JP4027766B2

JP4027766B2 - In vivo stabilizing sequences of polypeptides and uses thereof

Info

Publication number: JP4027766B2
Application number: JP2002294200A
Authority: JP
Inventors: 悟朗吉崎; 宏中村; 真紀河口; 牧人小林; 哲朗森田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-10-07
Filing date: 2002-10-07
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2022-10-07
Also published as: JP2004121180A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内ポリペプチドの生体内での安定化機能を付与するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び該ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを利用した生体内安定化ポリペプチドによる生体内生理機能の調節、特に魚類の成熟調節及び成長調節のような生体内生理機能の調節への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ヒトをはじめとして、種々の分野の種々の動物において、生体内に存在するポリペプチドを、生体に投与して、生体の種々の生理機能の調節や、種々の薬理作用を利用した生体の防御などが行われている。
魚類においては、その養殖に際して、性腺刺激ホルモン（生殖腺刺激ホルモン）を用いて、該ポリペプチドを、生体に投与し、魚類の成熟を調節することが行われている。例えば、魚類の養殖における卵の人口孵化に際しては、ウナギやハマチのような通常、産卵を行わない魚に対しては、性腺刺激ホルモンを投与することで、産卵を誘発し、卵や***を採る方法が行われている。また、マダイやヒラメのような産卵を行う魚に対しては、性腺刺激ホルモンを投入することで、産卵期等を調節し、養殖業者が望む時期に望む量・質の卵や***を採る方法が行われている。
【０００３】
また、養殖している魚に、成長ホルモン（ポリペプチド）を投与して、魚の成長を促進させたり、魚に抵抗力を付与するポリペプチドを投与して、病気に対する耐性を高める方法も知られている。
このように、例えば、魚類の養殖に際しては、種々のポリペプチドの魚体内への投与が行われているが、その場合に、投与されたポリペプチドの生体内での安定性が問題になる。すなわち、魚類の場合には、上記のようにポリペプチドを投与するには、生け簀の中の魚を捕まえ、その魚に性腺刺激ホルモンを注射器で注射することにより行うのが普通である。この場合、魚に注入されたポリペプチドは、魚体内に注入された後、吸収→代謝→分布→排出の過程を経るが、この生体内の代謝の過程で分解が起こる。したがって、通常、魚体内に注射されたポリペプチドの濃度を一定レベル以上に保つためには、ポリペプチドが減衰する前の所定の期間で、連続的に行わなければならない。
【０００４】
このような、ポリペプチドの魚体への連続投与の作業は、養殖業者にとって、作業にかかる時間とコストの増大の問題をひき起こすだけでなく、ポリペプチドを投与される魚体自体にとっても、例えば、ポリペプチド投与のために魚が弱って食欲を失ったり、魚の成長が阻害されたり、また魚が死亡したりするような、魚への負荷がかかり、大きな影響が及ぼされる。これらの問題を解決するために、養殖業者の間では、魚体内に投与したポリペプチドの延命化（生体内での半減期の延長効果）を図る方策が期待されている。
【０００５】
上記のように、例えば、魚類の養殖の分野では、性腺刺激ホルモンや成長ホルモンのようなポリペプチドを魚体内に投与することが行われており、そのような場合に、投与したポリペプチドの安定性の問題が提起されているが、一般に、生体内にポリペプチドを投与した場合には、その生体内におけるポリペプチドの分解の問題がある。そこで、投与したポリペプチドの本来の効果を有効に利用できるようにするためには、投与したポリペプチドの生体内での安定化を図ることが必要である。したがって、生体内に投与したポリペプチドの安定化は、ペプチドを生体機能の調整に用いる分野の一般的な課題でもある。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１０−３６２８５号公報
【特許文献２】
特開平１０−３６３９８号公報
【特許文献３】
特開平１０−３６３９９号公報
【特許文献４】
ＷＯ９８／２１２３８
【非特許文献１】
Mol Endocrinol 6, 951-959, 1992
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ホルモンのような生体内ポリペプチドの生体内での安定化機能を付与するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び該ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを利用した生体内安定化ポリペプチによる生体内生理機能の調節方法を提供すること、及び特別には、生体内でのポリペプチド安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを利用した魚類の成熟調節及び成長調節のような生体内生理機能の調節を行う方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
通常、霊長類やウマは、（１）胎盤から分泌される胎盤性性腺刺激ホルモン（絨毛性ゴナドトロピン）（chorionic gonadotropin：ＣＧ）、（２）下垂体から分泌される濾胞刺激ホルモン（follicle stimulating hormone：ＦＳＨ）及び（３）黄体形成ホルモン（luteinizing hormone：ＬＨ）の３種の性腺刺激ホルモンを持つ。これらのホルモンのうち、ＣＧは、ＦＳＨ及びＬＨと比較してホルモンの半減期が長いことが知られている。本発明者は、この原因究明のため、ホルモンの構造に着目して研究したところ、ＣＧには、ＦＳＨ及びＬＨには存在しないカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が付加していることが確認された。このカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が、ホルモンの半減期の延長に関与するかどうか調べた結果、ＣＴＰを、ＦＳＨ及びＬＨに付加したものは、従来のＦＳＨ及びＬＨに比較して、ホルモンの半減期が著しく延長することが判った。また、ＦＳＨ及びＬＨの本来のホルモンの活性には変化はないことが判った。
【０００９】
本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるポリペプチドを、ホルモンのような生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドとして用いて、生体内におけるポリペプチドの安定化を図ることよりなるものである。本発明は、また、生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチド及びＤＮＡの変異体、及び生体内ポリペプチドと生体内安定化機能を付与するポリペプチドとを結合した生体内安定化ポリペプチドからなる。
【００１０】
更に、本発明は、生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、魚類における性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等の生体内導入に適用して、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を行う方法を含むものである。本発明の生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に、該ポリペプチドをコードする塩基配列は、配列表の配列番号１に、例示される。
【００１１】
すなわち本発明は、魚類の生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類の生体内に導入し、生体内で発現することを特徴とする魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法（請求項１）や、魚類の生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項１記載の魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法（請求項２）からなる。
【００１２】
また本発明は、請求項１又は２記載の魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法を用いて、生体内安定化性腺刺激ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成熟調節方法（請求項３）や、魚類の成熟調節が、魚類の産卵誘発或いは産卵調節であることを特徴とする請求項３記載の魚類の成熟調節方法（請求項４）からなる。
【００１３】
さらに本発明は、請求項１又は２記載の魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法を用いて、生体内安定化成長ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成長調節方法（請求項５）からなる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドを、ホルモンのような生体内ポリペプチドのカルボキシ末端に結合して、該生体内ポリペプチドに生体内安定化機能を付与することよりなる。胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２で示され、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端３５アミノ酸残基からなる。また、本発明は、該胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドをコードするｃＤＮＡからなる。該ｃＤＮＡの塩基配列は、配列表の配列番号１で示され、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端３５アミノ酸残基をコードする１０５の塩基からなる。
【００１５】
更に、本発明は、上記胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドのペプチド変異体、及び該胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ変異体を含む。ＤＮＡ変異体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができ、これらの胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドをコードするｃＤＮＡやその変異体は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒトやウマの遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができ、また、そのＤＮＡ変異体は、公知の遺伝子操作の方法により、そのＤＮＡ配列を変更して、調製することができる。
【００１６】
また、本発明の対象となる生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号１に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。これらは例えば、ヒトやウマ由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、取得することができる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００１７】
本発明の胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドのペプチド変異体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる生体内安定化機能を付与するポリペプチドを挙げることができる。かかるポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用い、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の遺伝子工学的方法により調製することができる。
【００１８】
本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドを用いて生体内ポリペプチドの安定化を図るには、例えば、性腺刺激ホルモンや成長ホルモンのような生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３´末端に、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を結合し、該遺伝子を公知の真核生物を用いた遺伝子の発現系を用いて発現させて、生体内ポリペプチドのカルボキシ末端に本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドを結合したポリペプチドを取得する。該生体内安定化機能を付与するポリペプチドを結合したポリペプチドの形で、ポリペプチドを生体内へ投与することにより、生体内ポリペプチドの生体内における安定化を図ることができる。
【００１９】
また、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドを用いて生体内ポリペプチドの安定化を図る方法としては、生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３´末端に、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を結合し、該遺伝子を生体内に導入し、発現させて、安定化したポリペプチドとして利用することができる。
【００２０】
本発明の生体内安定化機能を付与したポリペプチドをコードする遺伝子を生体内へ導入するには、公知の動物生体組織や細胞内への遺伝子を導入する方法を使用することができる。例えば、ガラス針を動物細胞又は組織細胞にさして該細胞内導入物質を注入するマイクロインジェクション法（発生工学実験マニュアル、講談社）や、電気パルスを印加することによって細胞膜に穴を開け、遺伝子を動物生体組織や細胞内に導入するエレクトロポーレーション法のような方法を用いることができる（EMBO J. 1, 841-845 ,1982、Gene 96, 23-28, 1990）。これらの生体内ポリペプチドをコードする遺伝子を生体内へ導入する方法において、通常は、その操作が直接的であり、かつ簡便であることから、通常マイクロインジェクション法が便利に利用することができる。
【００２１】
更に、本発明は、生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、魚類における性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等の生体内導入に適用して、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を行う方法を含む。本発明の生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドを用いて、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を行うには、例えば性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの３´末端に、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列を結合した遺伝子を、魚類の受精卵へ注入することにより、生体内へ該遺伝子を導入して行うことができる。
【００２２】
また、上記のような生体内ポリペプチドとポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドを結合したポリペプチドをコードする遺伝子を、別途、遺伝子発現系を用いて発現させ、該結合ポリペプチドを取得して、それを魚類の生体内へ導入して、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節や、或いは魚類の成長調節等を行うことができる。従来、魚類の養殖に際しては、種々のポリペプチドを魚体内へ投与することが行われており、その場合に、投与されたポリペプチドの生体内での安定性が問題になっていたが、本発明の方法を用いることにより、ポリペプチドの生体内での安定化を図ることが可能となり、養殖業者にとって、魚体へのポリペプチドの繰り返し投与を行う必要がなくなるため、作業にかかる時間とコストの増大の問題を解消する。それと共に、ポリペプチドの生体内での効果の持続を図ることが可能となり、かつ魚体自体にとっても、その投与に対する魚への負荷の軽減を図ることが可能となる。
【００２３】
本発明の方法が適用される生体内ポリペプチドとしては、特に限定されないが、上記のように、αサブユニットとβサブユニットを備えた生体内ポリペプチドである性腺刺激ホルモンや成長ホルモンのような、生体内へ投与されるホルモンが挙げられる。
従来、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節に際して魚の生体内へ投与されていた濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）や、黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、生体内に投与した場合に、比較的短いホルモンの半減期しか得られなかったが、本発明の安定化機能を付与するペプチドを用いることによって、その半減期を著しく延長することが可能となる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料と方法］
（１本鎖ＧｔＨ発現コンストラクト・pB-SCF、pB-SCL+の構築）
タンパク質をコードする領域として、小林ら（Gen Comp Endocrinol 105, 372-378, 1997）及び吉浦ら（Gen Comp Endocrinol 105, 3, 379-389, 1997）によってクローン化されたキンギョ（goldfish）性腺刺激ホルモン（ＧｔＨ）α鎖（以下、「α１」という。）のｃＤＮＡ配列（配列表の配列番号３）、及び、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）β鎖（以下、「Ｆβ」という。）（配列表の配列番号５）、若しくは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）β鎖（以下、「Ｌβ」という。）（配列表の配列番号７）の、いずれか１種類のβ鎖のｃＤＮＡ配列を用いた。
ここで、キンギョＧｔＨα鎖は、小林ら（Gen Comp Endocrinol 105, 372-378, 1997）により、脳下垂体からα１とα２の２種類のｃＤＮＡ配列がクローン化されているが、α１が常に優位に発現していることから、本発明においてはα１を用いることとした。
【００２５】
β−アクチンは生物の細胞骨格を構成する主要なタンパク質で、その遺伝子は種を通じてよく保存されているうえ、いずれの種においてもその発現量が極めて高いことが知られており、そのメダカβ−アクチン遺伝子プロモーター／エンハンサー（以下、「β−アクチンＰ／Ｅ配列」という。）はメダカにおいて外来遺伝子の発現を組織非特異的に強く促すことが示されている（Mol Mar Biol Biotechnol 3, 192-199, 1998、Mol Mar Biol Biotechnol 7, 173-180, 1998）ことから、本発明においては、遺伝子発現を制御する領域として、メダカβ−アクチンＰ／Ｅ配列（Mol Mar Biol Biotechnol 3, 192-199, 1998）を用いることとした。また、ｍＲＮＡを安定化させる目的で、発現コンストラクトにはＧｔＨ−ｃＤＮＡ配列の下流に、ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル（ＢＧＨｐｏｌｙＡ配列）を組み込んだ。
【００２６】
１本鎖ＧｔＨ発現コンストラクトは、ＰＣＲ法により作製した。すなわち、タンパク質をコードする領域として、キンギョβ及びα各鎖ｃＤＮＡを融合し、更に、Minら（J Reprod Dev 40, 301-305, 1994）によってクローン化されているウマ黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン（ｅＬＨ／ＣＧ、ウマではＬＨβ鎖遺伝子とＣＧβ遺伝子が同一であるため、「ＬＨ／ＣＧ」と表記する。）ｃＤＮＡ（配列表の配列番号９）由来のＣ末端ペプチド領域（ｅＣＴＰ；5'- tcctcttcctctaaggatcccccatcccaacctctcacatccacatccaccccaactcctggggccagcagacgttcctctcatcccctcccaataaagacttct -3'：配列表の配列番号１）、アミノ酸３５残基分（配列表の配列番号２）をコードしている。以下、「ＣＴＰ」と表記する。）のｃＤＮＡ配列を挿入した１本鎖ＦＳＨ−ｃＤＮＡ（以下、「ＳＣＦ」と表記する。）（配列表の配列番号１１）及び１本鎖ＬＨ−ｃＤＮＡ（以下、「ＳＣＬ＋」と表記する。）（配列表の配列番号１３）を用いた（図１）。そして、遺伝子発現を制御する領域としてのメダカβ−アクチンＰ／Ｅ配列及びＢＧＨｐｏｌｙＡを、pBluescriptII SK+に組み込んだもの（以下、「pB-SCF」、及び、「pB-SCL+」と表記する。）を用いた（図２及び図３）。
【００２７】
ここで、α鎖、β鎖ｃＤＮＡのタンパク質コード領域を一致させて融合することにより、α鎖サブユニットとβ鎖サブユニットの会合効率を上昇させることができるため、遺伝子導入細胞内において組換えＧｔＨ分子が効率的に正確な立体構造をとり、生理活性を有するＧｔＨが生産される。α鎖とβ鎖の連結部分には、ＣＴＰのｃＤＮＡを挿入した。従来、ＣＴＰのｃＤＮＡ配列は、α鎖及びβ鎖の立体構造及びin vitroにおける生物活性を変化させることなく連結できる配列として、１本鎖ＧｔＨ生産の際一般的に用いられてきた。したがって、本発明の実施例においても、ＬＨ／ＣＧ由来のＣＴＰ−ｃＤＮＡ配列をα鎖とβ鎖の連結配列として利用した。
【００２８】
上記pB-SCFを構築するため、クローニングベクター・pBluescriptII SK+又はpGEM T-EasyにクローニングされているキンギョＧｔＨ各サブユニット（α鎖サブユニット：α１、及びβ鎖サブユニット：Ｆβ）及びpUC119にクローニングされているＣＴＰのｃＤＮＡ配列をＰＣＲ法によって増幅し（得られたＰＣＲ増幅産物；Ｆβは４４０ｂｐ、α１は６７０ｂｐ、ｅＣＴＰは１３０ｂｐ）、ＳＣＦ断片を作製した。
ＧｔＨサブユニット及びＣＴＰを増幅するため、Ｆβ鎖を増幅するプライマーとしてＰ−１及びＰ−２を、ＣＴＰを増幅するプライマーとしてＰ−３及びＰ−４を、α１鎖を増幅するプライマーとしてＰ−５及びＰ−６をそれぞれ設計し、ＰＣＲの反応に用いた（表１及び図４）。その際、Ｐ−２は５´側にＣＴＰのＤＮＡ配列を、Ｐ−３は５´側にＦβ鎖のＤＮＡ配列を、Ｐ−４は５´側にα１鎖のＤＮＡ配列を、Ｐ−５は５´側にＣＴＰの配列をそれぞれ含むように設計した（図４）。
【００２９】
【表１】

【００３０】
まず、Ｐ−１とＰ−２、Ｐ−３とＰ−４、Ｐ−５とＰ−６を用いてＰＣＲを行い、それぞれＦβ鎖、ＣＴＰ及びα１鎖を増幅した（図４：反応１、反応２、反応３）。ＰＣＲはＧｔＨα１、Ｆβ、ＣＴＰそれぞれのｃＤＮＡが組み込まれたpGEM T-Easy、pBluescriptII SK+（約０．５ｎｇ）、又はpUC119を鋳型として、１μＬの１０×LA PCR buffer、１μＭの各サブユニットに特異的なプライマー、４００μＭ dNTP solution、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、２．５unitのLA Taq polymeraseを含む１０μＬの反応混合液中で行った。ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９４℃で３０秒間熱変性させ、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。
【００３１】
次に、Ｐ−１とＰ−４を用いたＰＣＲによりＤＮＡ断片ＦβとＣＴＰを融合し、Ｆβ−ＣＴＰ（５７０ｂｐ）を作製した（図４：反応４）。ＰＣＲの反応条件としては、反応１で得たＦβ鎖断片０．５μＬと、反応２で得たＣＴＰ０．０５μＬを鋳型として、LA Taq polymeraseを含む上述と同様の反応混合液中で行った。ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９４℃で３０秒間熱変性させ、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。更に、Ｐ−１とＰ−６を用いたＰＣＲによりＤＮＡ断片Ｆβ−ＣＴＰとα１鎖を融合し、１本鎖Ｆβ−ＣＴＰ−α１（ＳＣＦ；１２４０ｂｐ）を作製した（図４：反応５）。ＰＣＲの反応条件としては、Ｆβ−ＣＴＰ断片０．５μＬとα１断片０．５μＬを鋳型として、LA Taq polymeraseを含む上述の反応混合液中で行った。ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９４℃で３０秒間熱変性させ、６５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で６０秒間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。ＰＣＲによる増幅産物は制限酵素Sal Iで消化し、ベクターの構築に用いた。
【００３２】
pB-SCL+を構築するため、キンギョＧｔＨ各サブユニット（α鎖サブユニット：α１、及びβ鎖サブユニット：Ｌβ）及びＣＴＰのｃＤＮＡ配列をＰＣＲ法によって増幅し（得られたＰＣＲ増幅産物；Ｌβは４４０ｂｐ、α１は６７０ｂｐ、ｅＣＴＰは１３０ｂｐ）、ＳＣＬ＋断片を作製した。
ＧｔＨサブユニット及びＣＴＰを増幅するため、ＬＨβ鎖を増幅するプライマーとしてＰ−１´及びＰ−２´を、ＣＴＰを増幅するプライマーとしてＰ−３´をそれぞれ設計した（表１及び図４）。その際、Ｐ−２´は５´側にＣＴＰのＤＮＡ配列を、Ｐ−３´は５´側にＬβ鎖のＤＮＡ配列を含むように設計した（図４）。
なお、ＣＴＰの３´側プライマーであるＰ−４、α１鎖を増幅するＰ−５及びＰ−６はＳＣＦ作製の際に用いたプライマーと同一のものを用いた（表１）。以上のプライマーを用いてＳＣＦ作製の際と同様の条件でＰＣＲ反応を行い、ベクター構築を行った（図４）。
【００３３】
β−アクチンＰ／Ｅ配列（約３８００ｂｐ）については、まずβ−アクチンＰ／Ｅ配列に特異的なプライマー（表１）を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅すると同時にその両端に制限酵素Eco RI(TaKaRa社製）の認識配列を付加した。ＰＣＲ反応はpOBAを鋳型として１０×Ex PCR buffer １μＬ、１μＭの各プライマー、２００μＭの各dNTP solution、１．２５unitのEx Taq polymerase（TaKaRa社製）を含む５０μＬの混合液中で行った。
ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９３℃で４５秒間熱変性させ、６０℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で５分間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は電気泳動で展開後、回収してEco RIで消化した。
ＢＧＨｐｏｌｙＡ（２８０ｂｐ）は、Ｒｃ／ＲＳＶベクター（Invitrogen社製）から制限酵素Xho I（TaKaRa社製）で切り離し、ベクター構築に用いた。
【００３４】
それぞれのＤＮＡ配列をpBluescriptII SK+ベクターの制限酵素クローニングサイト、即ちメダカβアクチンＰ／Ｅ遺伝子配列をEco RIサイトへ、１本鎖ＧｔＨ−ｃＤＮＡ（ＳＣＦ又はＳＣＬ＋）配列をSal Iサイトへ、ＢＧＨｐｏｌｙＡをXho Iサイトへ、それぞれライゲーション反応によって組み込み、２種類の発現コンストラクト・pB-SCF及びpB-SCL+を構築した（図５）。
また、pB-SCL+についてはＣＴＰの効果を確認するためにpB-SCL+からＣＴＰ配列を除去したpB-SCL-も同時に構築した。これらの発現コンストラクトはマイクロインジェクションに用いるためＴＥバッファーに溶解し、５０μｇ／ｍＬの濃度に調整した。
【００３５】
（マイクロインジェクション法による外来遺伝子の導入）
マイクロインジェクションには、東京水産大学大泉実験実習場で飼育され成熟した３才又は４才のニジマス（Oncorhynchus mykiss）雌から卵を採取し、１才のニジマス雄から搾出した***を用いて媒精した。その後、卵膜硬化抑制のため１ｍＭ還元型グルタチオン溶液（ｐＨ８．０）中にて１０℃で培養したものを用いた（Nippon Suisan Gakkaishi 55, 369, 1989）。マイクロインジェクションは受精後１時間から４時間の間にマイクロマニピュレーター（ナリシゲ化学社製）を用いて行った。ニジマス受精卵を等張液（ＮａＣｌ９．０４ｇ、ＫＣｌ０．２４ｇ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０．３４ｇ／Ｌ）中に微針で固定し、ＤＮＡ溶液２ｎＬをマイクロピペットによって受精卵の胚盤へ注入した（Nippon Suisan Gakkaishi 57, 819-824, 1991）。これらの作業は、室温をニジマス飼育水の温度である１０℃に保った状態で行った。
【００３６】
（遺伝子導入ニジマス初期胚を用いたウエスタン・ブロット解析）
pB-SCL+を導入した後、４日経過したニジマス胚（pB-SCL+導入ニジマス初期胚）とキンギョ脳下垂体から全タンパク質を抽出しウエスタン・ブロット法による解析を行った。pB-SCL+導入ニジマス初期胚の胚盤を剥がし１０個の胚をプールしてpB-SCL+導入区として３サンプルをサンプルバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）中でホモジナイズし、タンパク質を抽出した。一方、キンギョ雌１尾（ＢＷ８１．５ｇ、ＧＳＩ１１．７％）から脳下垂体を摘出し、上記ニジマス初期胚の際と同様の方法によりタンパク質の抽出を行った。
【００３７】
pB-SCL+導入ニジマス初期胚及びキンギョ脳下垂体から抽出したタンパク質のうち、それぞれ１個分及び１００分の１個分を９７℃で５分間熱処理を施した後、アクリルアミド濃度１５％のゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分子量の差で展開した後、アクリルアミドゲル中のタンパク質をミニバッファートランスファー装置（BIOCRAFT社製）を用いてHybond ECL nitrocellulose membrane（Pharmacia社製）へ転写した。メンブレンフィルターは、小林らによって作製された抗キンギョ合成α１ペプチド抗体又は抗キンギョＬＨβ鎖抗体とともに室温で１．５時間インキュベートした。
【００３８】
その後、メンブレンフィルターをＰＢＳ−Ｔ（８０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、２０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody（Pharmacia社製）とともに１時間室温でインキュベートし、この抗体の結合をECL Western blotting detecting reagents（Pharmacia社製）によって検出した。ゲルからメンブレンへのタンパク質の転写、メンブレンの抗体とのインキュベーション、ＰＢＳ−Ｔでの洗浄、タンパク質の検出は、ECL Western Blotting detecting reagentsに添付のプロトコールに従って行った。
また、pB-SCF導入ニジマス初期胚についても、上記pB-SCL+導入ニジマス初期胚と同様の手法でタンパク質を抽出し、ウエスタン・ブロット法による解析を行った。
【００３９】
（キンギョ生殖腺を用いた生物検定）
pB-SCF導入ニジマス初期胚から剥離した胚盤２５粒を回収し、培養培地中でホモジナイズしたものをサンプルとし、それぞれ２サンプルずつ用意した。その後、キンギョ雌２尾（平均ＢＷ２４．６ｇ、平均ＧＳＩ０．７４％）から卵巣を摘出した。摘出した卵巣は培養培地中で小片に切り分け、１区あたり約３０ｍｇを用いた。培養培地としては、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｌ、ペニシリン６０ｍｇ／ｌ、ＨＥＰＥＳ２．５ｇ／ｌを加え、２ＮＮａＯＨでｐＨ７．６に調整したLeibovitz's L-15 Medium（Ｌ−１５培地；GIBCO社製）０．５ｍｌにニジマス初期胚２５粒分のホモジネートを加えたものを用いた。
【００４０】
実験区としては、培地にニジマス初期胚を加えず、Ｌ−１５培地のみで精巣を培養した「培地のみ」、遺伝子を導入しなかったニジマス胚を加えた「野生型」、pB-SCF導入ニジマス胚を加えた「ＳＣＦ」及びニジマス初期胚を加えず、ｈＣＧ（三共株式会社製）５ＩＵを添加した「ｈＣＧ」の４区を設け、それぞれ２連の実験で行った。キンギョ卵巣片の培養は２０℃で２０時間行った。卵巣片を培養後、Ｌ−１５培地０．５ｍｌを回収し、エストラジオール（Ｅ２）量の測定を行った。Ｅ２は卵胞顆粒膜細胞から分泌されるホルモンであり、体内でテストステロンから合成され、卵子形成を促進する雌性ステロイドホルモンである。したがって本研究ではＥ２量を測定することにより、卵胞機能を正確に把握する。つまりニジマス初期胚内において産生された組換えタンパク質がin vitroにおけるＧｔＨとしての活性の有無を判定した。
【００４１】
Ｅ２量の測定は、Aidaら（Jpn. Soc. Sci. Fish. 50, 565-571, 1984）による放射免疫測定法（radioimmunoassay；以下、「ＲＩＡ法」という。）を用いて行った。まず、回収した培地４００μＬからジエチルエーテルによって３回のステロイドホルモン抽出を行い、４０℃の恒温槽中においてジエチルエーテル画分を乾固させた。そこに２００μｌの０．１％Ｇｅｌ−ＰＢＳ溶液（Gelatin−１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭＮａＣｌ）を加えて攪拌し、ステロイドホルモンを再溶解した。次に［³Ｈ］テストステロン（アマシャムバイオサイエンス社製）１００μｌ（約１００００ｃｐｍ）、及び抗エストラジオール抗体（COSMO BIO社製）２００μｌを加え、抗原抗体反応を進行させるため４℃で１２時間放置した。
【００４２】
続いて、デキストランチャーコール溶液（デキストラン（Sigma社製）５ｇ／ｌＰＢＳ、チャーコール（Norit“Plus”社製）０．５ｇ／ｌＰＢＳ）を２５０μｌ加えた後、３０００ｒｐｍで２０分間、冷却遠心を行い、抗体と結合したステロイドホルモン（bound）と結合していないステロイドホルモン（free）を分離した。さらに、boundのみを含む上清にシンチレーター（オムニフロー；Packard社製）３ｍＬを加え、攪拌後１２時間放置した。最後に、液体シンチレーションカウンター（liquid scintillation analyzer 1600TR；Packard社製）を用いて５分間放射活性を測定した。測定した値と濃度既知のスタンダード（６０〜３８４０ｐｇ／ｍＬ）より得られた標準曲線からＬ−１５培地中に分泌されたＥ２量をキンギョ卵巣１ｍｇ当たりの量に換算後、算出した。
【００４３】
pB-SCL+導入ニジマス初期胚から剥離した胚盤２５粒を回収し、培養培地中でホモジナイズしたものをサンプルとし、それぞれ２サンプルずつ用意した。その後、キンギョ雄２尾（平均ＢＷ１６．０ｇ、平均ＧＳＩ１．１％）から精巣を摘出し、摘出した精巣を培養培地中で小片に切り分け、１区あたり約３０ｍｇを用いた。また、培養培地はpB-SCF導入ニジマス初期胚を用いた研究と同様のものを使用した。実験区はpB-SCL+導入ニジマス胚を加えたものを「ＳＣＬ＋」とし、その他３区はpB-SCF導入ニジマス初期胚を用いた研究と同様に設け４区とし、２連の実験を行った。キンギョの精巣片の培養はキンギョ卵巣片の培養と同様の手法で行った。
【００４４】
精巣片を培養後、Ｌ−１５培地０．５ｍＬを回収し、テストステロン（Ｔ）量の測定を行った。Ｔは***形成を促進する雄性ステロイドホルモンである１１−ケトテストステロンの前駆ホルモンで、ＧｔＨの作用によって精巣内で多量に産生されることが知られている（長浜 1991 生殖：配偶子形成の制御機構．“魚類生理学” 板沢靖男・羽生功編．pp.243-286．恒星社厚生閣，東京. p20）。したがって、本研究ではＴ量を測定することにより、ニジマス初期胚内において産生された組換えタンパク質がin vitroにおけるＧｔＨとしての活性の有無を判定した。
測定方法は、pB-SCF導入ニジマス初期胚を用いた場合と同様の手法であるＲＩＡ法を採用した。測定後、測定値と濃度既知のスタンダード（６０〜３８４０ｐｇ／ｍｌ）より得られた標準曲線からＬ−１５培地中に分泌されたＴ量をキンギョ精巣１ｍｇ当たりの量に換算後、算出した。
【００４５】
（キンギョ個体を用いた生物検定）
pB-SCL+及びＣＴＰを含まないpB-SCL-導入ニジマス胚を淡水魚用リンゲル液（０．７５％ＮａＣｌ、０．０２％ＣａＣｌ₂、０．２％ＫＣｌ）中でホモジナイズし、体重１ｇ当たり２０粒の胚盤に相当する量を雄キンギョ（平均体重５．０ｇ）の腹腔内に注射した。注射後キンギョは水温２０℃の循環濾過水槽（６０Ｌ）に収容した。注射後６時間目、１２時間目及び２４時間目に尾柄部から約５０μＬの血液を採取した。採取した血液を４℃、３０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離後、上清を用いて血中テストステロン量を測定した。テストステロン量の測定には前述のＲＩＡ法を用いた。なお、これらの測定は３個体のキンギョを用いて行った。
【００４６】
［実験結果］
（ニジマス初期胚におけるキンギョ１本鎖ＬＨの発現）
キンギョ１本鎖ＧｔＨ遺伝子発現コンストラクト・pB-SCL+導入初期胚より抽出したタンパク質をサンプルとし、ウエスタン・ブロット法によって抗キンギョ合成α１鎖又は抗組換えＬβ鎖抗体と反応するタンパク質を検出した。その結果、キンギョ脳下垂体のα１鎖及びＬβ鎖と同様の抗原性を示す分子量約３６ｋＤａのタンパク質が検出された。この分子量は本発現コンストラクトから産生されるタンパク質に糖鎖が付加した場合の予想分子量と一致したことから、ニジマス初期胚内においてキンギョ１本鎖ＬＨが産生されたことを示している（図６）。
【００４７】
（遺伝子導入ニジマス初期胚で生産した組換えタンパク質の生物活性）
pB-SCF導入ニジマス初期胚ホモジネートを添加した培養液中でキンギョ卵巣を培養し、キンギョ卵巣が培養液中に産生したＥ２量をＲＩＡ法により測定した。その結果、「ｈＣＧ」区、及び「ＳＣＦ」区においてＥ２量の増加が見られた（図７）。また、「ＳＣＦ」区のエストラジオール量の平均値は、「培養のみ」区、及び「野生型」区の約４倍の１．４ｐｇ／ｍｇ卵巣片であった。
ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚ホモジネートを添加した培養液中でキンギョ精巣を培養し、キンギョ精巣が培養液中に産生したＴ量をＲＩＡ法により測定した。その結果、「ｈＣＧ」区、及び「ＳＣＬ＋」区においてＴ量の増加が見られた（図８）。また、「ＳＣＬ＋」区のテストステロン量の平均値は、「培養のみ」区、及び「野生型」区の約５倍の４．６ｐｇ／ｍｇ精巣片であった。
【００４８】
（キンギョ個体内で生産した組換えタンパク質の生物活性）
キンギョ個体内にpB-SCL+及びpB-SCL-導入ニジマス初期胚ホモジネートを注射し、注射後１２時間目の各区における血中Ｔ量の結果を図９に示した。「ＳＣＬ＋」区及び「ＳＣＬ−」区とも有意に血中Ｔ量の上昇を促したものの、「ＳＣＬ＋」区では「ＳＣＬ−」区の約３倍ほど血中Ｔ量が高かった。
【００４９】
（キンギョ個体内で生産した組換えタンパク質の経時変化）
キンギョ個体内にpB-SCL+及びpB-SCL-導入ニジマス初期胚ホモジネートを注射した場合の、注射後の血中テストステロン量の経時変化を図１０に示す。
注射後６時間目には、両区とも同程度の血中テストステロン量を示した。注射後１２時間目には、両区とも血中テストステロン量の減少が見られたが、減少量は「ＳＣＬ−」区が「ＳＣＬ＋」区より３倍程度大きかった。さらに注射後２４時間目にも注射後１２時間目と同様の減少量の差が顕著に見られた。このことから、pB-SCL+がキンギョ個体内において長期間安定的に効力を発揮したと考えられる。
【００５０】
［評価］
本発明においては、１本鎖ＧｔＨ−ｃＤＮＡ作製の際、α鎖とβ鎖の間に、Minら（J Reprod Dev 40, 301-305, 1994）によってクローン化されたＬＨ／ＣＧβ鎖由来のＣＴＰ配列を挿入した。Galetら（J Endocrinol 167, 117-124, 2000）によってＬＨ／ＣＧβ鎖のＣＴＰ配列の有無で、組換えＬＨ／ＣＧのin vitroにおける生物活性に変化はないことが示されているが、ｈＣＧのＣＴＰ配列を用いた研究から、ＣＴＰ配列がin vivoにおいてＧｔＨ分子の半減期を延長する役割を持つことが示唆されている（Proc Natl Acad Sci USA 89, 4304-4308, 1992）。これは、ＬＨ、ＦＳＨやＣＧは、分子量の約３割が付加されている糖鎖によるものであることから、これらのホルモンを比較した場合、生体内でのホルモンの寿命が長いＣＧのカルボキシ末端ポリペプチド（ＣＴＰ）に特異的に結合している糖鎖によるものと推測される。
【００５１】
従って、このようなＣＴＰ配列を付加した（付加型）ＬＨやＦＳＨを用いて魚類の催熟を行った場合、親魚体内に投与した付加型ＬＨ及び付加型ＦＳＨは、これら性腺刺激ホルモン（ＧｔＨ）が長期間体内に留まることとなり、その催熟効率が上昇する。上記のことから、本発明による発現系で産生された１本鎖ＬＨに含まれるｅＬＨ／ＣＧβ鎖由来のＣＴＰ配列も組換えＧｔＨ分子への半減期延長効果を有することが示される。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるポリペプチド、その変異体、或いは該ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて、ホルモンのような生体内ポリペプチドの生体内安定化を図ることにより、広く、生体に投与されるポリペプチド薬剤の生体内での安定化を図り、その効果を飛躍的に増大することを可能とする。また、特に、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、魚類における性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等のようなペプチドの、魚の生体内導入に適用することにより、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を効果的に行うことを可能とし、近年多くの種類の栽培漁業が行われている魚類の養殖技術に、その技術の効率化と確実性とをもたらすことができる。したがって、本発明の技術は、実用化技術としてこの分野の技術に大きな進歩をもたらすものである。
【００５３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡ及びＳＣＬ＋−ｃＤＮＡの構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡを含む発現コンストラクトを示す図である。
【図３】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＬ＋−ｃＤＮＡを含む発現コンストラクトを示す図である。
【図４】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡ及びＳＣＬ＋−ｃＤＮＡの作製について示す図である。
【図５】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡ及びＳＣＬ＋−ｃＤＮＡを含む発現コンストラクトの構造を示す図である。
【図６】本発明の実施例における、pB-SCL+導入ニジマス初期胚を用いたウエスタン・ブロット解析を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、ＳＣＦの生物活性について示す図である。
【図８】本発明の実施例において、ＳＣＬ＋の生物活性について示す図である。
【図９】本発明の実施例において、ＳＣＬ−及びＳＣＬ＋のin vivo生物活性について示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、ＳＣＬ＋及びＳＣＬ−の血中Ｔ量経時変化について示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a polypeptide that imparts an in vivo stabilization function of an in vivo polypeptide, a DNA that encodes the polypeptide, and an in vivo stabilization polypeptide that uses the polypeptide and a DNA that encodes the polypeptide. The present invention relates to the regulation of in vivo physiological functions by peptides, and in particular to its use for the regulation of in vivo physiological functions such as the regulation of fish maturity and growth.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, in various animals of various fields including humans, living body using polypeptides that are present in the living body to regulate various physiological functions of the living body and various pharmacological actions. The defense of is carried out.
In fish, when culturing, the polypeptide is administered to a living body using gonadotropin (gonad stimulating hormone) to regulate the maturation of the fish. For example, when eggs are hatched in fish farming, gonadotropic hormone is administered to fish that do not normally lay eggs, such as eel and hamachi, to induce egg laying and to collect eggs and sperm. The way is done. In addition, for fish that lay eggs, such as red sea bream and flounder, a method to adjust the spawning season, etc. by adding gonadotropin and to collect eggs and sperm of the desired quantity and quality at the time desired by the farmer Has been done.
[0003]
Also known is a method of increasing resistance to diseases by administering growth hormone (polypeptide) to farmed fish to promote fish growth or administering a polypeptide that imparts resistance to fish. ing.
Thus, for example, when fish are cultured, various polypeptides are administered into the fish body, and in that case, the stability of the administered polypeptides in vivo becomes a problem. That is, in the case of fish, in order to administer the polypeptide as described above, it is common to catch the fish in the ginger and inject the gonadotropin with a syringe into the fish. In this case, the polypeptide injected into the fish undergoes a process of absorption → metabolism → distribution → excretion after being injected into the fish body, and degradation occurs in the process of metabolism in the living body. Therefore, normally, in order to keep the concentration of the polypeptide injected into the fish body above a certain level, it must be continuously performed for a predetermined period before the polypeptide decays.
[0004]
Such a task of continuously administering the polypeptide to the fish not only raises the problem of increasing the time and cost of the work for the fisherman, but also for the fish itself to which the polypeptide is administered, for example, The administration of the polypeptide causes a significant impact on the fish, such as weakening the appetite of the fish, losing appetite, inhibiting the growth of the fish, or dying the fish. In order to solve these problems, farmers are expected to take measures to prolong the life of the polypeptide administered into the fish body (the effect of extending the half-life in vivo).
[0005]
As described above, for example, in the field of fish farming, polypeptides such as gonadotropin and growth hormone are administered into fish, and in such cases, the stability of the administered polypeptide is stabilized. In general, when a polypeptide is administered in vivo, there is a problem of degradation of the polypeptide in the living body. Therefore, in order to effectively use the original effect of the administered polypeptide, it is necessary to stabilize the administered polypeptide in vivo. Therefore, stabilization of polypeptides administered in vivo is also a general problem in the field of using peptides to adjust biological functions.
[0006]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-36285
[Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-36398
[Patent Document 3]
JP 10-36399 A
[Patent Document 4]
WO98 / 21238
[Non-Patent Document 1]
Mol Endocrinol 6, 951-959, 1992
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to use a polypeptide that imparts in vivo stabilization function of an in vivo polypeptide such as a hormone, a DNA that encodes the polypeptide, and a DNA that encodes the polypeptide and the polypeptide A method for regulating physiological functions in vivo by using an in vivo stabilized polypeptide, and in particular, a polypeptide imparting a polypeptide stabilizing function in vivo and a fish using DNA encoding the polypeptide It is an object of the present invention to provide a method for regulating in vivo physiological functions such as maturation regulation and growth regulation.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
Usually, primates and horses are (1) placental gonadotropin (CG) secreted from the placenta (2) follicle stimulating hormone secreted from the pituitary gland (follicle stimulating hormone: FSH) and (3) luteinizing hormone (LH). Of these hormones, CG is known to have a longer half-life of hormones than FSH and LH. In order to investigate the cause, the present inventor conducted research by paying attention to the structure of the hormone, and it was confirmed that a carboxy terminal peptide (CTP) not present in FSH and LH was added to CG. As a result of examining whether or not this carboxy terminal peptide (CTP) is involved in the extension of the half-life of the hormone, the addition of CTP to FSH and LH resulted in the half-life of the hormone as compared with conventional FSH and LH. Was found to extend significantly. It was also found that there was no change in the original hormone activity of FSH and LH.
[0009]
The present invention has been made based on the above findings, and uses a polypeptide comprising a carboxy-terminal region of placental gonadotropin as a polypeptide that imparts an in vivo stabilization function of an in vivo polypeptide such as a hormone. Thus, stabilization of the polypeptide in the living body is achieved. The present invention also combines DNA encoding a polypeptide that imparts an in vivo stabilization function, the polypeptide and a variant of DNA, and an in vivo polypeptide and a polypeptide that provides an in vivo stabilization function. It consists of an in vivo stabilizing polypeptide.
[0010]
Furthermore, the present invention applies a polypeptide that imparts an in vivo stabilization function of an in vivo polypeptide and a DNA encoding the polypeptide to the in vivo introduction of gonadotropin, growth hormone, etc. in fish, This includes methods for performing maturation regulation such as egg-laying induction and egg-laying regulation, or fish growth regulation. The amino acid sequence of the polypeptide imparting the in vivo stabilization function of the in vivo polypeptide of the present invention is exemplified in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the base sequence encoding the polypeptide is exemplified in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Is done.
[0011]
That is, the present invention relates to an in vivo polypeptide of fish. Consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing at the 3 ′ end of the DNA encoding Carboxy terminal region of placental gonadotropin A gene comprising DNA consisting of Introduced into fish And expressed in vivo The method for stabilizing and introducing an in vivo polypeptide into a fish (Claim 1), or the in vivo polypeptide of a fish is a gonadotropin or a growth hormone, It comprises a method for stabilizing and introducing an in vivo polypeptide into fish (Claim 2).
[0012]
The present invention also provides Claim 1 or 2 A method for regulating maturation of fish, characterized by introducing an in vivo stabilized gonadotropin into fish using the method for stabilizing in vivo polypeptide introduction into fish described above ( Claim 3 ) And maturation regulation of fish is spawning induction or regulation of spawning of fish Claim 3 The method for regulating maturity of the described fish ( Claim 4 ).
[0013]
Furthermore, the present invention provides Claim 1 or 2 A method for regulating the growth of a fish comprising introducing a biologically stabilized growth hormone into a fish using the method for stabilizing and introducing an in vivo polypeptide into a fish according to the description ( (Claim 5) Consists of.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention includes a peptide comprising a carboxy-terminal region of placental gonadotropin, which is bound to the carboxy terminus of an in vivo polypeptide such as a hormone to impart an in vivo stabilization function to the in vivo polypeptide. Become. The amino acid sequence of the polypeptide consisting of the carboxy terminal region of placental gonadotropin is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and consists of the 35 amino acid residues of the carboxy terminal of placental gonadotropin. The present invention also comprises a cDNA encoding a peptide comprising the carboxy terminal region of the placental gonadotropin. The base sequence of the cDNA is represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and consists of 105 bases encoding the carboxy terminal 35 amino acid residues of placental gonadotropin.
[0015]
Furthermore, the present invention includes a peptide variant of a peptide consisting of the carboxy-terminal region of the placental gonadotropin and a DNA variant of cDNA encoding the peptide consisting of the carboxy-terminal region of the placental gonadotropin. DNA variants include DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and imparting an in vivo stabilization function, and one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are missing. DNA encoding a polypeptide that provides an in vivo stabilization function consisting of a lost, substituted or added amino acid sequence, such as cDNA encoding a peptide consisting of the carboxy-terminal region of these placental gonadotropins, The mutant can be prepared from a human or equine gene library or cDNA library by a known method based on the DNA sequence information or the like, and the DNA mutant can be prepared by a known genetic manipulation. Depending on the method, the DNA sequence can be altered and prepared.
[0016]
The DNA encoding the polypeptide imparting the in vivo stabilization function, which is the subject of the present invention, hybridizes with the DNA represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has the in vivo stabilization function. Mention may be made of DNA encoding the polypeptide to be imparted. These can be obtained, for example, by performing hybridization under stringent conditions with a human or horse-derived DNA library. Examples of hybridization conditions for obtaining such DNA include hybridization at 42 ° C. and washing treatment at 42 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS. More preferably, hybridization at 65 ° C. and washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS can be mentioned.
[0017]
The peptide variant of the peptide consisting of the carboxy-terminal region of placental gonadotropin of the present invention is an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. And a polypeptide that imparts an in vivo stabilization function. Such a polypeptide can be prepared by a known genetic engineering method using a DNA sequence encoding the polypeptide and based on the DNA sequence information and the like.
[0018]
In order to stabilize the in vivo polypeptide using the polypeptide that imparts the in vivo stabilization function of the present invention, for example, 3 of the DNA sequence encoding the in vivo polypeptide such as gonadotropin hormone or growth hormone. A DNA sequence encoding a polypeptide that imparts the in vivo stabilization function of the present invention is bound to the ′ end, and the gene is expressed using a gene expression system using a known eukaryote. A polypeptide obtained by binding a polypeptide that imparts the in vivo stabilization function of the present invention to the carboxy terminus of the polypeptide is obtained. By administering the polypeptide into the living body in the form of a polypeptide combined with the polypeptide that provides the in vivo stabilization function, the in vivo polypeptide can be stabilized in the living body.
[0019]
In addition, as a method of stabilizing the in vivo polypeptide using the polypeptide imparting the in vivo stabilization function of the present invention, the 3 ′ end of the DNA sequence encoding the in vivo polypeptide is added to the living body of the present invention. A DNA sequence encoding a polypeptide that imparts a body stabilization function is bound, the gene is introduced into a living body, expressed, and used as a stabilized polypeptide.
[0020]
In order to introduce a gene encoding a polypeptide imparted with the in vivo stabilization function of the present invention into a living body, a known method for introducing a gene into a living animal tissue or cell can be used. For example, a microinjection method (Genetic Engineering Experiment Manual, Kodansha) in which a glass needle is placed in an animal cell or a tissue cell to inject the intracellular introduction substance, or a cell membrane is punctured by applying an electric pulse to transfer the gene to the animal body Methods such as electroporation introduced into tissues or cells can be used (EMBO J. 1, 841-845, 1982, Gene 96, 23-28, 1990). In a method for introducing a gene encoding such an in vivo polypeptide into a living body, since the operation is usually straightforward and simple, the microinjection method can usually be used conveniently.
[0021]
Furthermore, the present invention applies a polypeptide that imparts an in vivo stabilization function of an in vivo polypeptide and a DNA encoding the polypeptide to the in vivo introduction of gonadotropin, growth hormone, etc. in fish, Including maturation regulation such as egg-laying induction and egg-laying regulation, or fish growth regulation. In order to carry out maturation regulation such as fish spawning induction and spawning regulation, or fish growth regulation, etc. using the polypeptide that provides the in vivo stabilization function of the in vivo polypeptide of the present invention, for example, gonadotropin By injecting into a fish fertilized egg a gene in which the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 is linked to the 3 ′ end of DNA encoding an amino acid sequence such as or growth hormone, the gene is introduced into the living body. Can be done.
[0022]
In addition, a gene encoding a polypeptide in which a polypeptide that provides the in vivo stabilization function of the polypeptide and the polypeptide as described above is combined is separately expressed using a gene expression system, and the binding polypeptide Can be obtained and introduced into the living organisms of fish, and maturation control such as fish spawning induction and spawning control, or growth control of fish can be performed. Conventionally, in the culture of fish, various polypeptides have been administered into the fish body, and in that case, the stability of the administered polypeptide in vivo has been a problem. By using the method of the invention, it becomes possible to stabilize the polypeptide in vivo, and it is not necessary for the farmer to repeatedly administer the polypeptide to the fish body. Eliminate the problem of growth. At the same time, the effect of the polypeptide in the living body can be maintained, and the fish body itself can reduce the burden on the fish due to its administration.
[0023]
The in vivo polypeptide to which the method of the present invention is applied is not particularly limited, but as described above, such as gonadotropin and growth hormone, which are in vivo polypeptides having an α subunit and a β subunit. And hormones administered into the living body.
Conventionally, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), which have been administered into the living body of fish during maturation regulation such as induction of egg production and regulation of egg production, are relatively short when administered in vivo. Although only the half-life of the hormone was obtained, it is possible to significantly extend the half-life by using the peptide imparting the stabilizing function of the present invention.
[0024]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
[Materials and methods]
(Construction of single-stranded GtH expression constructs pB-SCF and pB-SCL +)
Goldfish gonadotropins cloned by Kobayashi et al. (Gen Comp Endocrinol 105, 372-378, 1997) and Yoshiura et al. (Gen Comp Endocrinol 105, 3, 379-389, 1997) (GtH) α chain (hereinafter referred to as “α1”) cDNA sequence (SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing) and follicle stimulating hormone (FSH) β chain (hereinafter referred to as “Fβ”) (sequence in the Sequence Listing) No. 5) or luteinizing hormone (LH) β chain (hereinafter referred to as “Lβ”) (SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing) was used for any one type of β chain cDNA sequence.
Here, the goldfish GtHα chain has been cloned from the pituitary gland by two cDNA sequences, α1 and α2, by Kobayashi et al. (Gen Comp Endocrinol 105, 372-378, 1997). Since it is expressed, α1 was used in the present invention.
[0025]
β-actin is a major protein that constitutes the cytoskeleton of living organisms, and its genes are well conserved throughout the species, and the expression level of each species is known to be extremely high. It has been shown that an actin gene promoter / enhancer (hereinafter referred to as “β-actin P / E sequence”) strongly promotes expression of foreign genes in medaka in a tissue non-specific manner (Mol Mar Biol Biotechnol 3, 192- 199, 1998, Mol Mar Biol Biotechnol 7, 173-180, 1998), in the present invention, a medaka β-actin P / E sequence (Mol Mar Biol Biotechnol 3, 192-199) is used as a region for controlling gene expression. , 1998). For the purpose of stabilizing mRNA, a bovine growth hormone gene polyA addition signal (BGH polyA sequence) was incorporated downstream of the GtH-cDNA sequence in the expression construct.
[0026]
A single-stranded GtH expression construct was prepared by the PCR method. That is, as a protein coding region, goldfish β and α chain cDNAs are fused, and further, equine luteinizing hormone / chorionic gonadotropin cloned by Min et al. (J Reprod Dev 40, 301-305, 1994). (In eLH / CG, equine, LHβ chain gene and CGβ gene are identical, so they are referred to as “LH / CG”.) C-terminal peptide region derived from cDNA (SEQ ID NO: 9 in Sequence Listing) (eCTP; 5′- It encodes tcctcttcctctaaggatcccccatcccaacctctcacatccacatccaccccaactcctggggccagcagacgttcctctcatcccctcccaataaagacttct-3 ': SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and 35 amino acid residues (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). Hereinafter, it is referred to as “CTP”. ) Inserted cDNA sequence (hereinafter referred to as “SCF”) (SEQ ID NO: 11 in the sequence listing) and single-stranded LH-cDNA (hereinafter referred to as “SCL +”). (SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing) was used (FIG. 1). Then, medaka β-actin P / E sequence and BGH polyA as a region controlling gene expression are incorporated into pBluescriptII SK + (hereinafter referred to as “pB-SCF” and “pB-SCL +”). Was used (FIGS. 2 and 3).
[0027]
Here, it is possible to increase the association efficiency of the α chain subunit and the β chain subunit by fusing the protein coding regions of the α chain and β chain cDNAs together, so that the recombinant GtH in the transgenic cell. The molecule takes an accurate three-dimensional structure efficiently and GtH having physiological activity is produced. CTP cDNA was inserted into the junction between the α chain and the β chain. Conventionally, the CTP cDNA sequence has been generally used in the production of single-stranded GtH as a sequence that can be linked without changing the three-dimensional structure and in vitro biological activity of α and β chains. Therefore, also in the examples of the present invention, the LH / CG-derived CTP-cDNA sequence was used as a linking sequence for α and β chains.
[0028]
In order to construct the above pB-SCF, it was cloned into the cloning vectors pBluescriptII SK + or pGEM T-Easy and the Ginkgo GtH subunits (α chain subunit: α1, and β chain subunit: Fβ) and pUC119. The CTP cDNA sequence was amplified by the PCR method (obtained PCR amplification product; Fβ was 440 bp, α1 was 670 bp, eCTP was 130 bp), and an SCF fragment was prepared.
In order to amplify the GtH subunit and CTP, P-1 and P-2 are used as primers for amplifying the Fβ chain, P-3 and P-4 are used as primers for amplifying CTP, and P- is used as a primer that amplifies the α1 chain. 5 and P-6 were designed and used for PCR reactions (Table 1 and FIG. 4). In this case, P-2 has a CTP DNA sequence on the 5 ′ side, P-3 has an Fβ chain DNA sequence on the 5 ′ side, P-4 has an α1 chain DNA sequence on the 5 ′ side, P-5 Was designed to include the CTP sequence on the 5 ′ side (FIG. 4).
[0029]
[Table 1]

[0030]
First, PCR was performed using P-1 and P-2, P-3 and P-4, P-5 and P-6, and Fβ chain, CTP, and α1 chain were amplified (FIG. 4: Reaction 1, Reaction 2, reaction 3). PCR is specific to each subunit of 1 μL of 10 × LA PCR buffer using pGEM T-Easy, pBluescriptII SK + (about 0.5 ng) or pUC119 in which cDNAs of GtHα1, Fβ, and CTP are incorporated, respectively. Primer, 400 μM dNTP solution, 2.5 mM MgCl ₂ , In a 10 μL reaction mixture containing 2.5 units of LA Taq polymerase. The PCR reaction cycle was carried out by repeating a series of reactions (thermal denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 30 seconds) 30 times.
[0031]
Next, DNA fragments Fβ and CTP were fused by PCR using P-1 and P-4 to prepare Fβ-CTP (570 bp) (FIG. 4: reaction 4). As PCR reaction conditions, 0.5 μL of the Fβ chain fragment obtained in Reaction 1 and 0.05 μL of CTP obtained in Reaction 2 were used as templates in the same reaction mixture containing LA Taq polymerase as described above. The PCR reaction cycle was carried out by repeating a series of reactions (thermal denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 40 seconds) 30 times. Further, the DNA fragment Fβ-CTP and α1 chain were fused by PCR using P-1 and P-6 to prepare single-chain Fβ-CTP-α1 (SCF; 1240 bp) (FIG. 4: reaction 5). As PCR reaction conditions, 0.5 μL of Fβ-CTP fragment and 0.5 μL of α1 fragment were used as templates in the above reaction mixture containing LA Taq polymerase. The PCR reaction cycle was performed by repeating a series of reactions (heat-denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealed at 65 ° C. for 30 seconds, and extended at 72 ° C. for 60 seconds) 30 times. The amplified product by PCR was digested with the restriction enzyme Sal I and used to construct the vector.
[0032]
In order to construct pB-SCL +, the cDNA sequences of goldfish GtH subunits (α chain subunit: α1, and β chain subunit: Lβ) and CTP were amplified by PCR (the obtained PCR amplification product; Lβ 440 bp, α1 was 670 bp, eCTP was 130 bp), and an SCL + fragment was prepared.
In order to amplify the GtH subunit and CTP, P-1 ′ and P-2 ′ were designed as primers for amplifying the LHβ chain, and P-3 ′ was designed as a primer for amplifying CTP (Table 1 and FIG. 4). At that time, P-2 ′ was designed to include the CTP DNA sequence on the 5 ′ side, and P-3 ′ to include the Lβ chain DNA sequence on the 5 ′ side (FIG. 4).
In addition, P-4 which is 3 'side primer of CTP, P-5 and P-6 which amplify the α1 chain were the same as those used in the preparation of SCF (Table 1). Using the above primers, a PCR reaction was carried out under the same conditions as in the preparation of SCF to construct a vector (FIG. 4).
[0033]
For the β-actin P / E sequence (about 3800 bp), PCR is first carried out using primers specific to the β-actin P / E sequence (Table 1) to amplify the target DNA fragment and simultaneously restrict both ends. A recognition sequence for the enzyme Eco RI (TaKaRa) was added. The PCR reaction was performed in 50 μL of a mixed solution containing 1 μL of 10 × Ex PCR buffer, 1 μM of each primer, 200 μM of each dNTP solution, and 1.25 units of Ex Taq polymerase (TaKaRa) using pOBA as a template.
The PCR reaction cycle was performed by repeating a series of reactions (thermal denaturation at 93 ° C for 45 seconds, annealing at 60 ° C for 60 seconds, and extension reaction at 72 ° C for 5 minutes) 30 times. The DNA fragment amplified by PCR was developed by electrophoresis, recovered and digested with Eco RI.
BGH polyA (280 bp) was cleaved from the Rc / RSV vector (Invitrogen) with restriction enzyme Xho I (TaKaRa) and used for vector construction.
[0034]
Each DNA sequence is a restriction enzyme cloning site of pBluescriptII SK + vector, that is, medaka β actin P / E gene sequence is Eco RI site, single-stranded GtH-cDNA (SCF or SCL +) sequence is Sal I site, and BGH polyA is Two types of expression constructs, pB-SCF and pB-SCL + were constructed by ligation reaction into the Xho I site (FIG. 5).
As for pB-SCL +, pB-SCL- from which the CTP sequence was removed from pB-SCL + was also constructed in order to confirm the effect of CTP. These expression constructs were dissolved in TE buffer for use in microinjection and adjusted to a concentration of 50 μg / mL.
[0035]
(Introduction of foreign genes by microinjection method)
For microinjection, eggs were collected from mature 3-year-old or 4-year-old rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) bred at the Oizumi Laboratory of Tokyo Fisheries University, and sperm was extracted using sperm extracted from a 1-year-old rainbow trout male. did. Then, what was cultured at 10 degreeC in 1 mM reduced glutathione solution (pH 8.0) was used (Nippon Suisan Gakkaishi 55, 369, 1989). Microinjection was performed using a micromanipulator (manufactured by Narishige Chemical Co., Ltd.) for 1 to 4 hours after fertilization. A rainbow trout fertilized egg isotonic solution (NaCl 9.04 g, KCl 0.24 g, CaCl ₂ ・ 2H ₂ O 0.34 g / L) was fixed with a fine needle, and 2 nL of DNA solution was injected into the scutellum of a fertilized egg by a micropipette (Nippon Suisan Gakkaishi 57, 819-824, 1991). These operations were performed with the room temperature maintained at 10 ° C., which is the temperature of rainbow trout breeding water.
[0036]
(Western blot analysis using transgenic rainbow trout early embryo)
All proteins were extracted from rainbow trout embryos (pB-SCL + introduced rainbow trout early embryos) and goldfish pituitary glands after 4 days after introduction of pB-SCL + and analyzed by Western blotting. PB-SCL + -introduced rainbow trout early embryo scutellum is removed, 10 embryos are pooled, and 3 samples are prepared as sample buffer (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 5% β− The protein was extracted by homogenization in mercaptoethanol (10% glycerol). On the other hand, the pituitary gland was excised from one goldfish female (BW 81.5 g, GSI 11.7%), and protein extraction was performed in the same manner as in the above rainbow trout early embryo.
[0037]
Among the proteins extracted from pB-SCL + introduced rainbow trout early embryo and goldfish pituitary gland, each one and one hundredth was heat-treated at 97 ° C for 5 minutes, and then a gel with an acrylamide concentration of 15% was used. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed.
After developing the protein with a difference in molecular weight by SDS-PAGE, the protein in the acrylamide gel was transferred to Hybond ECL nitrocellulose membrane (manufactured by Pharmacia) using a mini-buffer transfer device (manufactured by BIOCRAFT). The membrane filter was incubated for 1.5 hours at room temperature with anti-goldfish synthetic α1 peptide antibody or anti-goldfish LHβ chain antibody produced by Kobayashi et al.
[0038]
Thereafter, the membrane filter was washed with PBS-T (80 mM Na ₂ HPO _Four 20 mM NaH ₂ PO _Four , 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20), and incubated with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Pharmacia) for 1 hour at room temperature. The binding of this antibody was detected by ECL Western blotting detecting reagents (Pharmacia). Detected). Transfer of the protein from the gel to the membrane, incubation with the membrane antibody, washing with PBS-T, and protein detection were performed according to the protocol attached to ECL Western Blotting detecting reagents.
In addition, for pB-SCF-introduced rainbow trout early embryos, proteins were extracted in the same manner as the pB-SCL + introduced rainbow trout early embryos, and analyzed by Western blotting.
[0039]
(Bioassay using goldfish gonads)
Twenty-five scutellums separated from pB-SCF-introduced rainbow trout early embryos were collected and homogenized in culture medium as samples, and two samples each were prepared. Thereafter, ovaries were removed from two goldfish females (average BW 24.6 g, average GSI 0.74%). The extracted ovary was cut into small pieces in the culture medium, and about 30 mg per division was used. As a culture medium, streptomycin 100 mg / l, penicillin 60 mg / l, HEPES 2.5 g / l and Leibovitz's L-15 Medium (L-15 medium; manufactured by GIBCO) adjusted to pH 7.6 with 2N NaOH 0. A 5 ml homogenate of 25 early rainbow trout embryos was used.
[0040]
As experimental groups, rainbow trout early embryos were not added to the medium, “medium only” in which testis was cultured only in L-15 medium, “wild type” in which rainbow trout embryos were not introduced with genes, pB-SCF-introduced rainbow trout Four sections of “hCG” to which “SCF” with embryos and rainbow trout early embryos were not added, and hCG (manufactured by Sankyo Co., Ltd.) 5IU were added, were each performed in duplicate experiments. Goldfish ovary pieces were cultured at 20 ° C. for 20 hours. After culturing the ovary pieces, 0.5 ml of L-15 medium was collected, and the amount of estradiol (E2) was measured. E2 is a hormone secreted from follicular granulosa cells, and is a female steroid hormone that is synthesized from testosterone in the body and promotes egg formation. Therefore, in this study, the follicular function is accurately grasped by measuring the amount of E2. That is, it was determined whether or not the recombinant protein produced in the early rainbow trout embryo had activity as GtH in vitro.
[0041]
The amount of E2 was measured using a radioimmunoassay (hereinafter referred to as “RIA method”) by Aida et al. (Jpn. Soc. Sci. Fish. 50, 565-571, 1984). First, steroid hormone extraction was performed 3 times from 400 μL of the collected medium with diethyl ether, and the diethyl ether fraction was dried in a constant temperature bath at 40 ° C. 200 μl of 0.1% Gel-PBS solution (Gelatin-10 mM PBS (pH 7.5), 140 mM NaCl) was added thereto and stirred to re-dissolve the steroid hormone. next[ ^Three H] 100 μl (about 10,000 cpm) of testosterone (Amersham Biosciences) and 200 μl of anti-estradiol antibody (COSMO BIO) were added and left at 4 ° C. for 12 hours to allow the antigen-antibody reaction to proceed.
[0042]
Subsequently, 250 μl of dextran charcoal solution (dextran (Sigma) 5 g / l PBS, charcoal (Norit “Plus”) 0.5 g / l PBS) was added, and then cooled and centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The steroid hormone (bound) bound to the antibody and the steroid hormone (free) not bound were separated. Further, 3 mL of scintillator (Omniflow; manufactured by Packard) was added to the supernatant containing only bound, and the mixture was left for 12 hours after stirring. Finally, radioactivity was measured for 5 minutes using a liquid scintillation analyzer 1600TR (manufactured by Packard). The amount of E2 secreted into the L-15 medium was converted into the amount per 1 mg of goldfish ovary from the standard curve obtained from the measured value and the standard of known concentration (60-3840 pg / mL).
[0043]
Twenty-five scutellums separated from pB-SCL + -introduced rainbow trout early embryos were collected and homogenized in culture medium as samples, and two samples each were prepared. Then, the testis was extracted from two goldfish males (average BW 16.0 g, average GSI 1.1%), and the extracted testis was cut into small pieces in the culture medium, and about 30 mg per group was used. The culture medium used was the same as that used in the study using pB-SCF-introduced rainbow trout early embryos. The experimental group was obtained by adding pB-SCL + introduced rainbow trout embryos to “SCL +”, and the other three sections were provided in the same manner as in the study using pB-SCF-introduced rainbow trout early embryos, and two experiments were performed. Goldfish testis pieces were cultured in the same manner as goldfish ovary pieces.
[0044]
After culturing testis pieces, 0.5 mL of L-15 medium was collected, and the amount of testosterone (T) was measured. T is a precursor hormone of 11-ketotestosterone, a male steroid hormone that promotes spermatogenesis, and is known to be produced in large amounts in the testis by the action of GtH (Nagahama 1991 Reproductive: Control mechanism of gametogenesis) ”“ Fish physiology ”Ikuo Itazawa, Isao Hanyu, pp. 243-286, Hoshiseisha Koseikaku, Tokyo, p.20). Therefore, in this study, the amount of T was measured to determine whether the recombinant protein produced in the early rainbow trout embryo had activity as GtH in vitro.
As the measurement method, the RIA method, which is the same method as in the case of using pB-SCF-introduced rainbow trout early embryos, was employed. After the measurement, the amount of T secreted into the L-15 medium was converted into the amount per 1 mg of goldfish testis from the standard curve obtained from the measured value and the standard of known concentration (60-3840 pg / ml).
[0045]
(Bioassay using goldfish individuals)
pB-SCL + and pB-SCL-introduced rainbow trout embryos without CTP were added to freshwater Ringer's solution (0.75% NaCl, 0.02% CaCl ₂ , 0.2% KCl), and an amount equivalent to 20 scutellum per gram body weight was injected intraperitoneally into male goldfish (average body weight 5.0 g). After injection, the goldfish was stored in a circulating water tank (60 L) having a water temperature of 20 ° C. About 50 μL of blood was collected from the tail at 6 hours, 12 hours and 24 hours after the injection. The collected blood was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the amount of testosterone in the blood was measured using the supernatant. The RIA method described above was used to measure the amount of testosterone. These measurements were performed using three goldfish.
[0046]
[Experimental result]
(Expression of goldfish single chain LH in rainbow trout early embryo)
A sample extracted from a goldfish single chain GtH gene expression construct / pB-SCL + early embryo, a protein that reacts with an anti goldfish synthetic α1 chain or an anti-recombinant Lβ chain antibody was detected by Western blotting. As a result, a protein having a molecular weight of about 36 kDa that showed the same antigenicity as the α1 chain and Lβ chain of goldfish pituitary was detected. This molecular weight was consistent with the expected molecular weight when a sugar chain was added to the protein produced from this expression construct, indicating that goldfish single-chain LH was produced in the rainbow trout early embryo (FIG. 6). .
[0047]
(Bioactivity of recombinant protein produced in transgenic rainbow trout early embryo)
Goldfish ovary was cultured in a culture solution to which pB-SCF-introduced rainbow trout early embryo homogenate was added, and the amount of E2 produced by the goldfish ovary in the culture solution was measured by the RIA method. As a result, an increase in E2 amount was observed in the “hCG” group and the “SCF” group (FIG. 7). In addition, the average value of the amount of estradiol in the “SCF” group was 1.4 pg / mg ovary pieces, which was about 4 times that of the “culture only” group and the “wild type” group.
Goldfish testis were cultured in a culture solution to which pB-SCL + introduced rainbow trout early embryo homogenate was added, and the amount of T produced by the goldfish testis in the culture solution was measured by the RIA method. As a result, an increase in the T amount was observed in the “hCG” group and the “SCL +” group (FIG. 8). Moreover, the average value of the testosterone amount in the “SCL +” group was 4.6 pg / mg testis piece, which was about five times that of the “culture only” group and the “wild type” group.
[0048]
(Bioactivity of recombinant protein produced in goldfish)
The goldfish individuals were injected with pB-SCL + and pB-SCL-introduced rainbow trout early embryo homogenate, and the results of blood T levels in each section 12 hours after injection are shown in FIG. Although the “SCL +” group and the “SCL−” group both significantly increased the blood T level, the “SCL +” group had a blood T level about three times that of the “SCL−” group.
[0049]
(Change over time of recombinant protein produced in goldfish)
FIG. 10 shows the change over time in the amount of testosterone in the blood after injection when the goldfish individuals were injected with pB-SCL + and pB-SCL-introduced rainbow trout early embryo homogenate.
At 6 hours after injection, both groups showed similar blood testosterone levels. At 12 hours after injection, a decrease in the blood testosterone level was observed in both groups, but the decrease was about three times greater in the “SCL−” group than in the “SCL +” group. Furthermore, the difference in the amount of decrease similar to that at 12 hours after the injection was remarkably observed at 24 hours after the injection. From this, it is considered that pB-SCL + exerted stable efficacy for a long time in goldfish individuals.
[0050]
[Evaluation]
In the present invention, the CTP derived from the LH / CG β chain cloned by Min et al. (J Reprod Dev 40, 301-305, 1994) between the α chain and the β chain during the production of the single-stranded GtH-cDNA. The sequence was inserted. Galet et al. (J Endocrinol 167, 117-124, 2000) have shown that the in vitro biological activity of recombinant LH / CG remains unchanged with or without the CTP sequence of the LH / CGβ chain. Studies using CTP sequences suggest that CTP sequences have a role in extending the half-life of GtH molecules in vivo (Proc Natl Acad Sci USA 89, 4304-4308, 1992). This is because LH, FSH and CG are due to sugar chains to which about 30% of the molecular weight is added. Therefore, when these hormones are compared, the carboxy terminus of CG has a long life span in vivo. It is presumed to be due to the sugar chain specifically bound to the polypeptide (CTP).
[0051]
Therefore, when fish is ripened using LH or FSH to which such a CTP sequence is added (addition type), the addition type LH and the addition type FSH administered into the parent fish body are these gonadotropins (GtH). Will remain in the body for a long time, and its ripening efficiency will increase. From the above, it is shown that the CTP sequence derived from eLH / CGβ chain contained in the single-chain LH produced by the expression system according to the present invention also has a half-life extending effect on the recombinant GtH molecule.
[0052]
【The invention's effect】
According to the present invention, in vivo stabilization of an in vivo polypeptide such as a hormone using a polypeptide consisting of the carboxy terminal region of placental gonadotropin, a variant thereof, or a gene encoding the polypeptide. Thus, it is possible to stabilize the polypeptide drug administered to the living body widely in the living body, and to greatly increase the effect. In particular, the polypeptide that imparts the in vivo stabilization function of the present invention and the DNA encoding the polypeptide are applied to the in vivo introduction of peptides such as gonadotropin and growth hormone in fish. It is possible to effectively control maturation such as spawning and spawning regulation of fish, or growth control of fish. Technology efficiency and certainty can be brought about. Therefore, the technology of the present invention provides a great advancement in the technology in this field as a practical technology.
[0053]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the structures of single-stranded SCF-cDNA and SCL + -cDNA in an example of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing an expression construct containing a single-stranded SCF-cDNA in an example of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing an expression construct containing a single-stranded SCL + -cDNA in an example of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing the production of single-stranded SCF-cDNA and SCL + -cDNA in an example of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing the structure of an expression construct containing single-stranded SCF-cDNA and SCL + -cDNA in an example of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing Western blot analysis using pB-SCL + -introduced rainbow trout early embryos in Examples of the present invention.
FIG. 7 is a diagram showing the biological activity of SCF in the examples of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing the biological activity of SCL + in the examples of the present invention.
FIG. 9 shows in vivo biological activity of SCL− and SCL + in the examples of the present invention.
FIG. 10 is a graph showing changes over time in blood T levels of SCL + and SCL− in the examples of the present invention.

Claims

魚類の生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類の生体内に導入し、生体内で発現することを特徴とする魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法。 A gene in which a DNA comprising a carboxy-terminal region of placental gonadotropin comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is linked to the 3 'end of DNA encoding a fish in vivo polypeptide , A method for stabilizing and introducing an in vivo polypeptide into fish, which is introduced into the body and expressed in the body.

魚類の生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項１記載の魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法。 The method for stabilizing and introducing an in vivo polypeptide into fish according to claim 1, wherein the in vivo polypeptide of the fish is gonadotropin or growth hormone.

請求項１又は２記載の魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法を用いて、生体内安定化性腺刺激ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成熟調節方法。 3. A method for regulating fish maturation, comprising introducing in vivo stabilized gonadotropin into fish using the method for stabilizing in vivo polypeptide introduction into fish according to claim 1 or 2 .

魚類の成熟調節が、魚類の産卵誘発或いは産卵調節であることを特徴とする請求項３記載の魚類の成熟調節方法。4. The method for regulating maturity of fish according to claim 3 , wherein the maturation regulation of fish is spawning induction or regulation of spawning of fish.

請求項１又は２記載の魚類への生体内ポリペプチドの安定化導入方法を用いて、生体内安定化成長ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成長調節方法。 A method for regulating the growth of fish, comprising introducing the in vivo stabilized growth hormone into fish using the method for stabilizing and introducing an in vivo polypeptide into fish according to claim 1 or 2 .