JP4054025B2 - 脊髄小脳失調1型のための遺伝子配列および診断方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス(National Institute of Health)により授与された、許可No.NS22920および27699の下に政府の支援でなされた。政府は本発明において確かな権利を有する。
動性の臨床的特徴をもつ、変性神経学的障害の異種グループである。臨床的症状は、失調、構語障害、眼球麻痺、および変化する程度の運動性衰弱を包含する。症状は通常生活の30年または40年の間に開始するが、若年の発症は同定された。典型的には、この病気は徐々に悪化し、発症後10〜20年に完全な不能および死をしばしば生ずる。しかしながら、若年性発症の脊髄小脳失調の個体は典型的には後期の発症の症例よりも急速な表現型の進行を有する。脊髄小脳失調を診断する方法はその処置に向かう有意なステップを提供するであろう。
本発明は、SCA1遺伝子の中の高度に多形性のCAG反復領域を含有する染色体6の短いアームからの分離された1.2Mbの領域の一部分に関する。このCAG反復領域は不安定(すなわち、集団内で高度に変動性)であり、そして常染色体優性神経変性障害の脊髄小脳失調1型をもつ個体において拡張される(すなわち、影響を受けた個体は一般に36より多いCAG反復を有する)。CAG反復領域のサザン分析およびPCR分析は、拡張された反復領域および障害の発症年齢(若年の場合において起こる、より大きいアレレ、すなわち、より多い反復単位を伴う)と、障害の重症度(より多い重症の症例において起こる、より大きいアレレ、すなわち、より多い反復単位を伴う)との間の相関を証明する。
こうして、本発明は、RNAまたはDNAに基づくことができる検出方法(好ましくは、この方法はゲノムDNAを単離しそして分析することを包含する)に基づくか、あるいはタンパク質に基づく検出方法に基づくことができる、SCA1遺伝子の影響を受けた形態の存在または不存在を決定する方法を提供する。これらの方法は、例えば、PCRに基づく方法、直接核酸配列決定、発現されたmRNAの量の測定または発現されたアタクシン−1タンパク質の量の測定によるSCA1遺伝子の発現の測定を包含する。本発明の方法は、また、核酸またはアミノ酸分子の反復領域の大きさを検出する方法を包含する。
遺伝的および物理的マッピングの方法を使用してSCA1を局在化するために、実質的な努力がなされてきた。一般に、SCA1はほぼ0.08(セントレ・ドエチュデ・ヅ・ポリモーフィズメ・ヒューメイン(Ceter d’Etude du Polymorphisme Humain)(CEPH)の参照家族を使用するマーカー−マーカーの距離に基づく)の組換え画分においてD6S88によりセントロメア側でおよび0.19の組換え画分においてF13Aによりテロメア側でフランキングされる。参照、L.P.W.Ranumら、Am.J.Hum.Genet.、49、31−41(1991)。両方のマーカーは非常に離れており、そしてSCA1遺伝子のクローニングを目標とした努力における使用のために実際的ではない。D6S89マーカーはSCA1遺伝子により密接してマッピングする。
SCA1座を含有する染色体6の短いアーム上の候補の大きさは約1.2Mbであり、そしてD6S274によりセントロメア側にそしてD6S89によりテロメア側にフランキングされる。SCA1遺伝子はゲノムDNAの450kbをスパンし、そして9エクソンにおいて構成される(第15図は正常の個体からのSCA1遺伝子の代表である)。SCA1転写体(すなわち、mRNAまたはcDNAのクローン)は約10.6〜11kbである。この遺伝子は正常のおよび影響を受けた両方のアレレにおいて転写される。この遺伝子は5’−非翻訳領域において7つのエクソン、2448bpのコーディング領域を含有する2つの大きいエクソン(2080bpおよび7805bp)、および7277bpの3’−非翻訳領域を含有することにおいて、この遺伝子の構造は独特である。最初のコーディングエクソンは、いくつかの組織において広範な代替スプライシングを行う。
適当な複製可能なベクターの中へのSCA1DNAのクローニングは、遺伝子産物のアタクシン−1の発現を可能とし、そしてそれ以上の遺伝子操作のためにSCA1遺伝子を利用可能とする。アタクシン−1またはその部分の発現は有用である。なぜなら、これらの遺伝子産物はいっそう詳しく後述するように抗原として使用して抗体を生成することができるからである。
SCA1遺伝子を含有するDNAは、SCA1mRNAを有しかつ検出可能なレベルでそれを発現すると信じられる組織から調製したcDNAライブラリーから得ることができる。好ましくは、cDNAライブラリーはヒト胎児の脳または大人の小脳からのものである。必要に応じて、SCA1遺伝子はゲノムDNAライブラリーから得るか、あるいは完全なヌクレオチドまたはアミノ酸の配列からのin vitroのオリゴヌクレオチド合成により得ることができる。
SCA1遺伝子を含有する核酸(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)は、それ以上のクローニング(DNAの増幅)のために、あるいは遺伝子産物、アタクシン−1の発現のために、好ましくは複製可能なベクターの中に挿入される。多数のベクターが入手可能であり、そして適当なベクターの選択は次に依存するであろう:1)それをDNAの増幅またはDNA発現のために使用するかどうか;2)ベクターの中に挿入すべき核酸の大きさ;および3)ベクターで形質転換すべき宿主細胞。大部分の発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少なくとも1つのクラスの生物の中で複製することができるが、発現のために他の生物の中にトランスフェクションすることができる。例えば、ベクターを大腸菌(E.coli)の中にクローニングし、次いで同一ベクターが宿主細胞の染色体に対して独立に複製することができきなくてさえ、それを発現のために酵母または哺乳動物細胞の中にトランスフェクションされる。各複製可能なベクターは、その機能(DNAの増幅またはDNAの発現)およびそれが適合性である宿主細胞に依存して種々の構造成分を含有する。これらの成分は下に詳述する。
ここにおけるベクターのクローニングまたは発現のために適当な宿主細胞は、前述の原核細胞、酵母、または高等真核細胞である。適当な原核生物は、真性細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌(E.coli)、バシラス(Bacillus)、例えば、枯草菌(B.subtilis)、シュードモナス属(Pseudomonas)、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、またはセラチア・マルセカンス(Serratia marcsecans)を包含する。1つの好ましい大腸菌(E.coli)のクローニング宿主は大腸菌(E.coli)294(ATCC 31,446)であるが、他の株、例えば、大腸菌(E.coli)B、大腸菌(E.coli)X1776(ATCC 31,537)、および大腸菌(E.coli)W3110(ATCC 27,325)は適当である。これらの例は限定的あるよりむしろ例示的である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。あるいは、クローニングのin vitro法、例えば、PCRまたは他の核酸ポリメラーゼ反応は適当である。
宿主細胞を本発明の前述の発現ベクターまたはクローニングベクターによりトランスフェクションおよび形質転換し、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、あるいは所望の配列をエンコードする遺伝子を増幅するために適当であるように修飾された普通の栄養培地の中で培養する。
SCA1遺伝子産物、アタクシン−1を生産するために使用する原核細胞は、Sambrookらに一般に記載されているように、適当な培地の中で培養する。SCA1遺伝子産物を生産するために使用する哺乳動物宿主細胞は種々の培地の中で培養することができる。商業的に入手可能な培地、例えば、Hams F10(シグマ)、最小必須培地(MEM、シグマ)、RPMI 1640(シグマ)、およびダルベッコ変性イーグル培地(DMEM、シグマ)は宿主細胞の培養のために適当である。これらの培地は必要に応じてホルモンおよび/または他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩)、緩衝液(例えば、HEPES)、ヌクレオシド(例えば、アデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(GentamycinTM薬物)、微量元素(マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される)、およびグルコースまたは同等のエネルギー源で補充することができる。また、任意の他の必要な補充物質を当業者に知られている適当な濃度で含めることができる。培養条件、例えば、温度、pHなどは発現のために選択される宿主細胞とともに従来使用されているものであり、そして当業者にとって明らかであろう。この開示の中で言及される宿主細胞は、in vitroの培養物ならびに宿主動物内に存在する細胞を包含する。
SCA1遺伝子は新規なタンパク質、アタクシン−1をエンコードし、約87kDの推定分子量をもつその例は第15図に示されている。アタクシン−1はその不安定なCAG領域をもつSCA1遺伝子から生産される1組のタンパク質を表すことを理解すべきである。アタクシン−1は細胞培養物から生産することができる。組換えDNA技術の助けにより、アタクシン−1をコードする合成DNAおよびcDNAを微生物の中に導入し、次いでこの微生物がそのペプチドを生産するようにさせることができる。また、ペプチド合成について知られているように方法で、アタクシン−1を合成的に製造することができる。
アタクシン−1は組換え細胞のタンパク質またはポリペプチドから精製して、アタクシン−1として実質的に均質である調製物を得ることができる。第1ステップとして、培地またはリゼイトを遠心して粒状細胞破片を除去する。次いで、膜および可溶性タンパク質の画分を分離する。アタクシン−1が膜に結合しているかどうかに依存して、可溶性タンパク質画分からおよび培養リゼイトの膜画分から精製することができる。必要に応じて、アタクシン−1は汚染物質の可溶性タンパク質およびポリペプチドからさらに精製し、次の手順は適当な精製手順の典型である:イムノアフィニティーまたはイオン交換のカラム上の分画;逆相HPLC;シリカまたはカチオン交換樹脂、例えば、DEAE上のクロマトグラフィー;クロマトフィーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈澱;例えば、セファデックス(Sephadex)G−75を使用する、ゲル濾過;例えば、汚染物質、例えば、IgGを除去するためのプロテインAセファローズ(Sepharose)カラムを使用する、アフィニティークロマトグラフィー。
本発明は、また、アタクシン−1またはアタクシン−1断片(好ましくは、折りたたまれたタンパク質の表面を形成する、8〜40アミノ酸、より好ましくは10〜20アミノ酸を有する断片)、またはその変異型に対してレイズされたポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関し、そしてこのような抗体の使用に基づく診断方法に関し、このような方法はウェスタンブロッティングおよびELISA(酵素結合イムノアッセイ)を包含するが、これらに限定されない。
I. D6S89に対してセントロメアにマッピングするSCA1のための遺伝子
D6S89に関するSCA1の位置を決定しそしてより近いフランキングマーカーを同定するために、2つのジヌクレオチド反復の多形性D6S109およびD6S202を使用した。D6S89領域において分離されたYACクローンを使用して、3つの追加のジヌクレオチド反復の多形性が同定され、それらの一方(AM10GA)はSCA1との組換えを示さずそしてD6S89がSCA1に対してテロメアであることを確証した。D6S109におけるジヌクレオチド反復はSCA1との6つの組換え事象を明らかにし、そしてD6S109がセントロメアの末端における他方のフランキングマーカーであることを決定した。連鎖の分析、後述するような物理的マッピングデータ、および組換え事象の分析は、マーカーの順序は次の通りである:セントロメア−D6S109−AM10GA/SCA1−D6S89−SB1−LR40−D6S202−テロメア。
1.SCA1家系
9つの大きいSCA1の家族をこの研究において使用した。これらの家族がSCA1を分離したということを証明する臨床的発見および連鎖のデータは、従来報告された。参照、J.F.Jacksonら、N.Engl.J.Med.、296、1138−1141(1977);B.J.B.Keatsら、Am.J.Hum.Genet.、49、972−977(1991);L.P.W.Ranumら、Am.J.Hum.Genet.、49、31−41(1991);およびH.Y.Zoghbiら、Am.J.Hum.Genet.、49、23−30(1991)。位置D6S109、AM10GA、SB1、LR40、およびD6S202における多形性の分析は、これらの家系からの個体について実施した。
マーカー−マーカーの連鎖分析のために多数の情報を与える減数***を得るために、40の参照家族の遺伝子型をD6S109、LR40およびD6S202において決定した。酵母の人工的染色体(YAC)コンチグから分離されたマーカーAM10GAおよびSB1フランクD6S89は、D6S89から2方向に構築した(下を参照)。D6S109とD6S89との間で26の組換え体を定める18のCEPHのサブセットの遺伝子型をAM10GAおよびSB1において決定して、D6S109に関するAM10GA、D6S89およびSB1の順序を決定した。
D6S109およびD6S202位置における多形性ジヌクレオチド反復の同定および記述は、前に報告された。参照、L.P.W.Ranumら、Nucleic Acids Res.、19、1171(1991)およびF.LeBorgne−Demarquoyら、Nucleic Acids Res.、19、6060(1991)。
ヒトゲノムDNAからのジヌクレオチド反復の配列の増幅ために使用したプライマーの配列および濃度、およびPCRサイクル時間を表1に表す。LR40多形性について、プライマーの組「A」をTX−SCA1、LA−SCA1、およびMS−SCA1家系の分析のために使用したが、プライマーの組「B」はすべての他の家系のために使用した。緩衝液の組成は次の通りであった:50mMのKCl、10mMのTris−Cl pH8.3、1.25mMのMgCl2 (AM10GAについて1.5mMのKCl)、250μMのdNTP(複数)(AM10GAについて200μMのdNTP(複数))、0.01%(w/v)のゼラチン、および0.5〜0.625単位のTaqポリメラーゼ。LR40の分析のために、2%のホルムアミドをPCR緩衝液の中に含めた。プライマーの組BをLR40の分析のために使用したとき、125μMのdNTP(複数)、1.5mMのMgCl2 、および1単位のTaqポリメラーゼを使用した。すべての反応の体積は25μlであり、そして40ngのゲノムDNAを含有した。4μlの各反応混合物を2μlのホルムアミド負荷緩衝液と混合し、90〜100℃において3分間変性し、氷上で冷却し、そして2〜4μlを4%または6%のポリアクリルアミド/7.65Mの尿素配列決定ゲル上の電気泳動のために1100Vで2〜34時間使用した。PCRアッセイの条件は従来D6S202およびD6S109について報告された。参照、L.P.W.Ranumら、Nucleic AcidsRes.、19、1171(1991)およびF.LeBorgne−Demarquoyら、Nucleic Acids Res.、19、6060(1991)。
MLINK、ILINK、LINKMAP、CLODSCOREおよびCMAPプログラムを含むコンピュータープログラムLINKAGEバージョン5.1を使用して、D6S109、AM10GA、D6S89、SB1、LR40およびD6S202マーカーをSCA1に対する連鎖について分析した。参照、G.M.Lathropら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81、3443−3446(1984)。分析に含めた家族の各々について、年齢依存性浸透のクラスを独立に帰属させた。マーカーのアレレを家族において分離するアレレの数を4、5または6アレレに減少して分析を簡素化した。種々のマーカーについてのアレレの頻度は各家族における配偶者の間のアレレの頻度に基づき、そして2つのアメリカの黒人の家系について、イタリアの家系について、およびミネソタ州、ミシンガン州、およびミシシッピ州からの白人の家系について別々に決定し、ただし−MIおよびMNにおけるD6S109についてのアレレの頻度はCEPH家族におけるアレレの頻度に基づいた。
40のCEPH家族をGT反復マーカーD6S109、D6S202およびLR40について型別した。もとのアレレを5アレレに対して記録した。D6S109とD6S89との間の18の異なる家族から26の組換え体を定めるCEPHパネルのサブセットにおいて、SB1およびAM10マーカーを型別した。CLODSCOREプログラムを2点の分析のために使用し、そしてCMAPを3および4点の分析のために使用した。3点および4点の分析のために、マッピングしたマーカーの間の間隔を2点θm =θf の結果に基づいて固定した。各間隔内の10の異なる位置において、試験位置(SCA1)の位置の可能性を計算した。
Θ値における性差についての試験をχ2 統計学を使用して実施し、ここでχ2 =2(ln10)[Z(θm ,θf )−Z(θ=θm =θf )]、ここでZ(θm ,θf )は任意のθm およびθf についての全体のZmax であるが、Z(θ=θm =θf )はθm =θf に束縛されるZmax である。均質性(H1)の下で、χ2 は1d.f.でχ2 に近似する。均質性の拒絶はχ2 >3.84のとき起こる。
1.ジヌクレオチド反復のクローニングおよび配列決定および分析
ジヌクレオチド反復SB1およびLR40をAluプライムドPCRによりYACクローンから直接増幅し、そしてジヌクレオチド反復を含有する断片をハイブリダイゼーションにより同定した。PCR生成物を直接クローニングするか、あるいはAluプライマーと対合したテイルドポリ:GT)またはポリ(CA)を使用するそれ以上の増幅によりクローニングした。さらに、2つのジヌクレオチド反復をAM10位置においてYACから構成したライブラリーからのラムダファージクローンからサブクローニングした。
a.CEPH家族。SCA1遺伝子についてよく定められた遺伝地図を確立するために、新しく分離したDNAマーカーをCEPH参照家族を使用してマッピングした。CEPH家系における対の方法の連鎖分析の結果を表3に示す。D6S109とD6S89との間の26の組換え体を定めたCEPHパネルのサブセットを使用して、AM10GAとD6S89との間で組換え体は観察されなかった(θ=0.00、Zmax =15.1)。マーカーD6S109およびLR40はD6S89に近接し、組換え体の画分は、それぞれ、0.067(Zmax =71.4)および0.04(Zmax =84.5)であった。
SCA1家系における対の方法の連鎖分析の結果を表5に示す。AM10GA、D6S89、およびSB1のすべてはSCA1に密接に連鎖される。AM10GAおよびSCA1の組換えは観察されなかった;ロッド・スコアは0.00の組換え画分において42.1である。D6S89とSCA1との間の組換え画分は0.004である(67.6のロッド・スコア)。SB1とSCA1との間の組換え画分は0.007である(39.5のロッド・スコア)。D6S109、LR40およびD6S202は同様によくSCA1に連鎖されるが、距離がより大きい(それぞれ、0.04、0.03、および0.08の組換え画分)。9つの大きい家系における遺伝地図作製に基づいて、SCA1座はD6S89およびAM10GAに対して非常に密接し、Zmax −1支持間隔は両方の場合において0.002より小さいか、あるいはそれに等しい。
D6S89とSCA1との間の1つの組換え事象は影響を受けた個体において確証された。患者、第4図における個体MI−2は、また、SB1における組換え体であったが、LR40およびD6S202において情報を与えなかった。彼はHLA、D6S109およびAM10座における病気のハプロタイプを有し、第4図において一番右の矢印がに示すように、SCA1がD6S89に対してセントロメアであること証明した。試料の混合の可能性を排除するために、患者のDNAを髪の毛の試料から再抽出し、そしてD6S109、D6S89、D6S202、LR40、AM10GA、およびSB1について再型別した。髪の毛の試料からの結果は、患者の血液からの本来確立された細胞系からのものと合致した。患者の医学的記録を注意して再検査し、そして彼は事実失調を有することが確証された。さらに、彼のハプロタイプは姉妹および娘のものと合致した。
SCA1遺伝子を含有する可能性のある領域(SCA1臨界領域)の規定およびクローニングの究極的目標をもって、2.5Mbの酵母の人工的染色体(YAC)コンチグを発生させた。
1.細胞系
I−7は、その唯一のヒト染色体として染色体6の短いアームを含有する、ヒト−ハムスターのハイブリッド細胞系である。参照、H.Y.Zoghbiら、Genomics、6、352−357(1990)。R86、R78、R72、R54およびR17は、6p22−p23の種々の部分を保持する、放射線減数ハイブリッド細胞系である。参照、H.Y.Zoghbiら、Genomics、9、713−720(1991)。R54はD6589に対してテロメアであることが知られているマーカー、例えば、D6S202およびF13Aを保持する。
D6S89を保持する放射線減数ハイブリッド(R86)からDNA、およびD6S89を保持しないが、直ちにフランキングするD6S89マーカーを保持する4つの放射線ハイブリッド(R78、R72、R54およびR17)からのDNAを比較Alu−PCRにおいてを使用して、領域特異的DNAマーカーを分離した。参照、D.L.Nelsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、6686−6690(1989);およびH.Y.Zoghbiら、Genomics、9、713−720(1991)。さらに、R78は6pのセントロメア領域から誘導されるマーカーを排除するとき有用であった。H.Y.Zoghbiら、Genomics、9、713−720(1991)。Alu−PCRは個々にAluプライマー559および517(D.L.Nelsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、6686−6690(1989))ならびにPDJ34(C.Breukelら、Nucleic Acids Res.、18、3097(1990))を使用して実施した。R86の中に存在するが、R78、R72、R54およびR17の中に存在しないことが発見されたAlu−PCR断片を同定し、そしてT−ベクターのプロトコールを使用して修飾した、EcoRV消化pBluescript IIKS+プラスミド(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラジョラ)の中にクローニングした。参照、D.Marchukら、Nucleic Acids Res.、19、1154(1990)。クローニングした断片をアプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド(Applied Biosystems,Inc.)(カリフォルニア州フォスターシティー)自動化配列決定装置で配列決定してSTSを確立した。
ワシントン大学のYACライブラリー(B.H.Brownsteinら、Science、244、1348−1351(1989))、およびCEPH YACライブラリー(H.M.Albertsenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87、4256−4260(1990))を、PCRに基づく方法によりスクリーニングした。参照、E.D.Greenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87、1213−1217(1990));およびT.J.Kwiatkowskiら、Nucleic Acids Res.、18、7191−7192(1990)。50mMのKCl、10mMのTris−HCl p8.3,1.25mMのMgCl2 、0.01%(w/v)のゼラチン、250μMの各dNTP;1.25単位のアンプリタク(Amplitaq)ポリメラーゼ(パーキン・エルマー(Perkin Elmer)、コネチカット州ノーウォーク)および1μMの各プライマーを含有する25〜50mlの最終体積で、PCR増幅を実施した。PCRサイクル条件を表6に特定する。
b PCR条件は94℃で4分間、次いで1分間の94℃の変性、1分間の特定した温度におけるアニーリング、および2分間の72℃の伸長の35〜40サイクルであった。72℃において7分の最後の伸長を使用した。PCRの緩衝液およびプライマーの濃度はテキストに記載されている通りである;53G12−L STSについて、PCR反応において2%のホルムアミドの最終濃度を使用した。
コスミドライブラリーは4つのYACクローンから製造した;227B1、195B5、A250D5、および379C2。YACからのゲノムDNAをMboIで部分的に消化し、そして製造業者の推奨に従いコスミドベクターsuperCos1(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラジョラ)の中にクローニングした。プローブとして放射性標識化剪断ヒトDNAを使用して、ヒトインサートを含有するクローンを同定した。
M.C.Wapenaarら、Hum.Mol.Genet.、2、947−995(1993)に記載されているような希有カッター(rare−cutter)制限酵素を使用しそしてG.A.Silvermanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、7485−7489(1989)におけるように、YACプラグを完全に消化した。酵素はニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs)(マサチュセッツ州ベベリイ)およびベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス(Boehringer Manheim Biochemicals)(インジアナ州インジアナポリス)から購入し、そして製造業者が推奨するように使用した。50kb〜600kbの範囲のDNA断片を分離する条件下にバイオ−ラド(Bio−Rad)CHEF装置で、すべてのPFGE分析を実施した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、そして酸ニッキングするか、あるいはUVストラタリンカー(Stratalinker)(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラジョラ)の中で200,000mJの紫外線エネルギーに暴露した。ゲルを0.4N NaOHの中で変性し、そして10×SSC(1.5M NaCl/150mMのクエン酸ナトリウム)または0.4N NaOHの中でハイブリダイゼーション膜(オンコール(Oncor)、マリイランド州ガイサーバーグ)に製造業者の推奨に従い移した。フィルターのハイブリダイゼーションは表6および第6図に記載されているプローブを使用して実施した。また、それぞれ、左(TRP/CEN)および右(URA)のpYAC4に対して特異的な2.5kbおよび1.6kbのpBR322BamHI/PruII断片を使用した。プローブをA.P.Feinbergら、Anal.Biochem.、137、266−267(1984)に記載されているランダムプライミング技術により放射性標識化した;反復配列を従来P.G.Sealyら、Nucleic Acids Res.、13、1905−1922(1985)に記載されているように剪断ヒト胎盤DNAによりブロックした。
プライマーの配列およびPCRサイクル条件を表6に表す。緩衝液の条件はAlu−PCRと同一であった。すべての反応体積は25μlであり、そして40ngのゲノムDNAを含有した。各対の一方のプライマーを5’末端において[γ−32P]dATPで標識化した。各反応の4μlを2μlのホルムアミド負荷緩衝液と混合し、90〜100℃において3分間変性し、氷上で冷却し、そして4〜6μlを4%のポリアクリルアミド/7.65Mの尿素の配列決定ゲル上の電気泳動のために使用した。
1.6p22−p23およびYACのスクリーニングにおける配列標識化部位の発生
D6S89を保持する放射線ハイブリッド(R86)からおよびD6S89について欠失するが、D6S89をフランクするマーカーを保持する4つの放射線ハイブリッド(R78、R72、R54およびR17)からのAlu−PCR生成物の比較分析は、R86の中に存在するが、他の4つのの中に存在しない3つの新しいDNA断片の同定を可能とした。これらの3つのDNA断片を、AM10、AM12およびFLB1命名し、分離し、そして6p体細胞のハイブリッドのパネルおよび放射線減数ハイブリッドのパネルを使用してマッピングして(H.Y.Zoghbiら、Genomics、9、713−720(1991))それらの領域の局在化を確証した。すべての3つは6pおよびR86にマッピングされ、D6S89座への密接な近位を確証した。それらの3つのAlu−PCR断片をサブクローニングしそして配列決定して、配列決定された標識化部位(STS)を確立した。AM10、AM12、FLB1およびD6S89におけるSTSを使用して、ワシントン大学およびCEPH YACライブラリーをスクリーニングした(H.M.Albertsenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87、4256−4260(1990);およびB.H.Brownsteinら、Science、244、1348−1351(1989))。これらの4つのSTSにおいて分離されたYACをオーバーラップについて分析した。コンチグ末端を表すYACからのインサートの末端を分離し、サブクローニングし、そして配列決定して、それ以上のYACのウォーキングのための新しいSTSを確立した。1つの場合において、YAC 195B5について発生したコスミドライブラリーから誘導したコスミドからのサブクローンを使用することによって、STSを確立した。
YACインサートの大きさをパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)により決定した;インサートの大きさは75〜850kbであった。インサートのキメラ現象の高い頻度が与えられると、S.Banfiら、Nucleic Acids Res.、20、1814(1992)に記載されているように、キメラ現象の急速な検出のためのAlu−PCRに基づくハイブリダイゼーションの戦略を使用した。30のYACクローンをこのアプローチを使用して試験し、そして8つ(27%)はキメラであることが発見された。YACから分離されたインサートの末端は、ドットブロットハイブリダイゼーションにより非キメラであると決定され、他のキメラにマッピングされることが証明された198C8からの2つの末端を除外して、6p22−p23にマッピングされた。
クローンの間のオーバーラップの程度を定めそして可能な再配列、例えば、YACの内部の欠失を検出するために、プローブの含量のマッピングの戦略を次に基づいて使用した:1)表6に記載するもの、および高度に情報を与えるジヌクレオチド反復、例えば、AM10−GAおよびSB1におけるものの両方を含む領域におけるすべてのSTSを使用するすべてのクローンのPCR分析;および2)YAC末端、YACのコスミドのサブクローン、またはYACからのAlu−PCR断片から誘導された密に間隔を置いて位置するDNAプローブと、関係する領域の中にYACからのEcoRI消化DNAを含有するサザンブロットをハイブリダイゼーションさせること。YAC(32クローン)の代表的なサブセットについての分析の結果を表7に要約する。39のYACクローンは、D6S274から82G12−R(YACクローン0G12の左末端)の中断しないYACコンチグを形成する。1つのYAC(351B10)における内部の欠失以外に、この分析の分解能内で他の欠失は検出されなかった;さらにいくつかのYACクローン(例えば、270D12および140H2)についてのキメラ現象の程度を決定した。6p上のYACコンチグのセントロメア−テロメアの向きは、遺伝データならびに物理的マッピングのデータの両方を使用して決定された。D6S89とSCA1との間の組換え事象をもつ主要な個体におけるD6S109、AM10GA、D6S89、およびSB1におけるジヌクレオチド反復の分析を使用すると、AM10GAとD6S89との間で組換え事象が起こったことを明らかにした。D6S109がD6S89に対してセントロメアであることが与えられると、組換えの分析はAM10GAがD6S89に対してセントロメアであることを示唆する。D6S89に関するSB1のセントロメア−テロメアの位置は遺伝的に決定することができなかった。
最近同定されたジヌクレオチド反復(AM10GAおよびSB1)を使用する遺伝の研究は、SCA1が9つの大きいSCA1家系においてAM10GAに非常に密接したD6S89座に対してセントロメアにマッピングする(ゼロの組換え頻度において42.1のピーク負荷スコア)ことを示した(上の実施例1)。こうして、D6S89はテロメア末端における最も近いフランキングマーカーである。以前において、最も近いフランキングマーカーはD6S109、すなわち、D6S89に対して6.7cMセントロメアであると推定されたジヌクレオチド反復であった。セントロメア末端におけるより近いフランキングマーカーを同定するために、われわれは6p22−p23をマッピングすることが知られている4つのジヌクレオチド反復を含有するマーカー、D6S260、D6S274、D6S288およびD6S289をマッピングした(J.Weissenbachら、Nature、359、794−801(1992))。放射線減数ハイブリッドおよびこの領域から分離されたYACクローンを使用して、これらのマーカーの領域的マッピングを実施した。これらのデータを明らかにするように、AM10GAに対してセントロメアであることが知られている放射線ハイブリッドR17およびR72からのDNAの増幅により明らかであるように、D6S274およびD6S288はAM10GAに対してセントロメアにマッピングする。D6S109とD6S89との間の主要な組換え事象を有する個体から、ならびに5つのSCA1家系(MN−SCA1、MI−SCA1、TX−SCA1、M−SCA1およびMA−SCA)からの影響を受けたおよび正常の個体(染色体の相を確立するために)からのDNAの遺伝子型の分析を実施した。この分析はD6S288とSCA1との間の組換えがないことを明らかにした。D6S274とD6S288との間の単一の組換え事象がMN−SCA1家系からの個体MN−1において検出された(第7図);この個体はSCA1とD6S109との間の組換え事象を有するとして上で同定された6つの個体のうちの1つであった。この分析はセントロメア末端における最も近いフランキングマーカーとしてD6S274の同定を可能とした。これらのデータを前述のデータと組み合わせると、SCA1臨界領域はD6S274とD6S89との間でマッピングすることが決定された。この候補の領域(1.2Mb)を、第8図に示すように最小の4つのオーバーラップするおよび非キメラのYACの中でクローニングする。
SCA1臨界領域におけるYACコンチグの大きさの推定値を得るために、われわれはこの領域からのYACについて長い領域の制限分析を実施した。この分析のために使用したYACは次のものを包含した:227B1、60H7、351B10、172B5、195B5、A250D5、379C2、および168F1。次の希有カッター制限酵素を使用した:NotI、BssHII、NruI、MluI、およびSacII。PFGEにより分離しそしてナイロン膜上に移した制限断片をいくつかのDNAプローブにフィルターを順次にハイブリダイゼーションすることによって検出し、プローブは次のものを包含した:pYAC4ベクターの左および右のアームに対して特異的なDNAプローブ;内部のYACクローンのためのインサートの末端;内部のプローブおよびコスミドのサブクローン;およびAlu特異的プローブ。長い領域の制限分析において使用したすべてのプローブの位置および名称を第8図に示す。この分析に基づいて、YAC 351B10についての内部の欠失が確証された。YACクローンの間のオーバーラップの程度を決定した。重要SCA1領域の大きさは1.2Mbであると推定された。内部の欠失および/または再配列は、単一のYACを制限酵素分析により分析した区域について排除することができなかった。これらはYAC 195B5内の220kbの領域およびYAC 379C2内の335kb領域を包含する。
A.方法
1.トリヌクレオチド反復についてのスクリーニング
YACからのゲノムDNAをMboIで部分的に消化し、そして製造業者のプロトコールに従いコスミドベクターsuperCosI(ストラタジーン(Stratagene))の中にクローニングした。ヒトインサートを含有するクローンを放射性標識化ヒトDNAとのハイブリダイゼーションにより同定し、そして格子のプレート上に配列した。YAC227B1からのコスミドのクローンのフィルターのリフトを、[γ−32P]末端標識化(GCT)、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより、トリヌクレオチド反復の存在についてスクリーニングした。平行実験において、トリヌクレオチド反復の種々の順列を表す10オリゴヌクレオチドの混合物を末端標識化し、そしてYACの195B5およびA250D5からのEcoRI消化コスミドのサザン転移に対してハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは1M NaCl、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および10%(w/v)硫酸デキストランの溶液の中で実施した。フィルターを2×SSC(1×SSCは0.15M NaClおよび0.015Mのクエン酸ナトリウムである)、および0.1%SDSの中で室温において15分間洗浄し、次いで67℃に前もって加温した溶液の中で室温において15分間洗浄した。両方の戦略はいくつかの陽性のクローンを同定し、それらのうちの22はオーバーラップしており、そして同一の3.36kbのEcoRI断片を含有し、この断片は(GCT)7 プローブに対してハイブリダイゼーションしそして究極的に配列の分析によりCAG反復を有することが証明された。
ゲノムDNAをTaqI(ベーリンガー・マンヘイム(Boehringer Mannheim)、インジアナ州インディアナポリス)またはBstNI(ニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs)、マサチュセッツ州ベベリイ)で製造業者の推奨に従い消化した。サザンブロッティングは標準のプロトコールに従い実施した。
CAGトリヌクレオチド反復を含有しかつフランキングする領域の中のDNA配列を決定するために、3.36kbのEcoRI断片を含有するCAGトリヌクレオチド反復、クローンpGCT−7、をサブクローニングした。CAGトリヌクレオチド反復をもつ400bpの断片をpGCT−7からSau3AI消化により発生させ、そしてpBluescriptKS−(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラジョラ)のBamHIの中にサブクローニングした(クローンpGCT−7.s1)。さらに、pGCT−7をPstIで消化して1.3kbのDNAを除去し、そして形質転換について再循環した(クローンpGCT−7.p2)。トリヌクレオチド反復の位置を(GCT)7 オリゴヌクレオチドおよびフランキング配列決定プライマーの1つをPCRプライマーとして使用するPCRにより決定した。初期の結果は、CAGトリヌクレオチド反復が逆プライマー鎖上に、逆プライマーから約1.3kb、すなわち、PstIから400bpに存在することを示した。シクエナーゼ(Sequenase)および△Taqサイクル−配列決定キット(ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルス(Unites States Biochemicals)、オハイオ州クレブランド)を使用するジデオキシ連鎖停止法により、DNA配列決定を実施した。汎用(−40)プライマーおよび逆プライマーの両方をクローンpGCT−7.s1のために使用したが、汎用(−40)プライマーのみをpGCT−7.p2の配列決定に使用した。
チオシアン酸グアニジニウムおよび引き続いて塩化セシウム勾配を使用して、全体のRNAをリンパ芽球様細胞から抽出した。ダイナル(Dynal)(グレイト・ネック(Great Neck)、ニューヨーク)からのダイナビーズ(Dynabeads)オリゴ(dT)25を使用して、ポリ(A)- RNAを選択した。MMLV逆転写酵素(BRL、マリイランド州ガイサーバーグ)を使用して、第1鎖cDNA合成を実施した。次の3サイクルを使用するホット・スタートPCRにより、RT−PCRを実施した:1分間97℃、1分間59℃、および1分間72℃、Pre1およびPre2のプライマーの組について。次いで、1分間94℃、1分間57℃、および1分間72℃の33サイクルを実施した。Rep1およびRep2のプライマー対について、それぞれ、57℃および55℃のより低いアニーリング温度において同一PCRサイクル条件に従った。RT−PCR生成物を6%ヌシーブ(Nusieve)アガロースゲル上で分析した。種々のヒト組織を含有するノザンブロットをクローンテク(Clonetech)(カリフォルニア州パロアルト)から購入した。
1.5mMのMgCl2 、300μMの各dNTP(Rep−1/Rep−2について1.25mMのMgCl2 および250μMの各dNTP)、50mMのKCl、10mMのTris−HCl、pH8.3、および1単位のアンプリタク(Amplitaq)(パーキン・エルマー(Perkin Elmer)、コネチカット州ノーウォーク)を含有する20μlの合計の体積において、50ngのゲノムDNAを5pmolの各プライマー(CAG−a/CAG−bまたはRep−1/Rep−2)と混合した。CAG−a/CAG−bプライマー対について、[α−32P]dCTPをPCR反応に混入し、Rep−1/Rep−2プライマー対について、Rep−1プライマーを5’末端において[γ−32P]dATPで標識化した。Rep−1/Rep−2プライマー対使用するとき、ホルムアミドを2%の最終濃度で使用した。試料上に鉱油を配置し、試料を94℃において4分間変性し、次いで30サイクルの変性(94℃、1分)、アニーリング(55℃、1分)、および伸長(72℃、2分)を実施した。6マイクロリットル(μl)の各PCR反応混合物を4μlのホルムアミド負荷緩衝液と混合し、90℃において2分間変性し、そして6%ポリアクリルアミド/7.65M尿素DNA配列決定ゲルを通して電気泳動させた。移動をM13配列決定ラダーに関して比較することによって、アレレの大きさを決定した。
1.SCA1におけるCAG反復領域のクローニング
前述したように、SCA1遺伝子をクローニングする努力において、6p22−p23にマッピングするいくつかのジヌクレオチド反復の多形性を使用して主要な組換え事象を分析して、SCA1遺伝子を含有する可能性がある小さい領域を同定した。この分析により、5つの大きい家系においてSCA1とセントロメアのマーカーD6S288との間において、あるいは9つの大きい家系においてSCA1とテロメアのマーカーAM10GAとの間において、組換え事象が存在しないことが明らかにされた。単一の組換え事象がD6S274とD6S288との間において検出され、セントロメアの末端における最も近いフランキングマーカーがD6S274であることが同定された。テロメアの末端において、単一の組換え事象がAM10GAとD6S89との間において検出され、そして後者がフランキングマーカーとして同定された。D6S274からD6S89に伸長しそして全体のSCA1の候補の領域をスパンする、酵母の人工的染色体(YAC)コンチグが発生した。この領域を包含するYACクローンのサブセットを第9図に示す。長い領域の制限分析は、SCA1の候補の領域の大きさがほぼ1.2Mbであることを決定した。コスミドのライブラリーをYACの227B1、195B5、A250D5。PNAS(USA)379C2から構成した。ヒトインサートを含有するコスミドのクローンの配列を、直列に反復するCAGから成るオリゴヌクレオチドと、ならびに他のトリヌクレオチド反復を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた。いくつかのハイブリダイゼーションするコスミドのクローンが同定され、それらのうちの23はCAG反復について陽性であり、そしてD6S288とAM10GAとの間の領域にマッピングされた(第9図)。すべての22のこれらのクローンは、CAG反復に特別にハイブリダイゼーションした共通の3.36kbのEcoRI断片を共有した。
SCA1におけるこの反復の遺伝的安定性を試験するために、われわれはサザンブロット分析を使用して若年性発症SCA1を有する家族を検査した。TX−SCA1家族からの2世代下がった家系図を第10a図に示す。TaqI断片の拡張を有するSCA1の父系伝達が認められた。2830bpの断片が影響を受けなかった配偶者からのDNAにおいてかつSCA1患者からの正常の染色体上に検出されたが、2930bpの断片は影響を受けた父(25歳の発症)からのDNAにおいて見出されそして3000bpの断片は4歳の発症の彼の影響を受けた子供からのDNAにおいて検出された。第2のSCA1家系、家族MN−SCA1(第10b図)において、2つの子孫は彼らの父からのSCA1を受け継ぎそして発症年齢が異なった(25歳および9歳)。これらの個体は、また、彼らの影響を受けた父から受け継いだ増幅されたTaqI断片の大きさが異なった、それぞれ、2900bpおよび2970bp。
DNAの拡張に関係する領域を同定するために、3.36kbのEcoRI断片の500bpの(CAG)n を含有するサブクローンならびに全体の3.36kbの断片(第1図)を配列決定した。この正常のアレレは30のCAG反復領域を明らかにした。2つの反復単位(位置13および15)において、TがGの代わりに存在した。
CAG反復領域が遺伝子内に存在するかどうかを試験するために、反復を直ちにフランキングするプライマー(Rep1およびRep2)ならびに反復に直ちに隣接する配列を増幅するプライマー(Pre1およびPre2)を使用して、逆転写−PCR(RT−PCR)を実施した。RT−PCR分析は、CAG反復がリンパ芽球からのmRNAの中に存在することを確証する。さらに、プローブとして3.36kbのEcoRI断片からの1.1kbのサブクローン(C208−1.1)を使用する、ヒトポリ(A)- RNAのサザンブロット分析は、脳、骨格筋、胎盤においておよびより少ない程度に腎臓、肺および心臓において発現される10kbの転写体を同定した。この転写体の発現は骨格筋においてかなりの程度である。ノザンブロット上のプローブとして3.36kbのEcoRI断片を使用したとき、同一大きさの転写体が検出された。
CAG反復が観察された長さの変動に関係することを確証するために、われわれはCAG反復をフランキングする合成オリゴヌクレオチドを使用して、45の影響を受けなかった配偶者および31のSCA1影響を受けた個体においてPCR増幅した断片の大きさを分析した。1対のプライマー(CAG−a/CAG−b)は9bpの反復内に位置しそして同定された長さの変動はCAG反復が変動の基礎であることを示した。
CAG反復を含有する断片の配列の分析は、いくつかの伸長したオープンリーディングフレームの存在を示した。これらのフレームの1つ(389bp)における反復の翻訳はポリグルタミンをエンコードするであろう。
A.方法
1.cDNAライブラリーのスクリーニング
3つのcDNAライブラリーをスクリーニングした:ストラタジーン(Stratagene)(カリフォルニア州ラジョラ)からのヒト胎児脳ライブラリー、インサートがNotI制限部位の中にクローニングの中にクローニングされたλ−ZapIIの中で構成されたヒト胎児脳ライブラリー(チェン・チ・リー(ChengChi Lee)博士、Baylor College of Mecicine、により提供された)、およびクローンテク(Clonetech)(カリフォルニア州パロアルト)からの大人小脳cDNAライブラリー。細菌株LE392(ATCC No.33572)を使用して、ライブラリーを50,000pfu/プレートの密度で150cmのプレート上にプレートした。ハイボンド(Hybond)−Nフィルター(アマーシャム(Amersham)、イリノイ州アーリントンハイツ)を使用して、プラークのリフトを実施した。第1スクリーニングにおいてプローブとして使用した断片は、反復を直ちにフランキングするプライマーRep1およびRep2(第3図)および反復に直ちに隣接する配列を増幅するプライマーPre1およびPre2、および3.36kbのEcoRI断片の1.1kbのサブクローン(第1図)を使用することによって得られた、2つのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)生成物の混合物を含んだ。1.1bpの断片(C208−1.1)はCAG反復に対して540bp3’に位置する。また、CAG反復を含有する同一コスミドから誘導された9kbのEcoRI断片をこのスクリーニングにおいて使用した。スクリーニングの引き続くラウンドは、プローブとしてcDNAクローン31−5、3J、3c7−2および3c7を使用して同一ライブラリーについて実施した(第13図)。ゲノムおよびcDNAのプローブを、A.P.Feinbergら、Anal.Biochem.、137、266−267(1984)に記載されているランダムプライムド技術を使用して標識化した。反復配列をP.G.Sealyら、Nucl.Acids Res.、13、1905−1922(1985)に記載されているようにブロックした。簡単に述べると、プローブを大過剰の剪断ヒト胎盤DNAと再連合した。非反復領域は一本鎖のままであり、そして低いコピー数の成分からのシグナルを引き続く転移ハイブリダイゼーションにおいて検出できるようにするためには、再連合した断片からの一本鎖断片の分離は不必要であった。次いで、フィルターのハイブリダイゼーションをH.Y.Zoghbiら、Am.J.Hum.Genet.、42、877−883(1988)に記載されているような標準のプロトコールに従い実施した。
A.T.Bankierら、Meth.Enzymol.、155、55−93(1987)に記載されているように、次のcDNAクローンの各々についてショットガンライブラリーをM13の中で構成した:8−8、31−5、3c5、3c7−1、3J、3c7−2、3c7(第13図)。R.Gibbsら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、86、1919−1923(1989)に記載されているように、アプライド・バイオシステムス(Applied Biosystems)、ABI370A、自動化蛍光配列決定装置を使用して、20〜30のM13サブクローンを各cDNAクローンについて配列決定した。二本鎖鋳型についてシクエナーゼ(Sequenase)配列決定キット(USB、オハイオ州クレブランド)を製造業者の推奨に従い手動的に使用して、いくつかのcDNAクローン(8−9b、8−9a、AX1、B21、B11、3c28)を部分的に配列決定した。分析したcDNA/ゲノムのクローンの数による配列の被覆はコーディングおよび5’UTRにおいて3〜4Xであり、そして3’UTRにおいて2Xであり、そして逆PCR生成物は、D.Marchukら、Nucl.Acids Res.、19、1154(1990)に記載されているようにT−ベクターのプロトコールを使用して修飾した、SmaI消化pBluescriptSK−プラスミド(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラジョラ)の中にサブクローニングした後、手動的に配列決定した。このプロトコールの使用はクローニングを促進する。簡単に述べると、Taqポリメラーゼは通常PCR生成物の3’末端においてアデノシンの鋳型依存性付加を引き起こし、平滑末端の結合を困難とする。T−ベクターのプロトコールにおいて、チミジンは消化したプラスミドの3’末端に付加される。これにより、PCR生成物における3’アデノシンに対して相補的な1塩基の粘着末端が生じ、これはクローニングの効率を大きく増加する。
種々のヒト組織からのポリ−(A)+ RNAおよび大人のヒト小脳からのポリ−(A)+ RNAのノザンブロットをクローンテク(Clonetech)(カリフォルニア州パロアルト)から購入した。ヒトリンパ芽球様細胞からのポリ−(A)+ RNAは、まずチオシアン酸グアニジニウムを使用して全体のRNAを抽出し、次いで塩化セシウム勾配の遠心により調製した(P.Chomczynskiら、Anal.Biochem.、162、156−159(1987))。ダイナル(Dynal)(ニューヨーク州グレイトネック)からのダイナビーズ(Dynabeads)オリゴ(dT)25)を使用して、ポリ−(A)+ RNAを選択した。MMLV(ネズミマロネー白血病ウイルス)逆転写酵素(BRL、マリイランド州ガイサーバーグ)を使用して、第1鎖のランダムにプライミングされたcDNA合成を実施した。これは20μlの反応混合物中で実施し、この反応混合物は3μgのRNA、第1鎖緩衝液(50mMのTris−HCl、pH8.3、75mMのKCl、3mMのMgCl2 )(BRL、マリイランド州ガイサーバーグ)、10mMのジチオスレイトール(BRL、マリイランド州ガイサーバーグ)、1μMの3’末端プライマー、0.5単位のRNアーゼ(プロメガ(Promega)、ウイスコンシン州マディソン) 、5.0単位のMMLV逆転写酵素(BRL、マリイランド州ガイサーバーグ)、250μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸:dGTP、dATP、dCTP、dTTPを含有した。この混合物を37℃において20分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。10μlのアリコートをPCR反応のために使用した。脳、肝臓および副腎からの第1鎖のランダムにプライミングしたcDNAはG.Borsani博士(Baylor College of Medicine)により提供された。
CAG反復を含有することが示されたコスミドのクローンからの種々のDNA断片をプローブとして使用して、2つのヒト胎児脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。5つのcDNAクローンが同定された;これらはCAG反復を含有するクローン31−5、および31−5とオーバーラップしないことが発見されたクローン3Jを包含した(第13図)。ノザンブロット分析により、クローン31−5および3Jは検査したすべての組織において検出可能な同一の11kbの転写体を同定することが明らかにされた(第14図)。したがって、同一の2つのヒト胎児脳cDNAライブラリーおよびヒト大人小脳cDNAライブラリーを数ラウンドのスクリーニングのために使用して、全長の転写体を得た。結局、22のcDNAクローンを分離し、そして配列およびPCR分析により特性決定して、SCA1転写体をスパンするコンチグを組み立てた。cDNAコンチグをスパンするファージクローンの12を第13図に示す。これらのクローンを配列決定して、10,660bpをスパンするSCA1cDNAの全体の配列の集成を可能とした(第15図)。
A.方法
1.5’−RACE−PCR
実施例IVに記載するように、プライマー5R(第15図)を使用してヒト大人小脳からのポリ−(A)+ RNA(クローンテク(Clonetech)、カリフォルニア州パロアルト)の1mgから、第1鎖cDNAを調製した。5’−RACE−PCRは、M.A.Frohman、PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications;M.A.Innisら編;Academic Press:San Diego(1990)に記載されているように、特定のプライマーとしてSCA1プライマー5aおよびX4−1(表9)を使用して実施した。次いで、生成物を1.2%アガロースゲルを通して電気泳動させ、SureBlotハイブリダイゼーション膜(オンコール(Oncor)、マリイランド州ガイサーバーグ)上にブロットし、次いでエクソン1の中のプライマー9bとエクソン3の中のプライマーX3−1(表9)との間をスパンするPCR生成物により表されるSCA1特異的プローブにハイブリダイゼーションした、生成物の特異性を試験した。
CAG反復をフランキングするゲノム領域を特性決定するために、この反復を含有することが知られている3.36kbのEcoRIゲノム断片を完全に配列決定した。cDNA配列とのこのゲノム配列との整列は、160bpの5’UTR、第1の潜在的開始コドンおよび第1の1920bpのコーディング領域を有する2080bpのエクソンを3.36kbのEcoRI断片が含有することの決定を可能とする。コーディング領域の残部は、ゲノムDNAについてのPCR分析により検出される、次の下流のエクソン内に存在する。ゲノムDNAの中の9kbのEcoRI断片にマッピングする、最後のコーディングエクソンは、また、7805bpの合計の長さについて7277bpの3’UTRを含有する(第16a図)。
A.方法
1.イントロン−エクソン境界の同定
エクソン2〜9の境界を逆PCRにより同定した。逆PCRを実施するために、M.C.Wapenaarら、Hum.Mol.Genet.、2、947−952(1993)に記載されているように、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス(Boehringer Mannheim Biochemicals)(インジアナ州インジアナポリス)から購入しそして製造業者が推奨するように使用した頻繁カッター(frequent cutter)制限酵素、例えば、Sau3aI、TaqI、HaeIIIおよびMspIを使用して、YACアガロースを完全に消化した。次いで、プラグを製造業者の推奨に従いβアガラーゼI(USB、オハイオ州クレブランド)で消化し、引き続いてフェノール−クロロホルム(ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス(Boehringer Mannheim Biochemicals)(インジアナ州インジアナポリス))抽出し、エタノールで沈澱させ、そして12mlのTE(TE:10mMのTris−HCl、1mMのEDTA)pH8の中に再懸濁させた。次いで、各消化からの50ngのDNAをJ.Grodenら、Cell、66、589−600(1991)の発表されたプロトコールに従い循環させた。分岐するPCRプライマーをcDNA内で消化し、そしてJ.Grodenら、Cell、66、589−600(1991)に記載されている増幅条件下に循環生成物について使用した。次いで、PCR生成物を上の実施例IIに記載するようにサブクローニングしそして配列決定した。逆PCRは、エクソン1の境界を除外して、すべてのイントロン/エクソン境界を同定した。したがって、エクソン1を含有することが発見された9kbのEcoRIゲノム断片をYAC 227B1(実施例II)から誘導されたコスミドからサブクローニングした。このサブクローンを引き続いて部分的に配列決定して、エクソン1の境界を同定した。
SCA1臨界領域をスパンするYAC(複数)からのEcoRI消化DNAを含有するサザンブロットおよび希有カッター酵素(前の節を参照)で消化したYAC(複数)からのDNA(複数)を含有するサザンブロット、H.Y.Zoghbiら、Am.J.Hum.Genet.、42、877−883(1988)に記載されているような標準のプロトコールを使用して、種々のSCA1cDNAクローンに対してそしてイントロン−エクソン境界を含有するすべてのゲノム断片に対してハイブリダイゼーションさせた。簡単に述べると、制限断片を0.7%アガロースゲル上で電気泳動させ、変性しそしてニトラン(Nytran)(シュレイヘル・アンド・シュエル(Schleicher & Schuell)、ニューハンプシャイヤー州ネーネ)フィルターに移した。オリゴヘキサマー標識化法(A.P.Feinbergら、Anal.Biochem.、132、6−13(1983))を使用して、プローブを32P標識化した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄し、そしてオートラジオグラフィーをZoghbiら、Am.J.Hum.Genet.、42、877−883(1988)に記載されているように実施した。
3.36kbのEcoRI断片の完全な配列決定は、大部分のコーディング領域を含有する2080bpのエクソンについてのイントロン−エクソン境界を提供した。エクソンの実際の数を決定しかつイントロン−エクソン境界のすべてを得るために、いずれかの再配列を含有することが知られていない、2つのオーバーラップするYACクローン、227B1および149H3を使用して、逆PCRを採用した(実施例II参照)。合計9つのエクソン(それらのうちの7つは5’UTR内に存在した)が同定され、そしてエクソン1〜9についてのスプライス接合部をサブクローニングしそして配列決定した(第17図)。5’−非翻訳領域において、オールタネイトスプライシングは分析した5ファージcDNAクローンにわたってエクソン2、3および4を含んだが、エクソン5、6および7を含まなかった。推定上のエクソン1は175bpを包含し、そしてハムスターゲノムDNAから誘導されたEcoRI断片に非常に強くハイブリダイゼーションする。
トリヌクレオチドCAG反復の拡張がSCA1における神経変性に導く機構を理解するための第1ステップとして、患者において拡張したアレレからのSCA1の転写レベルを研究した。43〜69の範囲の反復大きさをもつSCA1患者からのリンパ芽球様mRNAを使用して、実施例Vに記載するようにCAG反復をフランキングするプライマーRep1およびRep2を使用して、RT−PCRを実施した。この分析により、mRNAは正常のアレレおよび拡張されたアレレの両方から発現されることが明らかにされた(第19図)。
SCA1遺伝子からのDNAをpMALTM−c2ベクター(ニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs)、マサチュセッツ州ベベリイ)の中にクローニングした。このベクターは引き続いて便利に切断できる連鎖の中の問題のタンパク質(アタクシン−1)のN−末端に融合したマルトース結合タンパク質から成るキメラ製造を生成する。クローニングのためのDNAを得るために、SCA1DNAを標準のPCR技術を使用して増幅しそしてクローン31−5(第13図)を分離した。適当なオリゴヌクレオチドのプライマー(pMALTMベクターのパッケージインサート、1992ニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs)、改定4/7/92)を消化するとき、製造業者の使用説明書に従った。各場合において、EcoRIリンカー部位を5’プライマーの中に消化しそしてHindIIIリンカー部位を3’プライマーの中に消化してクローニングを促進した。1つにおいて、コーディング領域の5’および3’末端にハイブリダイゼーションする2つの20マーのPCRプライマーCODおよびTCOD(表10)を利用してDNAを分離し、こうして増幅されるDNAのストレッチが、Met1で開始しそしてLys817で終わる、アタクシン−1の全体の配列をエンコードする推定される残基を含有するようにした(第15図)。次いで、増幅された生成物を製造業者により提供される使用説明書に従いpMALTM−c2のポリリンカー領域の中のEcoRI/HindIIIの中にクローニングした。2つの他の構成体を同一の方法でPCRを使用して作って、DNAのより短いセグメントを分離した。両方の場合において、同一の3’プライマーを使用したが、異なる5’プライマーを使用した(表10)。一方の5’プライマー(3COD)は増幅された生成物がMet277(コーディング領域における第4Met)において開始するように消化し、他方の5’プライマー(8COD)は増幅された生成物がMet548において開始するように消化した。pMALTM−c2をα−相補性のためのlacZ△M15アレレを含有する能力細胞の中に形質転換した。
実施例VIIにおける構成体により発現される融合タンパク質を、製造業者の指示に従いアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した(pMALTMベクターのパッケージインサート、1992ニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs)、改定4/7/92)。精製したタンパク質を8%SDSポリアクリルアミドの電気泳動により電気泳動させそして電気溶出した。最良の発現(1Lの細胞から約27mg)が最短の構成体から得られたが、すべての構成体はそれらのそれぞれのクローニングされた遺伝子産物と一致する大きさのタンパク質を測定可能なレベルで生産した。
A.材料および方法
1.家族の材料
優性に受け継がれた失調を有する87家系を代表する構成員を評価した。多様な民族的背景(白人のアメリカ人、黒人のアメリカ人、南アフリカ人、シベリア・イアクート人(Siberian Iakut))の9つ家系は、HLA座への連鎖および染色体6上のD6S89への連鎖に基づいてSCA1を有することが既に知られている。SCA1CAG反復の遺伝子型の分析をすべての9つの家系について実施して、すべての既知のSCA1家族が反復の拡張を含む同一の突然変異の機構を有するかどうかを決定した。研究の参加者の大部分を個人的に検査した。影響を受けた状態は神経学者により常に確証されたが、発症年齢は患者および/または他の家族の構成員からの歴史的情報に基づいた。病気の重症度は死亡年齢−発症年齢により測定した。反復の変動性の詳細な特性決定はすべての9つの家系について実施した。SCA1座におけるCAG拡張を有する追加の家系を同定するために、優性に受け継げられた失調を有する78の新しく同定された家族からの影響を受けた個体を臨床的に検査した。これらの家系の各々からの少なくとも1つの影響を受けた個体から血液を集め、そしてDNA分析により拡張した領域(≧42反復)内のCAG反復の大きさの存在についてスクリーニングした。これらの78個体が関係するという証拠は存在しなかったが、影響を受けた患者の幾人かが同一の家族から来る機会が存在する。
血液の試料を使用して、エプスタイン−バー−ウイルスの情報によりリンパ芽球様細胞系を確立した。ゲノムDNAを静脈の血液からか、あるいはリンパ芽球様細胞系から直接分離した。血液の試料をこれらの患者から8年の期間にわたって集め、その期間内に29人の患者が死亡した。Rep1(TTGACCTTTACACCTGCAT)およびRep2(CAACATGGGCAGTCTGAG)プライマーを使用して、PCR反応を実施した。1.25mMのMgCl2 、250μMの各dNTP、50mMのKCl、2%のホルムアミド、10mMのTris−HCl、pH8.3、および1単位のampliTaq(パーキン−エルマー・セツス(Perkin−Elmer Cetus))を含有する20μlの合計の体積の中で、50ngのゲノムDNAを5pmolの各プライマーと混合した。Rep1プライマーを5’末端において[γ−32P]ATPで標識化した。試料を94℃において4分間変性し、次いで30サイクルの変性(94℃、1分)、アニーリング(55℃、1分)および伸長(72℃、2分)を実施した。6μlの各PCR反応混合物を4μlのホルムアミドの負荷緩衝液と混合し、90℃において2分間変性し、そして6%のポリアクリルアミド/7.65Mの尿素DNA配列決定ゲルを通して電気泳動させた。M13配列決定ラダーに関して移動を比較することによって、アレレの大きさを決定した。
発症年齢と患者の影響を受けた染色体および正常の染色体の両方上のCAG反復との間の関係を、線形回帰分析により評価した。同様に、反復長さと病気の期間との間の関係を定量した。発症年齢をこれらの分析において直接を使用したが、また、対数および平方根の情報に従い使用した。後者の情報は正規分布に対する最良の近似を提供したが、得られた結果は形質転換の前後の分析の間で合致した。変動の分析を実施して、発症年齢へのCAG反復の作用について補正した後、平均の発症年齢における家族の間の差を検出した。さらに、伝達の親の性を発症年齢における変動についての可能な説明の変数として含めた。すべての回帰および分散の分析をコンピュータープログラム、バージョン4.0.1のSPSSパッケージを使用して実施した。
1.家族の研究
9つの既知のSCA1家系からのすべての影響を受けた個体は、それらのアレレの1つの上に拡張したトリヌクレオチド反復を有した。連鎖分析により配列でないことが前に示された8つの家系の間で、反復の拡張は観察されなかった。これらの8つの家系をSCA1遺伝子の拡張について検査して、連鎖の結果を確証した。
70の検査した他の優性失調の家族の間で、3つ(3%)はSCA1アレレの1つ上の拡張したCAG反復を有することが発見された。研究した優性家系のすべてのうちで、87のうちの12(14%)はSCA1座において拡張したCAG反復を有する。試料の大きさは比較的小さく、そして両方の推定値はSCA1家系について排除または選択するように恐らく間違いなく片寄らせたが、SCA1遺伝子ないの拡張したCAG反復の路は病気のこの複雑なグループの小さい部分のみを明瞭に説明する。正常の対照からおよび拡張をもたなかった失調の個体からのCAG反復数の分布はより小さかった(データは示されていない)。これらのデータは、これらの家族におけるSCA1座におけるCAG反復の包含と反対の結論を示す。しかしながら、これらの小さい家族のいくつかはSCA1座における他の突然変異を有する可能性がまだ存在する。
第20図は、失調の危険にある影響を受けなかった対照の個体からの304の染色体上のCAG反復の大きさの分布、およびこの病気で影響を受けた個体からの113の拡張したアレレを示す。正常のアレレは19〜36のCAG反復単位の大きさの範囲である。正常のアレレの95%以上は25〜33のCAG反復を含有し、それらの大部分(65%)は28〜30の反復を含有する。アメリカの黒人、白人、および南アフリカの集団は、それぞれ、29.1、29.8、および29.4のCAG反復単位を有し、非常に類似する。SCA1座におけるCAG反復についての組み合わせされたヘテロ接合性は検査した集団について0.809であり、0.787の全体の多形性の情報の含量(P.I.C.)価を与えた。正常の範囲内にCAG反復の路を含有するSCA1アレレの135の減数***についてCAG反復の長さの変化は観察されなかった、すなわち、すべてはメンデル方式で受け継がれた。対照的に、拡張したSCA1アレレを包含する62の減数***のうちの41は反復の大きさが変化した。家族の減数***についての反復の不安定性の割合は60%であるが、男性について観察された不安定性は82%であった。
Claims (6)
- (1)ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで消化してDNA断片を取得し;
(2)上記DNA断片をハイブリダイゼーション条件下、検出可能に標識化された遺伝子プローブでプロービングし、ここで、当該遺伝子プローブは、以下の:
(a)図1のヌクレオチド番号1〜1758に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、CAG反復領域、及び図1のヌクレオチド番号1848〜3366に記載のヌクレオチド配列をもつ第2のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該CAG反復領域は多型CAG反復領域である;
(b)図3のヌクレオチド番号1〜147に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、CAG反復領域、及び図3のヌクレオチド番号238〜506に記載のヌクレオチド配列をもつ第2のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該CAG反復領域は、多型CAG反復領域である;
(c)図15のヌクレオチド番号1〜1523に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、CAG反復領域、及び図15のヌクレオチド番号1614〜10660に記載のヌクレオチド配列をもつ第2のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該CAG反復領域は、多型CAG反復領域である;及び
(d)上記(a),(b)又は(c)の核酸分子の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸分子;
から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離SCA1遺伝子のCAG反復領域を含有する核酸分子にハイブリダイズする少なくとも100ヌクレオチドを有する;
(3)上記DNA断片にハイブリダイゼーションしたプローブDNAを検出し;そして
(4)SCA1遺伝子の正常の形態又は影響を受けた形態に特徴的なCAG反復領域について上記DNA断片を分析する;
を含むSCA1遺伝子のCAG反復領域を含有するDNA分子の存在を検出する方法。 - 前記分析ステップが(CAG)n 領域(n>36)について分析することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記分析ステップが(CAG)n 領域(n≧43)について分析することを含む、請求項2記載の方法。
- 前記検出可能に標識化された遺伝子プローブが、SCA1遺伝子のEcoRI断片の一部分を含む、請求項1記載の方法。
- 前記EcoRI断片が3360塩基対を含む、請求項4記載の方法。
- (1)SCA1遺伝子のCAG反復領域を含有するDNA分子の別々の相補的鎖をモル過剰量の2つのオリゴヌクレオチド・プライマーで処理し、ここで、当該2つのオリゴヌクレオチド・プライマーは、以下の:
(a)図1のヌクレオチド番号1〜1758に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、CAG反復領域、及び図1のヌクレオチド番号1848〜3366に記載のヌクレオチド配列をもつ第2のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該CAG反復領域は多型CAG反復領域である;
(b)図3のヌクレオチド番号1〜147に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、CAG反復領域、及び図3のヌクレオチド番号238〜506に記載のヌクレオチド配列をもつ第2のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該CAG反復領域は、多型CAG反復領域である;
(c)図15のヌクレオチド番号1〜1523に記載のヌクレオチド配列をもつフランキング領域、CAG反復領域、及び図15のヌクレオチド番号1614〜10660に記載のヌクレオチド配列をもつ第2のフランキング領域を含む核酸分子、ここで、当該CAG反復領域は、多型CAG反復領域である;及び
(d)上記(a),(b)又は(c)の核酸分子の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸分子;
から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含むSCA1遺伝子のCAG反復領域を含有する核酸分子にハイブリダイズする少なくとも16〜35以下のヌクレオチドを有する;
(2)上記プライマーを伸長させて、CAG反復領域を含有する所望の分子を合成するための鋳型として作用する相補的プライマー伸長生成物を形成し;
(3)そのように増幅された分子を検出し;そして
(4)SCA1失調の特徴を示すCAG反復領域について上記の増幅された分子を分析する
を含む、SCA1遺伝子の影響を受けたアレル内に位置するDNA分子の存在を検出する方法であって、前記オリゴヌクレオチド・プライマーが、CCGGAGCCCTGCTGAGGT(CAG−a)、CCAGACGCCGGGACAC(CAG−b)、AACTGGAAATGTGGACGTAC(Rep−1)、CAACATGGGCAGTCTGAG(Rep−2)、CCACCACTCCATCCCAGC(GCT−435)、TGCTGGGCTGGTGGGGGG(GCT−214)、CTCTCGGCTTTCTTGGTG(Pre−1)、及びGTACGTCCACATTTCCAGTT(Pre−2)から成る群から選ばれる前記方法。
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US6284522B1 (en) * | 1995-10-23 | 2001-09-04 | Regents Of The University Of Minnesota | Isolated and purified DNA molecule and protein for the degradation of triazine compounds |
FR2741088B1 (fr) * | 1995-11-10 | 1998-01-30 | Centre Nat Rech Scient | Methode de traitement de maladies neurodegeneratives mettant en oeuvre un anticorps ic2, un fragment ou derive de celui-ci et compositions pharmaceutiques correspondantes |
FR2745007B1 (fr) * | 1996-02-15 | 1998-05-07 | Fondation Jean Dausset Ceph | Diagnostic des maladies a repetition trinucleotidique et genes impliques dans ces maladies |
US6673535B1 (en) | 1996-05-08 | 2004-01-06 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods of detecting spinocerebellar Ataxia-2 nucleic acids |
US6844431B1 (en) | 1996-05-08 | 2005-01-18 | Cedars-Sinai Medical Center | Nucleic acid encoding spinocerebellar ataxia-2 and products related thereto |
WO1997042314A1 (en) * | 1996-05-08 | 1997-11-13 | Cedars-Sinai Medical Center | Nucleic acid encoding spinocerebellar ataxia-2 and products related thereto |
JP3950480B2 (ja) * | 1996-07-18 | 2007-08-01 | 株式会社エスアールエル | 脊髄小脳変性症2型の原因遺伝子の検出方法及びそのためのプライマー |
US5853995A (en) | 1997-01-07 | 1998-12-29 | Research Development Foundation | Large scale genotyping of diseases and a diagnostic test for spinocerebellar ataxia type 6 |
US6265201B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability |
FR2764611B1 (fr) * | 1997-06-11 | 2002-02-01 | Fond Jean Dausset Ceph | Sequences d'adn riches en triplet repete utiles dans le diagnostic de maladies a repetition trinucleotidique |
CA2294526A1 (en) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Human Genome Sciences, Inc. | 86 human secreted proteins |
US6514755B1 (en) * | 1998-08-18 | 2003-02-04 | Regents Of The University Of Minnesota | SCA7 gene and methods of use |
US6280938B1 (en) | 1997-08-19 | 2001-08-28 | Regents Of The University Of Minnesota | SCA7 gene and method of use |
CA2216057A1 (en) * | 1997-09-19 | 1999-03-19 | Ridha Joober | Polymorphic cag repeat-containing gene, diagnosis of psychiatric diseases and therapeutic uses thereof |
GB9805087D0 (en) * | 1998-03-10 | 1998-05-06 | Scottish Crop Research Inst | DNA sequences and their use |
US6235872B1 (en) * | 1998-03-12 | 2001-05-22 | The Burnham Institute | Proapoptotic peptides dependence polypeptides and methods of use |
US6322976B1 (en) * | 1998-05-28 | 2001-11-27 | Medical Research Council | Compositions and methods of disease diagnosis and therapy |
WO2000003739A1 (en) * | 1998-07-14 | 2000-01-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | (cag)/q expansion disorders |
US6524791B1 (en) | 1998-10-28 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Spinocerebellar ataxia type 8 and methods of detection |
GB9827016D0 (en) * | 1998-12-08 | 1999-02-03 | Merck Sharp & Dohme | Receptor protein |
US7058517B1 (en) | 1999-06-25 | 2006-06-06 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Methods for obtaining and using haplotype data |
DE1233364T1 (de) * | 1999-06-25 | 2003-04-10 | Genaissance Pharmaceuticals Inc., New Haven | Verfahren zur herstellung und verwendung von Haplotype Daten |
DE10032529A1 (de) * | 2000-06-30 | 2002-02-07 | Epigenomics Ag | Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complex (MHC) |
US6931326B1 (en) | 2000-06-26 | 2005-08-16 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Methods for obtaining and using haplotype data |
US6855497B2 (en) | 2000-08-31 | 2005-02-15 | Baylor College Of Medicine | DNA test for SCA-10 |
US6887687B2 (en) * | 2001-07-30 | 2005-05-03 | Immunex Corporation | Nucleic acids encoding human ataxin-1-like polypeptide IMX97018 |
KR20030013019A (ko) * | 2001-08-06 | 2003-02-14 | 주식회사 바이오메드랩 | 삼핵산 반복서열 증가질환용 진단키트 및 진단장치 |
US20040267458A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-12-30 | Judson Richard S. | Methods for obtaining and using haplotype data |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683194A (en) * | 1984-05-29 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences |
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4800159A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US5023171A (en) * | 1989-08-10 | 1991-06-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Method for gene splicing by overlap extension using the polymerase chain reaction |
WO1991019140A1 (en) * | 1990-05-25 | 1991-12-12 | Environmental Products Amalgamated Pty. Ltd. | Apparatus for conditioning gas, particularly refrigerant |
CA2094938A1 (en) * | 1991-01-04 | 1992-07-05 | Grant R. Sutherland | Dna sequences related to isolated fragile x syndrome |
WO1992014840A1 (fr) * | 1991-02-13 | 1992-09-03 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Fragment d'acide nucleique de la region du chromosome x implique dans le syndrome x fragile, sonde nucleotidique et procede pour le diagnostic du retard mental avec x fragile |
US6180337B1 (en) * | 1991-05-24 | 2001-01-30 | Baylor College Of Medicine | Diagnosis of the fragile X syndrome |
US5552282A (en) * | 1993-02-19 | 1996-09-03 | Baylor College Of Medicine | Diagnosis of myotonic muscular dystrophy |
AU6678194A (en) * | 1993-04-16 | 1994-11-08 | Johanna Eugenie Bergmann | Agents for the prevention and treatment of huntington's disease and other neurological disorders |
-
1994
- 1994-06-28 US US08/267,803 patent/US5834183A/en not_active Expired - Lifetime
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-
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