【発明の詳細な説明】
トランスジェニック魚による組換えペプチドの製造発明の分野
本発明は、医薬的あるいは生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸配列
、典型的には異種配列の魚における発現に関する。これにより組換えポリペプチ
ドが生成され、これはその後その魚あるいはその卵から回収できる。発明の背景
異種組換えタンパク質の発現のためにはいくつかの系が存在する。そのような
ものとしては、微生物系、例えば酵母を呼び大腸菌、及び二種の動物系、すなわ
ち組織培養及び完全な動物系がある。
微生物系は、異種タンパク質を正確にグリコシル化しあるいは折り畳むことが
できないことが多いという欠点を有する。多くの場合、これはタンパク質が生物
学的に不活性であることを意味し、特に真核生物タンパク質が大腸菌のようなグ
リコシル化が起こらない前核生物系中に置いて生産されるときにそうである。
典型的には哺乳動物細胞培養物である細胞培養物は、折り畳み及びグリコシル
化を行うことができるので、代替手段となる。しかし、細胞培養物は比較的単純
な実験方法を使用し再現可能な結果を迅速に与えるものの、非常に高価である。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞により製造された組換えVIII因子を使用
すると、血友病患者を治療するために年£80,000程度のコストがかかる。
別の代替手段は完全な動物の系にin vivoでクローン化配列を導入することで
あり、これは導入された配列が細胞特異的シグナルの完全な範囲に露出されるこ
とから遺伝子構築物の正確な発現の可能性が最大のものとなる。例えば、細胞培
養物を使用するよりも安価な異種タンパク質を製造する方法としてはトランスジ
ェニックウシあるいはヒツジのミルク中にそのようなタンパク質を製造すること
である。しかし重大な問題が残る。ミルク中に溶解酵素が含まれ、異種タンパク
質が分解に対して非常に高い抵抗性を有していないとそれらを加水分解してしま
う。さらに、ウシ及びヒツジのような哺乳類大動物は飼育に世話がかかる。また
、ある種の疾患は非ヒト哺乳動物及びヒトに共通するので、哺乳動物内で生産さ
れ
た組換え生成物が病原性ウイルス及び／またはプリオンをヒト患者に伝染させる
という危険がある。
最近、異種タンパク質を発現するのに魚が使用されており、何人かの研究者が
Ｆ１世代において導入遺伝子を発現する安定なトランスジェニック魚系を製造し
ている。これらには特に成長ホルモン及び抗凍結タンパク質をコードする遺伝子
、並びに細菌レポーター遺伝子、例えばCAT及びLacZを発現する系が含まれる。
魚は組換えタンパク質発現についていくつかの利点を有しており、（i）それ
らは大量に生産するのに安価であること、（ii）多数のトランスジェニック魚の
製造のための技術が利用できること、（iii）人と魚の両方に感染するウイルス
あるいはプリオンは知られていないので疾患の伝染の可能性は非常に低いこと等
がある。発明の概要
本発明者らは、CMVプロモーターの制御下にヒトVII因子タンパク質をコードす
るＤＮＡを含む構築物を使用して、トランスジェニックゼブラフィッシュ(zebra
fish)胚に一時的にVII因子を発現することが可能であることを見いだした。さら
にこれらの胚中において製造された組換えVII因子タンパク質は生物学的に活性
である。すなわち、トランスジェニック魚を使用して生物学的に活性な医薬ポリ
ペプチドを、特にその胚組織中において製造できることが示されたものである。
また本発明者らは、コイミオシン重鎖(MyoHC)遺伝子ファミリーの新規なメン
バー、FG2ミオシン重鎖遺伝子(Gauvryら、(1996)Eur.J.Bichem.,Vol 236;887-89
4、引用により本明細書の一部とする)について遺伝子のを5'領域を特性化した。
5'領域の配列決定により、プロモーター領域に典型的なTATA及びCCAAATボックス
の存在が明らかにされた。これらのモチーフは転写開始部位の上流30bp及び74bp
にそれぞれ位置する。この配列においては、転写開始部位に対して位置-896及び
-629の間のいくつかのEボックス(CANNTG)モチーフが明らかにされている。さら
に推定のMEF2結合部位(GCTATATTTA)が位置-860に位置している。この上流プロモ
ーター領域がレポーター遺伝子に結合されると、コイ(Cyprinus carpio)の胚の
骨格筋並びに成熟魚の筋肉中において組織特異的発現が誘導されることが見いだ
された。
従って本発明は、魚においてポリペプチドを発現するための発現構築物を提供
するものであり、該構築物はポリペプチドコードする核酸コード配列を含み、該
核酸コード配列は前記魚の細胞中において前記コード配列の発現を起こすことが
できる調節配列に機能可能なように結合されている。
好ましくは、前記調節配列は、例えば魚卵の細胞、胚組織の細胞、胚外組織の
細胞、例えば魚卵の卵黄シンシチウム層(YSL)及び／または被覆層(EVL)おいてコ
ード配列の発現を起こすことができるものである。別の態様においては前記調節
配列は骨格筋の細胞においてコード配列の発現を起こすことができるものである
。
好ましくは、前記ポリペプチドは生物活性を有する医薬製品である。これらは
ヒトVII因子、ヒトVIII因子、ヒトIX因子、カルシトニン、インターロイキン、
インターフェロン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子、α-ガラクトシダーゼ、
アデノシンデアミナーゼ、あるいはこれらのタンパク質の機能的活性部位とする
ことができる。
本発明はまた、本発明の発現構築物を含む核酸ベクターを提供する。
本発明はさらに、トランスジェニック魚、受精体、卵または胚を製造する方法
を提供し、該方法は、本発明の発現構築物を魚、受精体、卵または胚の細胞中に
エピソームにおいて導入することを含む。別の態様においては、本発明の方法は
、本発明の構築物を魚、受精体、卵または胚のゲノム中に染色体において導入す
ることを含む。
魚の種としては、分類Cyprinidae、Cichlidae、Salmonidae、Claridae、Silum
idaeあるいはIctaluridaeのものが含まれ、ゼブラフィッシュ(Danino rerio)、
アフリカナマズ(Clarias gariepinus)、ニジマス(Orcorhynchus mykiss)、コイ(
Cyprinus carpio)、テラピア(Oreochromis niloticus)が含まれる
本発明はまた、組換えポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法は、本発
明の構築物のコード配列によりコードされるポリペプチドを魚、魚卵または胚に
おいて発現させ、ポリペプチドを回収することを含む。
好ましくは、発現構築物はマイクロインジェクションにより導入される。ある
いは、エレクトロポレーションまたはリポフェクションにより導入してもよい。
好ましくは、前記調節配列は普遍的なあるいは組織特異的な発現を与えるプロ
モーターを含み、そのような調節配列、イントロン、エンハンサー、ポリAエレ
メ
ント、及び魚卵、胚あるいは成体の組織の一部あるいは全部における発現を最大
にするのに必要とされるその他の核酸配列を含む。発現構築物で使用される調節
配列、特にプロモーターは、ウイルスあるいは動物起源のものであり、魚細胞中
での発現を起こすことができるものである。
コード配列の発現は、一時的なものであってもよく、この場合は卵あるいは胚
から回収を行い、また安定なものであってもよく、この場合は胚、幼体、あるい
は成熟魚から回収を行う。
ポリペプチドの発現は、本発明の発現構築物を成体魚の体組織、好ましくは筋
肉組織/細胞に直接導入することにより得られる。また遺伝子構築物は、生殖細
胞のような生殖系組織/細胞に導入して子孫魚へ伝達させることができる。
また、トランスジェニックとされ、安定に染色体上に一体化された形態で1以
上の導入遺伝子コピーを発現する魚を交配に使用し、卵、胚、及び発現細胞及び
魚の別の世代が生成できるようにすることもできる。発明の詳細な説明
医薬的あるいは生物学的特性を有するタンパク質、典型的には異種タンパク質
を魚中で発現することができる。この技術により、適切にグリコシル化され折り
畳まれたタンパク質を製造でき、これにより微生物発現系の欠点が回避される一
方、異なる理由によるものであるものの、いずれも労力を要する方法を必要とす
る哺乳動物細胞培養あるいは哺乳類大動物宿主の使用よりも相対的に安価である
。
特に以下の２種の方法が可能である。
(i)魚筋肉あるいはその他の組織中で発現を起こすことができる調節配列を使用
して、該調節配列及び対象となるポリペプチドのコード配列を導入した核酸構築
物を、魚にその発生中の適当な段階において導入することができる。そして魚を
捕獲することにより筋肉及び／またはその他の組織からタンパク質を回収するこ
とができる。この方法には、筋肉特異的プロモーター、特にミオシン重鎖(MyoHC
)プロモーターが好ましい。
(ii)対象のポリペプチドを、受精していてもよくしていなくてもよい魚卵、ある
いは発生中の受精体あるいは胚中で発現させ、それから回収することができる。
例えば、その卵中で適当な調節配列の制御下に対象のポリペプチドを発現する性
的に成熟したトランスジェニック魚を製造できる。その後これらの卵を取り出し
、タンパク質を抽出することができる。この系は、成熟したトランスジェニック
魚を殺して組換えポリペプチドを得る必要がないという利点を有する。この方法
のためには、魚卵あるいは発生中の受精体もしくは胚において発現を起こすこと
ができる調節配列が必要である。
本発明のポリペプチドは、魚の細胞中でコード配列の発現を起こすことができ
る調節配列に機能可能なように結合したポリペプチドをコードする核酸コード配
列を含む本発明の発現構築物を使用してそれらをコードするＤＮＡを発現させる
ことにより製造できる。
核酸コード配列は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれでもよいが、好ましくはＤ
ＮＡであり、典型的にはゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡである。任意の適当な長
さのポリペプチドをコードするものとし得る。
任意の適当なポリペプチドを、それをコードする核酸、すなわちＤＮＡあるい
はＲＮＡを発現させることにより、本発明に従って製造できる。典型的には、そ
のようなポリペプチドは魚系に対しては異種であり、すなわちそれは魚が自然に
は生成しないポリペプチドである。ただし、同種ポリペプチドであってもよい。
典型的には、このように製造されるポリペプチドは医薬及び／または生物特性
を有するものである。好ましくは、本発明のポリペプチドは、哺乳動物、より好
ましくはヒトにおいて使用される医薬に適したものである。例えば、ヒトあるい
は動物の患者の疾患あるいはその他の病理的状態を治療し、予防し、あるいは緩
和するのに有用であり得る。
このようにして製造される好ましいポリペプチドは、血液凝固因子、例えばVI
I因子、VIII因子及びIX因子、カルシトニン、インターロイキン、インターフェ
ロン、例えばα、β及びγ-インターフェロン、α-ガラクトシダーゼ、腫瘍壊死
因子(TNF)、及びアデノシンデアミナーゼ等である。
好ましくは、そのようなポリペプチドはその完全な(ネイティブな)形態で製造
され、但し本発明の核酸配列はこれらのポリペプチドの機能的に活性な部分、例
えば完全なポリペプチドの活性あるいは活性の一部を有するそのようなポリペプ
チドの一部をコードするものであってもよい。同様に、本発明の核酸配列は、誘
導体、例えばネイティブなポリペプチドの変異体をコードするものであってもよ
い。例えば、ネイティブなものとは1以上のアミノ酸において異なるポリペプチ
ドをコードするものであってもよい。あるいは、前記核酸配列はネイティブな配
列とは異なるが、同じアミノ酸配列をコードするものであってもよい。すなわち
、前記核酸配列はネイティブな配列の縮退物であることができる。この点、ＤＮ
Ａ配列は、魚細胞において特定のアミノ酸を発現するのに好ましいコドンを含む
ように、すなわち、魚において発現される効率が低いコドンをより高い効率で発
現されるものに置き換えるように変化させることができる。
本発明の構築物においては、本発明の調節配列は魚の細胞中においてその発現
を起こすことができる調節配列に機能可能なように結合されている。「機能可能
なように結合される」とは、調節配列及び本発明活性のポリペプチドをコードす
る核酸配列が、プロモーターの制御下にコード配列が発現され得るような関係に
ある隣接関係(Juxtaposition)をいう。すなわち、5'非コード配列のようなエレ
メントが、調節配列によるコード配列の発現の正確な制御を増強する限り、ある
いは損ねない限り、調節配列とコード配列との間に存在してもよい。
調節配列は少なくともプロモーター配列を含む。さらに、調節配列は以下のも
の、すなわちプロモーターのレギュレーター、プロモーターのエンハンサー、及
び／または翻訳開始部位の一部あるいは全部のようなその他のエレメントを含み
得る。発現構築物は転写ターミネーター3'から本発明のポリペプチドをコードす
る配列を含み得る。また、発現構築物は1以上のイントロンあるいはその他の非
コード配列、例えば3'あるいは5'から本発明のポリペプチドをコードする配列を
含み得る。そのような配列は、それらがプロモーターによるコード配列の正確な
制御を増強し、あるいは損ねない場合には構築物中に含まれていてもよい。また
構築物は、3'から核酸コード配列に機能可能なように結合したポリアデニル化(
ポリA)シグナル、例えばSV40ポリAシグナルあるいはチヌークサーモンポリAシグ
ナルを含んでいてもよい。また本発明の構築物は任意に1以上の遺伝子座調節領
域(LCR)を含んでもよい。これらはある種の魚遺伝子のエンハンサーとして働き
、導入遺伝子発現を改善し得る(Aronrowら、(1995)Mol．Cell．Biol．Vol 15;11
23-1135)。
本発明の構築物はベクター中に含まれていてもよく、適当なベクターは複製可
能なベクター、例えば複製可能な発現ベクターである。
本発明の発現構築物に加え、本発明のベクターは通常は複製起点を含み、ベク
ターは細菌宿主細胞あるいは酵母宿主細胞のような宿主細胞中で複製することが
できる。またベクターは上記したようなコード配列の発現の制御に関与する別の
エレメントを含み得る。
またベクターは、細菌形質転換体の同定のために、1以上の選択可能なマーカ
ー遺伝子、典型的には抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子、あ
るいは酵母形質転換体の選択を可能とするためのマーカー遺伝子を含む。またベ
クターは任意に、プロモーターのエンハンサーを含むことができる。発現ベクタ
ーは任意の種類のものとすることができる。ベクターは直線形態のものであって
もよく、環状形態のものであってもよい。例えば、構築物をプラスミドベクター
あるいはウイルスベクターに導入することができる。当業者であれば、広範な種
類の利用可能なベクターから、例えばSambrookら(Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual;1989，Cold Spring Harbor Press，NY，USA)により記載されたよう
な遺伝子工学技術による改変により、本発明の適当なベクター及び構築物を調製
することができるであろう。
魚の細胞中で発現を起こすことができる調節配列である限り、任意の適当な調
節配列を本発明の構築物に使用できる。
本発明の発現構築物中の調節配列は、魚の組織の一部あるいは全部の組織中の
細胞において発現を起こすことができるものとすることができる。例えば、完全
に、あるいは主として１以上の特定の組織において発現を起こし得るものとする
ことができる。すなわち、組織特異的なものであることができる。例えば、完全
に、あるいは主として特定の魚組織において発現を起こすことができるものとす
ることができる。魚卵あるいは骨格筋の組織に特異的な調節配列が好ましい。
調節配列が、例えば魚卵の胚あるいは胚外組織の細胞のような魚卵の細胞中で
の発現を起こすものであることが好ましい。例えば、プロモーターは、卵の卵黄
シンシチウム層(YSL)または被覆層(EVL)の細胞のような胚外組織の細胞において
直接の発現を起こし得るものである。
また、魚の筋肉、典型的には骨格筋の細胞においてコード配列の発現を起こす
ことができるプロモーターを使用することも好ましい。
本発明の構築物中の調節配列は構成的なものであってもよく、あるいは誘導可
能なものであってもよい。
具体的には、好ましい調節配列の一つの種類は、ミオシン重鎖遺伝子プロモー
ターである。特に、Gauvryら、(1996)、上出、により記載されたコイFG2ミオシ
ン重鎖プロモーターが好ましい。これは骨格筋の細胞中での発現を起こすもので
あるという意味において筋肉特異的プロモーターである。予想されなかったこと
に、これはYSL及びEVL中での発現も起こす。FG2 MyoHCプロモーターの特に好ま
しい領域は、転写開始部位から901bp上流までのものである。組織特異的調節配
列のこの種類のものは、発現構築物が魚ゲノム、特に生殖系細胞のゲノムに長期
にわたって安定に導入される場合に特に好ましい。より一般的には、一時的な発
現ではなく、魚細胞ゲノム中の発現構築物の長期の発現及び／または安定な組み
込みが必要とされる場合には、魚由来の組織特異的調節配列が好ましい。また、
誘導可能なプロモーターであって、ポリペプチドの発現が所望の時点での適当な
刺激により誘導することができるものを使用することも好ましい。これにより異
種ポリペプチドの連続的な発現に伴う副作用を回避することができる。
その他の好ましい調節配列としては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ
ー(例えばCMV 1E1プロモーター)、フレンドネズミ白血病ウイルスの長い末端反
復配列プロモーター(MuLV-LTR)、任意にラウスサルコーマウイルス(RSV)エンハ
ンサーと組合せたチミジンキナーゼ(TK)プロモーター、マウスメタロチオネイン
I(mMTH1)プロモーター、任意にef1αエンハンサーと組合せたツメガエル延長因
子1α(ef1α）プロモーター、コイβ-アクチンプロモーター、マウスHox 1.3プ
ロモーター、ラットGAP 43遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ウサギ
β-心臓ミオシン重鎖プロモーター、及びヒトMxAプロモーター等が挙げられる。
一時的な発現に特に好ましいものは、あらゆる種類の細胞種において高いレベル
の発現を可能とする普遍的及び／または構成的な調節配列である。ウイルス調節
配列、例えばCMV及びRSV配列は特に好ましい。
任意に、プロモーターに加えてエンハンサーを使用することができる。エンハ
ンサーはプロモーターに適合するように選択される。適当なエンハンサーとして
は、ラット胎児軽鎖エンハンサー、ef1αエンハンサー及びRSVエンハンサーが挙
げられる。
本発明によれば、対象のポリペプチドを生産するために任意の種類の魚を使用
することができる。硬骨魚類が好ましい。硬骨魚類中で好ましい分類としては、
Cyprinidae、Cichlidae、Salmonidae、Claridae、Siluridae及びIctaluridaeが
挙げられる。特に好ましい魚の種類としては、コイ(例えばCyprinus carpio)、
ゼブラフィッシュ(Danino rerio)、アフリカナマズ(Clarias gariepinus)、テラ
ピア(Oreochronis niloticus)、タイセイヨウサケ(Salmo Salar)、ニジマス(Onc
orhyncus mykiss)、メダカ(Oryzias latipes)である。一般的には、魚卵、ある
いは発生中の受精体もしくは胚からポリペプチドを回収するのが望まれる場合に
は、本発明に従って使用するのに好ましい魚は大きい卵及び／または多数の卵を
生成するものである。また、増殖及び／またはトランスジェニック技術が十分に
開発された魚を使用することが好ましい。
本発明はまた、本発明のベクターまたは構築物を有する細胞を提供する。これ
らの細胞は任意の種類のものとすることができる。例えば、微生物細胞とするこ
とができる。すなわち、例えば細菌、例えば大腸菌、あるいは酵母細胞とするこ
とができる。
好ましい本発明の細胞は魚細胞である。魚の任意の種類の細胞が本発明の範囲
内に包含され、本明細書に挙げた分類の魚の細胞が好ましい。同様に、細胞は任
意の種類の魚組織の細胞とすることができるが、本明細書であげた組織が好まし
い。魚卵の細胞、例えば胚組織の細胞、あるいは胚外組織、例えばYSL及びEVLの
細胞が特に好ましい。また、筋肉細胞、典型的には骨格筋細胞も好ましい。
本発明の魚細胞は任意の形態とすることができる。例えば培養物中に単離され
てもよく、あるいは、例えば成魚、魚受精体、胚、卵のような魚体中のものとし
てもよい。従って本発明は、本発明の細胞を含むトランスジェニック魚を提供す
る。これらは発生の任意の段階にあるものとすることができる。従って、例えば
、本発明は成熟及び未成熟トランスジェニック魚並びにトランスジェニック魚受
精体、胚及び卵を提供する。そのような魚においては、細胞の一部あるいは全部
が
本発明の構築物あるいはベクターを有するものである。従って、前記魚は均一に
トランスジェニックであってもよく、あるいは部分的な細胞のみがトランスジェ
ニックであるトランスジェニック「モザイク」であってもよい。本発明の細胞は
、特定の種類の組織、例えば骨格筋、生殖細胞系、あるいは卵のような1種以上
の組織中に局在してもよい。
本発明のトランスジェニック魚はいずれの性でもよく、すなわち雄あるいは雌
いずれでもよい。
本発明の構築物及びベクターは、任意の適当な手段(例えばSambrookら、(1989
)、上出に記載されたような)を用いて細胞に導入し、本発明の細胞を製造するこ
とができる。例えば、細胞は当分野で公知の任意の手段を用いて形質転換あるい
はトランスフェクトすることができる。例えば本発明の構築物あるいはベクター
は感染性のウイルス粒子、例えばレトロウイルスのもの、粒子あるいはラムダウ
イルス粒子にパッケージすることができ、これはその後構築物あるいはベクター
を細胞中に移入するのに使用できる。また、それらはマイクロインジェクション
、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、バイオリスティック法(例
えばタングステンボンバードメント)により、あるいは裸の核酸ベクターもしく
は構築物を溶液中の細胞と接触させることにより導入することができる。任意に
、ＤＮＡの細胞中への移入を促進する物質を使用することができる。このような
ものとしてはリポソームがある。ＤＮＡあるいはＲＮＡを魚卵中に導入する際の
デリバリーの好ましい手段は、当業者に知られた方法を使用したマイクロインジ
ェクションである。マイクロインジェクションは卵の発生における任意の適当な
段階、例えば受精の前に行うことができ、あるいは一細胞、二細胞、四細胞、も
しくは八細胞期に行うことができる。核酸を魚卵あるいは魚***にデリバリーす
るための別の好ましい技術はエレクトロポレーションであり、これはTransgenic
Animals−Generation and Use（1997）pp 129-132，ed．L.M．Houdebin Harwoo
d Acedemic Publishersに詳細に記載されている。
細胞中に導入されたベクターあるいは構築物は任意の種類のものとすることが
できる。例えば、本発明の構築物を細胞ゲノム中に組み込んでいるもの、エピソ
ームに組み込んでいるもの、あるいは細胞中に遊離状態のままであるものとし得
る。
本発明は、本発明のトランスジェニック魚を製造する方法も提供する。任意の
適当な方法を使用し得る。原則として、本発明の方法は、上記のようにして本発
明の構築物あるいはベクターを細胞中に導入し、本発明の細胞を生成することを
含む。細胞が例えば魚、魚受精体、胚あるいは卵中のもののようなin vivoのも
のである場合、これにより本発明のトランスジェニック魚、受精体、胚あるいは
卵が得られる。適当な場合には、魚を生殖させ、本発明のトランスジェニック後
代魚を得ることができる。本発明の魚卵は適当に受精させ、成長させて本発明の
魚を得ることができ、その後これを生殖させてさらに本発明の後代魚を得ること
ができる。受精した本発明の魚卵、受精体、及び胚を成長させて本発明の魚を得
ることができ、その後これを生殖させてさらに本発明の後代魚を得ることができ
る。また、本発明の後代魚を生殖させてさらに本発明の魚を生成することもでき
る。
また、魚***を本発明の構築物により形質転換することができ、このトランス
ジェニック***を使用して魚卵、任意に本発明のトランスジェニック卵を受精さ
せることにより本発明のトランスジェニック魚を生成することができる。
典型的には、細胞あるいは魚(卵、受精体及び胚を含む)を適当な選択方法にか
け、形質転換細胞あるいは魚を非形質転換体から分離する。
また、本発明のベクターあるいは構築物を培養中の魚細胞に導入し、そして細
胞を魚、例えば成熟もしくは未成熟魚又は受精体、卵もしくは胚中に導入して本
発明の魚を生成することができる。これらは任意に適当に生殖させ、あるいは成
長させて本発明の魚を生成することができる。
好ましくは、本発明の方法においては、本発明の構築物あるいは構築物の一部
は、例えば一体化ベクターを使用して魚細胞ゲノム中の染色体に組込むことがで
きる。構築物の一部を組み込む場合には、好ましくはコード配列を含む部分、よ
り好ましくはコード配列、及び魚細胞中でその発現を起こすことができる隣接配
列(例えばプロモーター)を含む部分である。コード配列の1以上のコピーを各細
胞に組み込むことができる。
本発明のベクターあるいは構築物は、魚のライフサイクル中の任意の適当な段
階で魚細胞中に導入することができる。例えば、未受精の卵、あるいは受精した
受精体、あるいは発生中の胚、あるいは未成熟な魚もしくは成熟した魚に導入す
ることができる。このようにして得られた未受精卵を受精させて本発明の受精体
を得ることができ、そしてこれを成長させて胚を生成し、さらに本発明の魚を生
成することができる。雌の本発明の魚は本発明のトランスジェニック卵を生成す
ることができ、これは任意に本発明の雄の魚あるいはそのような魚から得た***
により受精させることができる。
本発明はまた、本発明の細胞中で本発明のコード配列によりコードされたポリ
ペプチドを発現させ、そのようにして生成されたポリペプチドを当分野で公知の
任意の手段により回収することにより本発明の組換えポリペプチドを生成する方
法を提供する。
本発明のポリペプチドは、in vitroで培養した本発明の細胞から生成し回収す
ることができる。しかし、本発明の生体魚の細胞、例えば本発明の成熟もしくは
未成熟の魚、又はそれらの受精体、卵もしくは胚においてin vivoで本発明のポ
リペプチドを製造することが好ましい。
ポリペプチドは、成熟魚、魚卵、胚及び受精体を集め、任意の適当な手段によ
りポリペプチドを回収することにより得られる。ポリペプチドは任意に、例えば
1以上の単離段階により単離し、あるいは実質的に単離することができる。ポリ
ペプチドは任意に、例えば1以上の精製段階により完全に、あるいは部分的に精
製することができる。
好ましい態様においては、本発明の成熟した雌のトランスジェニック魚を製造
し、卵を生成させ、その卵を任意に受精させることができる。卵を収集し、そし
てその卵から本発明のポリペプチドを回収する。この種類の方法においては、雌
の魚を過剰***させて生成される卵の数を増加させ、回収されるポリペプチドの
量を増加させることができる。そのような方法においては、任意に、適当なプロ
モーターにより発現を卵において特異的に得る。
別の好ましい態様においては、本発明の成熟したトランスジェニック魚を生成
し、その組織中においてポリペプチドを発現させる。好ましくは、発現は、例え
ばGauvryら、(1996)、上出、により記載さたコイFG2 MyoHCプロモーターのよう
な筋肉特異的プロモーターの制御下で骨格筋内で選択的に起こるものとする。
別の態様においては、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡあるいはＲＮ
Ａ配列を使用して、発生中の魚卵、受精体あるいは胚においてポリペプチドの一
時的な発現を得ることができる。ポリペプチドをコードするＲＮＡを魚卵に、任
意的には受精した卵に導入する。適当な場合には、卵を受精させ、発生中の任意
の段階に成長させ、これによりポリペプチドを発現させることができる。
発現されたポリペプチドは当分野において知られた任意の手段により回収する
。ポリペプチドは卵からその発生の任意の段階において回収することができる。
下記の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的
とするものであり、限定的なものではない。実施例においては図面を参照する。
参照する図面はより詳細には以下のとおりである。
図1は、FVIIｃＤＮＡを挿入するInvitrogenTM発現ベクターである。
図2は、FVIIｃＤＮＡをそこから単離した構築物である。
図3は、FVIIｃＤＮＡを図1の発現ベクターに挿入することにより形成した構築
物である。
図4は、組換えヒトVII因子を発現するナマズ胚を示すグラフである。実施例
魚胚中における組換えヒト血液凝固VII因子の製造
材料及び方法
プラスミド
ヒトVII因子をコードするＤＮＡはクローン化され、配列決定されている(O'Ha
raら、（1987）PNAS，Vol 84;5158-5162，Genebank受託番号J02933)。この実験
に用いた特定のヒトVII因子コード遺伝子ｃＤＮＡは、0.9kbラットミオシン重鎖
遺伝子由来筋肉特異的調節エレメントが隣接するFVII配列を含むプラスミド(pMy
HC/FVII)からHindIII/BamHIの二重消化により単離した(ラットミオシン重鎖プロ
モーター配列の例はGenbank受託番号U83321及びU55179として公表されている)。
2.46kb FVIIｃＤＮＡ及び0.12kb SV40ポリAシグナル配列を含む2.62kb FVIIｃＤ
ＮＡ断片を、pcDNAI発現ベクター(InvirtogenTM)のHindIII/BamHI部位に結合し
た。得られたプラスミドpCMV/FVII(図2)を、制限地図を作成することにより挿
入及び方向が適当かどうかチェックした。これはCMVウイルスE1初期プロモータ
ー及びエンハンサー5'からFVII配列を含む。プラスミドは慣用の分子技術(Sambr
ookら、(1989)、上出)を使用して製造し、受精魚卵中へのマイクロインジェクシ
ョンに使用した。
マイクロインジェクション及び胚培養
アフリカナマズの胚を、アフリカナマズ同腹魚の人工的増殖により製造した。
計画された***の8時間前に、PBS溶液中に溶解したコイ脳下垂体の3mg/kg体重を
雌に注射した。卵を雌から採取し、雄から切除された精巣から得た***を加える
ことにより受精させた。単一細胞胚(受精体)をマイクロインジェクションに使用
した。
ゼブラフィッシュ胚を、14時間の光照射及び10時間の暗黒のサイクルで28℃に
おいて維持した同腹魚の天然の卵から得た。そして卵を卵箱(Westfield，M(1993
)The zebrafish book:A guide for the laboratory use of zebrafish(Branchyd
anio rerio)，University of Oregon Press，Eugene，OR，USA)に入れ、初期発
生段階(1〜2細胞期)においてマイクロインジェクションのために箱から回収した
。
pCMV/FVII及びpMyHC/FVIIプラスミドの両者を、環状の形態で約106〜107コピ
ー、圧力駆動のピコインジェクターを使用してマイクロインジェクションにより
受精体段階のアフリカナマズあるいはゼブラフィッシュ胚に導入した。ナマズの
胚をペトリ皿に入れた。卵はその天然の粘着性によりペトリ皿に接着した。イン
ジェクションは、インジェクション滴の位置を示すために青色の食品染料を含む
適当なＤＮＡ溶液を充填したガラスマイクロキャピラリーを使用して手作業で行
った。ゼブラフィッシュ胚を、インジェクション用に卵を整列させて保持するよ
うに設計された寒天ゲルインジェクションモールドに置いた(Westerfieldら、19
93)。両方の種の場合についてインジェクションは細胞質領域、あるいは細胞質
領域と卵黄領域との境界をターゲットとした。マイクロインジェクションを受け
た胚を、プライム5段階(餌化の前)に達するまで、Holtfreter溶液中でサーモス
タットにおいて28℃で1日培養した。マイクロインジェクションを受けた胚及び
対照(インジェクションを受けていない)の胚をマイクロ遠心管中に回収し、プラ
スチックホモ
ジナイザーによりホモジナイズした。1〜100のホモジナイズされた胚(約20μｌ)
を含む管を液体窒素中で瞬間凍結させ、分析まで-70℃で保存した。
結果
魚胚ホモジネートからのFVIIタンパク質の免疫化学的検出
ヒトFVIIに対して生成したモノクローナル抗体(マウスモノクローナル抗体ク
ローンHVII-1，Slgma)で被覆した96ウェルプレート上でELISAアッセイを行った
。魚胚ホモジネート、FVIIタンパク質を含む正常血漿の希釈物、及び適当な陰性
対照サンプルをウェルにロードした。次いで西洋ワサビペルオキシダーゼを抱合
させたビオチン化抗-FVII TAG抗体を加えた。呈色反応バッファーを添加してイ
ンキュベートした後、慣用のELISAリーダーによりサンプルを読み取った。ゼブ
ラフィッシュ及びナマズ胚の結果をそれぞれ表I及び図4にそれぞれ示す。
活性アッセイ
魚胚において生成された組換えVII因子の酵素活性を発色体アッセイCoaset FV
II(Chromogenix,Sweden)により測定した。アッセイは2段階法に基づくものであ
る。段階1において、ヒトX因子を外部経路におけるCa2+及びFVIIの存在下でトロ
ンボプラスチンにより活性化する(FXa)。このプロセスの間にFVIIは完全にFVIIa
に変換され、従ってこのアッセイにおいては予備活性化されたFVII阻害は存在し
ない。段階2においては、生成したFXaが発色体基質S-2765を加水分解し、発色原
基pNAを放出する。呈色を405nmにおいて測光法により読み取る。生成されたFXa
は呈色の強度を増加させ、従って呈色はサンプル中のFVII活性に比例する。アッ
セイは、アッセイ中の非特異的タンパク質結合を防止するためにPBS中のBSAの1%
溶液で予め被覆したマイクロタイタープレート中で行った。正常血漿(血栓ある
いは出血の病歴を有しない20の個体から集めた)から標準曲線を作成し、1:5000
から倍々希釈することにより200U/dl〜12.5U/dlの範囲の標準曲線を調製するの
に使用した。血漿サンプルは1:1000に希釈した。
魚胚サンプルを未希釈及び1:40からの倍々希釈において測定した。表IIに示す
データはサンプルの1:1280希釈物から得た。結果に1.28を乗じることにより
1:1000の正常血漿希釈度に合わせ、100U/dlが2000ng/mlの受容されている正常血
漿濃度に等価であるという基準に基づいてng/mlで表した。ゼブラフィッシュ胚
における活性アッセイの結果を表IIに示す。
血液凝固アッセイ
免疫欠損血漿(Diagnostic Reagents Ltd.)から得たVII因子欠損血漿を血液凝
固アッセイに使用した(Chanarian，I，Laboratory Haematology，Churchhill Li
vingston，London 1989，pp.286-287)。トロンボプラスチン及び適当なサンプル
を加え、CaCl2を添加した。経時的な凝固反応をCoagulometer KC10で測定した。
対数スケールを使用して経時的な結果を標準血漿サンプルの希釈物と比較し、標
準血漿のパーセント活性として表した。正常血漿は100U/dl FVIIタンパク質を意
味する。血液凝固アッセイの結果を表IIIに示す。
表I
ヒトFVIIタンパク質の検出のためのゼブラフィッシュ胚についてのELISA試験
胚の数(db) FVII濃度(ng/ml)
pMyHC/FVIIをマイクロイン
ジェクションされた胚： 100 85
100 32
pCMV/FVIIをマイクロイン
ジェクションされた胚： 100 186
100 246
119 421
対照胚 100 30
FVII連続希釈物 適用した血清からの 測定されたFVII濃
FVII（ng/ml） 度（ng/ml）
500 508
250 239
125 109
63 65
16 14
0 8
表II
魚胚において生成された組換えFVIIの活性アッセイ
胚の数(db) FVII濃度(ng/ml)
pCMV/FVIIをマイクロイン
ジェクションされた胚： 14 80
100 880
50 540
インジェクションされて
いない対照胚： 100 0
表III
FVII欠損血漿を使用した魚胚中で生成された組換えFVIIの血液凝固活性のバイオ
アッセイの結果
数 %活性*
pCMV/FVIIをインジェ
クションされた胚
1． 100 21
2． 100 25
3． 100 28
4． 100 22
5． 50 29
インジェクションされてい
ない対照胚
1． 100 8
2． 10 8
対照血漿 100
バンク 8
* 血液凝固活性は正常レベルのFVII(100u/dl)を含む正常ヒト
血漿の活性の%として測定した。Detailed description of the invention Production of recombinant peptides by transgenic fish Field of the invention The present invention relates to the expression of nucleic acid sequences encoding pharmaceutically or biologically active proteins, typically heterologous sequences, in fish. This produces a recombinant polypeptide, which can then be recovered from the fish or egg. Background of the Invention Several systems exist for the expression of heterologous recombinant proteins. Such include microbial systems, such as E. coli, which calls yeast, and two animal systems, tissue culture and complete animal systems. Microbial systems have the disadvantage that heterologous proteins often cannot be glycosylated or folded correctly. In many cases, this means that the protein is biologically inactive, especially when eukaryotic proteins are produced in prokaryotic systems that do not undergo glycosylation, such as E. coli. It is. Cell cultures, which are typically mammalian cell cultures, are an alternative because they can be folded and glycosylated. However, while cell cultures provide reproducible results quickly using relatively simple experimental methods, they are very expensive. Using recombinant factor VIII produced by Chinese hamster ovary (CHO) cells costs around £ 80,000 per year to treat hemophiliacs. Another alternative is to introduce the cloned sequence in vivo into a complete animal system, which exposes the introduced sequence to the full range of cell-specific signals, thereby reducing the accuracy of the genetic construct. The potential for expression is maximized. For example, a less expensive method of producing a heterologous protein than using cell culture is to produce such protein in transgenic cow or sheep milk. But significant problems remain. Milk contains lytic enzymes and will hydrolyze heterologous proteins if they do not have very high resistance to degradation. In addition, large mammals such as cattle and sheep are cared for. Also, because certain diseases are common to non-human mammals and humans, there is a risk that recombinant products produced in mammals will transmit pathogenic viruses and / or prions to human patients. Recently, fish have been used to express heterologous proteins, and several researchers have produced stable transgenic fish lines that express the transgene in the F1 generation. These include, inter alia, genes encoding growth hormone and antifreeze proteins, and systems expressing bacterial reporter genes such as CAT and LacZ. Fish have several advantages for recombinant protein expression: (i) they are inexpensive to produce in large quantities; (ii) the technology available for the production of large numbers of transgenic fish; (Iii) Since the virus or prion that infects both humans and fish is not known, the possibility of disease transmission is very low. Summary of the Invention We can use a construct comprising DNA encoding the human factor VII protein under the control of the CMV promoter to temporarily express factor VII in transgenic zebra fish embryos. I found something. Furthermore, the recombinant factor VII protein produced in these embryos is biologically active. That is, it has been shown that a biologically active pharmaceutical polypeptide can be produced using transgenic fish, particularly in the embryonic tissue thereof. The present inventors have also proposed a novel member of the carp myosin heavy chain (MyoHC) gene family, the FG2 myosin heavy chain gene (Gauvry et al. (1996) Eur.J. Bichem., Vol 236; 887-894, which is hereby incorporated by reference. The 5 'region of the gene (as part of the specification) was characterized. Sequencing of the 5 'region revealed the presence of typical TATA and CCAAAT boxes in the promoter region. These motifs are located 30 bp and 74 bp upstream of the transcription start site, respectively. In this sequence, several E-box (CANNTG) motifs are defined between positions -896 and -629 relative to the transcription start site. In addition, a putative MEF2 binding site (GCTATATTTA) is located at position -860. When this upstream promoter region was linked to a reporter gene, it was found that tissue-specific expression was induced in skeletal muscle of carp (Cyprinus carpio) embryo and muscle of mature fish. Accordingly, the present invention provides an expression construct for expressing a polypeptide in a fish, wherein the construct comprises a nucleic acid coding sequence encoding a polypeptide, wherein the nucleic acid coding sequence is in a cell of the fish. It is operably linked to a regulatory sequence capable of causing expression. Preferably, the regulatory sequence expresses the coding sequence in, for example, fish egg cells, embryonic tissue cells, extraembryonic tissue cells, such as the egg yolk syncytium layer (YSL) and / or the coating layer (EVL) of fish eggs. Something that can happen. In another embodiment, the regulatory sequence is capable of causing expression of a coding sequence in a skeletal muscle cell. Preferably, the polypeptide is a biologically active pharmaceutical product. These can be human factor VII, human factor VIII, human factor IX, calcitonin, interleukin, interferon, erythropoietin, tumor necrosis factor, α-galactosidase, adenosine deaminase, or functional active sites of these proteins. The present invention also provides a nucleic acid vector comprising the expression construct of the present invention. The invention further provides a method of producing a transgenic fish, fertilizer, egg or embryo, comprising introducing the expression construct of the invention episomally into a fish, fertilizer, egg or embryo cell. including. In another embodiment, the method of the invention comprises introducing the construct of the invention chromosomally into the genome of a fish, fertilizer, egg or embryo. Fish species include those of the classification Cyprinidae, Cichlidae, Salmonidae, Claridae, Silum idae or Ictaluridae, zebrafish (Danino rerio), African catfish (Clarias gariepinus), rainbow trout (Orcorhynchus mykiss), carp (Cyprinus carp) The present invention also provides a method for producing a recombinant polypeptide, which method comprises encoding a polypeptide encoded by the coding sequence of a construct of the present invention in a fish, fish egg or embryo. Expressing and recovering the polypeptide. Preferably, the expression construct is introduced by microinjection. Alternatively, it may be introduced by electroporation or lipofection. Preferably, the regulatory sequences include a promoter that confers universal or tissue-specific expression, such regulatory sequences, introns, enhancers, polyA elements, and part or all of fish egg, embryo or adult tissue. And other nucleic acid sequences required to maximize expression in The regulatory sequences, particularly promoters, used in the expression constructs are of viral or animal origin and are capable of causing expression in fish cells. Expression of the coding sequence may be transient, in which case it may be recovered from an egg or embryo, or it may be stable, in which case it may be recovered from an embryo, juvenile, or mature fish. Do. Expression of the polypeptide is obtained by directly introducing the expression construct of the present invention into adult fish body tissue, preferably muscle tissue / cells. Gene constructs can also be introduced into germline tissues / cells, such as germ cells, and transmitted to offspring. Also, fish that are transgenic and express one or more transgene copies in a stably integrated chromosome form can be used for mating to produce eggs, embryos, and other generations of expressing cells and fish. You can also Detailed description of the invention Proteins having pharmaceutical or biological properties, typically heterologous proteins, can be expressed in fish. This technique allows for the production of properly glycosylated and folded proteins, thereby avoiding the disadvantages of microbial expression systems, but for different reasons, all of which require labor-intensive methods. Relatively less expensive than cell culture or use of mammalian large animal hosts. In particular, the following two methods are possible. (i) using a regulatory sequence capable of causing expression in fish muscle or other tissues, and introducing the nucleic acid construct into which the regulatory sequence and the coding sequence of the polypeptide of interest have been introduced into a fish, Can be introduced at different stages. By capturing fish, proteins can be recovered from muscle and / or other tissues. For this method, a muscle-specific promoter, particularly a myosin heavy chain (MyoHC) promoter, is preferred. (ii) The polypeptide of interest can be expressed in fish eggs, which may or may not be fertilized, or in a developing fertilizer or embryo, and then recovered. For example, a sexually mature transgenic fish expressing the polypeptide of interest under the control of appropriate regulatory sequences in the egg can be produced. These eggs can then be removed and the protein extracted. This system has the advantage that it is not necessary to kill the mature transgenic fish to obtain the recombinant polypeptide. This method requires regulatory sequences capable of causing expression in the fish egg or developing fertilizer or embryo. Polypeptides of the invention can be prepared using expression constructs of the invention that include a nucleic acid coding sequence encoding the polypeptide operably linked to regulatory sequences capable of causing expression of the coding sequence in fish cells. Can be produced by expressing a DNA encoding The nucleic acid coding sequence may be either DNA or RNA, but is preferably DNA, typically genomic DNA or cDNA. It may encode a polypeptide of any suitable length. Any suitable polypeptide can be produced according to the present invention by expressing the nucleic acid encoding it, ie, DNA or RNA. Typically, such a polypeptide is heterologous to the fish system, ie, it is a polypeptide that fish does not naturally produce. However, it may be a homologous polypeptide. Typically, the polypeptides so produced have pharmaceutical and / or biological properties. Preferably, the polypeptide of the invention is one suitable for a medicament for use in mammals, more preferably in humans. For example, it may be useful for treating, preventing or ameliorating a disease or other pathological condition in a human or animal patient. Preferred polypeptides so produced are blood coagulation factors such as factor VI, factor VIII and IX, calcitonin, interleukins, interferons such as α, β and γ-interferon, α-galactosidase, tumor necrosis factor (TNF), and adenosine deaminase. Preferably, such polypeptides are produced in their intact (native) form, provided that the nucleic acid sequences of the present invention comprise a functionally active portion of these polypeptides, such as the activity or activity of the intact polypeptide. It may encode a part of such a polypeptide having a part. Similarly, a nucleic acid sequence of the invention may encode a derivative, eg, a variant of a native polypeptide. For example, it may encode a polypeptide that differs in one or more amino acids from the native. Alternatively, the nucleic acid sequence may differ from the native sequence but encode the same amino acid sequence. That is, the nucleic acid sequence can be a degenerate of the native sequence. In this regard, the DNA sequence should include codons that are preferred for expressing a particular amino acid in fish cells, i.e., replace less efficiently expressed codons with those that are more efficiently expressed in fish. Can be changed. In the constructs of the present invention, the regulatory sequences of the present invention are operably linked to regulatory sequences capable of causing their expression in fish cells. "Operably linked" refers to a juxtaposition wherein the regulatory sequences and the nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention are in a relationship such that the coding sequence can be expressed under the control of a promoter. Say. That is, elements such as 5 'non-coding sequences may be present between the regulatory sequence and the coding sequence, as long as they enhance or do not impair the precise control of expression of the coding sequence by the regulatory sequence. The regulatory sequence includes at least a promoter sequence. In addition, the regulatory sequences may include the following: promoter regulators, promoter enhancers, and / or other elements such as some or all of the translation initiation site. The expression construct may include a sequence encoding a polypeptide of the invention from the transcription terminator 3 '. The expression construct may also include one or more introns or other non-coding sequences, such as 3 'or 5', that encode the polypeptide of the present invention. Such sequences may be included in the construct if they do not enhance or impair the precise control of the coding sequence by the promoter. The construct may also include a polyadenylation (polyA) signal operably linked from the 3 'to the nucleic acid coding sequence, such as an SV40 polyA signal or a chinook salmon polyA signal. The constructs of the invention may also optionally include one or more locus regulatory regions (LCRs). They can act as enhancers for certain fish genes and improve transgene expression (Aronrow et al., (1995) Mol. Cell. Biol. Vol 15; 1123-1135). The constructs of the invention may be contained in a vector, suitable vectors are replicable vectors, such as replicable expression vectors. In addition to the expression constructs of the present invention, the vectors of the present invention usually contain an origin of replication, and the vector can replicate in a host cell such as a bacterial or yeast host cell. The vector may also include other elements involved in controlling the expression of the coding sequence as described above. The vector may also be one or more selectable marker genes for identification of bacterial transformants, typically antibiotic resistance genes, such as ampicillin resistance genes, or to allow for the selection of yeast transformants. Includes marker genes. The vector can also optionally include a promoter enhancer. The expression vector can be of any type. The vector may be in a linear or circular form. For example, the construct can be introduced into a plasmid vector or a viral vector. One of skill in the art will be able to modify from a wide variety of available vectors, for example, by genetic engineering techniques as described by Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 1989, Cold Spring Harbor Press, NY, USA). Would make it possible to prepare suitable vectors and constructs of the present invention. Any suitable regulatory sequence can be used in the constructs of the present invention, so long as the regulatory sequence is capable of causing expression in fish cells. The regulatory sequences in the expression constructs of the present invention can be capable of causing expression in cells in part or all of a fish tissue. For example, it can be one that is capable of completely or predominantly expressing in one or more specific tissues. That is, it can be tissue-specific. For example, it can be one that is capable of completely or predominantly causing expression in a particular fish tissue. Regulatory sequences specific for fish egg or skeletal muscle tissue are preferred. Preferably, the regulatory sequence is one that causes expression in a fish egg cell, such as a cell in a fish egg embryo or extraembryonic tissue. For example, a promoter is one that can cause direct expression in cells of extraembryonic tissue, such as cells of the yolk syncytium layer (YSL) or coating layer (EVL) of an egg. It is also preferable to use a promoter capable of causing the expression of the coding sequence in cells of fish muscle, typically skeletal muscle. The regulatory sequences in the constructs of the invention may be constitutive or inducible. Specifically, one type of preferred regulatory sequence is the myosin heavy chain gene promoter. Particularly preferred is the carp FG2 myosin heavy chain promoter described by Gauvry et al. (1996), supra. It is a muscle-specific promoter in the sense that it causes expression in skeletal muscle cells. Unexpectedly, this also results in expression in YSL and EVL. A particularly preferred region of the FG2 MyoHC promoter is 901 bp upstream from the transcription start site. This type of tissue-specific regulatory sequence is particularly preferred when the expression construct is stably introduced into the fish genome, especially the genome of germline cells, over an extended period of time. More generally, fish-derived tissue-specific regulatory sequences are preferred where long-term expression and / or stable integration of the expression construct in the fish cell genome is required, rather than transient expression. It is also preferable to use an inducible promoter capable of inducing the expression of the polypeptide by a suitable stimulus at a desired time. This can avoid side effects associated with continuous expression of the heterologous polypeptide. Other preferred regulatory sequences include the cytomegalovirus (CMV) promoter (e.g., CMV 1E1 promoter), the long murine repeat promoter of murine murine leukemia virus (MuLV-LTR), optionally in combination with the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer. Thymidine kinase (TK) promoter, mouse metallothionein I (mMTH1) promoter, Xenopus elongation factor 1α (ef1α) promoter optionally combined with ef1α enhancer, carp β-actin promoter, mouse Hox 1.3 promoter, rat GAP43 gene promoter, SV40 Examples include the early promoter, the rabbit β-heart myosin heavy chain promoter, and the human MxA promoter. Particularly preferred for transient expression are universal and / or constitutive regulatory sequences which allow high levels of expression in all cell types. Particularly preferred are viral regulatory sequences such as CMV and RSV sequences. Optionally, an enhancer can be used in addition to the promoter. Enhancers are chosen to be compatible with the promoter. Suitable enhancers include rat fetal light chain enhancer, ef1α enhancer, and RSV enhancer. According to the present invention, any type of fish can be used to produce the polypeptide of interest. Teleost fish are preferred. Preferred classes among teleosts include Cyprinidae, Cichlidae, Salmonidae, Claridae, Siluridae and Ictaluridae. Particularly preferred types of fish include carp (e.g., Cyprinus carpio), zebrafish (Danino rerio), African catfish (Clarias gariepinus), tilapia (Oreochronis niloticus), Atlantic salmon (Salmo Salar), rainbow trout (Onc orhyncus mykiss), and medaka (Oryzias latipes). In general, if it is desired to recover the polypeptide from a fish egg, or a developing fertilizer or embryo, a preferred fish for use in accordance with the present invention produces large eggs and / or large numbers of eggs. Is what you do. It is also preferred to use fish for which propagation and / or transgenic technology has been fully developed. The present invention also provides a cell having the vector or the construct of the present invention. These cells can be of any type. For example, it can be a microbial cell. That is, for example, bacteria, such as Escherichia coli, or yeast cells can be used. Preferred cells of the invention are fish cells. Cells of any type of fish are included within the scope of the invention, with fish cells of the classes listed herein being preferred. Similarly, the cells can be cells of any type of fish tissue, but the tissues listed herein are preferred. Particularly preferred are fish egg cells, such as cells of embryonic tissue, or extraembryonic tissues, such as cells of YSL and EVL. Also preferred are muscle cells, typically skeletal muscle cells. The fish cells of the present invention can be in any form. For example, it may be isolated in culture or it may be in a fish body such as, for example, an adult fish, a fish fertilizer, an embryo, an egg. Accordingly, the present invention provides a transgenic fish comprising the cells of the present invention. These can be at any stage of development. Thus, for example, the present invention provides mature and immature transgenic fish and transgenic fish fertilizers, embryos and eggs. In such fish, some or all of the cells have the construct or vector of the present invention. Thus, the fish may be uniformly transgenic, or it may be a transgenic "mosaic" in which only some cells are transgenic. The cells of the invention may be located in a particular type of tissue, for example, skeletal muscle, germline, or one or more tissues such as eggs. The transgenic fish of the present invention may be of any sex, ie, either male or female. The constructs and vectors of the invention can be introduced into cells using any suitable means (eg, as described in Sambrook et al., (1989), supra) to produce cells of the invention. For example, cells can be transformed or transfected using any means known in the art. For example, a construct or vector of the invention can be packaged in an infectious viral particle, such as a retroviral, particle or lambda virus particle, which can then be used to transfer the construct or vector into a cell. They can also be introduced by microinjection, electroporation, calcium phosphate precipitation, biolistic methods (eg, tungsten bombardment), or by contacting naked nucleic acid vectors or constructs with cells in solution. Optionally, a substance that facilitates the transfer of DNA into cells can be used. These include liposomes. A preferred means of delivery when introducing DNA or RNA into fish eggs is microinjection using methods known to those skilled in the art. Microinjection can be performed at any suitable stage in egg development, such as prior to fertilization, or at the one, two, four, or eight cell stage. Another preferred technique for delivering nucleic acids to fish eggs or fish sperm is electroporation, which is described in Transgenic Animals-Generation and Use (1997) pp 129-132, ed. LM. It is described in detail in Houdebin Harwoo d Acedemic Publishers. The vector or construct introduced into the cell can be of any type. For example, a construct of the invention may be integrated into the genome of the cell, integrated into an episome, or remain free in the cell. The present invention also provides a method for producing the transgenic fish of the present invention. Any suitable method may be used. In principle, the method of the present invention involves introducing a construct or vector of the present invention into a cell as described above to produce a cell of the present invention. If the cells are in vivo, such as in a fish, fish fertiliser, embryo or egg, this results in a transgenic fish, fertiliser, embryo or egg of the invention. If appropriate, the fish can be bred to obtain the transgenic progeny fish of the present invention. The fish eggs of the present invention can be appropriately fertilized and grown to obtain the fish of the present invention, which can then be regenerated to further obtain the progeny fish of the present invention. Fertilized fish eggs, fertilized bodies and embryos of the present invention can be grown to obtain the fish of the present invention, which can then be regenerated to further obtain progeny fish of the present invention. In addition, the fish of the present invention can be further produced by reproducing the progeny fish of the present invention. Also, fish sperm can be transformed with the constructs of the present invention, and the transgenic sperm is used to fertilize a fish egg, optionally a transgenic egg of the present invention, to produce a transgenic fish of the present invention. be able to. Typically, cells or fish (including eggs, fertilized bodies and embryos) are subjected to a suitable selection method, and transformed cells or fish are separated from non-transformed ones. Alternatively, the vectors or constructs of the present invention can be introduced into fish cells in culture, and the cells introduced into a fish, such as a mature or immature fish or a fertilizer, egg or embryo to produce a fish of the present invention. it can. These can be arbitrarily appropriately reproduced or grown to produce the fish of the present invention. Preferably, in the method of the present invention, the construct or a part of the construct of the present invention can be integrated into a chromosome in a fish cell genome using, for example, an integrated vector. Where a portion of the construct is incorporated, it is preferably a portion containing the coding sequence, more preferably a portion containing the coding sequence and flanking sequences (eg, a promoter) that can cause its expression in fish cells. One or more copies of the coding sequence can be incorporated into each cell. The vectors or constructs of the present invention can be introduced into fish cells at any suitable stage in the fish life cycle. For example, it can be introduced into unfertilized eggs, or fertilized fertilized bodies, or developing embryos, or immature or mature fish. The unfertilized egg thus obtained can be fertilized to obtain the fertilized body of the present invention, and this can be grown to produce an embryo and further produce the fish of the present invention. The female fish of the present invention can produce the transgenic eggs of the present invention, which can optionally be fertilized by the male fish of the present invention or sperm obtained from such fish. The present invention also provides for expressing a polypeptide encoded by a coding sequence of the present invention in a cell of the present invention and recovering the polypeptide so produced by any means known in the art. A method is provided for producing a recombinant polypeptide of the invention. The polypeptide of the present invention can be produced and recovered from the cells of the present invention cultured in vitro. However, it is preferred to produce the polypeptide of the present invention in vivo in cells of the living fish of the present invention, such as the mature or immature fish of the present invention, or their fertilized bodies, eggs or embryos. The polypeptide can be obtained by collecting mature fish, fish eggs, embryos and fertilized bodies, and recovering the polypeptide by any appropriate means. The polypeptide can optionally be isolated, or substantially isolated, for example, by one or more isolation steps. The polypeptide can optionally be completely or partially purified, for example, by one or more purification steps. In a preferred embodiment, the transgenic mature female fish of the invention is produced, eggs are produced, and the eggs are optionally fertilized. The eggs are collected, and the polypeptide of the invention is recovered from the eggs. In this type of method, female fish can be superovulated to increase the number of eggs produced and increase the amount of polypeptide recovered. In such a method, expression is optionally obtained specifically in eggs by a suitable promoter. In another preferred embodiment, a mature transgenic fish of the invention is generated and the polypeptide is expressed in its tissue. Preferably, expression will occur selectively in skeletal muscle under the control of a muscle-specific promoter, such as the carp FG2 MyoHC promoter described by Gauvry et al. (1996), supra. In another aspect, DNA or RNA sequences encoding a polypeptide of the invention can be used to obtain transient expression of the polypeptide in a developing fish egg, fertilizer or embryo. RNA encoding the polypeptide is introduced into fish eggs, optionally into fertilized eggs. Where appropriate, the eggs can be fertilized and grown at any stage during development, thereby expressing the polypeptide. The expressed polypeptide is recovered by any means known in the art. Polypeptides can be recovered from eggs at any stage of their development. The present invention will be described with reference to the following examples. These examples are for illustrative purposes only and are not limiting. In the embodiments, reference is made to the drawings. The drawings referred to are as follows in more detail. Figure 1 shows Invitrogen for FVII cDNA insertion. TM An expression vector. FIG. 2 is a construct from which the FVII cDNA was isolated. FIG. 3 shows a construct formed by inserting the FVII cDNA into the expression vector of FIG. FIG. 4 is a graph showing catfish embryos expressing recombinant human factor VII. Example Production of recombinant human blood coagulation factor VII in fish embryos Materials and methods Plasmid DNA encoding human factor VII has been cloned and sequenced (O'Hara et al. (1987) PNAS, Vol 84; 5158). -5162, Genebank accession number J02933). The specific human Factor VII-encoding gene cDNA used in this experiment was a HindIII / BamHI double digest from a plasmid containing the FVII sequence flanked by a 0.9 kb rat myosin heavy chain gene-derived muscle-specific regulatory element (pMy HC / FVII). (Examples of rat myosin heavy chain promoter sequences are published as Genbank accession numbers U83321 and U55179). A 2.62 kb FVIIcDNA fragment containing a 2.46 kb FVII cDNA and a 0.12 kb SV40 polyA signal sequence was ligated into a pcDNAI expression vector (Invirtogen). TM ) Bound to the HindIII / BamHI site. The resulting plasmid pCMV / FVII (FIG. 2) was checked for proper insertion and orientation by creating a restriction map. It contains the FVII sequence from the CMV virus E1 early promoter and enhancer 5 '. Plasmids were prepared using conventional molecular techniques (Sambrook et al., (1989), supra) and used for microinjection into fertilized fish eggs. Microinjection and embryo culture African catfish embryos were produced by artificial propagation of African catfish littermates. Eight hours prior to planned ovulation, females were injected with 3 mg / kg body weight of carp pituitary gland dissolved in a PBS solution. Eggs were collected from females and fertilized by adding sperm from testes excised from males. Single cell embryos (fertilized bodies) were used for microinjection. Zebrafish embryos were obtained from native eggs of litterfish maintained at 28 ° C. with a 14 hour light irradiation and 10 hour dark cycle. The eggs are placed in an egg box (Westfield, M (1993) The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Branchyd anio rerio), University of Oregon Press, Eugene, OR, USA), and the initial development stage (1 to Collected from the box for microinjection at 2 cell stage). Both pCMV / FVII and pMyHC / FVII plasmids were cloned in circular form for approximately 10 6 ~Ten 7 Microinjection was performed using a copy and pressure-driven picoin injector and introduced into fertilized African catfish or zebrafish embryos. Catfish embryos were placed in Petri dishes. The eggs adhered to the Petri dish due to their natural tack. Injections were performed manually using a glass microcapillary filled with an appropriate DNA solution containing a blue food dye to indicate the location of the injection drops. Zebrafish embryos were placed in agar gel injection molds designed to keep the eggs aligned for injection (Westerfield et al., 1993). For both species, the injection was targeted at the cytoplasmic region or the boundary between the cytoplasmic region and the yolk region. Embryos that had been microinjected were cultured in Holtfreter's solution in a thermostat at 28 ° C. for 1 day until reaching the 5 prime stage (before feeding). Microinjected and control (non-injected) embryos were collected in microcentrifuge tubes and homogenized with a plastic homogenizer. Tubes containing 1-100 homogenized embryos (approximately 20 μl) were snap frozen in liquid nitrogen and stored at −70 ° C. until analysis. Results Immunochemical detection of FVII protein from fish embryo homogenate ELISA assays were performed on 96-well plates coated with monoclonal antibodies raised against human FVII (mouse monoclonal antibody clone HVII-1, Slgma). Fish embryo homogenates, dilutions of normal plasma containing FVII protein, and appropriate negative control samples were loaded into wells. Next, a biotinylated anti-FVII TAG antibody conjugated to horseradish peroxidase was added. After adding the color reaction buffer and incubating, the samples were read by a conventional ELISA reader. The results for zebrafish and catfish embryos are shown in Table I and FIG. 4, respectively. Activity assay The enzymatic activity of the recombinant factor VII produced in fish embryos was measured by the chromogenic assay Coaset FVII (Chromogenix, Sweden). The assay is based on a two-step method. In step 1, human factor X 2+ And activated by thromboplastin in the presence of FVII (FXa). During this process, FVII is completely converted to FVIIa, so there is no preactivated FVII inhibition in this assay. In step 2, the formed FXa hydrolyzes the chromogenic substrate S-2765, releasing the chromogenic primordium pNA. The color is read photometrically at 405 nm. The FXa produced increases the intensity of the color, and thus the color is proportional to the FVII activity in the sample. Assays were performed in microtiter plates pre-coated with a 1% solution of BSA in PBS to prevent non-specific protein binding during the assay. Prepare a standard curve from normal plasma (collected from 20 individuals with no history of thrombus or bleeding) and prepare a standard curve ranging from 200 U / dl to 12.5 U / dl by doubling dilution from 1: 5000 Used for Plasma samples were diluted 1: 1000. Fish embryo samples were measured undiluted and at 1:40 dilution. The data shown in Table II was obtained from a 1: 1280 dilution of the sample. The results were multiplied by 1.28 to a normal plasma dilution of 1: 1000 and expressed in ng / ml based on the criterion that 100 U / dl was equivalent to an accepted normal plasma concentration of 2000 ng / ml. Table II shows the results of the activity assay in zebrafish embryos. Blood clotting assay Factor VII deficient plasma obtained from immunodeficient plasma (Diagnostic Reagents Ltd.) was used for blood clotting assays (Chanarian, I, Laboratory Haematology, Churchhill Livingston, London 1989, pp. 286-287). Add thromboplastin and appropriate sample, add CaCl Two Was added. The coagulation reaction over time was measured with a Coagulometer KC10. Results over time were compared to dilutions of a standard plasma sample using a log scale and expressed as percent activity of the standard plasma. Normal plasma means 100 U / dl FVII protein. The results of the blood clotting assay are shown in Table III. Table I ELISA test on zebrafish embryos for detection of human FVII protein Number of embryos (db) FVII concentration (ng / ml) Embryos microinjected with pMyHC / FVII: 100 85 100 32 Microinjected with pCMV / FVII Embryos: 100 186 100 246 119 421 Control embryos 100 30 FVII serial dilutions Measured FVII concentration from applied serum FVII (ng / ml) Degree (ng / ml) 500 508 250 239 125 109 63 65 16 14 Table 8 Activity assay of recombinant FVII produced in fish embryos Number of embryos (db) FVII concentration (ng / ml) Embryos microinjected with pCMV / FVII: 14 80 100 880 50 540 Non-injected control Embryos: 100 0 Table III Results of bioassay of blood clotting activity of recombinant FVII produced in fish embryos using FVII-deficient plasma Several% activity * Embryos injected with pCMV / FVII 100 21 2. 100 25 3． 100 28 4. 100 22 5. 50 29 Non-injected control embryos 100 8 2. 10 8 control plasma 100 banks 8 * Blood clotting activity was measured as% of the activity of normal human plasma containing normal levels of FVII (100 u / dl).
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(72)発明者 ウィリアムズ，ダーレン，ウィリアム
イギリス国 シー エフ３ ９エービー,
カーディフ，ラムニー，リッジウェイ ロ
ード 51
(72)発明者 ゴールズピンク，ジェフリー
イギリス国 エー エル５ １ディー キ
ュー，ハートフォードシャー，ハーペンデ
ン，イースト コモン，ブランブルディー
ン
(72)発明者 マラー，フェレーン
イギリス国 シー エフ３ ９エービー,
カーディフ，ラムニー，リッジウェイ ロ
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Continuation of front page
(72) Inventors Williams, Darren, William
United Kingdom C F3 9 Abbe,
Cardiff, Ramney, Ridgway
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(72) Inventor Golds Pink, Jeffrey
UK AEL5 1D
View, Hertfordshire, Harpende
East Common, Brambledy
N
(72) Inventor Muller, Ferren
United Kingdom C F3 9 Abbe,
Cardiff, Ramney, Ridgway
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