JP4051719B2

JP4051719B2 - シロイヌナズナの根毛形成開始を制御するｃｐｃ遺伝子及びそれを導入した植物

Info

Publication number: JP4051719B2
Application number: JP02887797A
Authority: JP
Inventors: 清孝岡田; 拓治和田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-02-13
Publication date: 2008-02-27
Anticipated expiration: 2017-02-13
Also published as: DE69721892D1; US5831060A; EP0803572A3; EP0803572A2; DE69721892T2; JPH104978A; EP0803572B1; CA2199582A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の根毛の形成を促進する新規な遺伝子、及びそれを導入したトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の根毛に関する突然変異体としては、根毛の数が多くなっている ttg（transparent testa glabra）、 gl2（glabrous2 ）（Galway,M.E.ら(1994) Dev.Biol. 166 740-754、Rerie,W.G.ら(1994) Gnes & Development 8 1388-1399 ）、根毛の形が異常になっているrhd1、rhd2、rhd3、rhd4などが知られている（Schiefelbein,J. & Somerville,C.(1990) Plant Cell 2 235-243）。また、根毛の数が少なくなっている突然変異体として、rhd6が知られているが、これはオーキシン等の植物ホルモンによってその変異が相補されるものであり（Masucci,J.D. & Schiefelbein,J.W.(1994) Plant Physiol. 106 1335-1346 ）、植物ホルモンによって相補されない突然変異体、即ち、根毛をつくるシグナル伝達系そのものが異常となっている突然変異体は、従来全く知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
根毛をつくるシグナル伝達系の異常により根毛の数が少なくなった突然変異体を分離できれば、その異常が生じた部位を調べることにより、根毛形成に関与する遺伝子を特定することができる。
【０００４】
本発明は、このような技術的背景に基づきなされたものであり、その目的は、植物の根毛の形成を促進する新規な遺伝子を単離し、これを導入したトランスジェニック植物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、根毛の数が少なくなった突然変異シロイヌナズナを分離し、該植物よりその突然変異に関与する遺伝子をクローニングし、更に、これを野性型のシロイヌナズナに導入し、発現させることに成功し、これらの知見に基づき本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする新規な遺伝子である。
また、本発明は、上記記載の遺伝子を導入した植物である。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有する。ここで、「配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一な作用効果、即ち、植物の根毛形成促進効果を有するアミノ酸配列をいう。幾つかのアミノ酸残基について欠失、置換、付加等の変化を起こさせることは、本願の出願時において常用されている技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p6487-6500 (1982) ）により行うことができる。
【０００８】
本発明の遺伝子は、根毛の形成を促進するという機能を有する。これは、この遺伝子が破壊された突然変異体が、根毛数の減少という性質を示すことからわかる。根毛が少なくなる突然変異体としては、従来の技術で述べたようにrhd6などが既に知られているが、本発明の遺伝子に起因する突然変異体は、植物ホルモンによっては相補されないという点でrhd6とは異なっている。従って、この突然変異体は、従来全く知られていなかったものである。なお、本発明者は、この突然変異体の根毛が出たり出なかったりすることから、その名称を「caprice （日本語で「気紛れ」という意味）」とし、この突然変異体に関与する遺伝子を「ＣＰＣ」とした。
【０００９】
ＣＰＣ遺伝子は、例えば、以下のような方法によりクローニングすることができる。まず、シロイヌナズナから単離したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、断片化されたＤＮＡを適当なベクターにつなぎ、この組換えベタクーで宿主となる微生物を形質転換し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作成する。ＤＮＡの単離は、塩化セシウム及びエチジウムブロマイドなどを用いた常法に従って行うことができる。制限酵素は、特別なものを用いる必要はなく、例えば、Sau3AIなどを用いることができる。ベクターも特別のものを用いる必要はなく、例えば、λ DASH IIなどを用いることができる。宿主とする微生物は、用いたベクターに応じて決めればよく、例えば、λ DASH IIをベクターとした場合は、大腸菌XL-1 Blue MRA(P2) などを用いることができる。
【００１０】
次に、上記のゲノムＤＮＡライブラリーについてスクリーニングを行う。プローブとしては、突然変異体caprice のＴ−ＤＮＡ近傍付近のＤＮＡを使用する。caprice は、Ｔ−ＤＮＡの挿入によりＣＰＣ遺伝子が破壊されているのだから、Ｔ−ＤＮＡの近傍付近のＤＮＡには、ＣＰＣ遺伝子の一部が含まれているからである。
【００１１】
上記のプローブにより選抜された陽性クローンから、ベクターを取り出し、これから得られたＤＮＡ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行う。ｃＤＮＡライブラリーは、常法に従って作成することができる。即ち、植物体より全ＲＮＡを単離し、これからオリゴ（ｄＴ）等を用いてｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡを適当なベクターにつなぎ、この組換えベクターで宿主となる微生物を形質転換する。このスクリーニングにより選抜される陽性クローン中に含まれる組換えベクターが本発明のＣＰＣ遺伝子を含む。
【００１２】
ＣＰＣ遺伝子を植物中で発現させることは、ＣＰＣ遺伝子を適当な植物発現ベクターに挿入し、この組換えベクターを植物に導入することにより行うことができる。ここで用いる植物発現ベクターとしては、植物中で機能し得るプロモーターとマーカー遺伝子を有するものであればどのようなものでもよいが、広範な種類の植物中で機能し得るカリフラワーモザイク・ウイルスの３５Ｓプロモーターを有するベクターが好ましい。このようなベクターとしては、実施例で使用したpMAT137-Hmを挙げることができるが、これ以外にもpBI121（CLONTECH社製）などを例示することができる。ベクターを植物に導入することは、アグロバクテリウム菌を用いて行うのが好ましいが、これに限定されることなく、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いる方法によっても行うことができる。ＣＰＣ遺伝子を発現させる植物については、特に制限はないが、バラ、タバコ、トマト、イネ、トウモロコシ、ペテュニア、アブラナなどを好ましい植物として例示することができる。
【００１３】
本発明のＣＰＣ遺伝子は、以下の機能を有する。
１）植物の根毛形成を促進するはたらきを持つ。従って、ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、通常の植物より根毛の多い植物を作出することができる。このような植物は、水分吸収能が高いので、通常の植物よりも乾燥に強いと考えられる。
【００１４】
２）葉や茎のトライコームを減少させるはたらきを持つ。従って、ＣＰＣ遺伝子をバラのような刺を持つ植物に導入し、過剰発現させれば、刺の少ない植物を作出することができる。
３）植物の開花時期を早めるはたらきを持つ。従って、ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、花を早く咲かせることが期待できる。
【００１５】
４）葉中のアントシアニンの蓄積量を減少させるはたらきを持つ。即ち、シロイヌナズナを16℃くらいの低い温度で生育させると葉などにアントシアニン色素が蓄積して赤紫色に着色する。ところが、ＣＰＣ遺伝子を過剰発現させた植物体では、アントシアニンが蓄積しにくくなり、16℃で生育させても葉の色が緑色のままである。一般に花の赤い色などはアントシアニン系の色素によって着色されているので、花に色のついた植物体に、ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、花の色を変えることが期待できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
【００１７】
【実施例】
〔実施例１〕トランスジェニック植物の作出
シロイヌナズナ（品種：Wassilewskija 〔ＷＳ〕）の種子を滅菌した後、寒天培地に播き培養を行った。播種から２〜４日は、休眠を打破し発芽をそろえ、かつ早く花を咲かせるため、遮光した状態で４℃で培養し、その後は、22℃、連続光の下で培養した。滅菌は、種子を1.5ml のエッペンチューブに入れ、そこに10％のハイター（花王）、0.02% のTriton X-100を含む滅菌蒸留水を0.5ml 加え、ボルテックスで攪拌した後、３〜５分室温で放置し、次いで、種子を滅菌蒸留水で５回洗うことにより行った。寒天培地は、シロイヌナズナ用の栄養塩溶液〔蒸留水または脱イオン水985ml 、1M KNO₃ 5ml 、1M MgSO_{4 2}ml 、1M Ca(NO₃)₂ 2ml、 20mM Fe-EDTA 2.5ml 、微量要素液 1ml、K-PO₄緩衝液液(pH5.5) 2.5ml 〕（白石英秋ら、(1991) 現代化学増刊 20 植物バイオテクノロジーII、38頁）を蒸留水で1/2 に希釈したものに、寒天末（ナカライ製、特級）を1.5 ％の濃度になるように加え、オートクレーブ後シャーレに注いで固化させたものを用いた。なお、この濃度の寒天培地を用いれば、シロイヌナズナの根は寒天表面を這って成長し、培地中に入り込むことがないので、後述する根の形態観察が容易になる。光源としては、市販の40kwの白色蛍光灯２本と植物育成用の蛍光灯（ナショナル、ホモルクス）１本を用い、約30cm離して、光を照射した。この光源の明るさは、約3000lux である。
【００１８】
播種から３週間後に40個体のシロイヌナズナにアグロバクテリウム菌を接種した。アグロバクテリウム菌の接種は、シロイヌナズナの花茎に傷をつけて、アグロバクテリウム菌を感染させるin planta 法を改良した方法（Chang ら(1994)、Plant J.,5 551-558）により行った。アグロバクテリウム菌としては、Velten,J. らより入手したAgrobacterium tumefaciens C58C1Rif株（Velten,J. and Schell,J (1985) Nucl.Acids Res.13,6981-6998 ）を用いた。この菌株には、中間系ベクターのpGV3850HPTが入っており、ライトボーダーとレフトボーダーの間には植物の選択マーカーとしてハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子がカリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーターの下流におかれている。
【００１９】
アグロバクテリウム菌の接種後、シロイヌナズナをバーミュキュライトとパーライトを１：１で混合した培養土に移植した。移植から１カ月半から２カ月後に、種子（Ｔ２種子）を収穫した。得られた種子を前記と同様に滅菌し、ハイグロマシン含有培地（１ＸガンボーグＢ５培地用混合塩、1%ショ糖、0.8%寒天、10mg/lハイグロマイシンＢ）に播いて培養し、ハイグロマイシンに耐性を示す個体だけを選び出し、培養土に移植した。培養土は前記と同様のものを用いた。移植から１カ月半から２カ月後に自家受粉により得られた種子（Ｔ３種子）を収穫した。
【００２０】
〔実施例２〕根の突然変異体のスクリーニング
実施例１で得られたＴ３種子を滅菌した後、寒天培地に播き、培養を行った。滅菌の方法、及び寒天培地は上記と同様のものを使用した。なお、根の形態観察を容易にするため、寒天培地は、透明なプラスチックシャーレ（栄研器材株式会社、２号角シャーレ〔14cm×10cm〕）に入れた。
【００２１】
根の形態は、実態顕微鏡OLYMPUS SZH-IDDLによって透過光で観察した。約300 ラインのトランスジェニックシロイヌナズナの根の形態を観察し、それらの中から根毛が少なくなっている一系統の突然変異体を単離した。この突然変異体の根の形態を図１に示す。右側がこの突然変異体であり、左側が野性型である。図１に示すようにこの突然変異体は野性型に比べ、根毛の本数が明らかに少なくなっているが、その長さは野性型と変わらない。
【００２２】
〔実施例３〕 caprice の遺伝学的検討
caprice の変異がどのようなものであるかを調べために、シロイヌナズナの野性型のＷＳ株と戻し交雑を行った。caprice とＷＳ株との交雑は、岡田らの記述に従って行った。即ち、雄しべのやくが開裂していないcaprice のつぼみをピンセット（A.Dumonte Fils社製、DUMOXEL 5 番）で開き、雌しべ以外のものを削除し、雌親とした。ピンセット及び指先は、花粉の混入を防ぐため、予め９５％のエタノールで消毒した。この処理から約２日後にめしべの先端の柱頭毛に花粉がついていないことを確認してから、花が展開したＷＳ株から採取した花粉を、caprice の柱頭につけた。この戻し交雑の結果、14個体のＦ１世代が得られた。これらの表現型はすべて野性型であった。
【００２３】
次に、上記14個体について自家受粉を行い、Ｆ２世代を得た。Ｆ２世代の表現型は、257 個体が野性型で、67個体がcaprice 型であった。野性型：caprice 型の比が３：１であることから、 capriceは劣性の１遺伝子の変異によって起こったと考えられる。
【００２４】
〔実施例４〕トランスジニックシロイヌナズナのゲノムＤＮＡの単離
シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの単離法は、Doyle とDoyle （(1990)Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12,13-15 ）の記述に従った。
【００２５】
発芽後３〜４週間のシロイヌナズナ（caprice ）の展開したロゼッタ葉を２〜３枚、ピンセットで1.5ml のエッペンチューブにとり、200ml のＣＴＡＢバッファー〔 3% セチルメチルアンモニウムブロミド、1.4M NaCl 、 0.2% ２−メルカプトエタノール、 20mM ＥＤＴＡ 100mM Tris-HCl（pH 8.0）〕を加え、pellet pestle （Kontes社製）で粉砕した。さらに300ml のＣＴＡＢバッファーを加え、60℃で30分保温した。その後クロロホルムを加えて、上清を回収して、イソプロパノール沈殿を行った。ＲＮase 処理、フェノール処理、エタノール沈殿を行った後、最終的に10〜25mlのTris−ＥＤＴＡ（10mM Tris-HCl(pH8.0)、ＥＤＴＡ-Na₂ (pH8.0)）に溶かした。
【００２６】
〔実施例５〕トランスジェニックシロイヌナズナのゲノムＤＮＡのサザン解析実施例４で得られたcaprice シロイヌナズナのゲノムＤＮＡをサザンブロッティングにより解析した。サザン解析は、Current Protocol（Ausbelら(1987)）の方法に従った。
【００２７】
caprice より得られたＤＮＡ 0.5〜１μg をHindIII で切断し、アガロース電気泳動を行った。泳動後、ゲルを0.25 M塩酸に浸し、10分間振盪した後、変性溶液（1.5M NaCl 、0.5M NaOH ）で30分間、１回、中和溶液（1.5M NaCl 、0.5M Tris-HCl pH7.2 、1mM ＥＤＴＡ）で20分間、２回振盪した。振盪後、ゲルの上に、Hybond N（Amersham社製）を置き、ＵＶstratalinker 2400 （Stratagene社製）によりＵＶを照射して、ＤＮＡを固定した。
【００２８】
一方、pGV3850HPTのレフトボーダ領域を切り出し、Random primer labelling kit （宝酒造社製）を使って〔a-32P 〕ｄＣＴＰで標識してプローブを作成し、このプローブを含むハイブリダイゼーション溶液（5XSSC 、 0.1% Ｎ−ラウロイルスクロシン、0.02% ＳＤＳ、 1% ブロッキング試薬（Boehringer社製））に上記 Hybond N を一晩浸し、ハイブリダイゼーションを行った。その結果、後述する図３と同様に4.9kb の位置に一本だけバンドが現れた。
【００２９】
〔実施例６〕Ｔ−ＤＮＡ近傍のシロイヌナズナのゲノムＤＮＡの単離
実施例５より、caprice のゲノムＤＮＡに挿入されているＴ−ＤＮＡは一箇所に一本だけであると考えられるので、inverse ＰＣＲ法でＴ−ＤＮＡ近傍のゲノムＤＮＡの分離を試みた。inverse ＰＣＲ法は、Dengらの方法（(1992) Cell 71
791-801）に従った。
【００３０】
実施例４で得られたcaprice のＤＮＡを、HindIII （宝酒造製）で切断し、１％のアガロースゲルに泳動した後、４kb〜６kbに相当する部分のゲルを切り出し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡにＤＮＡライゲース（宝酒造製）を加え、セルフ・ライゲーションを行った後、レフト・ボーダーを外向きに増幅させる下記のプライマー（ＬＢ１、ＬＢ２）を用いＰＣＲを行った。
【００３１】
ＬＢ１：CAC GCC ATC GAT GTA ATA ATT GTC ATT GTC ATT AGA TTG T
ＬＢ２：GAG CTA TTG GCA CAC GAA GAA TGG T
【００３２】
ＰＣＲは、GeneAmp PCR system 9600 （Perkin Elmer社製）を用い、94℃×30秒、60℃×30秒、72℃×30秒の反応を35サイクル行った。この結果、約２kbの断片が増幅された。
【００３３】
次に、この断片をプローブとして、caprice 及び野性型ＷＳ株のそれぞれから単離し、HindIII で切断したＤＮＡについてサザンブロッテイングを行った。サザンブロッテイングは実施例５と同様にして行った。この結果を図２に示す。図中のｗｔが野性型ＷＳであり、１〜11がcaprice である。図２が示すように、caprice ではレフト・ボーダーをプローブとした時と同様に4.9kb の位置に、野性型ＷＳ株では約11kbの位置にバンドが検出された。
【００３４】
このように、両系統でバンドの位置が異なるのは、ゲノムＤＮＡに挿入されるレフト・ボーダー内にHindIII 切断部位があるからである。図３に示すように、レフト・ボーダーが挿入されていない野性型の場合、ゲノムＤＮＡ内に元々存在する２箇所の切断部位のみで切断されるが、レフト・ボーダーが挿入されているcaprice の場合、レフト・ボーダー内の切断部位でも切断されるため、より短い断片が検出される。
【００３５】
〔実施例７〕ＣＰＣ遺伝子のクローニング
ＷＳ株の地上部を集め、液体窒素で凍らせながら乳鉢で組織をつぶし、塩化セシウムとエチジウムブロマイドを使って、ＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡをSau3AI（宝酒造製）で部分分解し、ショ糖密度勾配遠心により15〜20kbの断片が入った画分を集め、このゲノムＤＮＡとBamHI （宝酒造製）で切断したλDASH II とのライゲーションを行った。得られた組換えベクターは、Gigapack II Packaging Extract （Stratagene社製）によりin vitroパッケージングをした。パッケージングをしたファージ約10万個を、大腸菌XL1-Blue MRA(P2)を含むＬＢプレート（脱イオン水 1 L 、バクトトリプトン 10g、バクトイースト抽出物 5g 、NaCl 10g、寒天 1.2% ）にまき、シロイヌナズナのゲノムライブラリーを作成し、実施例６で単離された約２kbのＤＮＡ断片をプローブとして、スクリーニングを行った。この結果、４種類の陽性クローンを単離した。これらのファージクローンを、EcoRI とXbaIで切断し、前記した約２kbのＤＮＡ断片をプローブとしてサザンブロットを行った。プローブがハイブリダイズした断片の中からEcoRI で切断した4.4kb 、XbaIで切断した7.3kb と５kbの３種類の断片をプラスミドベクターBluescript SK+（Stratagene社製）にクローニングした。
【００３６】
次に、Current Protocolの記載に従って、シロイヌナズナの根から全ＲＮＡを単離した。シロイヌナズナの根の組織２〜４g を液体窒素で凍らせながら乳鉢中でつぶし、グアニジンチオシナネートを含んだバッファー中に攪拌し、超遠心（22000 rpm ×16時間）を行うことによってＲＮＡを沈殿させ、組織再懸濁液（5mM ＥＤＴＡ、 0.5% サルコシル、 5% ２−メルカプトエタノール）に懸濁して回収した。得られた全ＲＮＡからOligotex-dT30[Super]（日本ロッシュ）を用いてpoly (A)⁺ＲＮＡを分離した。全ＲＮＡに対して0.5 〜１% の範囲でpoly (A)⁺ＲＮＡを回収できた。回収した根のpoly (A)⁺ＲＮＡ（ 5μg ）に3'末端にXhoI切断部位のついてオリゴdTプライマーをアニールさせて、逆転写酵素（Strata Script reverse transcriptase, Stratagene 社製）を用いて、２本鎖のｃＤＮＡを合成した。この２本鎖ｃＤＮＡの5'末端にはEcoRI 、3'末端にはXhoIの部位がついているので、EcoRI とXhoIで切断したZAPII ベクター（Stratagene社製）にクローニングした。得られた組換えベクターは、Gigapack II Packaging Extract （Stratagene社製）によりin vitroパッケージングをした。パッケージングをしたファージ約30万個を、大腸菌XL1-Blue MRF' を含むＬＢプレートにまき、シロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーを作成し、前記のXbaIで切断した５kbの断片をプローブとしてスクリーニングを行った。この結果、４個の陽性クローンを分離した。得られたクローンに含まれるｃＤＮＡの中から最も長いｃＤＮＡの塩基配列を決定した。シークエンス反応は、Dye primer cycle sequencing FS kit及びDye terminator cycle sequencing FS ready reaction kit （Perkin elemer 社製）を用いて行い、蛍光自動シークエンサー（ABI, Model 370A ）により塩基配列を決定した。決定した配列を配列番号２に示す。このｃＤＮＡの全長は５８４bpであり、一番長いＯＦＲを翻訳すると94アミノ酸で分子量は11kDであった。配列番号２が示すように、翻訳開始点の上流には２つの終止コドンが存在した。
【００３７】
〔実施例８〕ＣＰＣ遺伝子を過剰発現させた植物の作成
pMAT137-Hm（Matsuoka,K.and Nakamura,K.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,834-838 、名古屋大学農学部応用生物化学科の松岡健博士から分与）を制限酵素XbaI（宝酒造社製）とKpnI（宝酒造社製）で切断した。このベクターには、カリフラワーモザイク・ウイルスの３５Ｓプロモーターが３つtandemに連結されており、その下流にマルチクローニングサイトがあって任意の遺伝子をクローニングできるようになっている。また、薬剤耐性遺伝子としてハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子が別の３５Ｓプロモーターと連結されていて、大腸菌、アグロバクテリウム菌、植物で薬剤耐性遺伝子として働くことができる。
【００３８】
Bluescript SK+ベクター（Stratagene社製）にクローニングされたＣＰＣ遺伝子を上記と同様に制限酵素XbaI（宝酒造社製）とKpnI（宝酒造社製）で切断し、ＤＮＡLigation Kit Ver.2（宝酒造社製）を使って、pMAT137-Hmとライゲーション反応を行った。このプラスミド（以下、「pMAT137-Hm+CPC」という）をGene Pulser （Biorad社製）によって大腸菌JM109 （宝酒造社製）に導入し、50mg/lの濃度のハイグロマイシンＢ（和光純薬社製）を含んだＬＢ培地（1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストイクストラクト、1%ＮａＣｌ、1.2%寒天末）で形質転換された大腸菌を選抜した。
【００３９】
形質転換された大腸菌よりＤＮＡ自動分離装置PI100 Σ（倉敷紡績社製）でプラスミドを抽出した。このプラスミドpMAT137-Hm+CPCをGene Pulser （Biorad社製）でAgrobacterium tumefaciens C58C1Rif株に導入した。
【００４０】
シロイヌナズナ（学名Arabidopsis thaliana）ＷＳ株を、vacum infiltration法（Bechtold,Nら(1993)C.R.Acad.Sci.Paris,Life Sciences 316,1194-1199）によってＬＢ培地で液体振とう培養したアグロバクテリウム菌で形質転換した。形質転換植物体を培養土に植えかえ、種子を収穫してハイグロマイシンの入った培地（１ＸガンボーグＢ５培地用混合塩（和光純薬社製）、1%ショ糖、0.8%寒天末、10mg/ml ハイグロマイシンＢ（和光純薬社製））で薬剤耐性の組み換え体の選抜を行った。その結果、２個体の形質転換体を得た。この植物体を培養土に植え換えて生育させ、種子を収穫した。
【００４１】
収穫した種子のうちプラスミドpMAT137-Hm+CPCがゲノム中に挿入された植物体の根毛数（根毛１mmあたりの本数）を計測した。根毛数の計測は、実体顕微鏡で観察して行い、各系統ごとに20個体ずつ計測した。各系統の根毛数の平均値±標準誤差を表１に示す。また、シロイヌナズナの根の実体顕微鏡写真を図４に示す。図４中、Ａが野性型、Ｂが突然変異体「caprice 」、ＣがＣＰＣ遺伝子過剰発現植物である。
【００４２】
【表１】

【００４３】
表１が示すように、プラスミドpMAT137-Hm+CPCがゲノム中に挿入された植物体では、野性型に比べて２〜３倍根毛の数が多くなっていた（系統♯１で野性型の3.1 倍、系統♯２で2.3 倍までに増加していた。）。つまり、ＣＰＣ遺伝子をシロイヌナズナで過剰発現させると根毛の数が増大し、逆にＣＰＣ遺伝子がつぶれた突然変異体「caprice 」では根毛の数が減少する。
【００４４】
pMAT137-Hm+CPCがゲノム中に挿入された植物体では葉及び茎のトライコームの数が減少していた。トライコームとは、葉や茎などの地上部の表皮細胞の一端が伸長したものであり、葉のトライコームは先端が３つに分枝している。ＣＰＣ遺伝子を過剰発現させた植物の葉の写真を図４Ｂに、茎の写真を図５Ｂに示す。また、野性型の葉の写真を図４Ａに、茎の写真を図５Ａに示す。
以上のことをまとめると、ＣＰＣ遺伝子を過剰発現させた植物では根毛（地上部）の毛の数は増加するが、葉や茎（地上部）の毛の数は減少する。
【００４５】
シロイヌナズナでは、既に根毛の数が多くなった突然変異体として ttg、gl2 が同定されている（ Galawayら,1994 ； Massuciら,1996 ）。これら２つの突然変異体は元々葉のトライコームの突然変異体として分離されたものである（Koorneefら,1982 ；Hulskampら,1984,図５）。
ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の根毛とトライコームの表現型は、ttg 及びgl2 突然変異体と同じである。
【００４６】
〔実施例９〕根毛の二重突然変異体の作製
caprice とgl2 、caprice とttg をそれぞれ交配し、caprice とgl2 の二重突然変異体及びcaprice とttg の二重突然変異体を作製した。
【００４７】
caprice とgl2 の二重突然変異体の根毛に関する表現型は、gl2 と類似したものであった（表１）。このことから、ＣＰＣ遺伝子は gl2 に関係する遺伝子よりも上流で働いていることが示唆された。
【００４８】
caprice とttg の二重突然変異体の根毛に関する表現型は、それぞれの突然変異体の中間型であった（表１）。このことから、ＣＰＣ遺伝子とttg に関係する遺伝子は、なんらかの形で相互作用をし、根毛形成に関与していることが示唆された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明は、植物の根毛形成を促進する新規な遺伝子であるＣＰＣ遺伝子を提供する。この遺伝子を他の植物に導入して発現させることにより、当該植物の根毛の形成を促進し、葉及び茎のトライコームを減少させることができる。
【００５０】
【配列表】

【００５１】

【図面の簡単な説明】
【図１】 caprice の根の写真（生物の形態写真）
【図２】 caprice 及び野性型のサザンブロッティングを表す図
【図３】 caprice 及び野性型のHindIII の切断部位を示す図
【図４】ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の根の写真（生物の形態写真）
【図５】ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の葉の写真（生物の形態写真）
【図６】ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の茎の写真（生物の形態写真）
【図７】 ttg 、gl1 、gl2 の葉の写真（生物の形態写真）

Claims

以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の根毛形成促進活性を有するタンパク質
請求項１記載の遺伝子を導入した植物。