amersham International PLC)を行った。
アスパラギン297のオリゴ糖鎖は、正常なヒトIgG抗体(Kabatら.,1987,Sequence of Proteins of Immunological Interest,US Department of Helth Human Services Publication)の全てに特徴的なものであり、IgG分子の2つの重鎖のそれぞれが、アスパラギン残基のアミド基に結合した1箇所枝分かれした炭水化物基を有する(Rademacher and Dwek,1984,Prg.Immunol.,5,95−112)。アスパラギンをアラニンに置換すると、抗体のグリコシル化が防止される。
2.3Kbの脱グリコシル化IgG定常部を、BamHIとBglIIの二重制限酵素処理でM13から切り出してp316ベクターのBamHI部位へ挿入し、クローンp323を作成した。
dhfr-CHO細胞の準集密的(subconfluent)細胞単層を、重鎖遺伝子を含むp323ベクターと、再編成されたヒトλ軽鎖(Routledgeら.,1991,Eur.J.Immunol.,21,2717−2725)を含むp274ベクターとで同時にトランスフェクションした。トランスフェクションの前に、両プラスミドDNAを制限酵素PvuIで線状(linear)にした。トランスフェクションはDOTMA試薬(Boehringer,ドイツ)を用い、使用説明書に従って行った。
重鎖と軽鎖を含む形質転換体は、5%(v/v)透析ずみのウシ胎児血清(FCS)を含み、キサンチン/ヒポキサンチンを含まないIMDMで選択された。
野性型ヒトIgG−CD3重鎖ベクター、p278の類似体の作成方法は、種々の文献に記載されている(Routledgeら.,1991,Eur.J.Immunol.,21,2717−2725)。ヒトIgG2(Flanagan&Rabbitts,1982,Nature 300,709−713)、IgG3(Huckら.,1986,Nuc.Acid.Res.,14、1779−1789)、IgG4(Flanagan&Rabbitts,1982,Nature 300,709−713),イプシロン(ε)(Flanagan&Rabbitts,1982,EMBO.Journal 1,655−660)およびα−2(Flanagan&Rabbitts,1982,Nature 300,709−713)の定常部遺伝子の非変異体を有するH鎖発現ベクターは、p316ベクターから作成した(各々、ベクターp317,p318,p320,p321,p325)。軽鎖ベクターp274と結合したこれらベクターを、前述のdhfr-CHO細胞へ導入することにより、各々γ1、γ2、γ3、γ4、εおよびα−2のアイソタイプに対するCD3抗体を分泌する細胞系が作成された。CD3抗体を発現している細胞を用いて軟寒天中で2回クローニングを行い、その後回転式ボトル培養装置で大量培養を行った。各々の細胞系の約4リットルの組織培養上清から、免疫グロブリンを硫酸アンモニウム沈殿法によって採集し、PBS中で透析を行い、次の方法で定量した。
抗体の純度が高くないので、競合アッセイはCD3抗原への結合能力をもつ抗体の濃度を、特異的に定量することで行われた。ヒトT細胞未分化細胞を、UCTH−1ラベルされたFITC、すなわち、キメラパネルとしてCD3抗原の同じエピトープにして結合する抗体と共に、インキュベートした。使用するFITC試薬の濃度は、半飽和状態になるようあらかじめ定められた。ラベルされていないYTH12.5(HPLC精製)について、既知の出発濃度から滴定を行い、T細胞とUCTH−1を含んでいるウェルに加えた。未標識抗体は、抗原結合部位への競合体として機能する。これは、FACS分析を用いて細胞を分析する際に、平均の蛍光量が減少することによって検出された。よって、未知の出発濃度からのキメラ抗体の滴定を行い、平均蛍光を抗体の希釈に対してプロットすることで、シグモイド型曲線が得られた。これらは、YTH12.5の標準カ−ブと直接比較可能である。
実施例2:増殖分析
CD3抗体が溶液中のT細胞の増殖を支持する能力は、抗体のFc領域と補助細胞上のFc受容体との相互作用に関係している。
実施例1に示されたように調製された脱グリコシル化キメラCD3抗体を、可変部構造は同一であるがH鎖定常部(実施例1参照)は異なる他の一群のキメラ抗体と、ヒト末梢血液リンパ球の増殖促進力について比較した。健康な提供者の血液から得られたリンパ球を、リンホパーク勾配で分離、洗浄し、熱失活させたヒトAB血清を5%(v/v)含むIMDMに再懸濁し、CD3抗体の溶液をウェル中に含むプレ−トに5×104〜1×105細胞/ウェルになるよう播種した。培養3日後、細胞をトリチウムを含んだチミジンでパルスラベルし、6時間後に採集し、細胞の3H取り込みレベルを、シンチレーションカウンターで測定した。滴定された抗体に対する増殖反応を4人の血液提供者について調べた。5人目の提供者については、増殖反応は1μgについてのみ調べた。その結果は、図1〜8に示されている。
試験を行った提供者については、“野性型“の抗体は全てT細胞増殖を引き起こした。だが、変異型の脱グリコシル化IgG1アイソタイプは増殖促進作用を持たず、このことは炭水化物側鎖が重要な役割果たしていることを意味する。
別の実験では、溶液中CD3モノクロ−ナル抗体のパネルがT細胞増殖を促進する能力が、様々な人種の10人の提供者から得られたリンパ球を用いて調べられた。自然発生的アイソタイプはすべて、5%ヒトAB血清存在下で増殖を引き起こしたが、抗体により起こされた反応の程度は、T細胞の提供者によって異なった。一般的に、γ1、εモノクローナル抗体は増殖促進活性が最も高く、最も低濃度で細胞分化を起こし、γ3とγ2はこれらよりも活性が低い。γ1モノクローナル抗体の脱グリコシル化誘導体は、テストされたどの提供者においてもT細胞増殖を誘導せず、コントロールとして用いた非活性化性のモノクローナル抗体Campath−1Hと同様の反応を起こす、唯一のCD3抗体であった。α2とεの調製品においてみられた増殖を起こす原因が内毒素の混入である可能性を除くため、過剰量の脱グリコシル化CD3 mAbを加えると増殖を抑制できることを確認したが、このことは活性化の過程にCD3抗原が関与していることを意味する。
脱グリコシル化γ1CD3モノクローナル抗体に見られるような増殖促進活性の完全な欠失は、ECR活性レベル(後述の実施例5を参照)における順位を考慮すると驚くべきものである。この不活性化の原因は、おそらく、脱グリコシル化により増殖に必要な結合後の事象を誘導する能力を(例えば、モノクローナル抗体の2つ目の認識部位の破壊等によって)失ったことよりもむしろ、FcRに対する親和力が減少したことにある。このことは、IgGのない培地中でアッセイを行った場合、脱グリコシル化γ1 mAbはかなりの程度まで増殖を促進する、というような観察結果からも支持される。おそらく、T細胞と補助細胞との接触回数若しくは相互作用の強度には、増殖の開始前に越えていなければならない最小閾値があり、競合する免疫グロブリンが十分なレベルで存在する場合、脱グリコシル化γ1mAbによってはこの閾値を越えられないのであろう。
実施例3:混合リンパ球反応におけるキメラCD3抗体の影響
実施例1の脱グリコシル化IgG1Ag抗体が、混合リンパ球反応(MLR)においてT細胞増殖を抑制する能力があるかを調べるための一連の実験を行った。2つの実験の結果を図9乃至図12に示してある。
末梢血管リンパ球を2人の提供者から単離した。刺激細胞をセシウム照射した。照射された刺激細胞を加える前に、反応細胞集団を滴定された抗体と共に30分インキュベートした(図9、10、11)。反応細胞のコントロールウェルについても、各抗体条件の照射された反応細胞と共にインキュベートし、抗体の反応細胞に対する特異的な影響を調べた(図9、10、11)。
5日間インキュベーションした後、ウェルをトリチウムを含んだチミジンでパルスラベルし、6時間後に採集した。
脱グリコシル化抗体は確かに混合リンパ球反応を抑制する;抗体が滴定(希釈)されていくに従い、抑制効果が低下し、増殖が促進される。′野性型′IgG1は実際T細胞の***促進活性性を有するので、この反応においては、MCRの抑制は全く観察されない。
ネズミCD8抗原に特異的な′不適切な′脱グリコシル化抗体をネガティブコントロールとして使用した。この抗体は、予想通り、MCRにおいて何の影響も及ぼさなかった。
実施例4:IgG抗体のin vivoにおける効果
実施例1の脱グリコシル化抗体(IgG1Ag)を含むヒトCD3εサブユニットを遺伝子導入したマウスにおいて、キメラ抗ヒトCD3抗体を用いて、in vivo実験を行った。注射を一回行った後に、キメラCD3抗体がTNF因子放出を引き起こす能力を比較した。
この一連の実験で、注射前、関連したCD3抗体の10μg静脈注射後90分、4時間、の各時間にマウスから血清を採集した。5匹のマウスを1グループとし、各々のグループから血清を集め、プ−ルした。血清中のTNFレベルの分析が、Jean−Francois Bach教授の研究室で行われた。そこでは、L929マウス繊維芽細胞での血清に対する、TNF存在による細胞毒性の影響を測定するバオイオアッセイが用いられた。
結果は、下の表に示されている。
2種類のヒトIgG1の注射において、TNFレベルに有意な相違が観察される。脱グリコシル化型は、野性型IgG1またはIgG2抗体よりも、TNF放出が少なくとも8倍低い。
実施例2−4の結果は、脱グリコシル化CD3抗体は溶液中のT細胞に対する増殖促進因子ではないことを示しており、このことは、抗体の補助細胞のFc受容体と相互作用する能力が減少していることを示唆している。該抗体は、CD3抗体に特徴的な免疫抑制作用は保持している。in vivoでは、脱グリコシル化抗体がヒトCD3トランスジェニックマウスにおいて誘導する腫瘍破壊因子(TNF)の放出量は、元のIgG抗体の場合と比較して著しく少なかった。従って、もしマウスで観察されたようにヒトでもTNF放出量の減少が起こるならば、この薬剤は免疫抑制のための′改良型′CD3抗体として使用できるかもしれない。
実施例5:T細胞傷殺力を有するCD3抗体を検出するためのエフェクター細胞再標的分析(ECR)
この実験は、文献(Gillilandら.,1988,PNAS USA,85,4419)の記載に従って行い、「活性化T細胞をFcγRを産生している標的細胞にクロスリンクさせ、標的細胞の溶解を媒介する能力」がCD3モノクローナル抗体にあるかを測定した。簡単に述べると、Fcγ受容体がI、IIおよびIIIを発現しているヒト単核細胞U937を51Crクロム酸ナトリウム塩でラベルし、2×105細胞/mlになるように再懸濁した。これらの細胞を標的として用いた。ヒト末梢血液リンパ球を増殖促進CD3抗体によって活性化し続いてIL−2を含む培地で培養することによって生産したヒトT細胞未分化細胞をエフェクタ−細胞として用いた。分析を行う前に、それらを洗浄し、2×105細胞/mlの濃度で再懸濁した。精製キメラ抗体の調製液100μlをマイクロタイタープレートのウェル中で3倍希釈とした。エフェクター細胞および標的細胞を50μlずつ各々のウェルに加え、その混合物を37℃で4時間以上インキュベートした。この後100μlの上清を除去し、放出された51Crを測定した。各抗体の希釈液について二回ずつ実験を行った。
単核細胞系U937はヒトFc受容体を発現し、U937とT細胞未分化細胞とをクロスリンクできるCD3モノクローナル抗体存在下で、活性化ヒトT細胞未分化細胞によって溶解される。実施例1のヒトIg1G1抗体は脱グリコシル化した場合でも、少ないレベルではあるが、まだT細胞をU937細胞にクロスリンクさせ、T細胞の細胞毒性を再向させることができることが、実験結果(図13、14)によって示された。既知の公表デ−タから考えて、脱グリコシル化γ1モノクローナル抗体に媒介された効果的な殺傷現象は予想外であり、この結果は驚くべき発見であった。
炭水化物を除去することによって、このモノクローナル抗体は粘着性が特に増し、FcγRと相互作用せずにU937細胞と結合可能となったという可能性も考えられた。しかし、その後、脱グリコシル化γ1モノクローナル抗体がマウスL細胞標的(ヒトFcγRIを発現しているマウス細胞系)の破壊を媒介するか否かはトランスフェクトされたヒトFcγRI遺伝子の発現に依存していることが示され(結果は示していない)、このモノクローナル抗体はFcγRへの結合活性を有することが確認された。我々は、Fc−Fc受容体相互作用を検出するのにECR分析は特に感度の高い方法であると結論する。
ECRの結果より、IgGキメラ抗体の結合力の強さはγ2<γ3<Agγ1<γ4<γ1の順であることが示された。もし、抗体の増殖促進活性をFc受容体結合力から推定できるとすれば、T細胞増殖分析において上述の結合力順位付けが示されることを期待するであろう。しかし、この仮定は正しくない。すなわち、T細胞増殖実験(実施例1−3)における活性の順は、Agγ1<γ2<γ4<γ3<γ1であった。このことは、Fc−Fc受容体相互作用の測定結果から抗体の増殖促進性を単純に予想することはできないことを示している。ECRアッセイではあまり活性を示さなかったが、一定して高い増殖促進活性を示したεキメラ抗体の挙動からも、この見解が支持される。これにより、(U937細胞の例で示されたように)抗体は補助細胞上のFcγ受容体以外の何かと結合することによってT細胞を活性化しうる可能性が出てきた。つまり、Fcγ受容体へ結合することができないからといって、抗体が***促進活性を有しないとは限らないのである。
Claims (8)
- CD3に特異的に結合するヒト化脱グルコシル化IgG1抗体であって、
ヒト起源の、または、ヒト起源に由来する可変フレームワーク領域、及び、ヒト起源の、または、ヒト起源に由来する定常領域を有し、そして、
次のアミノ酸配列:
(a) Ser−Phe−Pro−Met−Ala (SEQ ID NO:1),
(b) Thr−Ile−Ser−Thr−Ser−Gly−Gly−Arg−Thr−Tyr−Tyr−Arg−Asp−Ser−Val−Lys−Gly (SEQ ID NO:2),
(c) Phe−Arg−Gln−Tyr−Ser−Gly−Gly−Phe−Asp−Tyr (SEQ ID NO:3),
を含む3つのCDRを有する重鎖、及び、
次のアミノ酸配列:
(d) Thr−Leu−Ser−Ser−Gly−Asn−Ile−Glu−Asn−Asn−Tyr−Val−His (SEQ ID NO:4),
(e) Asp−Asp−Asp−Lys−Arg−Pro−Asp (SEQ ID NO:5),
(f) His−Ser−Tyr−Val−Ser−Ser−Phe−Asn−Val (SEQ ID NO:6),
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有し、そして、重鎖CDRがリーダーから定常部の方向へ、(a)、(b)、(c)の順に配列されており、かつ、軽鎖CDRがリーダーから定常部の方向へ、(d)、(e)、(f)の順に配列されている、
ここにおいて、重鎖定常領域中のモチーフ アスパラギン297−X298−セリン若しくはスレオニン299(Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸を示す)が、抗体のN−結合グリコシル化を防ぐように、297番目のアスパラギンの他のアミノ酸による置換、又はX298のプロリンによる置換、又はセリン若しくはスレオニン299の他のアミノ酸による置換、によって変えられている、ヒト由来の重鎖定常領域を有し、そして、
重鎖可変部が、次のアミノ酸配列:
[化1]
Glu−Val−Gln−Leu−Leu−Glu−Ser−Gly−Gly−Gly−Leu−Val−Gln−Pro−Gly−Gly−Ser−Leu−Arg−Leu−Ser−Cys−Ala−Ala−Ser−Gly−Phe−Thr−Phe−Ser−Ser−Phe−Pro−Met−Ala−Trp−Val−Arg−Gln−Ala−Pro−Gly−Lys−Gly−Leu−Glu−Trp−Val−Ser−Thr−Ile−Ser−Thr−Ser−Gly−Gly−Arg−Thr−Tyr−Tyr−Arg−Asp−Ser−Val−Lys−Gly−Arg−Phe−Thr−Ile−Ser−Arg−Asp−Asn−Ser−Lys−Asn−Thr−Leu−Tyr−Leu−Gln−Met−Asn−Ser−Leu−Arg−Ala−Glu−Asp−Thr−Ala−Val−Tyr−Tyr−Cys−Ala−Lys−Phe−Arg−Gln−Tyr−Ser−Gly−Gly−Phe−Asp−Tyr−Trp−Gly−Gln−Gly−Thr−Leu−Val−Thr−Val−Ser−Ser (SEQ ID NO:11)
を含む重鎖可変部を有する、
前記脱グリコシル化IgG1抗体。 - 各定常領域重鎖の297番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基と置換された、請求項1に記載の脱グリコシル化IgG1抗体。
- アスパラギン残基がアラニン残基と置換された、請求項2に記載の脱グリコシル化IgG1抗体。
- ヒトCD3に特異的に結合する、請求項1又は2に記載の脱グリコシル化IgG1抗体。
- 次のアミノ酸配列:
[化2]
Asp−Phe−Met−Leu−Thr−Gln−Pro−His−Ser−Val−Ser−Glu−Ser−Pro−Gly−Lys−Thr−Val−Ile−lle−Ser−Cys−Thr−Leu−Ser−Ser−Gly−Asn−Ile−Glu−Asn−Asn−Tyr−Val−His−Trp−Tyr−Gln−Gln−Arg−Pro−Gly−Arg−Ala−Pro−Thr−Thr−Va1−Ile−Phe−Asp−Asp−Asp−Lys−Arg−Pro−Asp−Gly−Val−Pro−Asp−Arg−Phe−Ser−Gly−Ser−Ile−Asp−Arg−Ser−Ser−Asn−Ser−Ala−Ser−Leu−Thr−Ile−Ser−Gly−Leu−Gln−Thr−Glu−Asp−Glu−Ala−Asp−Tyr−Tyr−Cys−His−Ser−Tyr−Val−Ser−Ser−Phe−Asn−Val−Phe−Gly−Gly−Gly−Thr−Lys−Leu−Thr−Val−Leu (SEQ ID NO:16)
を含む軽鎖可変部を有する、請求項1又は2に記載の脱グリコシル化IgG1抗体。 - 片方のアームのみがCD3抗原に対する親和性を有する、請求項1又は2に記載の脱グリコシル化IgG1抗体。
- 単価抗体である、請求項6に記載の脱グリコシル化IgG1抗体。
- 半分が、完全な重鎖と軽鎖から成り、残りの半分が、類似しているが、軽鎖への結合部位を欠いている不完全な重鎖から成る、請求項7に記載の脱グリコシル化IgG1抗体。
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