JP4054025B2 - 脊髄小脳失調１型のための遺伝子配列および診断方法 - Google Patents

Description

政府の権利の陳述
本発明は、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により授与された、許可Ｎｏ．ＮＳ２２９２０および２７６９９の下に政府の支援でなされた。政府は本発明において確かな権利を有する。

発明の背景
動性の臨床的特徴をもつ、変性神経学的障害の異種グループである。臨床的症状は、失調、構語障害、眼球麻痺、および変化する程度の運動性衰弱を包含する。症状は通常生活の３０年または４０年の間に開始するが、若年の発症は同定された。典型的には、この病気は徐々に悪化し、発症後１０〜２０年に完全な不能および死をしばしば生ずる。しかしながら、若年性発症の脊髄小脳失調の個体は典型的には後期の発症の症例よりも急速な表現型の進行を有する。脊髄小脳失調を診断する方法はその処置に向かう有意なステップを提供するであろう。

脊髄小脳失調１型（ＳＣＡ１）は、ヒトの主要な組織適合性複合体（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｍｐｌｅｘ）（ＨＬＡ）への連鎖に基づく染色体６の短いアームに遺伝的に関係付づられる常染色体の優性の障害である。参照。例えば、Ｈ．Ｙａｕｋｕｒａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９１、１５４−１５５（１９７４）；およびＪ．Ｆ．Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９６、１１３８−１１４１（１９７７）。ＳＣＡ１は、ＨＬＡに対してテロメアの、染色体６の短いアーム上のマーカーＤ６Ｓ８９に密接に関連することが示された。参照、例えば、Ｌ．Ｐ．Ｗ．Ｒａｎｕｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、３１−４１（１９９１）；およびＨ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、２３−３０（１９９１）。最近、優性に遺伝された失調をもつ２つの家族はＨＬＡマーカーと検出可能な連鎖を示すことができなかったが、Ｄ６Ｓ８９に対する連鎖について研究したとき、ＳＣＡ１を有することが発見され、失調の家族の研究のための後者のマーカーの優秀性を示す。参照、例えば、Ｂ．Ｋｅａｔｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、９７２−９７７（１９９１）。ＳＣＡ１遺伝子の同定およびクローニングは、医学的処置をカウンセリングおよび計画している両方の家族について極めて価値がある検出方法を提供する。

発明の要約
本発明は、ＳＣＡ１遺伝子の中の高度に多形性のＣＡＧ反復領域を含有する染色体６の短いアームからの分離された１．２Ｍｂの領域の一部分に関する。このＣＡＧ反復領域は不安定（すなわち、集団内で高度に変動性）であり、そして常染色体優性神経変性障害の脊髄小脳失調１型をもつ個体において拡張される（すなわち、影響を受けた個体は一般に３６より多いＣＡＧ反復を有する）。ＣＡＧ反復領域のサザン分析およびＰＣＲ分析は、拡張された反復領域および障害の発症年齢（若年の場合において起こる、より大きいアレレ、すなわち、より多い反復単位を伴う）と、障害の重症度（より多い重症の症例において起こる、より大きいアレレ、すなわち、より多い反復単位を伴う）との間の相関を証明する。

詳しくは、本発明は、染色体６の短いアーム内に位置する分離常染色体優性脊髄小脳失調１型遺伝子（ここにおいて「ＳＣＡ１」と呼ぶ）のＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子を提供する。ＳＣＡ１遺伝子はここにおいて「アタクシン−１」と呼ぶタンパク質をエンコードする領域を含有する。本発明の核酸分子は一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドであることができる。それは分離ＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含むかぎり、任意の大きさのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡであることができる。好ましくは、核酸分子はＳＣＡ１コーディング領域を含み、そして約２．４〜１１ｋｂの長さを有する。それは全体のＳＣＡ１遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはその転写体であるかどうかにかかわらず）またはその遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有するその任意の断片であることができる。１つのこのような断片はＳＣＡ１遺伝子のＥｃｏＲＩ断片、すなわち、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ制限酵素を使用する消化により得られ、多形性ＣＡＧ反復領域をその中に有する約３３６０塩基対を含有する断片である。多形性ＣＡＧ反復領域とは、ＣＡＧトリヌクレオチドの数を変化することができる遺伝子のこの部分の中に反復するＣＡＧトリヌクレオチドが存在することを意味する。トリヌクレオチドの数は、例えば、１９程度に少なくから、例えば、８１程度およびそれより大きい程度に変化することができる。

正常の個体について、（ＣＡＧ）_n 領域においてｎ≦３６、すなわち、ｎ＝２〜３６、典型的にはｎ＝１９〜３６である。ＳＣＡ１遺伝子の正常のアレレにおけるこの領域は必要に応じてＣＡＴトリヌクレオチドで中断されている。典型的には、任意の（ＣＡＧ）_n 領域内に、約３以下のＣＡＴトリヌクレオチドが個々にまたは組み合わせで存在する。この分離配列の（ＣＡＧ）_n 領域は不安定であり、すなわち、集団内で高度に変動性であり、そしてこの病気の症状を有するか、あるいはこの病気の症状を発生する可能性のある個体において、より大きい、すなわち、拡張されている。影響を受けた個体、すなわち、ＳＣＡ１遺伝子の影響を受けたアレレをもつ個体について、（ＣＡＧ）_n 領域においてｎ＞３６、典型的にはｎ≧４３である。ＳＣＡ１遺伝子の１つの分離ＤＮＡ分子は、第１図に示すように約３３６０塩基対の長さである。いくつかの影響を受けた個体のＳＣＡ１遺伝子内のＥｃｏＲＩ断片の一部分の配列は第２図に示されている。ＳＣＡ１遺伝子の転写体の全体の１０，６６０は第１５図に示されている（全体のＳＣＡ１遺伝子はゲノムＤＮＡの約４５０ｋｂに及ぶ）。

本発明は、また、分離オリゴヌクレオチド、特にＰＣＲ技術において使用するためのプライマーおよび神経変性障害ＳＣＡ１を診断するためのプローブに関する。これらのオリゴヌクレオチドは少なくとも約１１のヌクレオチドを有し、そして分離ＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子にハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションはＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子の任意の部分に対して起こることができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＣＡＧ反復領域を有するＳＣＡ１遺伝子の３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片にハイブリダイゼーションする。換言すると、各オリゴヌクレオチドはＣＡＧ反復領域、すなわち、（ＣＡＧ）_n 領域を有するヌクレオチド配列に対して、好ましくはＳＣＡ１遺伝子の３．３６ｋｂｐＥｃｏＲＩ断片に対して実質的に相補的である（６５％より大きい相同性を有する）。オリゴヌクレオチドがプライマーである場合、分子は好ましくは少なくとも約１６のヌクレオチドおよび約３５以下のヌクレオチドを含有する。さらに、好ましいプライマーは、それらが約７０〜３５０塩基対、好ましくは約１００〜３００塩基対のプライムド（ｐｒｉｍｅｄ）生成物を生成するように、選択される。より好ましくは、プライマーは、ヌクレオチド配列が（ＣＡＧ）_n 領域に隣接するものを包含する、（ＣＡＧ）_n 領域のいずれかの側の約１５０ヌクレオチド内の影響を受けたアレレまたは正常のアレレの部分に対して相補的である。より好ましくは、プライマーは、ＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴ（ＣＡＧ−ａ）、ＣＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＣ（ＣＡＧ−ｂ）、ＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＣＧＴＡＣ（Ｒｅｐ−１）、ＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧ（Ｒｅｐ−２）、ＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣ（ＧＣＴ−４３５）、ＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧ（ＧＣＴ−２１４）、ＣＴＣＴＣＧＧＣＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧ（Ｐｒｅ−１）、およびＧＴＡＣＧＴＣＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴ（Ｐｒｅ−２）から成る群より選択される。これらのプライマーは第３図に示すものに実質的に相当する。

それらは、種々のＰＣＲ技術を使用して、増幅された核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子を配列決定または生成するための任意の組み合わせにおいて使用することができる。好ましくは、ＳＣＡ１の障害の特徴を示すＤＮＡ分子の増幅のために、Ｒｅｐ−１およびＲｅｐ−２は使用するプライマーの対である。ここにおいて使用するとき、用語「増幅されたＤＮＡ分子」はＤＮＡの一部分およびその相補的配列のコピーであるＤＮＡ分子を意味する。コピーはヌクレオチド配列がもとのＤＮＡ配列およびその相補的配列に相当する。用語「相補的」は、ここにおいて使用するとき、特定のＤＮＡ配列に対して相補的である（６５％より大きい相同性を有する）ＤＮＡ配列を意味する。用語「プライマーの対」は、ここにおいて使用するとき、増幅すべきＤＮＡ分子の５’末端とハイブリダイゼーションする５’上流のプライマーおよび増幅すべきＤＮＡ分子の３’末端の補体とハイブリダイゼーションする３’下流のプライマーを包含するプライマーの組を意味する。

本発明のプライマーを使用して、約３６より大きいＣＡＧの反復するトリヌクレオチド、好ましくは少なくとも４３の反復するＣＡＧトリヌクレオチドの領域を検出することによって、神経学的障害のＳＣＡ１の診断においてＰＣＲ技術を使用することができる。一般に、これは反復するＣＡＧコドンの領域を含有するＤＮＡ分子の別々の相補的鎖をモル過剰量の２つのオリゴヌクレオチドのプライマーで処理し、前記プライマーを伸長させて、ＣＡＧ反復単位を含有する所望の分子を合成するための鋳型として作用する相補的プライマー伸長生成物を形成し、そしてそのように増幅された分子を検出することを包含する。

ＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子を同定するための遺伝子プローブとして使用できるオリゴヌクレオチドが、また、提供される。遺伝子プローブはＳＣＡ１遺伝子の正常のアレレとより大きい影響を受けたアレレとの間を区別するために使用できる。遺伝子プローブは、それに対して相補的である、ＳＣＡ１遺伝子それ自体のヌクレオチド配列の一部分（例えば、３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片またはその一部分）であることができるか、あるいはそれにまたは補体にハイブリダイゼーションすることができる。それは安定な二重らせんを形成するために、すなわち、少なくとも約１１のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００のヌクレオチド（有効なサザンブロッティングのために）、そして最も好ましくは少なくとも約２００のヌクレオチドを有するために適当な大きさである。プローブは（ＣＡＧ）_n 領域の任意の部分を含有することができるが、これは要件ではない。しかしながら、プローブは（ＣＡＧ）_n 領域のいずれかの側に核酸分子の一部分を含有するすることが望ましい。一般に、このようなプローブのために最大の大きさの制限は存在しない。事実、全体のＳＣＡ１遺伝子はプローブであることができるであろう。

本発明の遺伝子プローブは、患者をＳＣＡ１について診断するために使用可能である。特に好ましい診断方法は、ＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有するＤＮＡ分子の存在を検出することを包含する。詳しくは、この方法はゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡ断片をつくり；好ましくはゲル電気泳動を使用して大きさにより断片を分離し；前記ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション条件下に検出可能に標識化された遺伝子プローブでプロービングし、前記プローブは分離ＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子にハイブリダイゼーションし；前記ＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡを検出し；そしてＳＣＡ１遺伝子の正常の形態または影響を受けた形態の特徴を示す（ＣＡＧ）_n 領域についてＤＮＡ断片を分析する；ステップを包含する。

本発明は、また、ＳＣＡ１遺伝子によりエンコードされるタンパク質（またはその部分）およびタンパク質またはその部分から生産された抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を提供する。抗体はＳＣＡ１遺伝子により発現される抗原性タンパク質を単離する方法において使用することができる。例えば、それらは抗原性タンパク質を含有する生物学的試料に添加して抗体−抗原の複合体を形成し、この複合体は試料から単離しそして抗原性タンパク質のアミノ酸の配列決定に暴露することができる。これはタンパク質がまだ抗体と複合化されている間に実施することができる。
こうして、本発明は、ＲＮＡまたはＤＮＡに基づくことができる検出方法（好ましくは、この方法はゲノムＤＮＡを単離しそして分析することを包含する）に基づくか、あるいはタンパク質に基づく検出方法に基づくことができる、ＳＣＡ１遺伝子の影響を受けた形態の存在または不存在を決定する方法を提供する。これらの方法は、例えば、ＰＣＲに基づく方法、直接核酸配列決定、発現されたｍＲＮＡの量の測定または発現されたアタクシン−１タンパク質の量の測定によるＳＣＡ１遺伝子の発現の測定を包含する。本発明の方法は、また、核酸またはアミノ酸分子の反復領域の大きさを検出する方法を包含する。

ここにおいて使用するとき、用語「分離（および精製）」は、核酸分子、遺伝子、またはオリゴヌクレオチドがヒトゲノムの残部および連合した細胞または他の不純物を本質的に含有しないことを意味する。これは生産物がヒトゲノムから抽出されてしまわなくてはならないことを意味しない；むしろ、生産物は、例えば、合成またはクローニングされた生産物であることができる。ここにおいて使用するとき、用語「核酸分子」は任意の一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを意味する。

ここにおいて使用するとき、用語「ＳＣＡ１遺伝子」は不安定のＣＡＧ反復領域を含有する約４５０ｋｂ（１０．５〜１１ｋｂの転写体）のマーカーＤ６Ｓ８９およびＤ６Ｓ２７４の間において染色体６の短いアーム内に位置するデオキシリボポリヌクレオチドを意味する。したがって、この用語はＣＡＧ反復領域の含量を除外して実質的に同一である多数の独特遺伝子を意味する。正常の個体についてＳＣＡ１遺伝子転写体の代表的な例は第１５図に示す。この用語の範囲内に、また、タンパク質アタクシン−１をエンコードする０、１または２以上のヌクレオチドの置換を含有する任意のリボ−またはデオキシリボポリヌクレオチドが包含される。用語「ＳＣＡ１遺伝子」内に、多形性ＣＡＧ反復領域の中に異なる数のＣＡＧおよび／またはＣＡＴの反復を有する前の文章の中に記載されている任意のポリヌクレオチドが包含される。また、用語「ＳＣＡ１遺伝子」はポリペプチドをエンコードする領域およびＳＣＡ１のためのｍＲＮＡの５’および３’非翻訳セグメントをエンコードする領域の両方を包含することが理解される。ここに記載するＳＣＡ１遺伝子はヒトゲノムで記載されるが、他の哺乳動物、例えば、マウスは、また、オリゴヌクレオチドの生成に使用できる、例えば、ヒトにおけるＳＣＡ１の障害の診断において有用である、ＣＡＧ反復領域を含有する非常に類似する遺伝子を有することができることが考えられる。

ここにおいて使用するとき、用語「アタクシン−１」はＳＣＡ１遺伝子の遺伝子生産物、すなわち、ＳＣＡ１遺伝子のオープンリーディングフレームによりエンコードされるタンパク質および、前記オープンリーディングフレームによりエンコードされる、各インフレームのＡＴＧ翻訳開始部位において開始する異なる長さ（例えば、２０〜９０ｋＤ、好ましくは６０〜９０ｋＤ）のすべてのタンパク質を包含する、それらに対して実質的に同等の任意のタンパク質を意味する。用語「アタクシン−１」は、さらに、本質的に同一のＮ−末端およびＣ−末端の配列をもつが、多形性反復領域の中に異なる数のグルタミン（Ｑ）および／またはヒスチジン（Ｈ）の反復（主としてグルタミンの反復）をもつすべてのタンパク質を包含する。

ここにおいて使用するとき、用語「多形性ＣＡＧ反復領域」または単に「ＣＡＧ反復領域」は、個々のアレレから個々のアレレで数が変化し、そして２〜８０またはそれ以上の数の範囲であることができる、ポリグルタメート残基のストリングをエンコードするＳＣＡ１遺伝子の領域を意味する。そのうえ、多形性ＣＡＧ反復領域はＣＡＧの代わりにＣＡＴ（ヒスチジンをエンコードする）を含有できるが、ＣＡＴはこの領域において非常にまれである。ＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子について言及するとき、これは対応するＧＵＣ反復領域を含有するＲＮＡ分子を包含することを理解すべきである。

ここにおいて使用するとき、「影響を受けた」遺伝子は、個体の中に存在するとき、脊髄小脳失調１型の原因であるＳＣＡ１遺伝子のアレレを意味し、そして「影響を受けた」個体は常染色体優性脊髄小脳失調１型の症状を有する。「正常の」ＳＣＡ１遺伝子のみをもつ個体はＳＣＡ１の症状をもたない。用語「アレレ」はコーディング領域に関連する遺伝的異形；すなわち、遺伝子の別の形態を意味する。

ここにおいて使用するとき、「ハイブリダイゼーションする」は、オリゴヌクレオチドが標準の条件下にストリンジェンシイ標的核酸分子と非共有結合の相互作用を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドは、非共有結合の相互作用の形成を妨害しない非ハイブリダイゼーションヌクレオチド、例えば、クローニングを促進する制限酵素認識部位を含有することができる。

詳細な説明
遺伝的および物理的マッピングの方法を使用してＳＣＡ１を局在化するために、実質的な努力がなされてきた。一般に、ＳＣＡ１はほぼ０．０８（セントレ・ドエチュデ・ヅ・ポリモーフィズメ・ヒューメイン（Ｃｅｔｅｒ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ）（ＣＥＰＨ）の参照家族を使用するマーカー−マーカーの距離に基づく）の組換え画分においてＤ６Ｓ８８によりセントロメア側でおよび０．１９の組換え画分においてＦ１３Ａによりテロメア側でフランキングされる。参照、Ｌ．Ｐ．Ｗ．Ｒａｎｕｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、３１−４１（１９９１）。両方のマーカーは非常に離れており、そしてＳＣＡ１遺伝子のクローニングを目標とした努力における使用のために実際的ではない。Ｄ６Ｓ８９マーカーはＳＣＡ１遺伝子により密接してマッピングする。

ＳＣＡ１をいっそう正確に局在化するために、Ｄ６Ｓ８９付近の５つのジヌクレオチドの多形性を同定した。新しいマーカーのＡＭ１０ＧＡは、ＳＣＡ１遺伝子との組換えがないことを証明する。連鎖の分析および組換え事象の分析は、セントロメアの末端における他方のフランキングマーカーとしてＤ６Ｓ１０９とともにＤ６Ｓ８９に対してセントロメアにマッピングすることを確証し、そして次の順序を確立する：セントロメア−Ｄ６Ｓ１０９−ＡＭ１０ＧＡ／ＳＣＡ１−Ｄ６Ｓ８９−ＬＲ４０−Ｄ６Ｓ２０２−テロメア。２つのフランキングマーカーＤ６Ｓ１０９およびＤ６Ｓ８９の間の遺伝的距離は、セントレ・ドエチュデ・ヅ・ポリモーフィズメ・ヒューメイン（Ｃｅｔｅｒ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ）（ＣＥＰＨ）からの４０の参照家族を使用する連鎖の分析に基づいて約６．７ｃＭである。

Ａ．ＳＣＡ１遺伝子および診断の方法
ＳＣＡ１座を含有する染色体６の短いアーム上の候補の大きさは約１．２Ｍｂであり、そしてＤ６Ｓ２７４によりセントロメア側にそしてＤ６Ｓ８９によりテロメア側にフランキングされる。ＳＣＡ１遺伝子はゲノムＤＮＡの４５０ｋｂをスパンし、そして９エクソンにおいて構成される（第１５図は正常の個体からのＳＣＡ１遺伝子の代表である）。ＳＣＡ１転写体（すなわち、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのクローン）は約１０．６〜１１ｋｂである。この遺伝子は正常のおよび影響を受けた両方のアレレにおいて転写される。この遺伝子は５’−非翻訳領域において７つのエクソン、２４４８ｂｐのコーディング領域を含有する２つの大きいエクソン（２０８０ｂｐおよび７８０５ｂｐ）、および７２７７ｂｐの３’−非翻訳領域を含有することにおいて、この遺伝子の構造は独特である。最初のコーディングエクソンは、いくつかの組織において広範な代替スプライシングを行う。

ＳＣＡ１についての遺伝子は、候補の領域を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化させることによって生成された３．３６ｋｂの断片内に位置する、高度に多形性のＣＡＧ反復を含有する。ＣＡＧ反復領域は好ましくはコーディング領域内に横たわり、そしてポリグルタミンをコードする。（ＣＡＧ）_n 反復のサザン分析およびＰＣＲ分析は、反復の拡張の大きさとＳＣＡ１の発症年齢および障害の重症度との間の相関を証明する。すなわち、より多い反復単位（またはより長い反復路）をもつ個体は早い発症年齢およびいっそう重症の病気の過程の両方を有する傾向がある。これらの結果が証明するように、ＳＣＡ１は脆弱Ｘ症候群、筋ジストロフィー、Ｘ染色体連鎖脊髄延髄筋萎縮、およびハンチントン病は、不安定のトリヌクレオチドの反復の拡張を包含する突然変異の機構を表す。

ＳＣＡ１に関連するトリヌクレオチドの反復の拡張の同定は、病気の改良された診断を可能とする。こうして、本発明はＳＣＡ１のための遺伝子およびそれによりエンコードされるタンパク質に関することに加えて、また、ＳＣＡ１を診断する方法に関する。これらの診断方法はＤＮＡの特定の断片を検出する任意の既知の方法を包含することができる。これらの方法は、例えば、ＤＮＡの直接的検出あるいはＲＮＡまたはタンパク質の検出による間接的検出を包含することができる。例えば、標識化プローブを使用するサザンまたはノザンブロッティングハイブリダイゼーション技術を使用することができる。あるいは、ＥｃｏＲＩ断片のＣＡＧ反復領域を増幅する新規なプライマーとともにＰＣＲ技術を使用することができる。また、ＣＡＧ反復の数を決定する直接的方法として、核酸の配列決定を使用することができる。

例えば、ＳＣＡ１遺伝子の影響を受けたアレレのＤＮＡセグメントを同定するために、ＤＮＡプローブを使用することができる。ＤＮＡプローブは、同定しようと探求する遺伝子から誘導された相補的一本鎖ＤＮＡとハイブリダイゼーションするか、あるいは非共有結合的に結合する、標識化一本鎖ＤＮＡのセグメントである。このプローブは、放射性および非放射性標識を包含する、当業者に知られている任意の適当な標識で標識化することができる。典型的な放射性標識化は、³²Ｐ、¹²⁵ Ｉ、³⁵Ｓなどを包含する。非放射性標識は、例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニンのようなリガンドならびにホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵素、あるいはルシフェリンのような種々の化学発光性物質、あるいはフルオレセインおよびその誘導体のような蛍光性化合物を包含する。また、プローブは両端において異なる型の標識で分離が容易であるように、例えば、一方の末端にアイソトープの標識および他方の末端にビオチン標識を使用することによって標識化することができる。

ＤＮＡプローブ分析を使用して、酵素的消化、分画、およびＳＣＡ１座を含む、染色体６の短いアームからのＤＮＡ含める、多数の異なる遺伝子からのＤＮＡを取り込んだ複雑な混合物を生ずるゲノムＤＮＡの変性により、標的ＤＮＡを誘導することができる。特定のＤＮＡ遺伝子のプローブはその標的遺伝子または遺伝子断片から誘導されたＤＮＡとのみハイブリダイゼーションし、そして生ずる複合体をこの分野において知られている技術により単離および同定することができる。

一般に、ＳＣＡ１遺伝子内に位置するＤＮＡ配列の存在を検出するために、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡ断片を得る。試験すべきゲノムＤＮＡ源はＤＮＡを含有する任意の生物学的検体であることができる。例は血液、***、膣スワブ、組織、毛髪、および体液の検体を包含する。制限エンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ＤＮＡの断片にゲノムＤＮＡを切断する任意のものであることができる。多数のエンドヌクレアーゼの特異性はよく知られており、そして種々の刊行物、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク（１９８２）の中に見出すことができる。そのマニュアルの全体をここに引用によって加える。好ましい制限エンドヌクレアーゼ酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＴａｑＩ、およびＢｓｔＮＩを包含する。ＥｃｏＲＩは特に好ましい。

あるいは、病気の診断は新規なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応の配列の増幅法（ＰＣＲ）の使用を包含することができる。米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７年７月２８日発行）は、核酸配列を増幅し、検出しおよび／またはクローニングする方法を記載している。この方法は、抽出したＤＮＡを処理して一本鎖の相補的鎖を形成し、ＤＮＡの別々の相補的鎖を２つのオリゴヌクレオチドのプライマーで処理し、プライマーを伸長して所望の核酸分子を合成するための鋳型として作用する相補的伸長生成物を形成し；そして増幅された分子を検出することを包含する。さらに詳しくは、ＤＮＡをプライマーで処理しそしてプライマーを伸長する方法のステップは次のステップを包含する：１対のオリゴヌクレオチドのプライマーを添加し、ここでこの対の一方のプライマーはセンス鎖の中の配列の部分に対して実質的に相補的でありそして各対の他方のプライマーは相補的アンチセンス鎖の中の同一配列の異なる部分に対して実質的に相補的であり；対のプライマーを相補的分子にアニーリングし；アニーリングしたプライマーを各プライマーの３’末端から同時に伸長して各プライマーにアニーリングされた鎖に対して相補的な生成物を合成し、ここで補体から分離後の伸長生成物は各対の他方のプライマーのための伸長生成物の合成のための鋳型として作用し；そして前記伸長生成物を分離して一本鎖の分子を生成する。この方法の変法は米国特許第４，６８３，１９４号（Ｓａｉｋｉら、１９８７年７月２８日発行）に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応の配列の増幅は、また、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、１３５０−１３５４（１９８５）およびＳｃｈａｒｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４、１６３−１６６（１９８６）に記載されている。これらの参考文献の各におけるこれらの技術の説明をここに引用によって加える。

プライマーは、染色体６の短いアームＳＣＡ１座のＣＡＧ反復トリヌクレオチドを含有するＤＮＡ配列の領域に対して相補的な生成物の合成の開始点として作用することができる、合成であるか、あるいは天然に見出されるオリゴヌクレオチドである。プライマーは、（ＣＡＧ）_n 領域を有するＳＣＡ１遺伝子の断片（好ましくは３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片）の影響を受けたまたは正常のアレレの鎖の一部分に対して実質的に相補的なヌクレオチドを包含する。プライマーの配列は、少なくとも約１１のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１６のヌクレオチドそして約３５以下のヌクレオチドを有する。プライマーは、それらが約７０〜３５０塩基対、好ましくは約１００〜３００塩基対のプライムド生成物を生成するように選択される。より好ましくは、プライマーはヌクレオチド配列が、（ＣＡＧ）_n 領域に直接隣接するものを包含する、（ＣＡＧ）_n 領域のいずれかの側の約１５０のヌクレオチド内の影響を受けたまたは正常のアレレの鎖の一部分に対して実質的に相補的であるように、選択される。

好ましいプライマーの例は、第３図において矢印をもつ実線により示されている。こうして、プライマーはＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴ（ＣＡＧ−ａ）、ＣＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＣ（ＣＡＧ−ｂ）、ＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＣＧＴＡＣ（Ｒｅｐ−１）、ＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧ（Ｒｅｐ−２）、ＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣ（ＧＣＴ−４３５）、ＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧ（ＧＣＴ−２１４）、ＣＴＣＴＣＧＧＣＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧ（Ｐｒｅ−１）、およびＧＴＡＣＧＴＣＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴ（Ｐｒｅ−２）から成る群より選択される。このプライマーは種々の組み合わせで使用することができるか、あるいはＣＡＧ反復領域を有するＳＣＡ１遺伝子の断片（好ましくは３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片）のＤＮＡの一部分にハイブリダイゼーションするように設計することができる任意の他のプライマーとともに使用することができる。例えば、Ｒｅｐ−２と標識するプライマーはＣＡＧ−ａと標識するプライマーと組み合わせることができ、そしてＣＡＧ−ｂと標識するプライマーはＲｅｐ−１と標識するプライマーと組み合わせることができる。より好ましくは、プライマーは、例えば、ＣＡＧ−ａ／ＣＡＧ−ｂ、Ｒｅｐ−１／Ｒｅｐ−２、Ｒｅｐ−１／ＧＣＴ−４３５と表示するプライマー対の組である。これらのプライマーの組はＰＣＲ技術を使用して問題のＣＡＧ反復単位を首尾よく増幅する。あるいは、それらは種々の既知の技術において使用してＳＣＡ１遺伝子を配列決定することができる。

前述したように、他の診断方法を同様によく使用することができる。それらはゲノムＤＮＡ（ＣＡＧ反復領域）、ｃＤＮＡ（ＣＡＧ反復領域）、ｍＲＮＡ（ＧＵＣ反復領域）、およびタンパク質生成物（グルタミン反復領域）の反復領域の分離および同定に基づく。これらは、例えば、種々の電気泳動技術を使用してＳＣＡ１遺伝子のヌクレオチド配列の中のわずかの変化を検出することを包含する。それ以上の非限定的例は、変性勾配電気泳動、一本鎖コンフォメーション多形性ゲル、および非変性ゲル電気泳動技術を包含する。

ＳＣＡ１遺伝子のマッピングおよびクローニングは、簡単な血液の試験を使用する優性に遺伝した失調の１つの型の基準の診断を可能とする。これは優性の失調の明白な分子の分類に向かう第１ステップを表す。臨床的症状が病気のＳＣＡ１形態と非ＳＣＡ１形態との間で広範にオーバーラップするので、失調の簡単なかつ信頼性ある分類系は重要である。さらに、既知のＳＣＡ１の突然変異のみについての分子の試験は、既知のＳＣＡ１の家族における病気の前徴の診断を可能とし、そして病気の家族の歴史が存在しない散発性または分離ＣＡＧ反復の拡張の同定を可能とする。こうして、本発明は家族のカウンセリング、医学的処置の計画において、および未知の病因学の失調の患者の標準の精密検査において使用することができる。

Ｂ．クローニング
適当な複製可能なベクターの中へのＳＣＡ１ＤＮＡのクローニングは、遺伝子産物のアタクシン−１の発現を可能とし、そしてそれ以上の遺伝子操作のためにＳＣＡ１遺伝子を利用可能とする。アタクシン−１またはその部分の発現は有用である。なぜなら、これらの遺伝子産物はいっそう詳しく後述するように抗原として使用して抗体を生成することができるからである。

１．ＤＮＡの分離
ＳＣＡ１遺伝子を含有するＤＮＡは、ＳＣＡ１ｍＲＮＡを有しかつ検出可能なレベルでそれを発現すると信じられる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーはヒト胎児の脳または大人の小脳からのものである。必要に応じて、ＳＣＡ１遺伝子はゲノムＤＮＡライブラリーから得るか、あるいは完全なヌクレオチドまたはアミノ酸の配列からのｉｎ ｖｉｔｒｏのオリゴヌクレオチド合成により得ることができる。

問題の遺伝子またはそれによりエンコードされるタンパク質を同定するように設計された適当なプローブで、ライブラリーをスクリーニングする。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーについて、適当なプローブは同一であるか、あるいは異なる種からのＳＣＡ１ｃＤＮＡの既知の部分または疑われる部分から成るオリゴヌクレオチド；および／または同一または類似の遺伝子から成る相補的または相同的ｃＤＮＡまたはその断片を包含する。必要に応じて、ｃＤＮＡの発現ライブラリー（タンパク質を発現する）について、適当なプローブはＳＣＡ１遺伝子産物、アタクシン−１を認識しそしてそれに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を包含する。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために適当なプローブは、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、または同一または同様な遺伝子から成るその断片、および／または相同性ゲノムＤＮＡまたはその断片を包含するが、これらに限定されない．選択したプローブを使用するｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーのスクリーニングは、標準の手順を使用して達成することができる。

プローブとして合成オリゴヌクレオチドを使用するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、本発明を実施する好ましい方法である。プローブとして選択したオリゴヌクレオチドの配列は、誤った陽性物質を最小とするために十分な長さを有しかつ十分に明瞭であるべきである。１または２以上のプローブの１または２以上の実際のヌクレオチド配列は、通常、最少のコドンの重剰性を有するＳＣＡ１遺伝子の領域に基づいて設計される。オリゴヌクレオチドは１または２以上の位置において縮重することがある、すなわち、２またはそれ以上の異なるヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの中に所定の位置に取り込まれ、多数の合成オリゴヌクレオチドを生ずることがある。縮重オリゴヌクレオチドの使用は、優先的コドンの使用が知られていない種からライブラリーをスクリーニング場合、特に重要である。

スクリーニングされるライブラリーの中のＤＮＡへのハイブリダイゼーションに基づいてオリゴヌクレオチドを検出できるように、オリゴヌクレオチドを標識化することができる。標識化の好ましい方法は、ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを使用してオリゴヌクレオチドの５’末端を放射線標識化することである。しかしながら、他の方法を使用してオリゴヌクレオチドを標識化することができ、このような方法はビオチニル化または酵素の標識化を包含するが、これらに限定されない。

遺伝子産物、アタクシン−１のための完全なコーディング領域を含む、全長のｍＲＮＡ転写体をエンコードするＳＣＡ１核酸は特に重要である。完全なコーディング領域を含有する核酸は、推定されたアミノ酸配列を使用して選択したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。

ＳＣＡ１遺伝子を分離する別の手段はＰＣＲの方法を使用することである。ＰＣＲプライマーのオリゴヌクレオチドの選択のための戦略を後述する。

２．ベクターの中へのＤＮＡの挿入
ＳＣＡ１遺伝子を含有する核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、それ以上のクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、あるいは遺伝子産物、アタクシン−１の発現のために、好ましくは複製可能なベクターの中に挿入される。多数のベクターが入手可能であり、そして適当なベクターの選択は次に依存するであろう：１）それをＤＮＡの増幅またはＤＮＡ発現のために使用するかどうか；２）ベクターの中に挿入すべき核酸の大きさ；および３）ベクターで形質転換すべき宿主細胞。大部分の発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少なくとも１つのクラスの生物の中で複製することができるが、発現のために他の生物の中にトランスフェクションすることができる。例えば、ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中にクローニングし、次いで同一ベクターが宿主細胞の染色体に対して独立に複製することができきなくてさえ、それを発現のために酵母または哺乳動物細胞の中にトランスフェクションされる。各複製可能なベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合性である宿主細胞に依存して種々の構造成分を含有する。これらの成分は下に詳述する。

適当なベクターの構成は、この分野において知られている標準の結合技術を使用する。分離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、製造し、そして要求されるプラスミドを発生させるために望む形態で再結合する。典型的には、結合混合物を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）を形質転換し、そして適当ならばアンピシリンまたはテトラサイクリンの耐性により有望な形質転換体を選択する。形質転換体からのプラスミドを製造し、制限エンドヌクレアーゼの消化により分析し、および／またはこの分野において知られている方法により配列決定する。参照、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、９、３０９（１９８１）およびＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５、４９９（１９８０）。

必要に応じて、ＤＮＡは宿主ゲノムの中に直接挿入することによって増幅することもできる。これは宿主としてバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を使用して、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のゲノムＤＮＡの中に見出される配列に対して相補的であるＤＮＡ配列をベクターの中に含めることによって容易に達成される。このベクターでバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）をトランスフェクションすると、ゲノムとの相同的組換えおよびＳＣＡ１ＤＮＡの挿入が生ずる。しかしながら、ＳＣＡ１遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの回収は、ＳＣＡ１ＤＮＡを切除するために制限酵素の消化を必要とするので、外因的に発現されたベクターの回収よりいっそう複雑する。

複製可能なクローニングおよび発現ベクターの成分は、次の１または２以上を包含するが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１または２以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写停止配列。

ベクターの成分：シグナル配列。シグナル配列を使用してクローニングされたタンパク質の細胞外輸送を促進することができる。この目的で、ＳＣＡ１遺伝子産物、アタクシン−１は直接発現されるばかりでなく、かつまた異種ポリペプチド、好ましくはシグナル配列あるいはクローニングされたタンパク質またはポリペプチドのＮ−末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドとの融合生成物として発現されることができる。シグナル配列はベクターの１成分であることができるか、あるいはそれはベクターの中に挿入されるＳＣＡ１ＤＮＡの一部分であることができる。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識されかつ処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものであるべきである。原核性宿主細胞について、原核性シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性インタートキシン（ｉｎｔｅｒｔｏｘｉｎ）ＩＩのリーダーの群から選択されることができる。酵母の分泌のために、使用するシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼ、アルファ因子、または酸性ホスファターゼのリーダーであることができる。哺乳動物細胞の発現において、自然のシグナル配列は満足すべきものであるが、他の哺乳動物のシグナル配列、例えば、同一または関係する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルは適当であることがある。

ベクターの成分：複製起点。発現ベクターおよびクローニングベクターの両方は、１または２以上の選択された宿主細胞の中でベクターを発現させる核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡに対して独立にベクターを複製させるものであり、そして複製起点または自律的に複製する配列を包含する。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は大部分のグラム陰性細菌のために適当であり、２ｍプラスミドの起点は酵母のために適当であり、そして種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般に、複製起点の成分は哺乳動物の発現ベクターのためには不必要である（ＳＶ４０の起点は初期のプロモーターを含有するので、典型的には使用することができる）。

ベクターの成分：マーカー遺伝子。発現ベクターおよびクローニングベクターはマーカー遺伝子、また、選択遺伝子または選択可能なマーカーと呼ぶ、を含有することができる。この遺伝子は、選択培地の中で増殖した形質転換された宿主細胞の生き残りまたは増殖のために必要なタンパク質をエンコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されない宿主細胞は培地の中で生き残ることができない。典型的な選択遺伝子は次のタンパク質をエンコードする：（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、ストレプトマイシンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質；（ｂ）栄養要求の欠失を補うタンパク質；または（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養を供給するタンパク質、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のためのＤ−アラニンラセマーゼをエンコードする遺伝子。選択のスキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を阻止するために薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、こうして選択の生活規制に生き残る。

哺乳動物細胞のための適当な選択可能なマーカーの例は、ＳＣＡ１核酸、例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼを吸収する能力を有する細胞の同定を可能とするものである。形質転換体のみがマーカーを吸収することによって独特に生き残るように適合される選択圧力下に、哺乳動物細胞の形質転換体を配置する。例えば、まず、メトトレキセート、すなわち、ＤＨＦＲのための競合拮抗物質を含有する培地の中ですべての形質転換体を培養することによって、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞を同定する。野生型ＤＨＦＲを使用するとき、適当な宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系であり、この細胞系はＵｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）に記載されているように調製しそして増殖させる。次いで、形質転換された細胞を増加したレベルのメトトレキセートに暴露させる。これはＤＨＦＲ遺伝子の多数のコピー、および、付随的に、発現ベクターを含有する他のＤＮＡ、例えば、ＳＣＡ１遺伝子の多数のコピーの合成に導く。この増幅技術は、例えば、メトトレキセートに対して高度に耐性である突然変異のＤＨＦＲを使用する場合、内因性ＤＨＦＲの存在にもかかわらず、任意のそうでなければ適当な宿主、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１ ＣＨＯ−Ｋ１とともに使用することができる。あるいは、ＳＣＡ１ＤＮＡ、野生型ＤＨＦＲタンパク質、および他の選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド３’リン酸転移酵素（ＡＰＨ）で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、選択可能なマーカーのための選択因子、例えば、アミノグリコシドの抗生物質、例えば、カナマイシンまたはネオマイシンを含有する培地の中の細胞増殖により選択することができる。酵母の中で使用するために適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７の中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２、３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７、１４１（１９７９）；またはＴｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０、１５７（１９８０））。ｔｒｐ１遺伝子はトリプトファンの中で増殖する能力を欠如する酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーである（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５、１２（１９７７））。次いで、酵母宿主細胞のゲノムの中のｔｒｐ１の損傷の存在は、トリプトファンの不存在下の増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２を欠失する酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補足される。

ベクターの成分：プロモーター。発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されそしてＳＣＡ１核酸に作用可能に連鎖されたプロモーターを含有する。プロモーターは、それらが作用可能に連鎖された特定の核酸配列、例えば、アタクシン−１核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンに対して上流（５’）（一般に約１００〜１０００ｂｐ内）に位置する非翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘導性および構成的の２つのクラスの中に入る。誘導性プロモーターは培養条件のある変化、例えば、栄養の存在または不存在あるいは温度の変化に応答してそれらの制御下にＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。対照的に、構成的プロモーターはクローニングされたＤＮＡセグメントの一定レベルの微量を生成する。

この時において、種々の潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターはこの分野においてよく知られている。プロモーターはそれらの源のＤＮＡから制限酵素の消化を使用して取り出され、そして標準の分子生物学の技術を使用してクローニングベクターの中に挿入される。天然のＳＣＡ１プロモーターおよび多数の異種プロモーターを使用して、ＳＣＡ１ＤＮＡの増幅および／または発現を指令することができる。異種プロモーターは、一般に、天然のプロモーターに比較してより大きい転写および発現されたタンパク質のより高い収率を可能とするので、好ましい。原核性宿主とともに使用するために適当なよく知られたプロモーターは、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターを包含する。このようなプロモーターは、任意の要求される制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用してＳＣＡ１ＤＮＡに結合することができる。細菌系において使用するためのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合のためのシャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含有することができる。

真核生物のためのプロモーター配列は知られている。事実上すべての真核性遺伝子は、転写が開始される部位からほぼ２５〜３０ｂｐ上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見出される他の配列はＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここでＸは任意のヌクレオチドであることができる。大部分の真核性遺伝子の３’末端に、コーディング配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであることができるＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。すべてのこれらの配列は真核性発現ベクターの中に適当に挿入される。酵母宿主とともに使用するために適当なプロモーティング配列の例は、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターを包含する。増殖条件により制御される転写の追加の利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースを利用する酵素のためのプロモーター領域である。

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＳＣＡ１転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーターにより制御することができる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３、１１３（１９７８）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９、１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐａｖｌａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、７３９８−７４０２（１９８１））。また、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）および熱ショックプロモーター、ならびにＳＣＡ１配列それ自体に通常関連するプロモーターを、ただしこのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であるかぎり、使用することができる。

ベクター成分：エンハンサー要素。高等真核生物によりＳＣＡ１ＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターの中に挿入することによって増加することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加する、通常約１０〜３００ｂｐを有する、ＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサーは比較的向きおよび位置独立性であり、イントロン内ならびにコーディング配列それ自体内の、転写ユニットに対して５’および３’に見出された。現在哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、およびインスリン）からの多数のエンハンサーが知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞のウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例は複製起点の後期の側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期のプロモーターのエンハンサー、複製起点の後期の側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーを包含する。エンハンサーをウイルスの中にＳＣＡ１遺伝子に対して５’または３’の位置においてスプライシングすることができるが、好ましくはプロモーターの部位５’に位置する。

ベクターの成分：転写停止。真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞）の中で使用する発現ベクターは、また、転写停止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有することができる。このような配列は真核性またはウイルス性ＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’−非翻訳領域および、時々、３’−非翻訳領域から普通に入手可能である。これらの領域はアタクシン−１をエンコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されたセグメントを含有することができる。

好ましくは、ｐＭＡＬ^TM−２ベクター（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチュセッツ州ベベリイ）を使用して発現ベクターをつくる。これらのベクターは、クローニングされたＳＣＡ１遺伝子から生産されるアタクシン−１の発現および精製のための便利な方法を提供する。ＳＣＡ１遺伝子は、ＭＢＰ融合タンパク質の発現を生ずるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をエンコードする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｍａｌＥ遺伝子から下流に挿入される。この方法はクローニングされた配列の高いレベルの発現を得るために強い「ｔａｃ」プロモーターおよびｍａｌＥ翻訳開始シグナルを使用し、そしてマルトースに対するＭＢＰの親和性を使用する融合タンパク質の１工程の精製を使用する。ベクターはｌａｃＺα遺伝子に融合したｍａｌＥ遺伝子（そのシグナル配列をもつか、あるいはもたない）を発現する。ｍａｌＥとｌａｃＺαとの間の制限部位は、問題のコーディング配列の挿入のために利用可能である。挿入はｍａｌＥ−ｌａｃＺα融合のβ−ガラクトシダーゼα−断片の活性を不活性化し、これにより、構成体がα−相補性宿主、例えば、ＴＢ１（Ｔ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、４８０５−４８１１（１９８６））またはＪＭ１０７（Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ、３３、１０３−１１９（１９８５））の中に形質転換されるとき、Ｘｇａｌプレート上で青色〜白色の色変化が生ずる。存在するとき、ｐｒｅ−ＭＢＰ上のシグナルペプチドは融合タンパク質を周辺質に向ける。首尾よく輸送することができる融合タンパク質について、これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の周辺質においてフォルディングおよびジサルファイド結合の形成を可能とし、ならびに周辺質からのタンパク質の精製を可能とする。ベクターはＬａｃリプレッサーをコードするｌａｃｑ遺伝子を有する。これはイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の誘導の不存在下にＰ^lac からの発現を低く保持する。ｐＭＡＬ^TM−２ベクターは、また、ポリリンカー挿入部位に対してちょうど５’に位置する、特定のプロテアーゼ因子Ｘａの認識部位をコードする配列を含有する。これは精製後のアタクシン−１からのＭＢＰの切断を可能とする。因子Ｘａはその４アミノ酸の認識配列後に切断するので、クローニングのために使用した部位に依存して、問題のタンパク質にわずかのベクター誘導残基が結合するか、あるいはこのような残基は結合しない。

また、ＳＣＡ１ＤＮＡの哺乳動物細胞の中の一時的発現を提供する発現ベクターは有用である。一般に、一時的発現は宿主細胞の中で効率よく複製することができ、引き続いて、発現ベクターによりエンコードされる所望のポリペプチドを高いレベルで合成する発現ベクターの使用を包含する。適当な発現ベクターおよび宿主細胞からなる一時的発現系は、クローニングしたＤＮＡによりエンコードされるポリペプチドの便利な積極的同定、ならびに所望の生物学的または生理学的性質についてのこのようなポリペプチドの急速なスクリーニングを可能とする。こうして、一時的発現系は、野生型または変異型の生物学的活性を有するアタクシン−１の類似体および変異型を同定する目的のために、本発明において特に有用である。

３．宿主細胞
ここにおけるベクターのクローニングまたは発現のために適当な宿主細胞は、前述の原核細胞、酵母、または高等真核細胞である。適当な原核生物は、真性細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、またはセラチア・マルセカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｓｅｃａｎｓ）を包含する。１つの好ましい大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のクローニング宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、他の株、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）は適当である。これらの例は限定的あるよりむしろ例示的である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。あるいは、クローニングのｉｎ ｖｉｔｒｏ法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応は適当である。

原核生物に加えて、真核微生物、例えば、フィラメント状真菌または酵母はＳＣＡ１をエンコードするベクターのために適当な宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または普通のパン酵母は、下等真核宿主微生物の間で最も普通に使用されるものである。しかしながら、ある数の属、種、および株は普通に入手可能であり、そしてここにおいて有用であり、このようなものの例は次の通りである：シゾサッカラロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・フラギリスス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、クルイベロマイセス・セルモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびクルイベロマイセス・マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、およびフィラメント状真菌、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）。

グリコシル化アタクシン−１の発現に適当な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は複雑なプロセシングおよびグリコシル化活性を有することができる。原理的には、任意の高等真核細胞の培養物は、脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞の培養物であるかどうかにかかわらず、使用可能である。無脊椎動物細胞の例は植物または昆虫の細胞を包含する。多数のバキュロウイルスの株および変異型および宿主、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、エデス・エジプティ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（カ）、エデス・アルボピクツス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（カ）、ドロソフィラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、およびボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）からの対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されてきている。参照、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、４７−５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８、２７７−２７９（１９８６）；およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５、５９２−５９４（１９８５）。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オウトフラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異型およびボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株は一般に入手可能であり、そしてこのようなウイルスは本発明に従いここにおけるウイルスとして、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、使用することができる。

ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞の培養物を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、前もってＳＣＡ１ＤＮＡを含有するように操作された細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のある種の株とのインキュベーションによりトランスフェクションされる。植物細胞の培養物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）とインキュベートすることによって、ＳＣＡ１ＤＮＡは細胞宿主の中に転移され、こうしてそれはトランスフェクションされ、そして、適当な条件下に、ＳＣＡ１ＤＮＡを発現する。さらに、植物細胞と適合性の調節配列およびシグナル配列、例えば、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列は入手可能である。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１、５６１（１９８２）。

また、脊椎動物細胞を宿主として使用できる。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、最近数年間に日常的手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎ＣＶ１系統（ＣＡＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎系統（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６、５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．、２３、２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７８）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファロ・ラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３、４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

４．トランスフェクションおよび形質転換
宿主細胞を本発明の前述の発現ベクターまたはクローニングベクターによりトランスフェクションおよび形質転換し、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、あるいは所望の配列をエンコードする遺伝子を増幅するために適当であるように修飾された普通の栄養培地の中で培養する。

トランスフェクションは、コーディング配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの吸収を意味する。トランスフェクションの多数の方法、例えば、リン酸カルシウム沈澱法が当業者に知られており、そしてエレクトロポレーションが普通に使用されている。有望なトランスフェクションは、一般に、ベクターの操作の指示が宿主細胞内で起こるとき、認識される。

形質転換は、ＤＮＡが染色体外の要素として、あるいは染色体の組込み体により複製可能であるように、ＤＮＡを生物の中に導入することを意味する。使用する宿主細胞に依存して、形質転換はこのような細胞に対して適当な標準の技術を使用して実施される。一般に、塩化カルシウムは原核生物または実質的な細胞壁のバリアーを含有する他の細胞のために使用される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による感染は、ある種の植物細胞の形質転換のために使用することができる。細胞壁をもたない哺乳動物細胞について、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２、４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈澱法は好ましい。典型的には、酵母の中への形質転換はＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０、９４６（１９７７）およびＨａｓｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７８、３８２９（１９７９）の方法に従い実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞の中に導入する他の方法、例えば、核注入、エレクトロポレーション、またはプロトプラストの融合を使用することもできる。

５．細胞培養
ＳＣＡ１遺伝子産物、アタクシン−１を生産するために使用する原核細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに一般に記載されているように、適当な培地の中で培養する。ＳＣＡ１遺伝子産物を生産するために使用する哺乳動物宿主細胞は種々の培地の中で培養することができる。商業的に入手可能な培地、例えば、Ｈａｍｓ Ｆ１０（シグマ）、最小必須培地（ＭＥＭ、シグマ）、ＲＰＭＩ １６４０（シグマ）、およびダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ）は宿主細胞の培養のために適当である。これらの培地は必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ^TM薬物）、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源で補充することができる。また、任意の他の必要な補充物質を当業者に知られている適当な濃度で含めることができる。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは発現のために選択される宿主細胞とともに従来使用されているものであり、そして当業者にとって明らかであろう。この開示の中で言及される宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物ならびに宿主動物内に存在する細胞を包含する。

Ｃ．タンパク質
ＳＣＡ１遺伝子は新規なタンパク質、アタクシン−１をエンコードし、約８７ｋＤの推定分子量をもつその例は第１５図に示されている。アタクシン−１はその不安定なＣＡＧ領域をもつＳＣＡ１遺伝子から生産される１組のタンパク質を表すことを理解すべきである。アタクシン−１は細胞培養物から生産することができる。組換えＤＮＡ技術の助けにより、アタクシン−１をコードする合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡを微生物の中に導入し、次いでこの微生物がそのペプチドを生産するようにさせることができる。また、ペプチド合成について知られているように方法で、アタクシン−１を合成的に製造することができる。

アタクシン−１は好ましくは培地から細胞質ゾルのポリペプチドとして回収されるが、また、分泌シグナルをもって発現されるとき、それは分泌されたポリペプチドとして回収することができる。
アタクシン−１は組換え細胞のタンパク質またはポリペプチドから精製して、アタクシン−１として実質的に均質である調製物を得ることができる。第１ステップとして、培地またはリゼイトを遠心して粒状細胞破片を除去する。次いで、膜および可溶性タンパク質の画分を分離する。アタクシン−１が膜に結合しているかどうかに依存して、可溶性タンパク質画分からおよび培養リゼイトの膜画分から精製することができる。必要に応じて、アタクシン−１は汚染物質の可溶性タンパク質およびポリペプチドからさらに精製し、次の手順は適当な精製手順の典型である：イムノアフィニティーまたはイオン交換のカラム上の分画；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはカチオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー；クロマトフィーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈澱；例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５を使用する、ゲル濾過；例えば、汚染物質、例えば、ＩｇＧを除去するためのプロテインＡセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムを使用する、アフィニティークロマトグラフィー。

残基が欠失、挿入、または置換されたアタクシン−１の変異型は、変動により引き起こされる性質の実質的な変化を考慮して、自然のアタクシン−１と同一の方式で回収される。例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、例えば、細菌またはウイルスの抗原とのアタクシン−１の融合体の製造は精製を促進する；抗原に対する抗体を含有するイムノアフィニティーカラムを使用して、融合ポリペプチドを吸着することができる。イムノアフィニティーカラム、例えば、ウサギポリクローナルアタクシン−１カラムを使用して、アタクシン−１変異型を少なくとも１つの残留する免疫エピトープにによりすることによって、それを吸収することができる。あるいは、アタクシン−１は、アフィニティークロマトグラフィーにより（好ましくは）固定化された樹脂、例えば、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州リッチモンド）などに結合された精製アタクシン−１−ＩｇＧを使用して、この分野においてよく知られている手段により精製することができる。また、プロテアーゼインヒビター、例えば、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）は精製の間のタンパク質分解的分解を阻止するために有用であることがあり、そして抗生物質を含めて外来の汚染物質の成長を防止することができる。

アタクシン−１の共有結合の修飾物は本発明の範囲内に含まれる。天然のアタクシン−１およびアタクシン−１のアミノ酸配列の変異型の両方を共有結合で修飾することができる。本発明の範囲内に含まれる共有結合の修飾物は、１または２以上のアタクシン−１断片を生成するものである。任意の数のアミノ酸残基を有するアタクシン−１断片は、化学的合成により、全長または変異型のアタクシン−１ポリペプチドの酵素的または化学的切断により、あるいはＳＣＡ１遺伝子の一部分のみのクローニングおよび発現により、便利に製造することができる。アタクシン−１またはその断片の共有結合の修飾物の他の型は、選択した側鎖あるいはＮ−またはＣ−末端の残基と反応することができる誘導化剤でアタクシン−１またはその断片の標的アミノ酸残基を処理することによって、分子の中に導入される。

例えば、システニル残基は最も普通にはα−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えば、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システニル残基は、また、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸ヨードアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−３−ピリジルジサルファイト、メチル２−ピリジルジサルファイト、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導化される。

ヒスチジル残基はジエチルピロカーボネートｐ−ブロモフェナシルとの反応により誘導化される。リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物およびイミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応で誘導化される。アルギニル残基は、なかでも、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。

チロシル残基の特定の修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基の中にスペクトルの標識を導入するとき、とくに重要性をもって、なすことができる。最も普通には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれ、Ｏ−アセチル種および３−ニトロ誘導体を生成する。チロシル残基は¹²⁵ Ｉまたは¹³¹ Ｉを使用してヨウ素化してラジオイムノアッセイにおける使用のための標識化タンパク質を製造し、前述のクロロアミンＴ法は適当である。

カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカーボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、ここでＲおよびＲ’は異なるアルキル基である、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カーボジイミドまたは１−エチル−２−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カーボジイミドとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパルギニルおよびグルタミニル残基に変換される。

２官能性剤を使用する誘導化は抗アタクシン−１抗体を精製する方法において使用のためにアタクシン−１を水不溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋するために有用であり、そしてその逆も同じである。普通に使用される架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アゾサリチル酸とのエステル、ブロモ２官能性イミドエステル、ジスクシニミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）を包含する、および２官能性マレイミド、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンを包含する。誘導化剤、例えば、メチル−２−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオミデートは、光の存在下に架橋を形成できる光活性化可能な中間体を生ずる。あるいは、反応性水不溶性マトリックス、例えば、臭化シアン活性化炭水化物および反応性基質をタンパク質の固定化のために使用する。

グルタミニルおよびアスパルギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に、しばしば脱アミン化される。これらの残基は中性または塩基性条件下に脱アミン化される。これらの残基の脱アミン化形態は本発明の範囲内に入る。

他の修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ−末端アミンのアセチル化、Ｃ−末端カルボキシル基のアミド化、および任意の適当な残基のグリコシル化を包含する。

Ｄ．抗体
本発明は、また、アタクシン−１またはアタクシン−１断片（好ましくは、折りたたまれたタンパク質の表面を形成する、８〜４０アミノ酸、より好ましくは１０〜２０アミノ酸を有する断片）、またはその変異型に対してレイズされたポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関し、そしてこのような抗体の使用に基づく診断方法に関し、このような方法はウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイ）を包含するが、これらに限定されない。

ＳＣＡ１ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、アミンにおいてアタクシン−１、アタクシン−１断片、またはその変異型、およびアジュバントの多数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によりレイズされる。ポリペプチドはクローニングされた生産物または合成分子であることができる。好ましくは、それは折りたたまれたタンパク質の表面上に存在し、こうして抗原性であるように思われるタンパク質の配列の中の位置に相当する。それはＳＣＡ１ポリペプチド（特定のアミノ酸配列を含有する断片を含む）を、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、２官能性または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による接合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ₂ 、またはＲ¹ Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、ここでＲおよびＲ¹ は異なるアルキル基である、を使用して接合するために有用である。接合体は、また、組換え細胞培養物の中でタンパク質融合体としてつくることができる。また、凝集剤、例えば、明礬を使用して免疫応答を増強する。

宿主動物を免疫化するか、あるいは抗体生産細胞の取り出しおよび培養のルートおよびスケジュールは変動性であり、そして一般に抗体の刺激および生産のための確立された普通の技術と一致する。マウスはしばしば宿主動物として使用されるが、ヒト被検者またはそれから得られた抗体生産細胞を包含する任意の哺乳動物の被検体を本発明の方法に従い使用して、ヒトを包含する哺乳動物、ハイブリッド細胞系の生産の基準として働くように操作することができることが考えられる。好ましくは、ウサギを使用してアタクシン−１に対して抗体レイズする。

典型的には、約１０μｇ〜約１ｍｇのアタクシン−１を約２〜３体積のフロインド完全アジュバントと組み合わせ、そしてこの溶液を多数の部位において皮内に注射することによって、動物を免疫原性接合体または誘導体に対して免疫化する。約１カ月後、フロインド完全アジュバント（または他の適当なアジュバント）中の接合体の約１／５〜約１／１０の量で多数の部位において皮下注射することによって動物を促進する。約７〜１４日後、動物から採血しそして血清を抗アタクシン−１ポリペプチドの力価についてアッセイする。

血清の抗体（ＩｇＧ）を、この分野においてよく知られているタンパク質精製のプロトコールにより精製する。抗体／抗原の反応性をウェスタンブロッティングにより分析し、ここで疑われる抗原をニトロセルロースのフィルターにブロットし、潜在的抗体に対して暴露し、そして規定された条件下にハイブリダイゼーションさせる。参照、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１、１−１５（１９８３）。次いで、タンパク質の抗原を標準の配列決定法によりニトロセルロース支持体上の抗体／抗原複合体から直接配列決定することができる。

免疫化した動物（通常マウス）から免疫細胞−典型的には脾細胞またはリンパ節組織からのリンパ球−を回収し、そして細胞を普通の方法、例えば、骨髄腫細胞との融合により永久***能化することによって、モノクローナル抗体を調製する。Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６、５１１（１９７６）により本来記載されたハイブリドーマ技術を広く適用して、多数の特定の抗原に対するモノクローナル抗体を高いレベルで分泌するハイブリッド細胞を生産する。しかしながら、免疫化抗体生産細胞および骨髄腫の源は同一種からものであることは好ましい。マウスのモノクローナル抗体は日常的に使用されるが、本発明はそのように限定されない。事実、典型的にはマウスのモノクローナル抗体が使用されるが、ヒトの抗体を使用することができそしてこのような抗体は好ましいことがある。このような抗体はヒトのハイブリドーマを使用することによって得ることができる。Ｃｏｔｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ；Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ、編；ｐ．７７（１９８３）。

分泌された抗体を組織培養上澄み液から普通の方法、例えば、沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどにより回収する。ここに記載する抗体は、また、ハイブリドーマ細胞培養物から、場合に応じて、プールした血漿からＩｇＧまたはＩｇＭを精製するために従来使用されてきている、これらの免疫グロブリンを精製する普通の方法、例えば、エタノールまたはポリエチレングリコール沈澱法により、回収する。精製した抗体を滅菌濾過し、そして必要に応じて被験試料の中のアタクシン−１の診断アッセイにおいて使用する検出可能なマーカー、例えば、酵素またはスピンラベルに接合させる。

モノクローナル抗体をバイパスする、抗体分子の抗原結合領域（Ｆａｂ断片として知られている）の組換えＤＮＡのバージョンをつくる技術は、本発明の実施の範囲内に含まれる。抗体特異的メッセンジャーＲＮＡを免疫化動物から取った免疫系細胞から抽出し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写し、そしてｃＤＮＡを細菌の発現系の中にクローニングする。

本発明の抗アタクシン−１抗体調製物はアタクシン−１に対して特異的であり、そして所定の使用を妨害する方法で他の物質と免疫化学的に反応しない。例えば、それらを使用して組織抽出物の中のアタクシン−１の存在についてスクリーニングして、アタクシン−１の組織特異的発現のレベルを決定することができる。

本発明は、また、アタクシン−１に対して向けられた抗体を試料の中に存在するアタクシン−１と反応させ、こうして（アタクシン−１／抗アタクシン−１）免疫複合体を形成することを含む免疫化学的アッセイを包含し、その形成および量は試料の中に存在するアタクシン−１の−それぞれ、定性的および定量的−測度である。タンパク質／抗体複合体と生物特異的に反応することができる他の試薬、例えば、分析的に検出可能な基を与えられた抗抗体の添加は、生物学的試料の中のアタクシン−１の検出および定量を促進し、そして生物学的試料の中のアタクシン−１のレベルの定量ために殊に有用である。また、アタクシン−１／抗アタクシン−１複合体をこの分野においてよく知られている方法によりアミノ酸配列決定して、ポリグルタミン領域の長さを決定し、これにより脊髄小脳失調に悩まされる可能性および多分発症年齢についての情報を提供することができる。競合阻害および非競合法、沈澱法、異種および均質法、使用する分析的に検出可能な基に従い命名される種々の方法、免疫電気泳動、粒子凝集、免疫拡散および標識化抗体を使用する免疫組織化学的方法のすべてを前述の免疫アッセイと組み合わせて使用することができる。

本発明を種々の特定のかつ好ましい態様を参照して説明したが、さらに次の詳細な実施例を参照して説明する。しかしながら、理解されるように、実施例および詳細な説明の中に示すものを越え、本発明の精神および範囲内入る、本発明の基本的テーマに基づく多数の拡張、変化、および修飾が存在する。

実験の節
Ｉ． Ｄ６Ｓ８９に対してセントロメアにマッピングするＳＣＡ１のための遺伝子
Ｄ６Ｓ８９に関するＳＣＡ１の位置を決定しそしてより近いフランキングマーカーを同定するために、２つのジヌクレオチド反復の多形性Ｄ６Ｓ１０９およびＤ６Ｓ２０２を使用した。Ｄ６Ｓ８９領域において分離されたＹＡＣクローンを使用して、３つの追加のジヌクレオチド反復の多形性が同定され、それらの一方（ＡＭ１０ＧＡ）はＳＣＡ１との組換えを示さずそしてＤ６Ｓ８９がＳＣＡ１に対してテロメアであることを確証した。Ｄ６Ｓ１０９におけるジヌクレオチド反復はＳＣＡ１との６つの組換え事象を明らかにし、そしてＤ６Ｓ１０９がセントロメアの末端における他方のフランキングマーカーであることを決定した。連鎖の分析、後述するような物理的マッピングデータ、および組換え事象の分析は、マーカーの順序は次の通りである：セントロメア−Ｄ６Ｓ１０９−ＡＭ１０ＧＡ／ＳＣＡ１−Ｄ６Ｓ８９−ＳＢ１−ＬＲ４０−Ｄ６Ｓ２０２−テロメア。

Ａ．材料および方法
１．ＳＣＡ１家系
９つの大きいＳＣＡ１の家族をこの研究において使用した。これらの家族がＳＣＡ１を分離したということを証明する臨床的発見および連鎖のデータは、従来報告された。参照、Ｊ．Ｆ．Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９６、１１３８−１１４１（１９７７）；Ｂ．Ｊ．Ｂ．Ｋｅａｔｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、９７２−９７７（１９９１）；Ｌ．Ｐ．Ｗ．Ｒａｎｕｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、３１−４１（１９９１）；およびＨ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、２３−３０（１９９１）。位置Ｄ６Ｓ１０９、ＡＭ１０ＧＡ、ＳＢ１、ＬＲ４０、およびＤ６Ｓ２０２における多形性の分析は、これらの家系からの個体について実施した。

ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）（ＴＸ−ＳＣＡ１）家系は１０６の個体を含み、それらのうちの５７（影響を受けた２５）の遺伝子型を決定した。参照、Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２３、５８０−５８４（１９８８）。試験のとき症候性である患者、ならびに症候性の子供および症候性の親の両方を有する無症候性の個体を「影響を受けた」と分類した。この家系において、影響を受けたと前に帰属した（家族の歴史のデータから）死亡した個体は、医学的記録を見た後未知の状態に再帰属させた。この再帰属は、ＴＸ−ＳＣＡ１家系においてＳＣＡ１とＤ６Ｓ８９との間の組換え事象であると前に考えられたものを排除した。連鎖の分析のために入手可能な情報の量を最大とするために、ＴＸ−ＳＣＡ１家系からの１５の影響を受けた個体および１つの影響を受けなかった個体についての体細胞のハイブリッドにおける２つの染色体６を分離した。参照、Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４４、２５５−２６３（１９８９）。ルイジアナ（Ｌｏｕｓｉａｎａ）（ＬＡ−ＳＣＡ１）家系は５０の個体を含み、それらのうちの２６（影響を受けた８）の遺伝子型を決定した。参照、Ｂ．Ｊ．Ｂ．Ｋｅａｔｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、９７２−９７７（１９９１）。ミネソタ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）（ＭＮ−ＳＣＡ１）家系は１７５の個体を含み、それらのうちの１０６（影響を受けた１７）の遺伝子型を決定した。参照、Ｊ．Ｌ．Ｈａｉｎｅｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３４、１５４２−１５４８（１９８４）；およびＬ．Ｐ．Ｗ．Ｒａｎｕｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４９、３１−４１（１９９１）。ミシガン（Ｍｉｃｈｉｇａｎ）（ＭＩ−ＳＣＡ１）家系は２０１の個体を含み、それらのうちの１２７（影響を受けた２５）の遺伝子型を決定した。参照、Ｈ．Ｅ．Ｎｉｎｏら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３０、１２−２０（１９８０）。ミシシッピ（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ）（ＭＳ−ＳＣＡ１）家系は８４の個体を含み、それらのうちの３７（影響を受けた１７）の遺伝子型を決定した。参照、Ｊ．Ｆ．Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９６、１１３８−１１４１（１９７７）。

ＳＣＡ１を分離する４つのイタリア（Ｉｔａｌｉａｎ）の家族を分析した；それらの臨床的表現型およびＨＬＡ連鎖のデータは従来報告された。参照、Ｍ．Ｓｐａｄａｒｏら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、８５、２５７−２６５（１９９２）。カラブリア・リージョン（Ｃａｌａｂｒｉａ Ｒｅｇｉｏｎ）（南イタリー）において由来した３つの家族：１３５の構成員をもつ家族ＩＴ−Ｐ、それらのうちの８０（影響を受けた２１）の遺伝子型を決定した；計算の理由で、この家族を３つの異なる家系図（ＲＭ、ＶＩ、およびＦＢ）に再分割しそして３つの血縁関係のループのうちの１つのみを考察した；４３の構成員をもつ家族ＩＴ−ＮＳ、それらのうちの２７（影響を受けた７）を型別した。ラチウム（Ｌａｔｉｕｍ）から由来しそして１７個体から成る、第４家族ＩＴ−ＭＲ、それらのうちの１０（影響を受けた４）の遺伝子型を決定した。

２．ＣＥＰＨ家族
マーカー−マーカーの連鎖分析のために多数の情報を与える減数***を得るために、４０の参照家族の遺伝子型をＤ６Ｓ１０９、ＬＲ４０およびＤ６Ｓ２０２において決定した。酵母の人工的染色体（ＹＡＣ）コンチグから分離されたマーカーＡＭ１０ＧＡおよびＳＢ１フランクＤ６Ｓ８９は、Ｄ６Ｓ８９から２方向に構築した（下を参照）。Ｄ６Ｓ１０９とＤ６Ｓ８９との間で２６の組換え体を定める１８のＣＥＰＨのサブセットの遺伝子型をＡＭ１０ＧＡおよびＳＢ１において決定して、Ｄ６Ｓ１０９に関するＡＭ１０ＧＡ、Ｄ６Ｓ８９およびＳＢ１の順序を決定した。

３．ジヌクレオチド反復を含有する配列のクローニング
Ｄ６Ｓ１０９およびＤ６Ｓ２０２位置における多形性ジヌクレオチド反復の同定および記述は、前に報告された。参照、Ｌ．Ｐ．Ｗ．Ｒａｎｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、１１７１（１９９１）およびＦ．ＬｅＢｏｒｇｎｅ−Ｄｅｍａｒｑｕｏｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、６０６０（１９９１）。

ジヌクレオチド反復を含有するＤＮＡ断片を、それぞれ、ＬＲ４０およびＦＬＢ１における酵母の人工的染色体（ＹＡＣ）クローンからＬＲ４０およびＳＢ１においてクローニングした（下を参照）。２０ｎｇのＤＮＡ、単一のＡｌｕプライマー（下を参照）、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．３、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００または２５０μＭのｄＮＴＰ（複数）、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、および１．２５単位のサームス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ−−パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、コネチカット州ノーウォーク）を含有する５０μｌの反応混合物の中で、各ＹＡＣクローンからのＤＮＡを増幅した。ＦＬＢ１ ＹＡＣ ＤＮＡの増幅のために、Ａｌｕコンセンサス配列（オンコール・ラボラトリーズ（Ｏｎｃｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マリイランド州ガイサーバーグ）の５’末端に対して相補的なプライマー（ＳＡＬ１と表示する）を０．６μＭの最終濃度で使用した＝５’−ＡＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＣ−３’。ＬＲ４０ ＹＡＣ ＤＮＡの増幅のために、０．２μＭのプライマーＰＤＪ３４を使用した。参照、Ｃ．Ｂｒｅｕｋｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、３０９７（１９９０）。試料の上に鉱油を横たえ、９４℃において５分間変性し、次いで９４℃において１分の変性、５５℃において１分のアニーリング、および７２℃において５分の伸長の３０サイクルにかけた。最後の伸長ステップを１０分に延長した。１５μｌのＰＣＲ生成物の電気泳動を１．５％のアガロースゲル上で実施し、これをサザンブロッティングし、そしてＡ．Ｐ．Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３７、２６６−２６７（１９８４）に記載されているようにして、合成ポリ（ｄＧ−ｄＴ）−ポリ（ｄＡ−ｄＣ）（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージイ州ピスカタェイ）のランダム−ヘキサマー−プライムド標識化により［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰを使用して製造したプローブとハイブリダイゼーションした。ジヌクレオチド反復のプローブとハイブリダイゼーションする断片を同定し、そして引き続いて低メルトのアガロースゲル上の電気泳動により精製した。

ＬＲ４０について、増幅したＤＮＡを低メルトのゲルの電気泳動により再精製し、そしてＤ．Ｍ．Ｈｅｅｒｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、６、１７３（１９９０）に記載されているようにガラスウールのスピンカラムを通過させることによって切除したバンドからＤＮＡを抽出した。精製した１．２ｋｂの断片を、Ｄ．Ｍａｒｃｈｕｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、１１５４（１９９０）に記載されているように、「Ｔ−ベクター」として修飾したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの中にクローニングした。このクローンから、０．６ｋｂのＧＴ反復を含有するＨｉｎｃＩＩ制限断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの中にサブクローニングし、そしてアプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）自動化配列決定装置で配列決定した。

ＳＢ１について、再増幅した１ｋｂの断片をエタノール沈澱させ、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの中に平滑末端クローニングした。プラスミドＤＮＡを分離し、そしてＭ１３リバース（Ｒｉｖｅｒｓｅ）プライマー＋ＢａｍＧＴプライマー（５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ−３’）との１つの反応においておよびＭ１３ユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）プライマーおよびＢａｍＣＡプライマー（５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ−３’）との第２の反応においてＰＣＲ増幅した。参照、Ｃ．Ａ．Ｆｅｅｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４８、６２１−６２７（１９９１）。ＰＣＲ条件は上の通りであったが、ただしプライマーは１μＭの濃度で使用した；２．５単位のＴａｑポリメラーゼおよびほぼ３０ｎｇのＤＮＡを反応につき使用し、最終の反応体積は１００μｌであり、そしてアニーリング温度は５０℃であった。生成物を沈澱させ、再懸濁させ、そしてＢａｍＨＩ（ユニバーサル・プライマー反応の生成物）またはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃＩＩ（リバース・反応の生成物）で消化した。これらの２つの断片を、前述したように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの中にクローニングしそして配列決定した。

ジヌクレオチド反復をＡＭ１０においてこの位置を含有するＹＡＣからクローニングした。この酵母クローンからのＤＮＡを使用してλＦｉｘＩＩライブラリーを構成し、そしてヒト胎盤ＤＮＡをプローブとしてを使用してヒトクローンをフィルターハイブリダイゼーションにより同定した。これらのヒトクローンの格子配列を成長させ、そしてこれらのクローンからのＤＮＡを含有するフィルターを³²Ｐ標識化ポリ（ｄＧ−ｄＴ）−ポリ（ｄＡ−ｄＣ３）プローブと前述したようにハイブリダイゼーションさせた。ＤＮＡを陽性のクローンから調製し、種々の制限酵素で消化し、そしてアガロースゲルの電気泳動により精製した。サザンブロッティングおよびポリ（ｄＧ−ｄＴ）−ポリ（ｄＡ−ｄＣ）プローブを使用してハイブリダイゼーションを実施した。ジヌクレオチド反復おプローブとハイブリダイゼーションする１ｋｂの断片を同定し、Ｍ１３の中にクローニングし、そして配列決定した。

４．ＰＣＲ分析
ヒトゲノムＤＮＡからのジヌクレオチド反復の配列の増幅ために使用したプライマーの配列および濃度、およびＰＣＲサイクル時間を表１に表す。ＬＲ４０多形性について、プライマーの組「Ａ」をＴＸ−ＳＣＡ１、ＬＡ−ＳＣＡ１、およびＭＳ−ＳＣＡ１家系の分析のために使用したが、プライマーの組「Ｂ」はすべての他の家系のために使用した。緩衝液の組成は次の通りであった：５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．３、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂ （ＡＭ１０ＧＡについて１．５ｍＭのＫＣｌ）、２５０μＭのｄＮＴＰ（複数）（ＡＭ１０ＧＡについて２００μＭのｄＮＴＰ（複数））、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、および０．５〜０．６２５単位のＴａｑポリメラーゼ。ＬＲ４０の分析のために、２％のホルムアミドをＰＣＲ緩衝液の中に含めた。プライマーの組ＢをＬＲ４０の分析のために使用したとき、１２５μＭのｄＮＴＰ（複数）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、および１単位のＴａｑポリメラーゼを使用した。すべての反応の体積は２５μｌであり、そして４０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。４μｌの各反応混合物を２μｌのホルムアミド負荷緩衝液と混合し、９０〜１００℃において３分間変性し、氷上で冷却し、そして２〜４μｌを４％または６％のポリアクリルアミド／７．６５Ｍの尿素配列決定ゲル上の電気泳動のために１１００Ｖで２〜３４時間使用した。ＰＣＲアッセイの条件は従来Ｄ６Ｓ２０２およびＤ６Ｓ１０９について報告された。参照、Ｌ．Ｐ．Ｗ．Ｒａｎｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９、１１７１（１９９１）およびＦ．ＬｅＢｏｒｇｎｅ−Ｄｅｍａｒｑｕｏｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、６０６０（１９９１）。

５．ＳＣＡ１連鎖分析
ＭＬＩＮＫ、ＩＬＩＮＫ、ＬＩＮＫＭＡＰ、ＣＬＯＤＳＣＯＲＥおよびＣＭＡＰプログラムを含むコンピュータープログラムＬＩＮＫＡＧＥバージョン５．１を使用して、Ｄ６Ｓ１０９、ＡＭ１０ＧＡ、Ｄ６Ｓ８９、ＳＢ１、ＬＲ４０およびＤ６Ｓ２０２マーカーをＳＣＡ１に対する連鎖について分析した。参照、Ｇ．Ｍ．Ｌａｔｈｒｏｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、３４４３−３４４６（１９８４）。分析に含めた家族の各々について、年齢依存性浸透のクラスを独立に帰属させた。マーカーのアレレを家族において分離するアレレの数を４、５または６アレレに減少して分析を簡素化した。種々のマーカーについてのアレレの頻度は各家族における配偶者の間のアレレの頻度に基づき、そして２つのアメリカの黒人の家系について、イタリアの家系について、およびミネソタ州、ミシンガン州、およびミシシッピ州からの白人の家系について別々に決定し、ただし−ＭＩおよびＭＮにおけるＤ６Ｓ１０９についてのアレレの頻度はＣＥＰＨ家族におけるアレレの頻度に基づいた。

０．０００５〜０．００１の増分のテータ値において、種々の家族について別々に分析の各々を実施し、次いで家系の各々の値を加えることによって、種々のマーカーについての最大のＬＯＤスコアをＭＬＩＮＫプログラムで計算した。分析を別々に実施して、種々のマーカーについてのアレレの頻度が民族的に多様の家族の各々について代表的であることを保証した。対照として、各マーカーについてのアレレの頻度を互いにに対して等しく設定した後、ＩＬＩＮＫプログラムを使用して各マーカーとＳＣＡ１との間の最大のロッド（ｌｏｄ）スコア（Ｚ_max ）における組換えの画分を計算した。すべての場合において、組換えの頻度は同一であり、そしてＺ_max 値は下の表５に報告した値に非常に類似した。

６．ＣＥＰＨの連鎖分析
４０のＣＥＰＨ家族をＧＴ反復マーカーＤ６Ｓ１０９、Ｄ６Ｓ２０２およびＬＲ４０について型別した。もとのアレレを５アレレに対して記録した。Ｄ６Ｓ１０９とＤ６Ｓ８９との間の１８の異なる家族から２６の組換え体を定めるＣＥＰＨパネルのサブセットにおいて、ＳＢ１およびＡＭ１０マーカーを型別した。ＣＬＯＤＳＣＯＲＥプログラムを２点の分析のために使用し、そしてＣＭＡＰを３および４点の分析のために使用した。３点および４点の分析のために、マッピングしたマーカーの間の間隔を２点θ_m ＝θ_f の結果に基づいて固定した。各間隔内の１０の異なる位置において、試験位置（ＳＣＡ１）の位置の可能性を計算した。
Θ値における性差についての試験をχ² 統計学を使用して実施し、ここでχ² ＝２（ｌｎ１０）［Ｚ（θ_m ，θ_f ）−Ｚ（θ＝θ_m ＝θ_f ）］、ここでＺ（θ_m ，θ_f ）は任意のθ_m およびθ_f についての全体のＺ_max であるが、Ｚ（θ＝θ_m ＝θ_f ）はθ_m ＝θ_f に束縛されるＺ_max である。均質性（Ｈ１）の下で、χ² は１ｄ．ｆ．でχ² に近似する。均質性の拒絶はχ² ＞３．８４のとき起こる。

Ｂ．結果
１．ジヌクレオチド反復のクローニングおよび配列決定および分析
ジヌクレオチド反復ＳＢ１およびＬＲ４０をＡｌｕプライムドＰＣＲによりＹＡＣクローンから直接増幅し、そしてジヌクレオチド反復を含有する断片をハイブリダイゼーションにより同定した。ＰＣＲ生成物を直接クローニングするか、あるいはＡｌｕプライマーと対合したテイルドポリ：ＧＴ）またはポリ（ＣＡ）を使用するそれ以上の増幅によりクローニングした。さらに、２つのジヌクレオチド反復をＡＭ１０位置においてＹＡＣから構成したライブラリーからのラムダファージクローンからサブクローニングした。

ＳＢ１、ＬＲ４０、およびＡＭ１０からのジヌクレオチド反復を配列決定した。ＬＲ４０において、クローニングした反復配列は（ＣＡ）₁₆ＴＡ（ＣＡ）₁₀であった。ＡＭ１０は４５ｂｐの非反復配列により分離された２つの反復配列を含有した。ＡＭ１０ＧＡと表示する第１反復は（ＧＡ）₂ ＡＴＧＡＣＡ（ＧＡ）₁₁であった。ＡＭ１０ＧＴと表示する第２反復は、ＴＸ−ＳＣＡ１家系の分析のとき、ＡＭ１０ＧＡ反復と同一の情報を生じたので、この研究において使用しなかった。ＡＭ１０ＧＴは（ＧＡ）₂ ＡＡ（ＧＡ）₆ ＧＴＧＡ（ＧＴ）₁₆ＡＴ（ＧＴ）₅ から成る。ＡＭ１０ＧＴについてのプライマーの情報は、ゲノム・データ・ベース（Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ）を通して入手可能である。ＳＢ１において、反復路は配列決定しなかった；フランキング配列のみを決定した。

異なるレースの間にマーカーのアレレ分布の差が存在するので、アレレの頻度をここにＣＥＰＨ家系（白人）およびＴＸ−ＳＣＡ１家系（アメリカの黒人）について別々に報告する（表２）。ＣＥＰＨアレレの頻度はＳＢ１について７２の独立の染色体、ＡＭ１０について８２の独立の染色体、そしてＤ６Ｓ１０９およびＬＲ４０について４０家族の完全な組に基づいた。ＴＸ−ＳＣＡ１アレレの頻度はＬＲ４０について４５の独立の染色体、ＳＢ１について４３の独立の染色体、ＡＭ１０について４５の独立の染色体、そしてＤ６Ｓ１０９について４２の独立の染色体に基づいた。

２．遺伝的連鎖のデータ
ａ．ＣＥＰＨ家族。ＳＣＡ１遺伝子についてよく定められた遺伝地図を確立するために、新しく分離したＤＮＡマーカーをＣＥＰＨ参照家族を使用してマッピングした。ＣＥＰＨ家系における対の方法の連鎖分析の結果を表３に示す。Ｄ６Ｓ１０９とＤ６Ｓ８９との間の２６の組換え体を定めたＣＥＰＨパネルのサブセットを使用して、ＡＭ１０ＧＡとＤ６Ｓ８９との間で組換え体は観察されなかった（θ＝０．００、Ｚ_max ＝１５．１）。マーカーＤ６Ｓ１０９およびＬＲ４０はＤ６Ｓ８９に近接し、組換え体の画分は、それぞれ、０．０６７（Ｚ_max ＝７１．４）および０．０４（Ｚ_max ＝８４．５）であった。

選択した多点分析を実施して、ＣＥＰＨパネルを使用して前にマッピングされたマーカーに関して、新しく分離されたマーカーＤ６Ｓ１０９、ＬＲ４０、Ｄ６Ｓ２０２を位置決定した。ＣＭＡＰプログラムを３および４点の連鎖分析のために使用してＤ６Ｓ８８およびＤ６Ｓ８９に関してＤ６Ｓ１０９を位置決定し、そして互いにかつＤ６Ｓ８９およびＦ１３Ａに関してＬＲ４０およびＤ６Ｓ２０２を位置決定した。３点分析のために、Ｄ６Ｓ８８−Ｄ６Ｓ８９の間隔をＣＥＰＨにおける３点の組換え画分に基づいて固定し、そしてロッド・スコアを種々の組換え画分において計算した。順序Ｄ６Ｓ８８−Ｄ６Ｓ１０９−Ｄ６Ｓ８９は次の最もありそうな順序よりも４×１０³ ：１の差だけよい（表４）。４点分析について、Ｄ６Ｓ８９−Ｄ６Ｓ２０２−Ｆ１３ＡおよびＤ６Ｓ８９−ＬＲ４０−Ｆ１３Ａの両方の間隔は２点の組換え画分に基づいて固定した；次いでそれぞれの固定した地図上の種々のθ値においてロッド・スコアをＬＲ４０およびＤ６Ｓ２０２について計算した。順序Ｄ６Ｓ８９−ＬＲ４０−Ｄ６Ｓ２０２−Ｆ１３Ａは両方の分析において次の最もありそうな順序よりもよい；有望さにおける差はＬＲ４０の位置が変化したとき４００：１であり、そしてＤ６Ｓ２０２が変化したとき１×１０⁶ ：１であった（表４）。

ＡＭ１０ＧＡおよびＤ６Ｓ８９の順序はＤ６Ｓ１０９／Ｄ６Ｓ８９／Ｄ６Ｓ８９ＤＥＰＣ組換え体を使用して決定することができなかった。しかしながら、オキシド−リダクターゼＡＭ１０ＧＡ−Ｄ６Ｓ８９−ＳＢ１は、これらのマーカーを含有するオーバーラップする酵母の人工的染色体のクローンの特性決定により推定された（下を参照）。さらに、このコンチグの１端はＤ６Ｓ１０９および他のセントロメアのマーカーを含有することが知られているよく特徴づけられた放射線減数ハイブリッドの中に存在し、順序Ｄ６Ｓ１０９−ＡＭ１０ＧＡ−Ｄ６Ｓ８９−ＳＢ１を示す。

ｂ．ＳＣＡ１家系
ＳＣＡ１家系における対の方法の連鎖分析の結果を表５に示す。ＡＭ１０ＧＡ、Ｄ６Ｓ８９、およびＳＢ１のすべてはＳＣＡ１に密接に連鎖される。ＡＭ１０ＧＡおよびＳＣＡ１の組換えは観察されなかった；ロッド・スコアは０．００の組換え画分において４２．１である。Ｄ６Ｓ８９とＳＣＡ１との間の組換え画分は０．００４である（６７．６のロッド・スコア）。ＳＢ１とＳＣＡ１との間の組換え画分は０．００７である（３９．５のロッド・スコア）。Ｄ６Ｓ１０９、ＬＲ４０およびＤ６Ｓ２０２は同様によくＳＣＡ１に連鎖されるが、距離がより大きい（それぞれ、０．０４、０．０３、および０．０８の組換え画分）。９つの大きい家系における遺伝地図作製に基づいて、ＳＣＡ１座はＤ６Ｓ８９およびＡＭ１０ＧＡに対して非常に密接し、Ｚ_max −１支持間隔は両方の場合において０．００２より小さいか、あるいはそれに等しい。

３．主要な組換え体の分析
Ｄ６Ｓ８９とＳＣＡ１との間の１つの組換え事象は影響を受けた個体において確証された。患者、第４図における個体ＭＩ−２は、また、ＳＢ１における組換え体であったが、ＬＲ４０およびＤ６Ｓ２０２において情報を与えなかった。彼はＨＬＡ、Ｄ６Ｓ１０９およびＡＭ１０座における病気のハプロタイプを有し、第４図において一番右の矢印がに示すように、ＳＣＡ１がＤ６Ｓ８９に対してセントロメアであること証明した。試料の混合の可能性を排除するために、患者のＤＮＡを髪の毛の試料から再抽出し、そしてＤ６Ｓ１０９、Ｄ６Ｓ８９、Ｄ６Ｓ２０２、ＬＲ４０、ＡＭ１０ＧＡ、およびＳＢ１について再型別した。髪の毛の試料からの結果は、患者の血液からの本来確立された細胞系からのものと合致した。患者の医学的記録を注意して再検査し、そして彼は事実失調を有することが確証された。さらに、彼のハプロタイプは姉妹および娘のものと合致した。

Ｄ６Ｓ１０９はＤ６Ｓ８９に対してセントロメアに横たわる；第４図に示すように、６つの組換え事象がＤ６Ｓ１０９とＳＣＡ１との間において観察された。この時点において、Ｄ６Ｓ１０９はＳＣＡ１に対して最も密接するセントロメアのマーカーである。第４図における矢印は影響を受けた染色体に対して共通の最大領域を示し、したがって、Ｄ６Ｓ８９からＤ６Ｓ１０９に伸びる、ＳＣＡ１遺伝子を含有する最大の可能な領域を示す。

追加のマーカー−ＳＣＡ１の組換え事象はＤ６Ｓ８９とＳＢ１との間において観察されなかった。さらにＳＢ１に対してテロメアであるマーカーはＳＣＡ１との追加の組換え−−ＳＣＡ１とＬＲ４０との間の１つの組換え事象およびＳＣＡ１とＤ６Ｓ２０２との間の３つの組換え事象−−を示す。これらの事象は第４図に描写されている（第４図に描写されているすべての組換え事象は影響を受けた個体におけるものである）。

ＩＩ． ＳＣＡ１遺伝子のために臨界的な遺伝地図作製
ＳＣＡ１遺伝子を含有する可能性のある領域（ＳＣＡ１臨界領域）の規定およびクローニングの究極的目標をもって、２．５Ｍｂの酵母の人工的染色体（ＹＡＣ）コンチグを発生させた。

Ａ．材料および方法
１．細胞系
Ｉ−７は、その唯一のヒト染色体として染色体６の短いアームを含有する、ヒト−ハムスターのハイブリッド細胞系である。参照、Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６、３５２−３５７（１９９０）。Ｒ８６、Ｒ７８、Ｒ７２、Ｒ５４およびＲ１７は、６ｐ２２−ｐ２３の種々の部分を保持する、放射線減数ハイブリッド細胞系である。参照、Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９、７１３−７２０（１９９１）。Ｒ５４はＤ６５８９に対してテロメアであることが知られているマーカー、例えば、Ｄ６Ｓ２０２およびＦ１３Ａを保持する。

２．新しいマーカーおよび配列標識化部位（ＳＴＳ）の発生
Ｄ６Ｓ８９を保持する放射線減数ハイブリッド（Ｒ８６）からＤＮＡ、およびＤ６Ｓ８９を保持しないが、直ちにフランキングするＤ６Ｓ８９マーカーを保持する４つの放射線ハイブリッド（Ｒ７８、Ｒ７２、Ｒ５４およびＲ１７）からのＤＮＡを比較Ａｌｕ−ＰＣＲにおいてを使用して、領域特異的ＤＮＡマーカーを分離した。参照、Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、６６８６−６６９０（１９８９）；およびＨ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９、７１３−７２０（１９９１）。さらに、Ｒ７８は６ｐのセントロメア領域から誘導されるマーカーを排除するとき有用であった。Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９、７１３−７２０（１９９１）。Ａｌｕ−ＰＣＲは個々にＡｌｕプライマー５５９および５１７（Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、６６８６−６６９０（１９８９））ならびにＰＤＪ３４（Ｃ．Ｂｒｅｕｋｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、３０９７（１９９０））を使用して実施した。Ｒ８６の中に存在するが、Ｒ７８、Ｒ７２、Ｒ５４およびＲ１７の中に存在しないことが発見されたＡｌｕ−ＰＣＲ断片を同定し、そしてＴ−ベクターのプロトコールを使用して修飾した、ＥｃｏＲＶ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＫＳ＋プラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラジョラ）の中にクローニングした。参照、Ｄ．Ｍａｒｃｈｕｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、１１５４（１９９０）。クローニングした断片をアプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州フォスターシティー）自動化配列決定装置で配列決定してＳＴＳを確立した。

３．ＹＡＣクローンの分離および特性決定
ワシントン大学のＹＡＣライブラリー（Ｂ．Ｈ．Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１３４８−１３５１（１９８９））、およびＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリー（Ｈ．Ｍ．Ａｌｂｅｒｔｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、４２５６−４２６０（１９９０））を、ＰＣＲに基づく方法によりスクリーニングした。参照、Ｅ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１２１３−１２１７（１９９０））；およびＴ．Ｊ．Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、７１９１−７１９２（１９９０）。５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ８．３，１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、２５０μＭの各ｄＮＴＰ；１．２５単位のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、コネチカット州ノーウォーク）および１μＭの各プライマーを含有する２５〜５０ｍｌの最終体積で、ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲサイクル条件を表６に特定する。

^a ＹＡＣはＣＥＰＨおよびワシントン大学のライブラリーからのものである。識別番号はライブラリー源を識別する（ワシントン大学の識別番号は文字の前に存在する）。いくつかのＹＡＣは２以上のＳＴＳで同定された；このような情報については、表２を参照されたい。
^b ＰＣＲ条件は９４℃で４分間、次いで１分間の９４℃の変性、１分間の特定した温度におけるアニーリング、および２分間の７２℃の伸長の３５〜４０サイクルであった。７２℃において７分の最後の伸長を使用した。ＰＣＲの緩衝液およびプライマーの濃度はテキストに記載されている通りである；５３Ｇ１２−Ｌ ＳＴＳについて、ＰＣＲ反応において２％のホルムアミドの最終濃度を使用した。

Ｄ．Ｃ．Ｓｃｈｗａｒｚら、Ｃｅｌｌ、３７、６７−７５（１９８４）；およびＧ．Ｊ．Ｂ．ｖａｎ Ｏｍｍｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ編；ｐｐ．１１３−１１７；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８６）に記載されているように、酵母ＤＮＡ−アガロースのブロックを製造した。すべてのＹＡＣクローンをパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により分析して、インサートの大きさを決定しそして単一のＹＡＣが特定のコロニーの中に存在することを確証した。０．５×ＴＡＥ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート／０．５ｍＭのＥＤＴＡ）の中の１％のファーストレーン（Ｆａｓｔｌａｎｅ）アガロース（ＦＭＣ、メイン州ロックランド）を通して酵母ＤＮＡを電気泳動させることによって、ＹＡＣインサートの大きさを決定した。異なるＳＴＳにおいて分離されたＹＡＣクローンの間の可能なオーバーラップの急速な検出のために、その領域の中に個々のＹＡＣのＡｌｕ−ＰＣＲ生成物を含有するフィルターに対して、新しいＹＡＣの標識化Ａｌｕ−ＰＣＲ生成物をハイブリダイゼーションさせた。ＹＡＣクローンの大部分は、Ｓ．Ｂａｎｆｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、１８１４（１９９２）に記載されているＡｌｕ−ＰＣＲドットブロット法を使用して、キメラ現象について試験した。従来Ｓ．Ｂａｎｆｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、１８１４（１９９２）に記載されているように、２４の異なるヒト染色体の各々を表すモノ染色体または高度に減数されたハイブリッドからのＡｌｕ−ＰＣＲ生成物を含有するドットブロットに対して、ＹＡＣクローンからのＡｌｕ−ＰＣＲ生成物をハイブリダイゼーションさせた。さらに、６ｐの異なるセグメントを表す放射線減数ハイブリッドからのＡｌｕ−ＰＣＲ生成物を含有するドットブロットを使用して、ＹＡＣが２つの非隣接セグメントを含有しないことを保証した。ＹＡＣクローンの末端は、従来Ｇ．Ｊｏｓｌｙｎら、Ｃｅｌｌ、６６、６０１−６１３（１９９１）に記載されているように逆ＰＣＲによるか、あるいはＤ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、６１５７−６１６１（１９９１）に記載されているようにＡｌｕ−ベクターＰＣＲにより分離した。Ａｌｕ−ベクターＰＣＲは、Ｃ．Ｂｒｅｕｋｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、３０９７（１９９０）に記載されているようなＡｌｕ−プライマーＰＤＪ３４およびＳＡＬ１；およびＭ．Ｃ．Ｗａｐｅｎａａｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２、９４７−９９５（１９９３）に記載されているようなｐＹＡＣ４ベクタープライマーおよびＧ．Ｐ．Ｂａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１、１８０−１８７（１９９２）に記載されている類似のベクターを使用して実施した。すべてのＹＡＣの末端は、ＹＡＣクローンからおよびハイブリッド細胞系：Ｉ−７、Ｒ８６およびＲ７２からのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを含有するサザンブロットに対するハイブリダイゼーションにより、領域的にマッピングされた。

４．ＹＡＣからのコスミドライブラリーの製造
コスミドライブラリーは４つのＹＡＣクローンから製造した；２２７Ｂ１、１９５Ｂ５、Ａ２５０Ｄ５、および３７９Ｃ２。ＹＡＣからのゲノムＤＮＡをＭｂｏＩで部分的に消化し、そして製造業者の推奨に従いコスミドベクターｓｕｐｅｒＣｏｓ１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラジョラ）の中にクローニングした。プローブとして放射性標識化剪断ヒトＤＮＡを使用して、ヒトインサートを含有するクローンを同定した。

５．長い領域の制限分析
Ｍ．Ｃ．Ｗａｐｅｎａａｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２、９４７−９９５（１９９３）に記載されているような希有カッター（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｅｒ）制限酵素を使用しそしてＧ．Ａ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、７４８５−７４８９（１９８９）におけるように、ＹＡＣプラグを完全に消化した。酵素はニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチュセッツ州ベベリイ）およびベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（インジアナ州インジアナポリス）から購入し、そして製造業者が推奨するように使用した。５０ｋｂ〜６００ｋｂの範囲のＤＮＡ断片を分離する条件下にバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＣＨＥＦ装置で、すべてのＰＦＧＥ分析を実施した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、そして酸ニッキングするか、あるいはＵＶストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラジョラ）の中で２００，０００ｍＪの紫外線エネルギーに暴露した。ゲルを０．４Ｎ ＮａＯＨの中で変性し、そして１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ／１５０ｍＭのクエン酸ナトリウム）または０．４Ｎ ＮａＯＨの中でハイブリダイゼーション膜（オンコール（Ｏｎｃｏｒ）、マリイランド州ガイサーバーグ）に製造業者の推奨に従い移した。フィルターのハイブリダイゼーションは表６および第６図に記載されているプローブを使用して実施した。また、それぞれ、左（ＴＲＰ／ＣＥＮ）および右（ＵＲＡ）のｐＹＡＣ４に対して特異的な２．５ｋｂおよび１．６ｋｂのｐＢＲ３２２ＢａｍＨＩ／ＰｒｕＩＩ断片を使用した。プローブをＡ．Ｐ．Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３７、２６６−２６７（１９８４）に記載されているランダムプライミング技術により放射性標識化した；反復配列を従来Ｐ．Ｇ．Ｓｅａｌｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３、１９０５−１９２２（１９８５）に記載されているように剪断ヒト胎盤ＤＮＡによりブロックした。

６．ジヌクレオチド反復の分析
プライマーの配列およびＰＣＲサイクル条件を表６に表す。緩衝液の条件はＡｌｕ−ＰＣＲと同一であった。すべての反応体積は２５μｌであり、そして４０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。各対の一方のプライマーを５’末端において［γ−³²Ｐ］ｄＡＴＰで標識化した。各反応の４μｌを２μｌのホルムアミド負荷緩衝液と混合し、９０〜１００℃において３分間変性し、氷上で冷却し、そして４〜６μｌを４％のポリアクリルアミド／７．６５Ｍの尿素の配列決定ゲル上の電気泳動のために使用した。

Ｂ．結果
１．６ｐ２２−ｐ２３およびＹＡＣのスクリーニングにおける配列標識化部位の発生
Ｄ６Ｓ８９を保持する放射線ハイブリッド（Ｒ８６）からおよびＤ６Ｓ８９について欠失するが、Ｄ６Ｓ８９をフランクするマーカーを保持する４つの放射線ハイブリッド（Ｒ７８、Ｒ７２、Ｒ５４およびＲ１７）からのＡｌｕ−ＰＣＲ生成物の比較分析は、Ｒ８６の中に存在するが、他の４つのの中に存在しない３つの新しいＤＮＡ断片の同定を可能とした。これらの３つのＤＮＡ断片を、ＡＭ１０、ＡＭ１２およびＦＬＢ１命名し、分離し、そして６ｐ体細胞のハイブリッドのパネルおよび放射線減数ハイブリッドのパネルを使用してマッピングして（Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９、７１３−７２０（１９９１））それらの領域の局在化を確証した。すべての３つは６ｐおよびＲ８６にマッピングされ、Ｄ６Ｓ８９座への密接な近位を確証した。それらの３つのＡｌｕ−ＰＣＲ断片をサブクローニングしそして配列決定して、配列決定された標識化部位（ＳＴＳ）を確立した。ＡＭ１０、ＡＭ１２、ＦＬＢ１およびＤ６Ｓ８９におけるＳＴＳを使用して、ワシントン大学およびＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーをスクリーニングした（Ｈ．Ｍ．Ａｌｂｅｒｔｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、４２５６−４２６０（１９９０）；およびＢ．Ｈ．Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１３４８−１３５１（１９８９））。これらの４つのＳＴＳにおいて分離されたＹＡＣをオーバーラップについて分析した。コンチグ末端を表すＹＡＣからのインサートの末端を分離し、サブクローニングし、そして配列決定して、それ以上のＹＡＣのウォーキングのための新しいＳＴＳを確立した。１つの場合において、ＹＡＣ １９５Ｂ５について発生したコスミドライブラリーから誘導したコスミドからのサブクローンを使用することによって、ＳＴＳを確立した。

最近、いくつかの高度に情報を与えるジヌクレオチド反復のマーカーが、Ｊ．Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３５９、７９４−８０１（１９９２）により同定されそして遺伝的にマッピングされた。前述したように、２つのマーカーＤ６Ｓ２７４およびＤ６Ｓ２８８がＳＣＡ１臨界領域内にマッピングされることが発見され、そして引き続いてこれらをＹＡＣライブラリーをスクリーニングするために使用した。表６に列挙するＳＴＳを使用して、ＹＡＣクローンを分離した。

２．ＹＡＣクローンの特性決定
ＹＡＣインサートの大きさをパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により決定した；インサートの大きさは７５〜８５０ｋｂであった。インサートのキメラ現象の高い頻度が与えられると、Ｓ．Ｂａｎｆｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、１８１４（１９９２）に記載されているように、キメラ現象の急速な検出のためのＡｌｕ−ＰＣＲに基づくハイブリダイゼーションの戦略を使用した。３０のＹＡＣクローンをこのアプローチを使用して試験し、そして８つ（２７％）はキメラであることが発見された。ＹＡＣから分離されたインサートの末端は、ドットブロットハイブリダイゼーションにより非キメラであると決定され、他のキメラにマッピングされることが証明された１９８Ｃ８からの２つの末端を除外して、６ｐ２２−ｐ２３にマッピングされた。

２つのアプローチ、逆ＰＣＲ（Ｇ．Ｊｏｓｌｙｎら、Ｃｅｌｌ、６６、６０１−６１３（１９９１）およびＡｌｕ−ＰＣＲ（Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、６６８６−６６９０（１９８９）に記載されているものに類似する）を使用して、ＹＡＣ末端を分離した。全体で、３４のＹＡＣ末端が分離された；逆ＰＣＲは２６末端を生じそしてＡｌｕ−ベクターＰＣＲは８末端を生じた。１９５Ｂ５ ＹＡＣの左末端を分離するために、われわれはプローブとしてｐＹＡＣ４の左末端の配列（Ｓ．Ｋ．Ｂｒｏｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１６７６−１６８０（１９９１））を使用してこのＹＡＣから調製したコスミドライブラリーをスクリーニングした。このアプローチを採用した。なぜなら、逆ＰＣＲは主としてＡｌｕを含有する配列である末端を生じそしてＡｌｕ−ＰＣＲは末端を生ずることができなかったからである。コスミドのクローンＡ３２は１９５Ｂ５の左末端を含有することが発見され、そしてサブクローン６４Ｕを使用して、それ以上のＹＡＣライブラリーのスクリーニングのためのＳＴＳを確立した。

すべてのＹＡＣ末端またはサブクローンの６ｐ２２−ｐ２３領域的起源を確証するために、これらの断片を、６ｐ（Ｉ−７）を保持する体細胞ハイブリッドから、６ｐの断片を保持することが知られている放射線減数ハイブリッド（Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９、７１３−７２０（１９９１））からおよび特定のＳＴＳにおけるＹＡＣクローンからのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを含有するサザンブロットに対して、プローブとして使用した。

３．ＹＡＣのプローブ含量のマッピング
クローンの間のオーバーラップの程度を定めそして可能な再配列、例えば、ＹＡＣの内部の欠失を検出するために、プローブの含量のマッピングの戦略を次に基づいて使用した：１）表６に記載するもの、および高度に情報を与えるジヌクレオチド反復、例えば、ＡＭ１０−ＧＡおよびＳＢ１におけるものの両方を含む領域におけるすべてのＳＴＳを使用するすべてのクローンのＰＣＲ分析；および２）ＹＡＣ末端、ＹＡＣのコスミドのサブクローン、またはＹＡＣからのＡｌｕ−ＰＣＲ断片から誘導された密に間隔を置いて位置するＤＮＡプローブと、関係する領域の中にＹＡＣからのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを含有するサザンブロットをハイブリダイゼーションさせること。ＹＡＣ（３２クローン）の代表的なサブセットについての分析の結果を表７に要約する。３９のＹＡＣクローンは、Ｄ６Ｓ２７４から８２Ｇ１２−Ｒ（ＹＡＣクローン０Ｇ１２の左末端）の中断しないＹＡＣコンチグを形成する。１つのＹＡＣ（３５１Ｂ１０）における内部の欠失以外に、この分析の分解能内で他の欠失は検出されなかった；さらにいくつかのＹＡＣクローン（例えば、２７０Ｄ１２および１４０Ｈ２）についてのキメラ現象の程度を決定した。６ｐ上のＹＡＣコンチグのセントロメア−テロメアの向きは、遺伝データならびに物理的マッピングのデータの両方を使用して決定された。Ｄ６Ｓ８９とＳＣＡ１との間の組換え事象をもつ主要な個体におけるＤ６Ｓ１０９、ＡＭ１０ＧＡ、Ｄ６Ｓ８９、およびＳＢ１におけるジヌクレオチド反復の分析を使用すると、ＡＭ１０ＧＡとＤ６Ｓ８９との間で組換え事象が起こったことを明らかにした。Ｄ６Ｓ１０９がＤ６Ｓ８９に対してセントロメアであることが与えられると、組換えの分析はＡＭ１０ＧＡがＤ６Ｓ８９に対してセントロメアであることを示唆する。Ｄ６Ｓ８９に関するＳＢ１のセントロメア−テロメアの位置は遺伝的に決定することができなかった。

注：（＋）＝存在、（−）＝不存在；Ｙ／Ｎ＝キメラ現象は検出される／されない。ＹＡＣ末端はＹＡＣの名称および引き続く左または右についてのＬまたはＲにより識別される。

放射線ハイブリッドおよびＹＡＣの両方を使用する物理的マッピングを実施して、遺伝子座のセントロメア−テロメアの順序を分解した。放射線減数ハイブリッドＲ１７およびＲ７２はＤ６Ｓ８９に対してセントロメアのマーカーを含有することが知られている；これらのマーカーはＤ６Ｓ１０９に対してセントロメアにマッピングするＤ６Ｓ１０８およびＤ６Ｓ８８を含む。参照、Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９、７１３−７２０（１９９１）。また、Ｒ７２はＤ６Ｓ１０９を保持するが、Ｒ１７において小さいギャップを明らかにされ、この放射線ハイブリッドはＤ６Ｓ１０９を保持しなかったが、Ｄ６Ｓ１０９座においてＹＡＣから分離された末端について陽性であった。放射線減数ハイブリッドの分析はＤ６Ｓ２７４およびＤ６Ｓ２８８がＲ１７、Ｒ７２およびＲ８６の中に存在することを明らかにしたが、ＡＭ１０ＧＡ、Ｄ６Ｓ８９、およびＳＢ１はＲ８６の中にのみ存在する（第５図）。さらに、Ｄ６Ｓ２６０およびＤ６Ｓ２８９、Ｄ６Ｓ２８８に対してテロメアである２つのジヌクレオチド反復を使用するＳＴＳ含量のマッピング（Ｊ．Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３５９、７９４−８０１（１９９２））は、Ｄ６Ｓ２６０がＤ６Ｓ８９およびＳＢ１と同一のＹＡＣ（３７９Ｃ２および１６８Ｆ１）の中に存在すること、およびＤ６Ｓ２８９は、それぞれ、ＦＬＢ１およびＡＭ１２ＳＴＳを使用して誘導された５７Ｇ３および３５Ｅ８２つのＹＡＣの中に存在することを明らかにした。これらのデータは、遺伝子座の順序ならびに第６図に表されているＹＡＣコンチグのセントロメア−テロメアの向きが正しいことを確証する。

第６図は、Ｄ６Ｓ２７４から８２Ｇ１２−Ｒへの全体のコンチグをスパンするＹＡＣクローンの選択したサブセットを示す。最小数の８ＹＡＣはこの領域をスパンする。また、ＹＡＣの分離に使用したＳＴＳの位置が示されている。ＹＡＣの大きさおよびオーバーラップの程度に基づいて、このコンチグはＤ６Ｓ８９がほぼ中央に位置する６ｐ２２−ｐ２３の中の２．５ＭｂのゲノムＤＮＡをスパンすることが推定される。

４．ＳＣＡ１臨界領域の描写
最近同定されたジヌクレオチド反復（ＡＭ１０ＧＡおよびＳＢ１）を使用する遺伝の研究は、ＳＣＡ１が９つの大きいＳＣＡ１家系においてＡＭ１０ＧＡに非常に密接したＤ６Ｓ８９座に対してセントロメアにマッピングする（ゼロの組換え頻度において４２．１のピーク負荷スコア）ことを示した（上の実施例１）。こうして、Ｄ６Ｓ８９はテロメア末端における最も近いフランキングマーカーである。以前において、最も近いフランキングマーカーはＤ６Ｓ１０９、すなわち、Ｄ６Ｓ８９に対して６．７ｃＭセントロメアであると推定されたジヌクレオチド反復であった。セントロメア末端におけるより近いフランキングマーカーを同定するために、われわれは６ｐ２２−ｐ２３をマッピングすることが知られている４つのジヌクレオチド反復を含有するマーカー、Ｄ６Ｓ２６０、Ｄ６Ｓ２７４、Ｄ６Ｓ２８８およびＤ６Ｓ２８９をマッピングした（Ｊ．Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３５９、７９４−８０１（１９９２））。放射線減数ハイブリッドおよびこの領域から分離されたＹＡＣクローンを使用して、これらのマーカーの領域的マッピングを実施した。これらのデータを明らかにするように、ＡＭ１０ＧＡに対してセントロメアであることが知られている放射線ハイブリッドＲ１７およびＲ７２からのＤＮＡの増幅により明らかであるように、Ｄ６Ｓ２７４およびＤ６Ｓ２８８はＡＭ１０ＧＡに対してセントロメアにマッピングする。Ｄ６Ｓ１０９とＤ６Ｓ８９との間の主要な組換え事象を有する個体から、ならびに５つのＳＣＡ１家系（ＭＮ−ＳＣＡ１、ＭＩ−ＳＣＡ１、ＴＸ−ＳＣＡ１、Ｍ−ＳＣＡ１およびＭＡ−ＳＣＡ）からの影響を受けたおよび正常の個体（染色体の相を確立するために）からのＤＮＡの遺伝子型の分析を実施した。この分析はＤ６Ｓ２８８とＳＣＡ１との間の組換えがないことを明らかにした。Ｄ６Ｓ２７４とＤ６Ｓ２８８との間の単一の組換え事象がＭＮ−ＳＣＡ１家系からの個体ＭＮ−１において検出された（第７図）；この個体はＳＣＡ１とＤ６Ｓ１０９との間の組換え事象を有するとして上で同定された６つの個体のうちの１つであった。この分析はセントロメア末端における最も近いフランキングマーカーとしてＤ６Ｓ２７４の同定を可能とした。これらのデータを前述のデータと組み合わせると、ＳＣＡ１臨界領域はＤ６Ｓ２７４とＤ６Ｓ８９との間でマッピングすることが決定された。この候補の領域（１．２Ｍｂ）を、第８図に示すように最小の４つのオーバーラップするおよび非キメラのＹＡＣの中でクローニングする。

５．長い領域の制限マッピング
ＳＣＡ１臨界領域におけるＹＡＣコンチグの大きさの推定値を得るために、われわれはこの領域からのＹＡＣについて長い領域の制限分析を実施した。この分析のために使用したＹＡＣは次のものを包含した：２２７Ｂ１、６０Ｈ７、３５１Ｂ１０、１７２Ｂ５、１９５Ｂ５、Ａ２５０Ｄ５、３７９Ｃ２、および１６８Ｆ１。次の希有カッター制限酵素を使用した：ＮｏｔＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｒｕＩ、ＭｌｕＩ、およびＳａｃＩＩ。ＰＦＧＥにより分離しそしてナイロン膜上に移した制限断片をいくつかのＤＮＡプローブにフィルターを順次にハイブリダイゼーションすることによって検出し、プローブは次のものを包含した：ｐＹＡＣ４ベクターの左および右のアームに対して特異的なＤＮＡプローブ；内部のＹＡＣクローンのためのインサートの末端；内部のプローブおよびコスミドのサブクローン；およびＡｌｕ特異的プローブ。長い領域の制限分析において使用したすべてのプローブの位置および名称を第８図に示す。この分析に基づいて、ＹＡＣ ３５１Ｂ１０についての内部の欠失が確証された。ＹＡＣクローンの間のオーバーラップの程度を決定した。重要ＳＣＡ１領域の大きさは１．２Ｍｂであると推定された。内部の欠失および／または再配列は、単一のＹＡＣを制限酵素分析により分析した区域について排除することができなかった。これらはＹＡＣ １９５Ｂ５内の２２０ｋｂの領域およびＹＡＣ ３７９Ｃ２内の３３５ｋｂ領域を包含する。

ＩＩＩ． ＳＣＡ１における不安定なトリヌクレオチド反復の拡張
Ａ．方法
１．トリヌクレオチド反復についてのスクリーニング
ＹＡＣからのゲノムＤＮＡをＭｂｏＩで部分的に消化し、そして製造業者のプロトコールに従いコスミドベクターｓｕｐｅｒＣｏｓＩ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の中にクローニングした。ヒトインサートを含有するクローンを放射性標識化ヒトＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより同定し、そして格子のプレート上に配列した。ＹＡＣ２２７Ｂ１からのコスミドのクローンのフィルターのリフトを、［γ−³²Ｐ］末端標識化（ＧＣＴ）、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより、トリヌクレオチド反復の存在についてスクリーニングした。平行実験において、トリヌクレオチド反復の種々の順列を表す１０オリゴヌクレオチドの混合物を末端標識化し、そしてＹＡＣの１９５Ｂ５およびＡ２５０Ｄ５からのＥｃｏＲＩ消化コスミドのサザン転移に対してハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは１Ｍ ＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストランの溶液の中で実施した。フィルターを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである）、および０．１％ＳＤＳの中で室温において１５分間洗浄し、次いで６７℃に前もって加温した溶液の中で室温において１５分間洗浄した。両方の戦略はいくつかの陽性のクローンを同定し、それらのうちの２２はオーバーラップしており、そして同一の３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含有し、この断片は（ＧＣＴ）₇ プローブに対してハイブリダイゼーションしそして究極的に配列の分析によりＣＡＧ反復を有することが証明された。

２．ゲノムの消化およびサザンブロット
ゲノムＤＮＡをＴａｑＩ（ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インジアナ州インディアナポリス）またはＢｓｔＮＩ（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチュセッツ州ベベリイ）で製造業者の推奨に従い消化した。サザンブロッティングは標準のプロトコールに従い実施した。

３．ＤＮＡ配列決定
ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有しかつフランキングする領域の中のＤＮＡ配列を決定するために、３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含有するＣＡＧトリヌクレオチド反復、クローンｐＧＣＴ−７、をサブクローニングした。ＣＡＧトリヌクレオチド反復をもつ４００ｂｐの断片をｐＧＣＴ−７からＳａｕ３ＡＩ消化により発生させ、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラジョラ）のＢａｍＨＩの中にサブクローニングした（クローンｐＧＣＴ−７．ｓ１）。さらに、ｐＧＣＴ−７をＰｓｔＩで消化して１．３ｋｂのＤＮＡを除去し、そして形質転換について再循環した（クローンｐＧＣＴ−７．ｐ２）。トリヌクレオチド反復の位置を（ＧＣＴ）₇ オリゴヌクレオチドおよびフランキング配列決定プライマーの１つをＰＣＲプライマーとして使用するＰＣＲにより決定した。初期の結果は、ＣＡＧトリヌクレオチド反復が逆プライマー鎖上に、逆プライマーから約１．３ｋｂ、すなわち、ＰｓｔＩから４００ｂｐに存在することを示した。シクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）および△Ｔａｑサイクル−配列決定キット（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルス（Ｕｎｉｔｅｓ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、オハイオ州クレブランド）を使用するジデオキシ連鎖停止法により、ＤＮＡ配列決定を実施した。汎用（−４０）プライマーおよび逆プライマーの両方をクローンｐＧＣＴ−７．ｓ１のために使用したが、汎用（−４０）プライマーのみをｐＧＣＴ−７．ｐ２の配列決定に使用した。

４．ＲＴ−ＰＣＲおよびノザン分析
チオシアン酸グアニジニウムおよび引き続いて塩化セシウム勾配を使用して、全体のＲＮＡをリンパ芽球様細胞から抽出した。ダイナル（Ｄｙｎａｌ）（グレイト・ネック（Ｇｒｅａｔ Ｎｅｃｋ）、ニューヨーク）からのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）オリゴ（ｄＴ）₂₅を使用して、ポリ（Ａ）- ＲＮＡを選択した。ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。次の３サイクルを使用するホット・スタートＰＣＲにより、ＲＴ−ＰＣＲを実施した：１分間９７℃、１分間５９℃、および１分間７２℃、Ｐｒｅ１およびＰｒｅ２のプライマーの組について。次いで、１分間９４℃、１分間５７℃、および１分間７２℃の３３サイクルを実施した。Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２のプライマー対について、それぞれ、５７℃および５５℃のより低いアニーリング温度において同一ＰＣＲサイクル条件に従った。ＲＴ−ＰＣＲ生成物を６％ヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）アガロースゲル上で分析した。種々のヒト組織を含有するノザンブロットをクローンテク（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。

５．ＰＣＲ分析
１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、３００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｅｐ−１／Ｒｅｐ−２について１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂ および２５０μＭの各ｄＮＴＰ）、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、および１単位のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、コネチカット州ノーウォーク）を含有する２０μｌの合計の体積において、５０ｎｇのゲノムＤＮＡを５ｐｍｏｌの各プライマー（ＣＡＧ−ａ／ＣＡＧ−ｂまたはＲｅｐ−１／Ｒｅｐ−２）と混合した。ＣＡＧ−ａ／ＣＡＧ−ｂプライマー対について、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰをＰＣＲ反応に混入し、Ｒｅｐ−１／Ｒｅｐ−２プライマー対について、Ｒｅｐ−１プライマーを５’末端において［γ−³²Ｐ］ｄＡＴＰで標識化した。Ｒｅｐ−１／Ｒｅｐ−２プライマー対使用するとき、ホルムアミドを２％の最終濃度で使用した。試料上に鉱油を配置し、試料を９４℃において４分間変性し、次いで３０サイクルの変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、および伸長（７２℃、２分）を実施した。６マイクロリットル（μｌ）の各ＰＣＲ反応混合物を４μｌのホルムアミド負荷緩衝液と混合し、９０℃において２分間変性し、そして６％ポリアクリルアミド／７．６５Ｍ尿素ＤＮＡ配列決定ゲルを通して電気泳動させた。移動をＭ１３配列決定ラダーに関して比較することによって、アレレの大きさを決定した。

Ｂ．結果
１．ＳＣＡ１におけるＣＡＧ反復領域のクローニング
前述したように、ＳＣＡ１遺伝子をクローニングする努力において、６ｐ２２−ｐ２３にマッピングするいくつかのジヌクレオチド反復の多形性を使用して主要な組換え事象を分析して、ＳＣＡ１遺伝子を含有する可能性がある小さい領域を同定した。この分析により、５つの大きい家系においてＳＣＡ１とセントロメアのマーカーＤ６Ｓ２８８との間において、あるいは９つの大きい家系においてＳＣＡ１とテロメアのマーカーＡＭ１０ＧＡとの間において、組換え事象が存在しないことが明らかにされた。単一の組換え事象がＤ６Ｓ２７４とＤ６Ｓ２８８との間において検出され、セントロメアの末端における最も近いフランキングマーカーがＤ６Ｓ２７４であることが同定された。テロメアの末端において、単一の組換え事象がＡＭ１０ＧＡとＤ６Ｓ８９との間において検出され、そして後者がフランキングマーカーとして同定された。Ｄ６Ｓ２７４からＤ６Ｓ８９に伸長しそして全体のＳＣＡ１の候補の領域をスパンする、酵母の人工的染色体（ＹＡＣ）コンチグが発生した。この領域を包含するＹＡＣクローンのサブセットを第９図に示す。長い領域の制限分析は、ＳＣＡ１の候補の領域の大きさがほぼ１．２Ｍｂであることを決定した。コスミドのライブラリーをＹＡＣの２２７Ｂ１、１９５Ｂ５、Ａ２５０Ｄ５。ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）３７９Ｃ２から構成した。ヒトインサートを含有するコスミドのクローンの配列を、直列に反復するＣＡＧから成るオリゴヌクレオチドと、ならびに他のトリヌクレオチド反復を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた。いくつかのハイブリダイゼーションするコスミドのクローンが同定され、それらのうちの２３はＣＡＧ反復について陽性であり、そしてＤ６Ｓ２８８とＡＭ１０ＧＡとの間の領域にマッピングされた（第９図）。すべての２２のこれらのクローンは、ＣＡＧ反復に特別にハイブリダイゼーションした共通の３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を共有した。

２．サザン分析を使用するＣＡＧ反復の変異性
ＳＣＡ１におけるこの反復の遺伝的安定性を試験するために、われわれはサザンブロット分析を使用して若年性発症ＳＣＡ１を有する家族を検査した。ＴＸ−ＳＣＡ１家族からの２世代下がった家系図を第１０ａ図に示す。ＴａｑＩ断片の拡張を有するＳＣＡ１の父系伝達が認められた。２８３０ｂｐの断片が影響を受けなかった配偶者からのＤＮＡにおいてかつＳＣＡ１患者からの正常の染色体上に検出されたが、２９３０ｂｐの断片は影響を受けた父（２５歳の発症）からのＤＮＡにおいて見出されそして３０００ｂｐの断片は４歳の発症の彼の影響を受けた子供からのＤＮＡにおいて検出された。第２のＳＣＡ１家系、家族ＭＮ−ＳＣＡ１（第１０ｂ図）において、２つの子孫は彼らの父からのＳＣＡ１を受け継ぎそして発症年齢が異なった（２５歳および９歳）。これらの個体は、また、彼らの影響を受けた父から受け継いだ増幅されたＴａｑＩ断片の大きさが異なった、それぞれ、２９００ｂｐおよび２９７０ｂｐ。

同一ＴＸ−ＳＣＡ１若年性発症の家族からのＳＣＡ１染色体上の（ＣＡＧ）_n を含有する断片の拡大は、また、ＢｓｔＮＩ消化後のサザン分析により証明された。ＢｓｔＮＩ断片は正常染色体上の５３０ｂｐであり、ＳＣＡ１影響を受けた父において６１０ｂｐであり、そして影響を受けた若年性発症の子孫において６８０ｂｐである（第１０ｃ図）。これらの家族の各々において、多数（１０より大きい）のジヌクレオチド反復のマーカーを使用する遺伝子型の分析により、非父系を排除した。３０人の影響を受けなかった配偶者からのＤＮＡにおける（ＣＡＧ）_n を含有するＴａｑＩ断片の大きさを、後期の発症のＳＣＡ１で影響を受けた６２人の個体からのＤＮＡにおけるＴａｑＩ断片を含有する反復の大きさと比較した。影響を受けた個体は５つのＳＣＡ１家族からのものである：ＬＡ−ＳＣＡ１、ＭＩ−ＳＣＡ１、ＭＮ−ＳＣＡ１、およびＴＸ−ＳＣＡ１。すべての３０人の配偶者において、断片の大きさはほぼ２８３０ｂｐであり、そして拡張または減少は子孫への伝達とともに検出された。対照的に、６２のＳＣＡ１影響を受けた個体のうちの５８からのＤＮＡは２８３０ｂｐの断片に加えて２８６０ｂｐ〜３０００ｂｐの大きさの範囲の拡張したＴａｑＩ断片を検出可能に含有した。残りの４個体からのＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により分析したとき、拡張を含有することが発見された。拡張した断片は常に病気とともに分離し、そしてある場合において断片は連続する世代においてさらに拡張した。若年性症例において、拡張した制限断片は影響を受けた親（均一に分析した症例における父）におけるより大きく、ＤＮＡ配列の拡張がＳＣＡ１の突然変異の基礎であるという結論を支持した。

３．反復領域のゲノムＤＮＡの分析
ＤＮＡの拡張に関係する領域を同定するために、３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の５００ｂｐの（ＣＡＧ）_n を含有するサブクローンならびに全体の３．３６ｋｂの断片（第１図）を配列決定した。この正常のアレレは３０のＣＡＧ反復領域を明らかにした。２つの反復単位（位置１３および１５）において、ＴがＧの代わりに存在した。

少なくとも２つの民族的背景、アメリカの黒人および白人、を表す５つの異なる家系からのＰＣＲにより検査したすべての影響を受けた個体において、トリヌクレオチド反復の拡張が観察された。ＳＣＡ１に非常に密接に連鎖するＤＮＡマーカー（Ｄ６Ｓ２７４、Ｄ６Ｓ２８８、ＡＭ１０ＧＡ、Ｄ６Ｓ８９およびＳＢ１）を使用する遺伝子型の分析において、分析した５つの家族の間に病気とともに分離する４つのハプロタイプが存在することが明らかにされた。

４．トリヌクレオチド反復は転写される
ＣＡＧ反復領域が遺伝子内に存在するかどうかを試験するために、反復を直ちにフランキングするプライマー（Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２）ならびに反復に直ちに隣接する配列を増幅するプライマー（Ｐｒｅ１およびＰｒｅ２）を使用して、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＣＡＧ反復がリンパ芽球からのｍＲＮＡの中に存在することを確証する。さらに、プローブとして３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片からの１．１ｋｂのサブクローン（Ｃ２０８−１．１）を使用する、ヒトポリ（Ａ）- ＲＮＡのサザンブロット分析は、脳、骨格筋、胎盤においておよびより少ない程度に腎臓、肺および心臓において発現される１０ｋｂの転写体を同定した。この転写体の発現は骨格筋においてかなりの程度である。ノザンブロット上のプローブとして３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を使用したとき、同一大きさの転写体が検出された。

５．ＣＡＧ反復のＰＣＲ分析
ＣＡＧ反復が観察された長さの変動に関係することを確証するために、われわれはＣＡＧ反復をフランキングする合成オリゴヌクレオチドを使用して、４５の影響を受けなかった配偶者および３１のＳＣＡ１影響を受けた個体においてＰＣＲ増幅した断片の大きさを分析した。１対のプライマー（ＣＡＧ−ａ／ＣＡＧ−ｂ）は９ｂｐの反復内に位置しそして同定された長さの変動はＣＡＧ反復が変動の基礎であることを示した。

正常の個体は２５〜３６反復単位の範囲の１１アレレを表示した（表８）。正常の個体におけるヘテロ接合性は８４％であった。３１のＳＣＡ１で影響を受けた個体において、この配列を検査すると、各々はヘテロ接合体であり、１つのアレレは正常の個体において見られる大きさの範囲内でありそして第２の拡張したアレレは４３〜８１反復単位の範囲内にあることが証明された（第１１図）。後期の発症のＳＣＡ１の個体は少なくとも４３の反復を示したが、５９〜８１単位は若年性症例において見出された。第１２図は発症年齢と反復単位数との間の相関を描写する。−０．８４５の線型相関係数（ｒ）が得られ、これは発症年齢の変動の７１．４％（ｒ² ）は（ＣＡＧ）_n 反復単位の数により説明することができることを示す。最大のトリヌクレオチド反復の拡張は、典型的にはいっそう急速な進行を有する若年性発症を有するＳＣＡ１患者において認められた。これらの患者のすべては影響を受けた男性の子孫であることは興味あることであり、これは若年性症例における男性の伝達の優勢が存在するハンチントン病を暗示する。
ＣＡＧ反復を含有する断片の配列の分析は、いくつかの伸長したオープンリーディングフレームの存在を示した。これらのフレームの１つ（３８９ｂｐ）における反復の翻訳はポリグルタミンをエンコードするであろう。

ＩＶ． ＳＣＡ１ｃＤＮＡの分離
Ａ．方法
１．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
３つのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした：ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラジョラ）からのヒト胎児脳ライブラリー、インサートがＮｏｔＩ制限部位の中にクローニングの中にクローニングされたλ−ＺａｐＩＩの中で構成されたヒト胎児脳ライブラリー（チェン・チ・リー（ＣｈｅｎｇＣｈｉ Ｌｅｅ）博士、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｃｉｃｉｎｅ、により提供された）、およびクローンテク（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）からの大人小脳ｃＤＮＡライブラリー。細菌株ＬＥ３９２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５７２）を使用して、ライブラリーを５０，０００ｐｆｕ／プレートの密度で１５０ｃｍのプレート上にプレートした。ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎフィルター（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、イリノイ州アーリントンハイツ）を使用して、プラークのリフトを実施した。第１スクリーニングにおいてプローブとして使用した断片は、反復を直ちにフランキングするプライマーＲｅｐ１およびＲｅｐ２（第３図）および反復に直ちに隣接する配列を増幅するプライマーＰｒｅ１およびＰｒｅ２、および３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の１．１ｋｂのサブクローン（第１図）を使用することによって得られた、２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の混合物を含んだ。１．１ｂｐの断片（Ｃ２０８−１．１）はＣＡＧ反復に対して５４０ｂｐ３’に位置する。また、ＣＡＧ反復を含有する同一コスミドから誘導された９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をこのスクリーニングにおいて使用した。スクリーニングの引き続くラウンドは、プローブとしてｃＤＮＡクローン３１−５、３Ｊ、３ｃ７−２および３ｃ７を使用して同一ライブラリーについて実施した（第１３図）。ゲノムおよびｃＤＮＡのプローブを、Ａ．Ｐ．Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３７、２６６−２６７（１９８４）に記載されているランダムプライムド技術を使用して標識化した。反復配列をＰ．Ｇ．Ｓｅａｌｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３、１９０５−１９２２（１９８５）に記載されているようにブロックした。簡単に述べると、プローブを大過剰の剪断ヒト胎盤ＤＮＡと再連合した。非反復領域は一本鎖のままであり、そして低いコピー数の成分からのシグナルを引き続く転移ハイブリダイゼーションにおいて検出できるようにするためには、再連合した断片からの一本鎖断片の分離は不必要であった。次いで、フィルターのハイブリダイゼーションをＨ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４２、８７７−８８３（１９８８）に記載されているような標準のプロトコールに従い実施した。

２．ＤＮＡ配列決定および配列の分析
Ａ．Ｔ．Ｂａｎｋｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５、５５−９３（１９８７）に記載されているように、次のｃＤＮＡクローンの各々についてショットガンライブラリーをＭ１３の中で構成した：８−８、３１−５、３ｃ５、３ｃ７−１、３Ｊ、３ｃ７−２、３ｃ７（第１３図）。Ｒ．Ｇｉｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６、１９１９−１９２３（１９８９）に記載されているように、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＢＩ３７０Ａ、自動化蛍光配列決定装置を使用して、２０〜３０のＭ１３サブクローンを各ｃＤＮＡクローンについて配列決定した。二本鎖鋳型についてシクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）配列決定キット（ＵＳＢ、オハイオ州クレブランド）を製造業者の推奨に従い手動的に使用して、いくつかのｃＤＮＡクローン（８−９ｂ、８−９ａ、ＡＸ１、Ｂ２１、Ｂ１１、３ｃ２８）を部分的に配列決定した。分析したｃＤＮＡ／ゲノムのクローンの数による配列の被覆はコーディングおよび５’ＵＴＲにおいて３〜４Ｘであり、そして３’ＵＴＲにおいて２Ｘであり、そして逆ＰＣＲ生成物は、Ｄ．Ｍａｒｃｈｕｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、１１５４（１９９０）に記載されているようにＴ−ベクターのプロトコールを使用して修飾した、ＳｍａＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−プラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラジョラ）の中にサブクローニングした後、手動的に配列決定した。このプロトコールの使用はクローニングを促進する。簡単に述べると、Ｔａｑポリメラーゼは通常ＰＣＲ生成物の３’末端においてアデノシンの鋳型依存性付加を引き起こし、平滑末端の結合を困難とする。Ｔ−ベクターのプロトコールにおいて、チミジンは消化したプラスミドの３’末端に付加される。これにより、ＰＣＲ生成物における３’アデノシンに対して相補的な１塩基の粘着末端が生じ、これはクローニングの効率を大きく増加する。

ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ウイスコンシン州マディソン）およびナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｎｔｉｏｎ）からのＢＬＡＳＴネットワークサービスを使用して、データベースのサーチを実施した（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３−４１０（１９９０））。ＳＣＡ１転写体の配列は遺伝子バンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）に寄託された、受け入れ番号Ｘ７９２０４。

３．ノザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムＰＣＲの分析
種々のヒト組織からのポリ−（Ａ）⁺ ＲＮＡおよび大人のヒト小脳からのポリ−（Ａ）⁺ ＲＮＡのノザンブロットをクローンテク（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。ヒトリンパ芽球様細胞からのポリ−（Ａ）⁺ ＲＮＡは、まずチオシアン酸グアニジニウムを使用して全体のＲＮＡを抽出し、次いで塩化セシウム勾配の遠心により調製した（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２、１５６−１５９（１９８７））。ダイナル（Ｄｙｎａｌ）（ニューヨーク州グレイトネック）からのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）オリゴ（ｄＴ）₂₅）を使用して、ポリ−（Ａ）⁺ ＲＮＡを選択した。ＭＭＬＶ（ネズミマロネー白血病ウイルス）逆転写酵素（ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）を使用して、第１鎖のランダムにプライミングされたｃＤＮＡ合成を実施した。これは２０μｌの反応混合物中で実施し、この反応混合物は３μｇのＲＮＡ、第１鎖緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ₂ ）（ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）、１μＭの３’末端プライマー、０．５単位のＲＮアーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウイスコンシン州マディソン） 、５．０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）、２５０μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸：ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含有した。この混合物を３７℃において２０分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。１０μｌのアリコートをＰＣＲ反応のために使用した。脳、肝臓および副腎からの第１鎖のランダムにプライミングしたｃＤＮＡはＧ．Ｂｏｒｓａｎｉ博士（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により提供された。

オールタネイト（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）スプライシングの検出のためのＲＴ−ＰＣＲをプライマー９ｂおよび５Ｒおよびプライマー５Ｆおよび５Ｒ（第１５図）を使用して次の条件下に実施した：９４℃において５分間の初期の変性、引き続く３０サイクルの９４℃において１分間、６０℃において１分間および７２℃において２分間。反応混合物は１０μｌのｃＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂ ）、１μＭの関係する３’プライマー（プライマー５Ｒ）、２％のホルムアミドおよび１．２５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ酵素（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、コネチカット州ノーウォーク）を含有した。

ＳＣＡ１ｍＲＮＡの発現の検出のためのプライマーＲｅｐ１およびＲｅｐ２を使用するリンパ芽球様細胞系についてのＲＴ−ＰＣＲを、「ホット・スタート」ＰＣＲを使用して次の３サイクルに従い実施した：９７℃において１分間、５７℃において１分間および７２℃において１分間。その後、３３サイクルの９４℃において１分間、５５℃において１分間および７２℃において１分間を実施した。次いで、２０μｌのＰＣＲ反応を２％アガロースゲル（４０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の中の２ｇのＵｌｔｒａｕｒｅアガロース（ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ））上で分割し、そしてＳｕｒｅｂｌｏｔ膜（オンコール（Ｏｎｃｏｒ）、マリイランド州ガイサーバーグ）上にブロットした。フィルターをγ−³²Ｐ−ＡＴＰで末端標識化した（ＧＣＴ）₇ オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは１Ｍ ＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ミゾリー州セントルイス）および１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の溶液の中で実施した。フィルターを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである）、および０．１％のＳＤＳの中で室温において１５分間、次いで６７℃に前もって加温した溶液の中で室温において１５分間洗浄した。

Ｂ．結果
ＣＡＧ反復を含有することが示されたコスミドのクローンからの種々のＤＮＡ断片をプローブとして使用して、２つのヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。５つのｃＤＮＡクローンが同定された；これらはＣＡＧ反復を含有するクローン３１−５、および３１−５とオーバーラップしないことが発見されたクローン３Ｊを包含した（第１３図）。ノザンブロット分析により、クローン３１−５および３Ｊは検査したすべての組織において検出可能な同一の１１ｋｂの転写体を同定することが明らかにされた（第１４図）。したがって、同一の２つのヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーおよびヒト大人小脳ｃＤＮＡライブラリーを数ラウンドのスクリーニングのために使用して、全長の転写体を得た。結局、２２のｃＤＮＡクローンを分離し、そして配列およびＰＣＲ分析により特性決定して、ＳＣＡ１転写体をスパンするコンチグを組み立てた。ｃＤＮＡコンチグをスパンするファージクローンの１２を第１３図に示す。これらのクローンを配列決定して、１０，６６０ｂｐをスパンするＳＣＡ１ｃＤＮＡの全体の配列の集成を可能とした（第１５図）。

配列の分析において、開始コドンのためのコザック（Ｋｏｚａｋ）基準を満足するヌクレオチド配列内に位置する塩基９３６に推定上のＡＴＧイニシエイターコドンで開始する、２４４８ｂｐのコーディング領域が明らかにされた（Ｍ．Ｋｏｚａｋ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０８：２２９−２４１（１９８９））。インフレームの停止コドンは、３つの独立のｃＤＮＡクローンならびにゲノムＤＮＡの中にそのＡＴＧより５７ｂｐ上流に存在する。さらに、コーディング領域の開始におけるＡＴＧおよび上流の停止コドンの両方は、ネズミ胎児脳ライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラジョラ）の中のＳＣＡ１のネズミ相同体の中に見出された。したがって、ＳＣＡ１遺伝子は約８１６アミノ酸の、８７ｋＤの期待する大きさをもつ、アタクシン−１と表示する、ポリペプチドをエンコードする。しかしながら、より小さいタンパク質を生ずる、第１メチオニンの下流に位置する他のＡＴＧ（複数）のいずれかにおいてコーディング領域が開始する可能性を排除することができない。

ＣＡＧ反復は第１メチオニンから５８８ｂｐのコーディング領域内に位置し、そしてポリグルタミン路をエンコードする。オープンリーディングフレームは塩基３３８４におけるＴＡＧ停止コドンで終わる。したがって、この転写体は９３５ｂｐの５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および７２７７ｂｐの３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を有する。この転写体は５７アデノシン残基のテイルで終わる；ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡはポリ（Ａ）テイルより２３ヌクレオチド上流に見出される。コーディング領域のＤＮＡ配列および予測されるタンパク質配列の両方（それぞれ、ＣＡＧ反復およびポリグルタミン路を欠如する）を使用する相同性のサーチは、データベースの中の他の既知タンパク質との有意な相同性を明らかにしなかった。アタクシン−１の配列の分析は、強いリン酸化部位の存在ならびに特定のモチーフ、例えば、ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合のドメインを明らかにすることができなかった。このタンパク質の推定上の二次構造は、疎水性ドメインが同定されなかったので、可溶性タンパク質のそれと適合性である。ＤＮＡ配列のデータベースのサーチは、ＳＣＡ１転写体の３’ＵＴＲの中の３８０ｂｐとヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから分離された発現された配列の標識（ＥＳＴ０４３７９）（Ｍ．Ｄ．Ａｄａｍｓ、Ｍ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、４、２５６−２６７（１９９３））との間の同一性を明らかにした。

Ｖ． ＳＣＡ１転写体の構成：５’ＵＴＲにおけるオールタネイトスプライシングについての証拠
Ａ．方法
１．５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
実施例ＩＶに記載するように、プライマー５Ｒ（第１５図）を使用してヒト大人小脳からのポリ−（Ａ）⁺ ＲＮＡ（クローンテク（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト）の１ｍｇから、第１鎖ｃＤＮＡを調製した。５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）に記載されているように、特定のプライマーとしてＳＣＡ１プライマー５ａおよびＸ４−１（表９）を使用して実施した。次いで、生成物を１．２％アガロースゲルを通して電気泳動させ、ＳｕｒｅＢｌｏｔハイブリダイゼーション膜（オンコール（Ｏｎｃｏｒ）、マリイランド州ガイサーバーグ）上にブロットし、次いでエクソン１の中のプライマー９ｂとエクソン３の中のプライマーＸ３−１（表９）との間をスパンするＰＣＲ生成物により表されるＳＣＡ１特異的プローブにハイブリダイゼーションした、生成物の特異性を試験した。

Ｂ．結果
ＣＡＧ反復をフランキングするゲノム領域を特性決定するために、この反復を含有することが知られている３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩゲノム断片を完全に配列決定した。ｃＤＮＡ配列とのこのゲノム配列との整列は、１６０ｂｐの５’ＵＴＲ、第１の潜在的開始コドンおよび第１の１９２０ｂｐのコーディング領域を有する２０８０ｂｐのエクソンを３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が含有することの決定を可能とする。コーディング領域の残部は、ゲノムＤＮＡについてのＰＣＲ分析により検出される、次の下流のエクソン内に存在する。ゲノムＤＮＡの中の９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片にマッピングする、最後のコーディングエクソンは、また、７８０５ｂｐの合計の長さについて７２７７ｂｐの３’ＵＴＲを含有する（第１６ａ図）。

５’ＵＴＲにおけるオールタネイトスプライシングについての証拠は、全体のヒトＤＮＡからのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡとＳＣＡ１領域をスパンするＹＡＣ（複数）とを含有するサザンブロットに対する２つの大部分のｃＤＮＡクローン、すなわち、８−８および８−９ｂ（第１３図）のハイブリダイゼーションパターンに基づいて最初に示唆された。３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片に加えて、少なくとも３つの強くハイブリダイゼーションする断片が見られた。いずれのｃＤＮＡクローンもＥｃｏＲＩ部位を含有しないので、この結果はＳＣＡ１転写体の５’ＵＴＲの中のいくつかのエクソンの存在を示唆した。これらのデータおよび５’ＵＴＲの異常な長さが与えられると、この領域はより多い詳細に特性決定された。

クローン８−８および８−９ｂの配列の整列は、塩基対３２２において分岐する２つの異なる５’配列の存在を明らかにした。この結果はオールタネイトスプライシングを高度に示唆した。この仮定を試験するために、第１５図に示すプライマーを使用して、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を小脳組織からのｍＲＮＡについて実施した。プライマー９ｂ（８−９ｂクローンに対して特異的）および５Ｒ（両方のクローンの中に存在する）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用したとき、３つの生成物が得られた：１つの期待された大きさ（２４６ｂｐ）およびより大きい大きさの少なくとも２つの断片（第１６ｂ図）。ＲＴ−ＰＣＲを肝臓、副腎、脳およびリンパ芽球のｃＤＮＡについて実施したとき、同一の結果が得られた。種々のＲＴ−ＰＣＲ生成物をクローニングしそして配列決定した。すべてのこれらの生成物の配列の分析およびファージクローン８−８および８−９ｂの配列との比較により、それらはオールタネイトスプライシングの結果であることが確証された。第１６ａ図はＳＣＡ１遺伝子の５’エクソンを含有するすべてのｃＤＮＡクローンの構造を示し、そしてスプライス変異型を描写する。３つのｃＤＮＡクローンの配列分析および小脳ＲＴ−ＰＣＲ生成物の特性決定に基づいて、５つのエクソン（エクソン１〜５）が同定され、そして転写体におけるそれらの境界を決定した。エクソン２、３および４は検査したクローンにおいておよび小脳組織においてオールタネイトスプライシングされるが、エクソン５はすべてのｃＤＮＡクローンおよびＲＴ−ＰＣＲ存在の中に存在した。

ｃＤＮＡライブラリーをプローブとしてクローン８−８および８−９ｂで再スクリーニングしたが、追加のｃＤＮＡクローンは生じなかった。５’ＵＴＲにおいて追加のオールタネイトスプライシングされたエクソンを同定しそして最初の結果を確証するために、エクソン５および４の５’末端からのプライマーを使用して、逆転写された小脳ｍＲＮＡについて５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲを実施した。２１８ｂｐの生成物が同定され、そしてその特異性はプローブとして内部のＰＣＲ生成物を使用するサザン分析により確証された。さらに、５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ生成物の配列分析は、２つのエクソン（２および３）のオールタネイトスプライシングを確証し、そしてこの遺伝子の５’末端における追加の１２７ｂｐの同定を可能とした。

ＶＩ． イントロン−エクソン境界の同定およびＳＣＡ１のゲノム構造の決定
Ａ．方法
１．イントロン−エクソン境界の同定
エクソン２〜９の境界を逆ＰＣＲにより同定した。逆ＰＣＲを実施するために、Ｍ．Ｃ．Ｗａｐｅｎａａｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２、９４７−９５２（１９９３）に記載されているように、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（インジアナ州インジアナポリス）から購入しそして製造業者が推奨するように使用した頻繁カッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｃｕｔｔｅｒ）制限酵素、例えば、Ｓａｕ３ａＩ、ＴａｑＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩを使用して、ＹＡＣアガロースを完全に消化した。次いで、プラグを製造業者の推奨に従いβアガラーゼＩ（ＵＳＢ、オハイオ州クレブランド）で消化し、引き続いてフェノール−クロロホルム（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（インジアナ州インジアナポリス））抽出し、エタノールで沈澱させ、そして１２ｍｌのＴＥ（ＴＥ：１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）ｐＨ８の中に再懸濁させた。次いで、各消化からの５０ｎｇのＤＮＡをＪ．Ｇｒｏｄｅｎら、Ｃｅｌｌ、６６、５８９−６００（１９９１）の発表されたプロトコールに従い循環させた。分岐するＰＣＲプライマーをｃＤＮＡ内で消化し、そしてＪ．Ｇｒｏｄｅｎら、Ｃｅｌｌ、６６、５８９−６００（１９９１）に記載されている増幅条件下に循環生成物について使用した。次いで、ＰＣＲ生成物を上の実施例ＩＩに記載するようにサブクローニングしそして配列決定した。逆ＰＣＲは、エクソン１の境界を除外して、すべてのイントロン／エクソン境界を同定した。したがって、エクソン１を含有することが発見された９ｋｂのＥｃｏＲＩゲノム断片をＹＡＣ ２２７Ｂ１（実施例ＩＩ）から誘導されたコスミドからサブクローニングした。このサブクローンを引き続いて部分的に配列決定して、エクソン１の境界を同定した。

２．ＹＡＣおよびコスミドへのｃＤＮＡクローンのマッピング
ＳＣＡ１臨界領域をスパンするＹＡＣ（複数）からのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを含有するサザンブロットおよび希有カッター酵素（前の節を参照）で消化したＹＡＣ（複数）からのＤＮＡ（複数）を含有するサザンブロット、Ｈ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４２、８７７−８８３（１９８８）に記載されているような標準のプロトコールを使用して、種々のＳＣＡ１ｃＤＮＡクローンに対してそしてイントロン−エクソン境界を含有するすべてのゲノム断片に対してハイブリダイゼーションさせた。簡単に述べると、制限断片を０．７％アガロースゲル上で電気泳動させ、変性しそしてニトラン（Ｎｙｔｒａｎ）（シュレイヘル・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ニューハンプシャイヤー州ネーネ）フィルターに移した。オリゴヘキサマー標識化法（Ａ．Ｐ．Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２、６−１３（１９８３））を使用して、プローブを³²Ｐ標識化した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄し、そしてオートラジオグラフィーをＺｏｇｈｂｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４２、８７７−８８３（１９８８）に記載されているように実施した。

Ｂ．結果
３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の完全な配列決定は、大部分のコーディング領域を含有する２０８０ｂｐのエクソンについてのイントロン−エクソン境界を提供した。エクソンの実際の数を決定しかつイントロン−エクソン境界のすべてを得るために、いずれかの再配列を含有することが知られていない、２つのオーバーラップするＹＡＣクローン、２２７Ｂ１および１４９Ｈ３を使用して、逆ＰＣＲを採用した（実施例ＩＩ参照）。合計９つのエクソン（それらのうちの７つは５’ＵＴＲ内に存在した）が同定され、そしてエクソン１〜９についてのスプライス接合部をサブクローニングしそして配列決定した（第１７図）。５’−非翻訳領域において、オールタネイトスプライシングは分析した５ファージｃＤＮＡクローンにわたってエクソン２、３および４を含んだが、エクソン５、６および７を含まなかった。推定上のエクソン１は１７５ｂｐを包含し、そしてハムスターゲノムＤＮＡから誘導されたＥｃｏＲＩ断片に非常に強くハイブリダイゼーションする。

ＳＣＡ１遺伝子のゲノムの構成を研究するために、１０のｃＤＮＡクローンならびにすべてのエクソンのためのスプライス接合部を含有するゲノム断片をサザン分析によりマッピングし、そしてＳＣＡ１臨界領域をスパンする４つのオーバーラッピングＹＡＣクローンの長い領域の制限地図上に局在化した（第１８図）。この分析により、この遺伝子はゲノムＤＮＡの少なくとも４５０ｋｂをスパンすること、および推定上の第１エクソンはハイポメチル化ＣｐＧアイランドを含有するゲノム断片にマッピングすることが明らかにされた。２つのエクソン（８および９）の間のイントロンの詳細な分析は、このイントロンがほぼ４．５ｂｐの長さであることを明らかにした。残りのイントロンの大きさは、長い領域の制限地図からおよびＰＣＲ分析により推定され、そして６５０ｂｐ（イントロン２）からほぼ２００ｋｂ（イントロン７）の範囲であった（第１８図）。

ＶＩＩ． ＳＣＡ１患者におけるＳＣＡ１ｍＲＮＡの発現
トリヌクレオチドＣＡＧ反復の拡張がＳＣＡ１における神経変性に導く機構を理解するための第１ステップとして、患者において拡張したアレレからのＳＣＡ１の転写レベルを研究した。４３〜６９の範囲の反復大きさをもつＳＣＡ１患者からのリンパ芽球様ｍＲＮＡを使用して、実施例Ｖに記載するようにＣＡＧ反復をフランキングするプライマーＲｅｐ１およびＲｅｐ２を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。この分析により、ｍＲＮＡは正常のアレレおよび拡張されたアレレの両方から発現されることが明らかにされた（第１９図）。

ＶＩＩＩ． ｐＭＡＬ ^TM −ｃ２ベクターの中へのＳＣＡ１遺伝子のクローニング
ＳＣＡ１遺伝子からのＤＮＡをｐＭＡＬ^TM−ｃ２ベクター（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチュセッツ州ベベリイ）の中にクローニングした。このベクターは引き続いて便利に切断できる連鎖の中の問題のタンパク質（アタクシン−１）のＮ−末端に融合したマルトース結合タンパク質から成るキメラ製造を生成する。クローニングのためのＤＮＡを得るために、ＳＣＡ１ＤＮＡを標準のＰＣＲ技術を使用して増幅しそしてクローン３１−５（第１３図）を分離した。適当なオリゴヌクレオチドのプライマー（ｐＭＡＬ^TMベクターのパッケージインサート、１９９２ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、改定４／７／９２）を消化するとき、製造業者の使用説明書に従った。各場合において、ＥｃｏＲＩリンカー部位を５’プライマーの中に消化しそしてＨｉｎｄＩＩＩリンカー部位を３’プライマーの中に消化してクローニングを促進した。１つにおいて、コーディング領域の５’および３’末端にハイブリダイゼーションする２つの２０マーのＰＣＲプライマーＣＯＤおよびＴＣＯＤ（表１０）を利用してＤＮＡを分離し、こうして増幅されるＤＮＡのストレッチが、Ｍｅｔ１で開始しそしてＬｙｓ８１７で終わる、アタクシン−１の全体の配列をエンコードする推定される残基を含有するようにした（第１５図）。次いで、増幅された生成物を製造業者により提供される使用説明書に従いｐＭＡＬ^TM−ｃ２のポリリンカー領域の中のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの中にクローニングした。２つの他の構成体を同一の方法でＰＣＲを使用して作って、ＤＮＡのより短いセグメントを分離した。両方の場合において、同一の３’プライマーを使用したが、異なる５’プライマーを使用した（表１０）。一方の５’プライマー（３ＣＯＤ）は増幅された生成物がＭｅｔ２７７（コーディング領域における第４Ｍｅｔ）において開始するように消化し、他方の５’プライマー（８ＣＯＤ）は増幅された生成物がＭｅｔ５４８において開始するように消化した。ｐＭＡＬ^TM−ｃ２をα−相補性のためのｌａｃＺ△Ｍ１５アレレを含有する能力細胞の中に形質転換した。

ＩＸ． アタクシン−１の発現、抗原性ペプチドの設計および抗体の生産
実施例ＶＩＩにおける構成体により発現される融合タンパク質を、製造業者の指示に従いアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した（ｐＭＡＬ^TMベクターのパッケージインサート、１９９２ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、改定４／７／９２）。精製したタンパク質を８％ＳＤＳポリアクリルアミドの電気泳動により電気泳動させそして電気溶出した。最良の発現（１Ｌの細胞から約２７ｍｇ）が最短の構成体から得られたが、すべての構成体はそれらのそれぞれのクローニングされた遺伝子産物と一致する大きさのタンパク質を測定可能なレベルで生産した。

Ｖ．Ｍｅｈｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３、７０１３−７０１７（１９８６）の多重抗原性ペプチドの戦略を使用して、ウサギにおける抗体の応答を開始させた。前の節に記載した３つの電気溶出しクローニングした遺伝子産物に加えて、３つの合成ペプチドは同様によく使用された。使用した合成ペプチドはペプチドＡ（アミノ酸４−１８）、ペプチドＢ（アミノ酸１６２−１７６）およびペプチドＣ（アミノ酸７７４−７８８）であった。これらのペプチドは、それらがタンパク質の中の既知の短いアミノ酸のストレッチとの相同性をほとんど示さないかか、あるいはまったく示さないように、そしてまた、それらがプロリンを含有し、これによりこれらの断片が製造の表面上に位置する可能性を多くし、こうして断片に対する抗体が全タンパク質を同様によく反応するように選択した。

ウサギの血液からの免疫グロブリン（ＩｇＧ）を精製し、そしてＧｅｒｓｈｏｎｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１、１−１５（１９８３）に記載するようにウェスタンブロットを使用して抗体／抗原の結果を分析した。ウサギからのＩｇＧにクローニングした遺伝子産物を注入し、そして合成配列はそれらのそれぞれの抗原にハイブリダイゼーションすることが発見された。８ＣＯＤ−ＲＣＯＤ遺伝子産物（すなわち、残基５４８−８１７をスパンするアタクシン−１断片）で免疫化したウサギからの抗血清は、マウス、ラット、およびヒトからの脳組織抽出物の中の期待される大きさのタンパク質とハイブリダイゼーションした。このハイブリダイゼーションはポリペプチドの抗原との前インキュベーションによりブロックされるが、無関係の抗原によりブロックされない。特に、ペプチドＣに対してレイズされた抗体はペプチドＣまたは短い遺伝子産物によりブロックされる。

Ｘ． 脊髄小脳失調１型（ＳＣＡ１）における分子および臨床的相関
Ａ．材料および方法
１．家族の材料
優性に受け継がれた失調を有する８７家系を代表する構成員を評価した。多様な民族的背景（白人のアメリカ人、黒人のアメリカ人、南アフリカ人、シベリア・イアクート人（Ｓｉｂｅｒｉａｎ Ｉａｋｕｔ））の９つ家系は、ＨＬＡ座への連鎖および染色体６上のＤ６Ｓ８９への連鎖に基づいてＳＣＡ１を有することが既に知られている。ＳＣＡ１ＣＡＧ反復の遺伝子型の分析をすべての９つの家系について実施して、すべての既知のＳＣＡ１家族が反復の拡張を含む同一の突然変異の機構を有するかどうかを決定した。研究の参加者の大部分を個人的に検査した。影響を受けた状態は神経学者により常に確証されたが、発症年齢は患者および／または他の家族の構成員からの歴史的情報に基づいた。病気の重症度は死亡年齢−発症年齢により測定した。反復の変動性の詳細な特性決定はすべての９つの家系について実施した。ＳＣＡ１座におけるＣＡＧ拡張を有する追加の家系を同定するために、優性に受け継げられた失調を有する７８の新しく同定された家族からの影響を受けた個体を臨床的に検査した。これらの家系の各々からの少なくとも１つの影響を受けた個体から血液を集め、そしてＤＮＡ分析により拡張した領域（≧４２反復）内のＣＡＧ反復の大きさの存在についてスクリーニングした。これらの７８個体が関係するという証拠は存在しなかったが、影響を受けた患者の幾人かが同一の家族から来る機会が存在する。

正常の染色体上のＣＡＧ反復の大きさの分布をさらに評価するために、種々の民族的背景の無関係の個体からの３０４の正常の染色体についてＣＡＧ反復の数を決定した。

２．分子の研究
血液の試料を使用して、エプスタイン−バー−ウイルスの情報によりリンパ芽球様細胞系を確立した。ゲノムＤＮＡを静脈の血液からか、あるいはリンパ芽球様細胞系から直接分離した。血液の試料をこれらの患者から８年の期間にわたって集め、その期間内に２９人の患者が死亡した。Ｒｅｐ１（ＴＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴ）およびＲｅｐ２（ＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧ）プライマーを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、２％のホルムアミド、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、および１単位のａｍｐｌｉＴａｑ（パーキン−エルマー・セツス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ））を含有する２０μｌの合計の体積の中で、５０ｎｇのゲノムＤＮＡを５ｐｍｏｌの各プライマーと混合した。Ｒｅｐ１プライマーを５’末端において［γ−32Ｐ］ＡＴＰで標識化した。試料を９４℃において４分間変性し、次いで３０サイクルの変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）および伸長（７２℃、２分）を実施した。６μｌの各ＰＣＲ反応混合物を４μｌのホルムアミドの負荷緩衝液と混合し、９０℃において２分間変性し、そして６％のポリアクリルアミド／７．６５Ｍの尿素ＤＮＡ配列決定ゲルを通して電気泳動させた。Ｍ１３配列決定ラダーに関して移動を比較することによって、アレレの大きさを決定した。

３．統計学的分析
発症年齢と患者の影響を受けた染色体および正常の染色体の両方上のＣＡＧ反復との間の関係を、線形回帰分析により評価した。同様に、反復長さと病気の期間との間の関係を定量した。発症年齢をこれらの分析において直接を使用したが、また、対数および平方根の情報に従い使用した。後者の情報は正規分布に対する最良の近似を提供したが、得られた結果は形質転換の前後の分析の間で合致した。変動の分析を実施して、発症年齢へのＣＡＧ反復の作用について補正した後、平均の発症年齢における家族の間の差を検出した。さらに、伝達の親の性を発症年齢における変動についての可能な説明の変数として含めた。すべての回帰および分散の分析をコンピュータープログラム、バージョン４．０．１のＳＰＳＳパッケージを使用して実施した。

Ｂ．結果
１．家族の研究
９つの既知のＳＣＡ１家系からのすべての影響を受けた個体は、それらのアレレの１つの上に拡張したトリヌクレオチド反復を有した。連鎖分析により配列でないことが前に示された８つの家系の間で、反復の拡張は観察されなかった。これらの８つの家系をＳＣＡ１遺伝子の拡張について検査して、連鎖の結果を確証した。
７０の検査した他の優性失調の家族の間で、３つ（３％）はＳＣＡ１アレレの１つ上の拡張したＣＡＧ反復を有することが発見された。研究した優性家系のすべてのうちで、８７のうちの１２（１４％）はＳＣＡ１座において拡張したＣＡＧ反復を有する。試料の大きさは比較的小さく、そして両方の推定値はＳＣＡ１家系について排除または選択するように恐らく間違いなく片寄らせたが、ＳＣＡ１遺伝子ないの拡張したＣＡＧ反復の路は病気のこの複雑なグループの小さい部分のみを明瞭に説明する。正常の対照からおよび拡張をもたなかった失調の個体からのＣＡＧ反復数の分布はより小さかった（データは示されていない）。これらのデータは、これらの家族におけるＳＣＡ１座におけるＣＡＧ反復の包含と反対の結論を示す。しかしながら、これらの小さい家族のいくつかはＳＣＡ１座における他の突然変異を有する可能性がまだ存在する。

遺伝的に証明されたＳＣＡ１家系における典型的な臨床的発見は、歩行および肢の失調、構語障害、錐体路の徴候（痙直、異常高熱、伸筋足底の応答）および１または２以上の次のものを包含する変化する程度の眼球運動の発見であった：眼球震盪、遅い断続運動、および眼球麻痺。病気の経過の後期の段階において、脳神経ＩＸ、Ｘ、およびＸＩＩの機能障害と一致する延髄は明らかとなった。また、失調性姿勢および舞踏病アテトーシスを包含する不随意運動は病気の後期の段階における明らかとなった。また、運動衰弱、筋委縮、およびプロピオセプティブ・ロス（ｐｒｏｐｉｏｃｅｐｔｉｖｅ ｌｏｓｓ）として発現した軽症の感覚欠乏が検出された。失調、構語障害および脳神経機能障害はすべてのＳＣＡ１影響を受けた個体において絶えず存在するが、かなりの家族内の変動性が他の臨床的特徴のすべてに関して認められた。若年性発症（≦１８歳）が４つの家系において観察された。若年性発症の症例は典型的には影響を受けた父からの病気の遺伝子から受け継がれるという発見は、興味あることである。拡張したＳＣＡ１ＣＡＧ反復をもたなかった家系のいくつかは、ＳＣＡ１家系における観察されたものと同一の臨床的発見を表示し、この病気のグループを臨床的に分類するときの固有の困難を確証する。これらの家系のいくつかはＳＣＡ１座に他の突然変異を有する可能性が存在するが、これらの家族の８つについての病気の１または２以上の遺伝子座は、また、連鎖分析によりＳＣＡ１領域から排除された。

２．正常およびＳＣＡ１の染色体についての反復の分析
第２０図は、失調の危険にある影響を受けなかった対照の個体からの３０４の染色体上のＣＡＧ反復の大きさの分布、およびこの病気で影響を受けた個体からの１１３の拡張したアレレを示す。正常のアレレは１９〜３６のＣＡＧ反復単位の大きさの範囲である。正常のアレレの９５％以上は２５〜３３のＣＡＧ反復を含有し、それらの大部分（６５％）は２８〜３０の反復を含有する。アメリカの黒人、白人、および南アフリカの集団は、それぞれ、２９．１、２９．８、および２９．４のＣＡＧ反復単位を有し、非常に類似する。ＳＣＡ１座におけるＣＡＧ反復についての組み合わせされたヘテロ接合性は検査した集団について０．８０９であり、０．７８７の全体の多形性の情報の含量（Ｐ．Ｉ．Ｃ．）価を与えた。正常の範囲内にＣＡＧ反復の路を含有するＳＣＡ１アレレの１３５の減数***についてＣＡＧ反復の長さの変化は観察されなかった、すなわち、すべてはメンデル方式で受け継がれた。対照的に、拡張したＳＣＡ１アレレを包含する６２の減数***のうちの４１は反復の大きさが変化した。家族の減数***についての反復の不安定性の割合は６０％であるが、男性について観察された不安定性は８２％であった。

１１３の影響を受けた個体からのＳＣＡ１染色体上に見出されたＣＡＧ反復の数は、正常の染色体上の反復の数より常に大きく、４２〜８１の範囲であり、平均は５２．６であった（第２０図）。

引用したすべての特許、特許書類、および刊行物をここに引用によって加える。以上の詳細な説明および実施例は、理解を明瞭にするためにのみ与えられた。不必要な限定はそれから理解されるべきではない。本発明は示されそして記載された細部に制限されず、当業者にとって明らかな変化は請求の範囲により規定される発明内に包含される。

染色体６の短いアーム内に位置する正常のＳＣＡ１遺伝子の３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の配列。常染色体優性脊髄小脳失調１型に関連するＣＡＧ反復領域において突然変異が起こるのは、この断片内である。 染色体６の短いアーム内に位置するＣＡＧ反復領域、すなわち、ＣＡＧトリヌクレオチドの反復、およびそのフランキング領域において影響を受けた５つの個体についての配列の情報。 ＣＡＧトリヌクレオチドの反復およびそのフランキング領域の配列。図１に示すＳＣＡ１遺伝子の３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の一本鎖の中の約５００ヌクレオチドが表されている。ＰＣＲプライマーの位置は矢印とともに実線により示されている。 ＳＣＡ１座の正確なマッピングに導くＳＣＡ１組換え事象の要約。組換えの病気を有する染色体は上に示したマーカーについて示されている。６ｐ２２の関係する領域の略線図（一定の割合で描かれていない）は、この図面の上部に示されている。家族は次のようにコード化した：ＴＸ＝ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）、ＭＮ＝ミネソタ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、ＭＩ＝ミシガン（ＭｉＣｈｉｇａｎ）、ＩＴ＝イタリー（Ｉｔａｌｙ）。各組換えの事象は家族のコード後の数で与えられている。 放射線減数ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｄ ｈｙｂｒｉｄｓ）のＰＣＲ分析による６ｐ２２−ｐ２３のＳＴＳの領域の局在化。３つのパネル（ａ〜ｃ）は、Ｄ６Ｓ２７４、Ｄ６Ｓ２８８、およびＡＭ１０ＧＡの領域の局在化を示す。各パネルにおいて、ＰＣＲ増幅の結果はゲノムＤＮＡ、６ｐを保持するＩ−７細胞系、放射線減数ハイブリッドＲ１７、Ｒ７２、Ｒ８６、およびＲ５４、およびＲＪＫ８８ハムスターＤＮＡについて示されている。ブランクの対照（ｃ）は各パネルについて示されている。Ｒ８６は前にＤ６Ｓ８９を保持することが示された；Ｒ１７およびＲ７２はＤ６Ｓ８８およびＤ６Ｓ１０８、すなわち、Ｄ６Ｓ８９に対するセントロメアにマッピングする２つのＤＮＡマーカーを含有することが知られている。増幅生成物はＤ６Ｓ２７４およびＤ６Ｓ２８８についてＩ−７、Ｒ１７、Ｒ７２、およびＲ８６において見られるが、ＡＭ１０ＧＡについての増幅生成物はＩ−７およびＲ８６においてのみ見られ、Ｄ６Ｓ２７４およびＤ６Ｓ２８８がＡＭ１０ＧＡおよびＤ６Ｓ８９に対するセントロメアにマッピングすることを確証する。 新しいマーカーおよびＹＡＣコンチグ（ｃｏｎｔｉｇ）を示す６ｐ２２−ｐ２３領域の略線図。この線図の下部において、領域のマッピングのために使用した放射線ハイブリッド減数パネルが示されている。ＹＡＣクローンは黒い線で表されており、白抜きセグメントはＤＮＡの非隣接領域を示す。ＹＡＣクローン３５１Ｂ１０の中に示す不連続は、このＹＡＣが内部の欠失を有することを示す。分離されたＹＡＣクローンの末端のすべては、左末端について「Ｌ」または右末端について「Ｒ」で表示されている。 ６ｐ２２−ｐ２３ジヌクレオチドの反復マーカーについての遺伝子型のデータは、ＭＮ−ＳＣＡ１家系からの家系図について示されている。この図面は、ＳＣＡ１座の正確なマッピングに導く第２の組換え事象を要約する。 ＹＡＣ（複数）、２２７Ｂ１、６０Ｈ７、１９５Ｂ５、Ａ２５０Ｄ５、および３７９Ｃ２の大きい範囲の制限地図。また、ＹＡＣ（複数）３５１Ｂ１０、１７２Ｂ５、１７２Ｂ５、および１６８Ｆ１を制限分析において使用した（データは示されていない）。制限部位はＮ、ＮｏｔＩ；Ｂ、ＢｓｓＨＩＩ；Ｎｒ、ＮｒｕＩ；Ｍ、ＭｌｕＩ、Ｓ、ＳａｃＩＩ、およびＳａ、ＳａｌＩとしてしるした。プローブとして使用したＤＮＡマーカーの位置（ボックス）をもつＳＣＡ１遺伝子領域の要約地図が示されている。セントロメア−テロメアの向きが、それぞれ、ｃｅｎ／ｔｅｌにより示されている。 ＳＣＡ１領域の物理的地図。オーバーラップするＹＡＣクローンに関する種々の遺伝的マーカーおよび配列標識化部位（ＳＴＳ）の位置が示されている。放射線減数ハイブリッドを保持する６ｐ２２−ｐ２３、Ａ２０５Ｄ５−Ｌおよび１９５Ｂ５−Ｌを使用して発生したＡＭ１０およびＦＬＢ１およびＳＴＳ（複数）は、ＹＡＣ（複数）Ａ２５０Ｄ５および１９５Ｂ５の挿入末端からのＳＴＳ（複数）である。Ｄ６Ｓ８９、Ｄ６Ｓ１０９およびＤ６Ｓ２８８およびＤ６Ｓ２７４、およびＡＭ１０−ＧＡはＳＣＡ１家族の遺伝分析において使用したジヌクレオチドの反復である。ＳＣＡ１候補の領域は、最も近い組換え事象を同定するＤ６Ｓ２７４およびＤ６Ｓ８９マーカーによりフランキングされる。ここに示すＹＡＣクローンはクロス−ハッチングのマーキングにより示されている。ＹＡＣの１７２Ｂ５は、非６ｐのセグメントについて白抜きバーにより示すようにＤＮＡの２つの非隣接セグメントを有する。ＹＡＣ（複数）はセント・ルイス・アンド・ＣＥＰＨ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ａｎｄ ＣＥＰＨ）ライブラリーズに従い表示されている。（ＣＡＧ）n 陽性であるオーバーラップするコスミドを含有するコスミド・コンチグ（ｃｏｎｔｉｇ）（Ｃ）の位置は、濃い黒色のバーにより示されている。ＹＡＣ（複数）の間のオーバーラップは長い範囲の制限分析により決定した。向きはセントロメア（Ｃｅｎ）およびテロメア（Ｔｅｌ）として示されている。 プローブとして反復を含有する３．３６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を使用する白血球ＤＮＡのサザンブロット分析。第１０ａ図：ＴＸ−ＳＣＡ１家系からのＴａｑＩ消化ＤＮＡ。影響を受けなかった配偶者は２８３０ｂｐに単一の断片を有する。２５歳において発症した影響を受けた個体は、２８３０ｂｐの断片ならびに２９３０ｂｐの断片を有する。４歳で発症した影響を受けた子供は彼女の母から正常の２８３０ｂｐを受け継ぎ、そしていずれの親においても見られなかった３０００ｂｐの新しい断片を有する。第１０ｂ図：ＭＮ−ＳＣＡ１家系からのＴａｑＩ消化ＤＮＡ。影響を受けなかった配偶者および影響を受けなかった兄弟は２８３０ｂｐの断片を有する。２人の影響を受けた兄弟は２８３０ｂｐの断片ならびに２５歳で発症した兄弟の一方において２９００ｂｐおよび９歳で発症した兄弟の他方において２９７０ｂｐの拡張した断片を有する。第１０ｃ図：ＴＸ−ＳＣＡ１家系からのＢｓｔＮＩ消化ＤＮＡ。レーン１〜３は（Ａ）に描写したのと同一の家系からのものである。正常の断片の大きさは５３０ｂｐであり、２５〜３０歳で発症した個体（レーン１および４）において、断片は６１０ｂｐに拡張する。１５歳で発症した個体（レーン７）において、断片の大きさは６４０ｂｐであり、そして４歳で発症した個体（レーン３）において、断片の大きさは６８０ｂｐである。レーン５におけるＤＮＡは無症候性である１４歳の子供からのものである。 正常およびＳＣＡ１の個体におけるトリヌクレオチドの反復トラックを含有するＰＣＲ増幅生成物の分析。ＣＡＧ−ａ／ＣＡＧ−ｂのプライマー対をパネル（ａ）において使用したが、Ｒｅｐ−１／Ｒｅｐ−２のプライマー対をパネル（ｂ）において使用した。パネル（ａ）におけるレーン１、２および３における個体は兄弟である。正常（ＮＬ）および拡張した（ＥＸＰ）（ＣＡＧ）_n 反復単位についての範囲が示されている。

発症年齢と拡張の大きさとの間の相関を証明するために、発症年齢／（ＣＡＧ）_n 反復単位の数についての散乱プロットが示されている。−０．８４５の線型の相関係数が得られた。さらに、曲線の相関係数を計算してプロットの非線型パターンを得た。曲線の相関係数は−０．９３６である。 ＳＣＡ１のｃＤＮＡのコンチグの概略的表示。ＳＣＡ１転写体の１０．６６ｋｂをスパンするオーバーラップするファージｃＤＮＡクローン（黒いバー）および５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ生成物（Ｒ１）のサブセットが示されている。ｃＤＮＡクローン３１−５はＳＣＡ１遺伝子生成物、アタクシン−１のための全体のコーディング領域を含有する。上部において、略図はＳＣＡ１転写体の構造を示す；（長方形）ならびに５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ（細い線）の大きさが示されている。また、コーディング領域内のＣＡＧ反復の位置が示されている。星印はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして使用したクローンを示す。下部において、ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、およびＴａｑＩ（Ｔ）制限部位が示されている。 多数のヒト組織からのＲＮＡを使用するＳＣＡ１遺伝子のノザンブロット分析。左のパネルはコーディング領域の一部分（ｂｐ２４６０−ｂｐ３４３２）からのＰＣＲ生成物でプロービングする。右のパネルを３’ＵＴＲからの３ＪｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる。両方のプローブならびにｃＤＮＡクローン３１−５および８−８（それらの両方はＣＡＧ反復を含有する）（図１３）を使用してすべての組織からのＲＮＡにおいて約１１ｋｂの転写体が検出される。 ＳＣＡ１転写体の配列。プライマー９ｂ、５Ｆおよび５Ｒの配列（５’−３’の向きにおいて、それぞれ、ｂｐ１２９−１４７、ｂｐ１７３−１９１およびｂｐ５３８−５１８）に下線が引かれている。ＣＡＧ反復領域は約ｂｐ１５２４〜約ｂｐ１６１３である。図１５ａ〜図１５ｄは、一体となって図１５となる。 ＳＣＡ１転写体の配列。プライマー９ｂ、５Ｆおよび５Ｒの配列（５’−３’の向きにおいて、それぞれ、ｂｐ１２９−１４７、ｂｐ１７３−１９１およびｂｐ５３８−５１８）に下線が引かれている。ＣＡＧ反復領域は約ｂｐ１５２４〜約ｂｐ１６１３である。図１５ａ〜図１５ｄは、一体となって図１５となる。 ＳＣＡ１転写体の配列。プライマー９ｂ、５Ｆおよび５Ｒの配列（５’−３’の向きにおいて、それぞれ、ｂｐ１２９−１４７、ｂｐ１７３−１９１およびｂｐ５３８−５１８）に下線が引かれている。ＣＡＧ反復領域は約ｂｐ１５２４〜約ｂｐ１６１３である。図１５ａ〜図１５ｄは、一体となって図１５となる。 ＳＣＡ１転写体の配列。プライマー９ｂ、５Ｆおよび５Ｒの配列（５’−３’の向きにおいて、それぞれ、ｂｐ１２９−１４７、ｂｐ１７３−１９１およびｂｐ５３８−５１８）に下線が引かれている。ＣＡＧ反復領域は約ｂｐ１５２４〜約ｂｐ１６１３である。図１５ａ〜図１５ｄは、一体となって図１５となる。 ＳＣＡ１転写体および種々のスプライス変異型の構造。略図は上部において９つのエクソン（一定の割合で描かれていない）およびそれらのそれぞれの大きさを表す。点描の区域はコーディング領域を示す。また、ＳＣＡ１転写体の異なるスプライス変異型を表す５つのｃＤＮＡクローンの構造が示されている。クローン８−８および８−９ｂはファージのクローンであり、ＲＴ−ＰＣＲ１およびＲＴ−ＰＣＲ２はプライマー９ｂおよび５Ｒ（図１５）を使用して小脳ポリ−（Ａ）⁺ ＲＮＡについて実施したＲＴ−ＰＣＲにより得られた２つのクローンである。長方形の中に破線により示されているように、わずか３０ｂｐのエクソン１がクローン８−９ｂおよびＲＴ−ＰＣＲ生成物の中に存在する。 小脳のポリ−（Ａ） ⁺ＲＮＡ（ＣＢＬ ＲＮＡ）の中のＳＣＡ１転写体の別のスプライシングの検出。２組のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した：９ｂ−５Ｒおよび５Ｆ−５Ｒ。期待した大きさのＰＣＲ生成物がプライマーの両方の対をもつ逆転写酵素（＋ＲＴ）の存在下にＣＢＬ ＲＮＡにおいて検出された。９ｂ−５Ｒ対を使用して、少なくとも２つのより大きいＰＣＲ生成物がまた検出された。アニーリングＴ＜６０°におけるＲＴ−ＰＣＲのために５Ｆ−５Ｒを使用して、９ｂ−５Ｒプライマー対を使用して見られるものと同一の大きさのいくつかの淡いバンドがまた見られた。８−８および８−９ｂは陽性の対照として使用したファージのクローンである。分子量マーカー（ＨａｅＩＩＩで切断したＦＸ１７４）の関係するバンドは左に示されている。 ＳＣＡ１遺伝子のイントロン−エクソン境界。スプライスアクセプターおよびスプライスドナーの部位が肉太文字で示されている。各エクソンの開始および終わりにおける数字は、図１５におけるＳＣＡ１の複合配列における位置を意味する。アッパーケースの文字はエクソンの配列を示し、ロワーケースはイントロンの配列を示す。Ｙ＝ピリミジン；Ｒ＝プリン；Ｎ＝未定。 ＳＣＡ１遺伝子のゲノムの構造。ＳＣＡ１遺伝子の９つのエクソン（濃い長方形は一定の割合で描かれていない）は、いくつかのＹＡＣクローンからの稀なカッターのＤＮＡ消化物を使用するサザン分析によりＳＣＡ１領域の制限地図に基づいて局在化される。ＳＣＡ１遺伝子を包含する、ＹＡＣクローン２２７Ｂ１を使用する代表的な地図が示されている。このＹＡＣの制限地図はその領域における４つのオーバーラップするＹＡＣクローンの分析により確証された。セントロメア−テロメアの向きは、それぞれ、ＣＥＮ−ＴＥＬにより示されている。Ｌ＝左のＹＡＣ末端；Ｒ＝右のＹＡＣ末端；Ｂ＝ＢｓｓＨＩＩ；Ｃ＝ＣｓｐＩ；Ｍ＝ＭｌｕＩ；Ｎ＝ＮｏｔＩ；Ｎｒ＝ＮｒｕＩ；Ｓ＝ＳａｃＩＩ。 拡張されたＳＣＡ１アレレの発現の分析。ＲＴ−ＰＣＲは、１人の影響を受けなかった個体（レーン１）および４人の患者（レーン２〜５）からのリンパ芽球ポリ−（Ａ） ⁺ＲＮＡについて、プライマーＲｅｐ１およびＲｅｐ２を使用して実施した。この分析は、正常および拡張されたＳＣＡ１の両方のアレレが転写されることを示す。各アレレについての反復単位の数は各レーンの下に示されている；レーン６はＲＴマイナスの対照である。 影響を受けなかった対照の個体およびＳＣＡ１アレレからのＣＡＧ反復の長さの分布。正常のアレレは１９〜３６の反復単位の大きさの範囲であるが、病気のアレレは４２〜８１の反復を含有する。

Claims (6)

1. （１）ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡ断片を取得し；
   （２）上記ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション条件下、検出可能に標識化された遺伝子プローブでプロービングし、ここで、当該遺伝子プローブは、以下の：
   （ａ）図１のヌクレオチド番号１〜１７５８に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、ＣＡＧ反復領域、及び図１のヌクレオチド番号１８４８〜３３６６に記載のヌクレオチド配列をもつ第２のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該ＣＡＧ反復領域は多型ＣＡＧ反復領域である；
   （ｂ）図３のヌクレオチド番号１〜１４７に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、ＣＡＧ反復領域、及び図３のヌクレオチド番号２３８〜５０６に記載のヌクレオチド配列をもつ第２のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該ＣＡＧ反復領域は、多型ＣＡＧ反復領域である；
   （ｃ）図１５のヌクレオチド番号１〜１５２３に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、ＣＡＧ反復領域、及び図１５のヌクレオチド番号１６１４〜１０６６０に記載のヌクレオチド配列をもつ第２のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該ＣＡＧ反復領域は、多型ＣＡＧ反復領域である；及び
   （ｄ）上記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の核酸分子の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
   から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子にハイブリダイズする少なくとも１００ヌクレオチドを有する；
   （３）上記ＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡを検出し；そして
   （４）ＳＣＡ１遺伝子の正常の形態又は影響を受けた形態に特徴的なＣＡＧ反復領域について上記ＤＮＡ断片を分析する；
   を含むＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有するＤＮＡ分子の存在を検出する方法。
2. 前記分析ステップが（ＣＡＧ）_n 領域（ｎ＞３６）について分析することを含む、請求項１記載の方法。
3. 前記分析ステップが（ＣＡＧ）_n 領域（ｎ≧４３）について分析することを含む、請求項２記載の方法。
4. 前記検出可能に標識化された遺伝子プローブが、ＳＣＡ１遺伝子のＥｃｏＲＩ断片の一部分を含む、請求項１記載の方法。
5. 前記ＥｃｏＲＩ断片が３３６０塩基対を含む、請求項４記載の方法。
6. （１）ＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有するＤＮＡ分子の別々の相補的鎖をモル過剰量の２つのオリゴヌクレオチド・プライマーで処理し、ここで、当該２つのオリゴヌクレオチド・プライマーは、以下の：
   （ａ）図１のヌクレオチド番号１〜１７５８に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、ＣＡＧ反復領域、及び図１のヌクレオチド番号１８４８〜３３６６に記載のヌクレオチド配列をもつ第２のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該ＣＡＧ反復領域は多型ＣＡＧ反復領域である；
   （ｂ）図３のヌクレオチド番号１〜１４７に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、ＣＡＧ反復領域、及び図３のヌクレオチド番号２３８〜５０６に記載のヌクレオチド配列をもつ第２のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該ＣＡＧ反復領域は、多型ＣＡＧ反復領域である；
   （ｃ）図１５のヌクレオチド番号１〜１５２３に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、ＣＡＧ反復領域、及び図１５のヌクレオチド番号１６１４〜１０６６０に記載のヌクレオチド配列をもつ第２のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該ＣＡＧ反復領域は、多型ＣＡＧ反復領域である；及び
   （ｄ）上記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の核酸分子の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
   から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含むＳＣＡ１遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有する核酸分子にハイブリダイズする少なくとも１６〜３５以下のヌクレオチドを有する；
   （２）上記プライマーを伸長させて、ＣＡＧ反復領域を含有する所望の分子を合成するための鋳型として作用する相補的プライマー伸長生成物を形成し；
   （３）そのように増幅された分子を検出し；そして
   （４）ＳＣＡ１失調の特徴を示すＣＡＧ反復領域について上記の増幅された分子を分析する
   を含む、ＳＣＡ１遺伝子の影響を受けたアレル内に位置するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、前記オリゴヌクレオチド・プライマーが、ＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴ（ＣＡＧ−ａ）、ＣＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＣ（ＣＡＧ−ｂ）、ＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＣＧＴＡＣ（Ｒｅｐ−１）、ＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧ（Ｒｅｐ−２）、ＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣ（ＧＣＴ−４３５）、ＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧ（ＧＣＴ−２１４）、ＣＴＣＴＣＧＧＣＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧ（Ｐｒｅ−１）、及びＧＴＡＣＧＴＣＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴ（Ｐｒｅ−２）から成る群から選ばれる前記方法。

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