JP4051440B2 - Cell manipulation device and method - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子および遺伝子の発現に関与する物質を細胞内に導入して細胞を操作するための装置および方法であって、特に、これら物質の導入による細胞の動態変化をリアルタイムで観察し得るとともに細胞分化の制御にも使用しうる装置および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、遺伝子を細胞内に導入し、該遺伝子を発現させるための手段としては、物理学的手法としてエレクトロポレーション法、パーティイクルガン法、マイクロインジェクション法等が、また、細胞のエンドサイトシスを利用する手法としてリン酸カルシウム法、デアエデキストラン法、リポフェクション法等がそれぞれ知られており、さらに、そのほか、ウイルスベクターを使用する感染法、遺伝子を封入したリポソームを細胞融合により細胞に導入するリポソーム法等もあるが、これら手法による遺伝子導入は、いずれも、単に、導入された遺伝子を恒常的に細胞内に保持させることを主眼におくものであり、例えば遺伝子の導入から発現に至るまでの間、細胞に表れる経時的な動態変化を詳細に観察しようとするものではなく、事実、このような観察は不可能であった。
【０００３】
特に細胞の発生・分化においては、発現遺伝子の経時的な変化、相互関与が重要であり、上記従来技術のような導入された遺伝子が恒常的に細胞内に保持される手法では、細胞分化の解明、あるいは制御を行うことは困難である。また、上記従来の手法は、細胞に遺伝子を導入する際、細胞にかなりのダメージを与え、細胞の生存率が必ずしも良好とはいえず、以降の実験に支障を来す場合もあり、さらに、遺伝子導入後、ダメージを受けた細胞の修復が行われるとしても、回復にかかる時間は大きく、また不明確であるため、高時間分解の解析は不可能であるという問題点もあった。
【０００４】
【発明の課題】
本発明の課題は、このような従来技術の問題点を解消しようとするものであり、具体的には、遺伝子の導入から発現に至るまでの間、細胞に表れる経時的な動態変化を詳細に観察でき、また、細胞分化の解明あるいは制御に対しても適用可能であり、さらに遺伝子等の導入時における細胞のダメージを極力低減し得る、細胞操作手段を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質の細胞内導入およびこれらの機能発現手段として、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質を針状物に固定化して細胞に挿入し、上記遺伝子等を針状物に固定化状態で細胞内に保持して機能発現を行うという、細胞操作手段として全く新しい手段を開発した。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）に挙げる細胞操作装置および細胞操作方法に係るものであり、これらにより上記課題は解決される。
（１）遺伝子または遺伝子発現に関与する物質を固定化するための針状物、針状物の移動手段、及び針状物の位置を制御する手段を有するとともに、少なくとも針状物の細胞への挿入を検知する手段を有し、該針状物の細胞への挿入を検知する手段が、細胞が針状物に及ぼす力を測定するものであることを特徴とする、細胞操作装置。
（２）少なくとも針状物の細胞への挿入を検知する手段が、針状物の細胞に対する、接触、穿刺、挿入及び引き抜きを検知するものである（１）に記載の細胞操作装置。
（３）細胞が針状物に及ぼす力を測定する手段が、原子間力顕微鏡における力の変動量測定手段または分子間力測定装置における力の変動量測定手段である（１）に記載の細胞操作装置。
（４）細胞が針状物に及ぼす力を測定する手段が、原子間力測定手段または分子間力測定手段における、プローブ、プローブをその先端に設けたカンチレバー、及びカンチレバーの変位を検出する手段を有するものであって、該プローブに針状物が固定されているものである（３）に記載の細胞操作装置。
（５）細胞が針状物に及ぼす力を測定する手段が、原子間力測定手段または分子間力測定手段における、プローブ、プローブをその先端に設けたカンチレバー、及びカンチレバーの変位を検出する手段を有するものであって、該プローブ自身が先鋭化された針状物である（４）に記載の細胞操作装置。
（６）遺伝子または遺伝子の発現に関与する物質を担持するための針状物がカーボンナノチューブである（１）〜（４）のいずれか一項に記載の細胞操作装置。
（７）ａ）針状物に遺伝子または遺伝子発現に関与する物質を固定させる工程、ｂ）遺伝子または遺伝子発現に関与する物質が担持された針状物を細胞に挿入する工程、およびｃ）細胞内において遺伝子または遺伝子発現に関与する物質を針状物に担持した状態に保持する工程とを含み、上記ｂ）及びｃ）工程を細胞が針状物に及ぼす力を測定しながら行うことを特徴とする、細胞操作方法。
（８）ａ）針状物に遺伝子または遺伝子発現に関与する物質を固定させる工程、ｂ）遺伝子または遺伝子発現に関与する物質が担持された針状物を細胞内に挿入する工程、ｃ）細胞内において遺伝子または遺伝子発現に関与する物質を針状物に担持した状態で保持する工程、およびｄ）遺伝子または遺伝子発現に関与する物質が担持された状態で針状物を細胞から引き抜く工程とを含み、上記ｂ）〜ｄ）工程を細胞が針状物に及ぼす力を測定しながら行うことを特徴とする、細胞操作方法。
【０００７】
【発明の実施の態様】
本発明の細胞操作装置は、遺伝子または遺伝子発現に関与する物質を固定化するための針状物、該針状物の移動手段、及び該針状物の位置を制御する手段を有するとともに、少なくとも針状物の細胞内への挿入を検知する手段を有する。
【０００８】
本発明の細胞操作装置における、針状物の細胞内への挿入を検知する手段は、さらに、接触、穿刺、及び引き抜きをも検知する手段であることが望ましい。これには針状物の細胞への接触、穿刺、挿入及び引き抜きの各状態における、細胞が針状物に及ぼす微少な力を測定しうるものであればよい。これには例えば、原子間力顕微鏡あるいは分子間力測定装置における、プローブに及ぼされる力についての測定手段を利用することができる。具体的にはこれら手段におけるプローブ、プローブをその先端に設けたカンチレバー、及びカンチレバーの変位を検出する手段を挙げることができる。
【０００９】
遺伝子または遺伝子発現に関与する物質を固定化するための針状物は、このプローブに固定してもよく、また、プローブ自身を先鋭化し針状に形成しても良い。本発明においてこれら装置を利用する場合、これら装置におけるプローブに及ぼされる力の変動量測定機能を利用するものであって、原子間力あるいは分子間力そのものを測定するものではない。また、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）あるいは分子間力測定装置における、プローブないしプローブをその先端に設けたカンチレバーの移動手段及びこれらのその位置の検出あるいは制御手段も利用できる。また、これら装置としては、細胞を培養したシャーレをそのまま使用出来る上方よりの接触可能でカンチレバー駆動型の装置が好ましい。
【００１０】
以下、ＡＦＭのプローブ及びその付属手段を利用する場合を例に取り、本発明を説明する。
ＡＦＭの測定原理は、カンチレバー先端の微小プローブ（探針）を試料表面に近づけると、原子間力によってカンチレバーがたわみ、このカンチレバーの変異をレーザー反射光で検知し、試料表面の凹凸をナノメートルオーダーで画像化するものである。
【００１１】
本発明においては、この原子間力顕微鏡のプローブに、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質を固定化して細胞に挿入するための針状物を設けるが、針状物としては、例えばカーボンナノチューブ、シリコン結晶、チタン、ジルコニウム等の金属結晶、ZnO等の金属酸化物等を、プローブ先端に固定するか、あるいは、シリコン、窒化シリコン等からなるプローブを使用し自身を先鋭化加工し、針状にしたものを使用する。
プローブに固定する上記針状物の直径はおおよそ10ｎｍ〜30μｍ程度である。好ましくは10〜100ｎｍであり、本発明のカーボンナノチューブの直径は10〜100ｎｍのオーダーであって、細胞の大きさに比して充分小さく、このため細胞への挿入に対してダメージを与えない。
また、針状に加工したプローブも直径が100nm程度まで加工することが可能であり、細胞挿入において大きなダメージを与えない。
一方、針状物の長さはおおよそ0.5〜200μｍ程度であり、好ましくは2〜10μｍである。針状に加工したプローブにおいても、長さが5μｍ程度まで加工することが可能であり、細胞挿入において十分な長さを確保できる。
また、カーボンナノチューブには、大きく分けて単層のものと多層のものがあるが、本発明においては横方向の曲げに対してある程度の強度を必要とするため、多層のカーボンナノチューブが好ましい。
【００１２】
プローブに針状物を取り付けるには、上記カーボンナノチューブの場合、例えば、電子顕微鏡観察下に、基底部に固定されたカーボンナノチューブ先端部分とカンチレバー先端のプローブとを接触させ、該接触部に電子線を照射し、炭素化合物ガスをこの電子線のエネルギーによって分解し、非晶質のカーボンとして堆積させ、プローブとカーボンナノチューブを固着する。その後に、カーボンナノチューブを基底部より取り外す。また、ＣＶＤ法によりカンチレバー表面にカーボンナノチューブを成長させる方法により、カーボンナノチューブ付きカンチレバーを作製してもよい。
【００１３】
プローブを針状に加工するには、上記シリコン製プローブの場合、例えば、収束イオンビーム加工装置等を用いて、ビーム照射によるエッチングにより先端を針状に加工することが出来る。また、窒化シリコン製のプローブの場合は成型時に使用する型の窪み部分を針状の構造にしておき、針状のプローブを作製してもよい。
【００１４】
本発明の細胞操作装置は、例えば、培養容器を載置する２次元ステージ（３）を設けた原子間力顕微鏡（１）と落射蛍光顕微鏡（２）からなり、２次元ステージ上には、原子間力顕微鏡（１）のカンチレバー（４）のプローブ（５）及びその先端に取り付けたカーボンナノチューブ等の針状物（６）が位置するよう配置され、このカーボンナノチューブ等の針状物は、原子間力顕微鏡（１）のカンチレバー移動手段及び位置制御手段（いずれも図示せず）により、上下に移動可能に構成されており（図３）、また、針状物にかかる力はカンチレバー（４）のたわみをレーザー反射光で検知し、画像によりモニター可能になっている。
【００１５】
この装置を使用して、細胞操作を行う例を以下に説明する。
まず、カンチレバー（４）先端のプローブ（５）に設けた針状物（６）、もしくは先鋭化加工した針状プローブ（６）に遺伝子または遺伝子の発現に関与する物質を固定化する（図３）。この固定化手段としては、例えば物理吸着や固定化アビジンを利用したアビジンビオチン結合の利用等の手段が挙げられるが、カーボンナノチューブの場合には、カーボンナノチューブ自身の表面を有機合成の手法であらかじめ修飾することが可能である。例えばカルボキシル基などの官能基を出すように修飾することで、表面を親水化することが可能である上に、この官能基に対して、活性化試薬を用いた有機化学的手法によって遺伝子を共有結合的にカーボンナノチューブ表面に固定化することができる。プローブ自身を針状に加工した場合も、素材はシリコンもしくは窒化シリコン等を使用すれば、表面を酸化処理した後に、各種シラン化剤を利用して、官能基を表面に形成し、有機化学的手法によって遺伝子を共有結合的に固定化することができる。
【００１６】
次いで、細胞操作装置の２次元ステージ上（３）に、標的細胞を培養した培養容器を載置し、落射蛍光顕微鏡（２）でモニターしながら、カンチレバーのプローブ部分（５）が２次元ステージ上に載置された培養容器中の標的細胞の真上にくるように２次元ステージを操作しで位置あわせを行い、カンチレバー（４）の変位をモニターしながら、カンチレバーのプローブ先端の針状物（６）と細胞（７）を徐々に接近させて、該針状物を細胞（７）に挿入した後、この状態で保持し、針状物に固定化された遺伝子の発現等を行う。この場合、上記針状物と細胞が接触時点においてはカンチレバー（４）が斤力を受け変位し、また、針状物が細胞膜を突き破って挿入されるとカンチレバー（４）にかかる斤力が緩和されカンチレバーの変位は減少する。
【００１７】
上記細胞内に針状物（６）が保持され、針状物（６）に固定化された遺伝子が発現等している間、斤力は徐々に減少するが、微小な変位は調節を行いながら観察を続ける。次いで本発明においては、遺伝子の発現等を一定時間行った後、針状物を細胞（７）から引き抜き、遺伝子を細胞外に取り出すが、この場合においては、細胞から針状物を抜くのに弱い抵抗がかかり、この抵抗がカンチレバー（４）の弱い引力の変位を引き起こす。
【００１８】
この後、変位は回復するが、これは針状物が細胞から完全に引き抜かれたことを意味する。これらのカンチレバー（４）の変位は、画面上でモニターでき、したがって、これらの細胞（７）と針状物（６）との接触、挿入、細胞内保持、引き抜き等の一連の細胞操作はリアルタイムで詳細に知ることができ（図４）、また、針状物の細胞内保持による遺伝子の発現あるいは遺伝子の発現に関与する物質の影響は、本発明の細胞操作装置の落射蛍光顕微鏡によりリアルタイムで観察できる。
【００１９】
以上の説明から明らかなように、本発明においては、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質は、細胞内に恒常的に保持せず、遺伝子発現の場合においても遺伝子組み換え体を作らない。したがって、発現する遺伝子と発現しない遺伝子とが比較的短時間のうちに変化する細胞分化において、分化機構の解明あるいは分化誘導、分化制御の手段として最適な方法である。また、本発明において、遺伝子組み換え体を作らないことは、遺伝子導入における安全性の点で有利であり、また、細胞治療においても、遺伝子型は患者本人と全く同一のままとなるので、抗原性、拒絶反応という問題を解決できる可能性がある。このため遺伝子診断、遺伝子治療にも適用が期待できる手段である。
【００２０】
本発明において、針状物に固定化する遺伝子は、特に限定されるものではない。例えば、幹細胞における発生・分化の遺伝子相互関与の解明あるいは、転写調節機構等において、発現が抑制、あるいは促進され、分化の原因となる遺伝子あるいは原因であろうと予想されている遺伝子である。また、疾病に関連する遺伝子などを導入して、病態を観察することも可能である。
また、針状物に固定化される、遺伝子発現に関与する物質も特に限定されず、タンパク質等、細胞内の遺伝子応答に関係する全ての物質が考えられる。例えば分化制御において、細胞内において発現する遺伝子の転写を抑制するリプレッサータンパク質等を導入し、ゲノム上の遺伝子発現を制御することも考えられる。以上においては、主として原子間力顕微鏡のプローブ、プローブの移動手段、位置制御手段、カンチレバーによる検知手段を利用する場合について説明した。
【００２１】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
（１）〔カーボンナノチューブのAFMプローブへの固定〕
精製された多層カーボンナノチューブに電気泳動を施す。これによりナノチューブは電界方向に沿って向きを変えて動き、電極のナイフエッジに、一端を突き出した形で多数吸着された。このナノチューブ付ナイフエッジとカンチレバーを、取り付け作業専用の走査型電子顕微鏡(SEM)に導入した。ここには、カーボンナノチューブとカンチレバープローブを接触させるための３次元移動ステージが備え付けており、このステージ上で両者を対向するように取り付け、電子顕微鏡観察により、細胞の核にまで達する３μｍ以上の長さのナノチューブを選んだ。そのまま両者を顕微鏡観察しながら接近させ、ナノチューブの先端部分をプローブの側面に接触させたところで接近を停止し、接触箇所の周辺だけを電子顕微鏡の入射電子線で数分間走査した。これにより、電子顕微鏡に内蔵する真空容器内に残留している炭素化合物ガスを電子線のエネルギーによって分解し、走査領域に非晶質のカーボンとして堆積させ、ナノチューブをプローブに固定した。この際に、ナノチューブがカンチレバーの面垂直方向から約１５°傾いた角度になるように調整し、傾斜したAFMのカンチレバーホルダーに取り付けた時にナノチューブが真下を向くようにした。さらにナノチューブの根元部分を機械的に強化して折れ曲がりを防止するため、この部分にも同様に電子線照射により非晶質カーボンを堆積させた。こうして、先端部太さ約10ナノメーター程度、長さ３ミクロン以上の理想的な遺伝子注入用プローブを製作することができた（図１）。
【００２２】
（２）〔細胞培養〕
一方、新生児表皮メラニン細胞NHEM-Neo (Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) は培地としてMGM-3ブリットキット(Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) を使用し、37℃、5% CO2条件下にて培養を行った。培養容器は35 mmペトリディッシュを用い、細胞数が1.6x106個となるよう播種後、一晩培養を行ったものを遺伝子導入に使用した（図２）。
【００２３】
（３）〔ナノチューブの細胞への挿入の力応答測定〕
図３に示すように、原子間力顕微鏡（AFM）（１）の試料台として、生体試料への応用が容易にできるよう２次元ステージ（３）を設け、培養された細胞を培養容器ごとこのステージに取り付けた。また、落射蛍光顕微鏡（２）を、原子間力顕微鏡（１）と一体化して設け、下方からの照明によって、試料（７）とAFMカンチレバー（４）を照明しながら明視野観察によって位置合わせを行い、またAFMカンチレバーで細胞操作を行いながら高感度CCDによってリアルタイムの蛍光観察を行うことができるよう構成した。また、温度、CO2を制御できるチャンバーを取り付けてあり、これにより、AFMカンチレバー（４）による細胞操作の間、細胞の生育に適当な環境を維持する。
【００２４】
この顕微鏡によって、カンチレバー（４）のプローブ部分（５）が標的細胞中央部の真上に来るよう２次元ステージ（３）で位置あわせをした。 次に図４に示すように、カンチレバー（４）の変位を監視しながら、カンチレバーと細胞を徐々に接近させ、カンチレバーにかかる力応答を観察した。その結果、急激にカンチレバーが斥力を受けてたわむ点が観察され、この点でナノチューブ（６）の先端が細胞膜に接触したことを意味する。さらに両者を接近させていくと、この斥力はより強くなり、続いて急激に緩和するのが観察された。これは、ナノチューブ（６）の先端が細胞膜を突き破って、細胞内部に進入したためである。その後、ナノチューブ（６）を細胞（７）から引き抜いた。この時にはナノチューブを抜かせまいとする方向の弱い引力が観察され、その後に再び緩和された。この再緩和の点はナノチューブが完全（７）に細胞から離れた点であると考えられる。この一連の動作において観測された、カンチレバー試料と距離間の距離に対する力の変化の様子から、ナノチューブ（６）と細胞（７）との接触状況をリアルタイムに詳細に知ることが出来た。
【００２５】
（４）〔カーボンナノチューブへの遺伝子の吸着〕
遺伝子は緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を有し、ヒト細胞内で良好な転写活性を持つCMV-IEプロモーター／エンハンサーを有するプラスミド遺伝子pQBI25 (和光純薬工業、東京)を使用した。0.5 μg/μl のプラスミド溶液（10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1.0 mMEDTA）10 μlを カンチレバー上に滴下し、30分間、室温にて静置し、物理吸着によって固定化を行った。
【００２６】
（５）ナノチューブによる遺伝子導入
カンチレバーのプローブ部分を細胞中央部の核が存在すると考えられる部位に位置あわせをした。次にカンチレバーの変位を監視しながら、カンチレバーと細胞を徐々に接近させ、遺伝子固定化ナノチューブを挿入した。この状態を５時間保持し、ナノチューブに吸着した遺伝子の発現を１時間ごとに蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ナノチューブを注入した細胞だけが２時間後あたりからGFPの蛍光が観察されはじめ、４時間の間に強い蛍光を発することが観測された（図５）。この結果、単一細胞に選択的に遺伝子導入を行うことが可能であることが証明された。
【００２７】
【実施例２】
（１）〔先鋭化AFMプローブの作製〕
バネ定数0.1N/mの単結晶シリコンからなるAFMカンチレバーに対して、収束イオンビーム加工装置を用いたビームエッチングによって、探針部分の尖鋭化を行った。すなわち、ピラミッド状のシリコン製探針に対して一方向からイオンビームを照射し、針状になるように切削を行い、さらに、一度取り出して９０度回転させてAFMカンチレバーを設置し、再び同様のビーム照射によって針状に先鋭化し切削を行った。得られた先鋭化AFMプローブを図６に示す。
【００２８】
（２）〔細胞培養〕
実施例１と同様に、新生児表皮メラニン細胞NHEM-Neo (Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) は培地としてMGM-3ブリットキット(Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) を使用し、37℃、5% CO2条件下にて培養を行った。培養容器は35 mmペトリディッシュを用い、細胞数が1.6x106個となるよう播種後、一晩培養を行ったものを遺伝子導入に使用した。
【００２９】
（３）〔先鋭化プローブの細胞への挿入の力応答測定〕
実施例１のカーボンナノチューブに代えて、上記（１）で得られた先鋭化ＡFMプローブを用いた他は、上記実施例１（３）と同様に構成された測定装置を用いて測定した。
すなわち、原子間力顕微鏡（AFM）（１）の試料台として、生体試料への応用が容易にできるよう２次元ステージ（３）を設け、培養された細胞を培養容器ごとこのステージに取り付けた。また、落射蛍光顕微鏡（２）を、原子間力顕微鏡（１）と一体化して設け、下方からの照明によって、試料（７）とAFMカンチレバー（４）を照明しながら明視野観察によって位置合わせを行い、またAFMカンチレバーで細胞操作を行いながら高感度CCDによってリアルタイムの蛍光観察を行うことができるよう構成した。また、温度、CO２を制御できるチャンバーを取り付けてあり、これにより、AFMカンチレバー（４）による細胞操作の間、細胞の生育環境を維持した。
【００３０】
この顕微鏡によって、カンチレバー（４）のプローブ部分（５）が標的細胞中央部の真上に来るよう２次元ステージ（３）で位置あわせをし、カンチレバー（４）の変位を監視しながら、先鋭化プローブを細胞に挿入し、カンチレバーにかかる力応答を観察した。その観察結果を図７に示す。これによればカンチレバーと細胞を徐々に接近させていくと、急激にカンチレバーが斥力を受けてたわむ点が観察され、この点で先鋭化AFMプローブの針状部先端が細胞膜に接触したことを意味する。さらに両者を接近させていくと、この斥力はより強くなり、続いて急激に緩和するのが観察された。これは、プローブ針状部先端が細胞膜を突き破って、細胞内部に進入したためと考えられる。その後、プローブ針状部を細胞内に挿入させていくと斤力が上昇していくが、これは針状部側面傾斜部の抵抗によるものと考えられる。なお、この途中に核膜と接触しているものと思われる点も観察されている。次いでさらに挿入を続けた後、先鋭化プローブを細胞から引き抜いた。この時には先鋭化プローブを抜かせまいとする方向の弱い引力が観察され、その後に再び緩和された。この再緩和の点は先鋭化プローブが完全に細胞から離れた点であると考えられる。この一連の動作において観測された、カンチレバー試料と距離間の距離に対する力の変化の様子から、先鋭化プローブと細胞との接触状況をリアルタイムに詳細に知ることが出来た。
【００３１】
（４）〔先鋭化プローブへの遺伝子の固定化〕
遺伝子は緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を有し、ヒト細胞内で良好な転写活性を持つCMV-IEプロモーター／エンハンサーを有するプラスミド遺伝子pQBI25 (和光純薬工業、東京)を使用した。PCR法によって、プロモーターを含むGFP遺伝子の断片を作製した。PCRに用いたプライマーはビオチン化されており、アビジンビオチン結合を利用して固定化出来る。シリコン製先鋭化プローブは、オゾンクリーナーによる処理で表面を酸化した。その後、シラン化剤及び二価性カップリング試薬を用いて、アビジンを先鋭化プローブ針状部表面に固定化した。このアビジン修飾プローブに対してビオチン化GFP遺伝子断片の溶液を添加し、DNAの固定化を行った。
【００３２】
（５）先鋭化プローブによる遺伝子導入
カンチレバーのプローブ部分を細胞中央部の核が存在すると考えられる部位に位置あわせをした。次にカンチレバーの変位を監視しながら、カンチレバーと細胞を徐々に接近させ、遺伝子固定化先鋭化プローブを挿入した。この状態を５時間保持し、先鋭化プローブ針状部に固定化した遺伝子の発現を１時間ごとに蛍光顕微鏡で観察した。その結果、該プローブを注入した細胞だけが２時間後あたりからGFPの蛍光が観察されはじめ、４時間の間に強い蛍光を発することが観測された。図８は先鋭化プローブの細胞挿入２時間後の観察写真である。
この結果、単一細胞に選択的に遺伝子導入を行うことが可能であることが証明された。
【００３３】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明においては、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質の細胞内導入において細胞のダメージを極力低減できるとともに、遺伝子の発現あるいは遺伝子の発現に関与する物質の影響を、リアルタイムで観察できる。また、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質は、細胞内に恒常的に保持せず、遺伝子発現の場合においても遺伝子組み換え体を作らない。したがって、発現する遺伝子と発現しない遺伝子とが比較的短時間のうちに異なる細胞分化において、分化機構の解明あるいは分化誘導、分化制御の手段として最適な方法であり、特にガン、アルツハイマー等の遺伝子治療、細胞治療にも期待できるものである。また、テーラーメイド医療における、薬剤効果試験に用いることが出来る。ガン患者から組織を一部取り、試験薬剤の投与を行いながら増殖抑制の指標となるマーカー遺伝子を針で採取した細胞に挿入する。マーカー遺伝子が発現すれば、試験した薬剤に効果があると判断できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において使用したカーボンナノチューブ固定化プローブの電子顕微鏡写真である。
【図２】実施例において使用した新生児表皮メラニン細胞NHEM-Neoの光学顕微鏡写真である。
【図３】本発明の細胞操作装置の１例を示す図である。
（１）原子間力顕微鏡
（２）落射蛍光顕微鏡
（３）２次元ステージ
（４）カンチレバー
（５）プローブ（探針）
（６）取り付けたカーボンナノチューブ等の針状物
（７）細胞
【図４】プローブ先端に固定化したカーボンナノチューブを細胞に導入した時に、カンチレバーにかかる力応答を示す図である。
【図５】実施例１においてGFP遺伝子を導入したメラニン細胞の蛍光タンパク質発現の経時変化を示す観察写真である。
【図６】実施例２において作製した先鋭化AFMプローブの電子顕微鏡写真である。
【図７】先鋭化AFMプローブを細胞に導入した時に、カンチレバーにかかる力応答を示す図である。
【図８】実施例２においてGFP遺伝子を導入したメラニン細胞の蛍光タンパク質発現の経時変化を示す観察写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an apparatus and method for manipulating a cell by introducing a gene and a substance involved in gene expression into the cell, and in particular, changes in cell dynamics due to the introduction of these substances can be observed in real time. The present invention also relates to an apparatus and method that can be used for controlling cell differentiation.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as a means for introducing a gene into a cell and expressing the gene, a physical method such as an electroporation method, a particle gun method, a microinjection method, etc. Calcium phosphate method, deaedextran method, lipofection method, etc. are known as methods to be used. In addition, infection method using virus vector, liposome method in which liposome encapsulating gene is introduced into cells by cell fusion, etc. However, all of the gene transfer by these methods is simply to keep the introduced gene in the cell constantly, for example, from the introduction of the gene to the expression, It is not intended to observe in detail the kinetic changes that appear in cells over time, in fact, Was is such as observation impossible.
[0003]
In particular, in the development and differentiation of cells, it is important to change the expression genes over time and to interact with each other. It is difficult to elucidate or control. In addition, the above-described conventional method causes considerable damage to the cell when introducing a gene into the cell, and the cell survival rate is not necessarily good, and may hinder subsequent experiments. Even if the damaged cells are repaired after gene introduction, the time required for recovery is long and unclear, so that there is a problem that analysis of high time resolution is impossible.
[0004]
[Problems of the Invention]
An object of the present invention is to solve such problems of the prior art. Specifically, in detail from the introduction of the gene to the expression, the change in kinetics appearing in the cells over time is described in detail. The present invention is intended to provide a cell manipulation means that can be observed and can be applied to elucidation or control of cell differentiation, and that can reduce cell damage as much as possible when a gene or the like is introduced.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research to solve the above problems, the present inventors have introduced a gene or a substance involved in the expression of a gene as a needle-like introduction as a gene or a substance involved in the expression of the gene. An entirely new means has been developed as a means for cell manipulation, in which the above gene and the like are immobilized in needles and retained in the cells for functional expression.
[0006]
That is, the present invention relates to the cell manipulation device and the cell manipulation method listed in the following (1) to (8), and the above problems are solved by these.
(1)It has a needle to immobilize a gene or a substance involved in gene expression, a means for moving the needle, and a means for controlling the position of the needle, and at least detects the insertion of the needle into the cell A cell manipulation device, characterized in that the means for detecting insertion of the needle-like object into the cell measures the force exerted by the cell on the needle-like object.
(2) At least the means for detecting the insertion of the needle-like object into the cell detects contact, puncture, insertion and withdrawal of the needle-like object with respect to the cell (As described in 1)Cell manipulation device.
(3) The cell according to (1), wherein the means for measuring the force exerted by the cell on the needle-like object is a force fluctuation amount measuring means in an atomic force microscope or a force fluctuation amount measuring means in an intermolecular force measuring device. Operating device.
(4) The means for measuring the force exerted by the cell on the needle-like object includes a probe, a cantilever provided with the probe at the tip thereof, and a means for detecting the displacement of the cantilever in the atomic force measuring means or the intermolecular force measuring means. The cell manipulation device according to (3), which has a needle-like object fixed to the probe.
(5) The means for measuring the force exerted by the cell on the needle-shaped object includes a probe, a cantilever provided with a probe at the tip thereof, and a means for detecting the displacement of the cantilever in the atomic force measuring means or the intermolecular force measuring means. The cell manipulation device according to (4), wherein the probe itself is a sharpened needle-like object.
(6) The cell manipulation device according to any one of (1) to (4), wherein the needle-like material for supporting a gene or a substance involved in gene expression is a carbon nanotube.
(7)a) fixing a gene or a substance involved in gene expression to the needle, b) inserting a needle carrying a gene or a substance involved in gene expression into the cell, and c) a gene in the cell Or a step of holding the substance involved in gene expression in a state of being carried on the needle-like material, and performing the steps b) and c) while measuring the force exerted by the cell on the needle-like material, Cell manipulation method.
(8)a) a step of fixing a gene or a substance involved in gene expression to the needle, b) a step of inserting a needle or a substance carrying a gene or a substance involved in gene expression into the cell, c) a gene in the cell Or a step of holding a substance involved in gene expression in a state of being carried on a needle, and d) a step of pulling out the needle from a cell in a state of carrying a gene or a substance involved in gene expression, A cell manipulation method comprising performing steps b) to d) while measuring a force exerted by a cell on a needle-like object.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The cell manipulation device of the present invention has a needle-like object for immobilizing a gene or a substance involved in gene expression, means for moving the needle-like object, and means for controlling the position of the needle-like object, and at least Means for detecting insertion of a needle-like object into a cell are provided.
[0008]
In the cell manipulation device of the present invention, it is desirable that the means for detecting the insertion of the needle-like object into the cell is also a means for detecting contact, puncture, and withdrawal. This may be anything as long as the minute force exerted by the cell on the needle can be measured in each state of contact, puncture, insertion, and withdrawal of the needle. For this, for example, a means for measuring the force exerted on the probe in an atomic force microscope or an intermolecular force measuring apparatus can be used. Specifically, a probe in these means, a cantilever provided with a probe at its tip, and a means for detecting displacement of the cantilever can be mentioned.
[0009]
A needle-like material for immobilizing a gene or a substance involved in gene expression may be fixed to this probe, or the probe itself may be sharpened and formed into a needle shape. When these devices are used in the present invention, a function for measuring the amount of fluctuation of the force exerted on the probe in these devices is used, and the atomic force or intermolecular force itself is not measured. Further, in the atomic force microscope (AFM) or the intermolecular force measuring device, a cantilever moving means provided with a probe or a probe at the tip thereof, and a detection or control means for these positions can also be used. In addition, as these devices, cantilever drive type devices that can be contacted from above and can use the petri dish in which cells are cultured as they are are preferable.
[0010]
Hereinafter, the present invention will be described by taking the case of using an AFM probe and its attachment means as an example.
The measurement principle of AFM is that when a microprobe (probe) at the tip of the cantilever is brought close to the sample surface, the cantilever bends due to atomic force, and this cantilever mutation is detected by laser reflected light, and the unevenness of the sample surface is on the nanometer order. It is to be imaged.
[0011]
In the present invention, the probe of the atomic force microscope is provided with a needle-like material for immobilizing a gene or a substance involved in gene expression and inserting it into a cell. Examples of the needle-like material include carbon nanotubes, Fix silicon crystals, metal crystals such as titanium and zirconium, metal oxides such as ZnO, etc. to the tip of the probe, or sharpen themselves using a probe made of silicon, silicon nitride, etc. Use what you did.
The diameter of the needle-shaped object fixed to the probe is about 10 nm to 30 μm. The diameter of the carbon nanotube of the present invention is preferably on the order of 10 to 100 nm, and is sufficiently small compared to the size of the cell, and therefore does not damage the insertion into the cell.
In addition, the probe processed into a needle shape can be processed to a diameter of about 100 nm, and does not cause great damage in cell insertion.
On the other hand, the length of the needle-like material is about 0.5 to 200 μm, preferably 2 to 10 μm. Even a probe processed into a needle shape can be processed to a length of about 5 μm, and a sufficient length can be secured for cell insertion.
Carbon nanotubes can be broadly classified into single-walled and multi-walled carbon nanotubes. In the present invention, a certain level of strength against lateral bending is required, so multi-walled carbon nanotubes are preferred.
[0012]
In order to attach the needle-like object to the probe, in the case of the above-mentioned carbon nanotube, for example, under observation with an electron microscope, the tip of the carbon nanotube fixed to the base and the probe at the tip of the cantilever are brought into contact with the electron beam. , The carbon compound gas is decomposed by the energy of the electron beam, deposited as amorphous carbon, and the probe and the carbon nanotube are fixed. Thereafter, the carbon nanotube is removed from the base. Further, a cantilever with carbon nanotubes may be produced by a method of growing carbon nanotubes on the cantilever surface by a CVD method.
[0013]
In order to process the probe into a needle shape, the tip of the silicon probe can be processed into a needle shape by etching by beam irradiation using, for example, a focused ion beam processing apparatus. In the case of a probe made of silicon nitride, a needle-like probe may be manufactured by forming a hollow portion of a mold used at the time of molding into a needle-like structure.
[0014]
The cell manipulation device of the present invention comprises, for example, an atomic force microscope (1) provided with a two-dimensional stage (3) on which a culture vessel is placed and an epifluorescence microscope (2). The probe (5) of the cantilever (4) of the atomic force microscope (1) and the needle-like object (6) such as a carbon nanotube attached to the tip of the cantilever (4) are disposed. The cantilever moving means and position control means (both not shown) of the atomic force microscope (1) are configured to be movable up and down (FIG. 3), and the force applied to the needle-like object is the cantilever (4). It is possible to monitor the deflection by detecting with the reflected laser beam.
[0015]
An example of performing cell manipulation using this apparatus will be described below.
First, a gene or a substance involved in gene expression is immobilized on a needle-like object (6) provided on a probe (5) at the tip of a cantilever (4) or a sharpened needle-like probe (6) (FIG. 3). ). Examples of the immobilization means include physical adsorption and use of avidin-biotin bonds using immobilized avidin. In the case of carbon nanotubes, the surface of carbon nanotubes itself is modified in advance by an organic synthesis technique. Is possible. For example, it is possible to make the surface hydrophilic by modifying it so that it has a functional group such as a carboxyl group, and to share this gene with an organic chemical method using an activating reagent. It can be bonded and immobilized on the carbon nanotube surface. Even when the probe itself is processed into a needle shape, if silicon or silicon nitride is used as the material, after oxidizing the surface, various silanizing agents are used to form functional groups on the surface. The gene can be covalently immobilized by this technique.
[0016]
The cantilever probe portion (5) is then placed on the two-dimensional stage while the culture vessel in which the target cells are cultured is placed on the two-dimensional stage (3) of the cell manipulation device and monitored with an epifluorescence microscope (2). Adjust the position by operating the two-dimensional stage so that it is directly above the target cell in the culture vessel placed on the needle, while monitoring the displacement of the cantilever (4), 6) and the cell (7) are gradually brought close together, and the needle-like object is inserted into the cell (7), and then held in this state, and the gene immobilized on the needle-like object is expressed. In this case, the cantilever (4) is displaced due to repulsive force when the needle-shaped object and the cell are in contact with each other, and when the needle-shaped object is inserted through the cell membrane, the repulsive force applied to the cantilever (4) is reduced. The cantilever displacement is reduced.
[0017]
While the needle-like object (6) is held in the cell and the gene immobilized on the needle-like object (6) is expressed, the repulsive force gradually decreases, but the minute displacement is adjusted. Continue to observe. Next, in the present invention, after gene expression or the like is performed for a certain period of time, the needle-like material is extracted from the cell (7) and the gene is taken out of the cell. In this case, the needle-like material is extracted from the cell. A weak resistance is applied, which causes a displacement of the weak attraction of the cantilever (4).
[0018]
After this, the displacement recovers, which means that the needle has been completely removed from the cell. The displacement of these cantilevers (4) can be monitored on the screen. Therefore, a series of cell operations such as contact, insertion, intracellular retention, and extraction between these cells (7) and needles (6) are performed in real time. (Fig. 4), and the influence of substances involved in gene expression or gene expression due to intracellular retention of needles can be measured in real time using the epifluorescence microscope of the cell manipulation device of the present invention. I can observe.
[0019]
As is apparent from the above description, in the present invention, a gene or a substance involved in gene expression is not constantly retained in the cell, and a gene recombinant is not produced even in the case of gene expression. Therefore, in cell differentiation in which a gene to be expressed and a gene that is not expressed change in a relatively short time, it is an optimal method as a means for elucidating a differentiation mechanism, inducing differentiation, or controlling differentiation. Further, in the present invention, it is advantageous from the viewpoint of safety in gene transfer not to make a gene recombinant, and also in cell therapy, since the genotype remains exactly the same as the patient himself, the antigenicity , There is a possibility to solve the problem of rejection. Therefore, it can be expected to be applied to gene diagnosis and gene therapy.
[0020]
In the present invention, the gene immobilized on the needle is not particularly limited. For example, it is a gene that is expected to be a gene that causes or is expected to cause differentiation by elucidating gene interaction in development / differentiation in stem cells, or in a transcriptional regulatory mechanism or the like. It is also possible to observe a disease state by introducing a gene related to a disease.
In addition, substances involved in gene expression that are immobilized on needles are not particularly limited, and all substances related to gene responses in cells such as proteins can be considered. For example, in differentiation control, a repressor protein or the like that suppresses transcription of a gene expressed in a cell may be introduced to control gene expression on the genome. In the above, the case where the probe of the atomic force microscope, the probe moving means, the position control means, and the detection means using the cantilever are mainly described.
[0021]
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not particularly limited by these Examples.
[Example 1]
(1) [Immobilization of carbon nanotube to AFM probe]
Electrophoresis is performed on the purified multi-walled carbon nanotubes. As a result, the nanotubes moved in different directions along the electric field direction, and a large number of the nanotubes were adsorbed on the knife edge of the electrode with one end protruding. The knife edge with the nanotube and the cantilever were introduced into a scanning electron microscope (SEM) dedicated to the attachment work. This is equipped with a three-dimensional moving stage for bringing the carbon nanotubes into contact with the cantilever probe. The stage is mounted on the stage so as to face each other, and the length of 3 μm or more reaching the cell nucleus is observed by an electron microscope. I chose the nanotube. The two were brought close together while observing under a microscope, the approach was stopped when the tip of the nanotube was brought into contact with the side of the probe, and only the periphery of the contact was scanned with an incident electron beam of an electron microscope for several minutes. As a result, the carbon compound gas remaining in the vacuum container built in the electron microscope was decomposed by the energy of the electron beam, deposited as amorphous carbon in the scanning region, and the nanotubes were fixed to the probe. At this time, the nanotube was adjusted so as to be inclined at an angle of about 15 ° with respect to the direction perpendicular to the surface of the cantilever so that the nanotube was directed directly downward when it was attached to the tilted AFM cantilever holder. Furthermore, in order to mechanically strengthen the base portion of the nanotube to prevent bending, amorphous carbon was deposited on this portion by electron beam irradiation as well. In this manner, an ideal gene injection probe having a tip thickness of about 10 nanometers and a length of 3 microns or more could be produced (FIG. 1).
[0022]
(2) [Cell culture]
In contrast, neonatal epidermal melanocytes NHEM-Neo (Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) use the MGM-3 bullet kit (Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) as the medium, at 37 ° C and 5% CO2.2Culture was performed under conditions. The culture vessel is a 35 mm Petri dish with a cell count of 1.6x106What was cultured overnight after seeding so as to be individual was used for gene transfer (FIG. 2).
[0023]
(3) [Measurement of force response of insertion of nanotube into cell]
As shown in FIG. 3, a two-dimensional stage (3) is provided as a sample stage for an atomic force microscope (AFM) (1) so that it can be easily applied to a biological sample. Attached to the stage. In addition, the epifluorescence microscope (2) is integrated with the atomic force microscope (1), and is aligned by bright field observation while illuminating the sample (7) and the AFM cantilever (4) by illumination from below. In addition, a high-sensitivity CCD was used for real-time fluorescence observation while performing cell manipulation with an AFM cantilever. In addition, a chamber capable of controlling temperature and CO2 is attached, thereby maintaining an appropriate environment for cell growth during cell manipulation by the AFM cantilever (4).
[0024]
Using this microscope, the probe portion (5) of the cantilever (4) was aligned on the two-dimensional stage (3) so that it was directly above the center of the target cell. Next, as shown in FIG. 4, while monitoring the displacement of the cantilever (4), the cantilever and the cell were gradually brought closer to each other, and the force response applied to the cantilever was observed. As a result, a point where the cantilever is suddenly bent due to repulsive force is observed, which means that the tip of the nanotube (6) is in contact with the cell membrane. Furthermore, it was observed that as the two were brought closer together, this repulsion became stronger and then suddenly relaxed. This is because the tip of the nanotube (6) broke through the cell membrane and entered the inside of the cell. Thereafter, the nanotube (6) was pulled out from the cell (7). At this time, a weak attractive force in the direction of pulling out the nanotube was observed, and then relaxed again. This rerelaxation point is considered to be the point at which the nanotubes are completely (7) away from the cell. From the state of force change with respect to the distance between the cantilever sample and the distance observed in this series of operations, the contact state between the nanotube (6) and the cell (7) could be known in detail in real time.
[0025]
(4) [Adsorption of gene to carbon nanotube]
The gene was a green fluorescent protein (GFP) gene, and a plasmid gene pQBI25 (Wako Pure Chemical Industries, Tokyo) having a CMV-IE promoter / enhancer having good transcription activity in human cells was used. 10 μl of a 0.5 μg / μl plasmid solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1.0 mM EDTA) was dropped on the cantilever, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and immobilized by physical adsorption.
[0026]
(5) Gene transfer using nanotubes
The probe part of the cantilever was aligned with the site where the nucleus at the center of the cell was thought to exist. Next, while monitoring the displacement of the cantilever, the cantilever and the cell were gradually brought closer together, and the gene-immobilized nanotube was inserted. This state was maintained for 5 hours, and the expression of the gene adsorbed on the nanotubes was observed with a fluorescence microscope every hour. As a result, only the cells into which the nanotubes were injected started to observe GFP fluorescence from about 2 hours later, and it was observed that strong fluorescence was emitted in 4 hours (FIG. 5). As a result, it was proved that a gene can be selectively introduced into a single cell.
[0027]
[Example 2]
(1) [Production of sharpened AFM probe]
The AFM cantilever made of single-crystal silicon with a spring constant of 0.1 N / m was sharpened by probe etching using a focused ion beam processing system. In other words, a pyramidal silicon probe is irradiated with an ion beam from one direction, cut to become a needle, and once removed, rotated 90 degrees, an AFM cantilever is installed, and again the same The needle was sharpened by beam irradiation and cut. The resulting sharpened AFM probe is shown in FIG.
[0028]
(2) [Cell culture]
As in Example 1, the neonatal epidermal melanocytes NHEM-Neo (Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) used the MGM-3 bullet kit (Bio Whittaker, Inc., Maryland, USA) as the medium at 37 ° C. , 5% CO2Culture was performed under conditions. The culture vessel is a 35 mm Petri dish with a cell count of 1.6x106What was cultured overnight after seeding so as to be individual was used for gene transfer.
[0029]
(3) [Measurement of force response of insertion of sharpened probe into cells]
In place of the carbon nanotube of Example 1, measurement was performed using a measuring apparatus configured in the same manner as in Example 1 (3) except that the sharpened AFM probe obtained in (1) was used.
That is, a two-dimensional stage (3) was provided as a sample stage for an atomic force microscope (AFM) (1) so that it could be easily applied to a biological sample, and the cultured cells were attached to the stage together with the culture vessel. In addition, the epifluorescence microscope (2) is integrated with the atomic force microscope (1), and is aligned by bright field observation while illuminating the sample (7) and the AFM cantilever (4) by illumination from below. In addition, a high-sensitivity CCD was used for real-time fluorescence observation while performing cell manipulation with an AFM cantilever. Also, temperature, CO2A chamber that can control the cell growth was maintained, thereby maintaining the cell growth environment during cell manipulation with the AFM cantilever (4).
[0030]
Using this microscope, the probe part (5) of the cantilever (4) is aligned on the two-dimensional stage (3) so that the probe part (5) is directly above the center of the target cell, and the cantilever (4) is monitored for displacement while sharpening. The probe was inserted into the cell and the force response on the cantilever was observed. The observation results are shown in FIG. According to this, when the cantilever and the cell are gradually approached, a point where the cantilever is bent due to a repulsive force is observed, which means that the tip of the needle-shaped part of the sharpened AFM probe contacts the cell membrane. To do. Furthermore, it was observed that as the two were brought closer together, this repulsion became stronger and then suddenly relaxed. This is presumably because the tip of the probe needle penetrated the cell membrane and entered the inside of the cell. After that, when the probe needle-like portion is inserted into the cell, the repulsive force increases, which is considered to be due to the resistance of the needle-like portion side inclined portion. In the middle of this, it is also observed that it seems to be in contact with the nuclear membrane. Subsequently, after further insertion, the sharpened probe was withdrawn from the cells. At this time, a weak attractive force was observed in the direction in which the sharpened probe was not pulled out, and then relaxed again. This rerelaxation point is considered to be the point where the sharpened probe is completely separated from the cell. The state of contact between the sharpened probe and the cells was able to be known in detail in real time from the state of force change with respect to the distance between the cantilever sample and the distance observed in this series of operations.
[0031]
(4) [Immobilization of gene to sharpened probe]
The gene was a green fluorescent protein (GFP) gene, and a plasmid gene pQBI25 (Wako Pure Chemical Industries, Tokyo) having a CMV-IE promoter / enhancer having good transcription activity in human cells was used. A GFP gene fragment containing a promoter was prepared by PCR. Primers used for PCR are biotinylated and can be immobilized using avidin biotin bonds. The silicon sharpened probe was oxidized by treatment with an ozone cleaner. Thereafter, avidin was immobilized on the surface of the sharpened probe needle using a silanizing agent and a divalent coupling reagent. A biotinylated GFP gene fragment solution was added to the avidin-modified probe to immobilize DNA.
[0032]
(5) Gene transfer using a sharpened probe
The probe part of the cantilever was aligned with the site where the nucleus at the center of the cell was thought to exist. Next, while monitoring the displacement of the cantilever, the cantilever and the cell were gradually approached, and a gene-immobilized sharpening probe was inserted. This state was maintained for 5 hours, and the expression of the gene immobilized on the sharpened probe needle was observed with a fluorescence microscope every hour. As a result, only the cells injected with the probe began to observe GFP fluorescence from about 2 hours later, and it was observed that strong fluorescence was emitted in 4 hours. FIG. 8 is an
As a result, it was proved that a gene can be selectively introduced into a single cell.
[0033]
【The invention's effect】
As is apparent from the above description, in the present invention, cell damage can be reduced as much as possible by introducing a gene or a substance involved in gene expression into the cell, and the effect of the substance involved in gene expression or gene expression can be reduced. Can be observed in real time. In addition, genes or substances involved in gene expression are not constantly retained in cells, and gene recombinants are not produced even in the case of gene expression. Therefore, it is an optimal method for elucidating the differentiation mechanism or inducing differentiation and controlling differentiation in the cell differentiation in which the gene to be expressed and the gene not to be expressed differ in a relatively short time, especially gene therapy for cancer, Alzheimer, etc. It can also be expected for cell therapy. It can also be used for drug effect testing in tailor-made medicine. A portion of tissue is taken from a cancer patient, and a marker gene that serves as an index of growth inhibition is inserted into the cells collected with a needle while administering a test drug. If the marker gene is expressed, it can be determined that the tested drug is effective.
[Brief description of the drawings]
1 is an electron micrograph of a carbon nanotube-immobilized probe used in Example 1. FIG.
FIG. 2 is an optical micrograph of neonatal epidermal melanocytes NHEM-Neo used in Examples.
FIG. 3 is a diagram showing an example of the cell manipulation device of the present invention.
(1) Atomic force microscope
(2) Epifluorescence microscope
(3) Two-dimensional stage
(4) Cantilever
(5) Probe (probe)
(6) Acicular objects such as attached carbon nanotubes
(7) Cells
FIG. 4 is a diagram showing a force response applied to a cantilever when a carbon nanotube fixed to the probe tip is introduced into a cell.
FIG. 5 is an observation photograph showing temporal changes in fluorescent protein expression of melanocytes into which a GFP gene was introduced in Example 1.
6 is an electron micrograph of a sharpened AFM probe produced in Example 2. FIG.
FIG. 7 is a diagram showing a force response applied to a cantilever when a sharpened AFM probe is introduced into a cell.
FIG. 8 is an observation photograph showing temporal changes in fluorescent protein expression of melanocytes into which a GFP gene was introduced in Example 2.
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