JP4020845B2 - Base mutation analysis method - Google Patents
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Description
生命体の遺伝子分析は疾病に対する危険度、診断、予診又は治療方法の提示等と関連し広範囲に用いられている。例えば、特定人の特定遺伝子に対する変異分析を介して疾病に対する危険度がどの程度であるか予測し予防努力をするよう誘導することができる。又は、生命体に肝炎を発生させる別の生命体、例えばウイルス等の遺伝変異分析を介してそのウイルスが治療薬物に対し耐性を有するか否かを調査することにより、効果的な治療を誘導することができる。本発明は、生命体の遺伝子を分析する方法に関し、特に遺伝変異を調査する方法に関する。 Genetic analysis of living organisms is widely used in relation to the risk level of diseases, diagnosis, diagnosis, presentation of treatment methods, and the like. For example, it is possible to predict the degree of risk for a disease through mutation analysis for a specific gene of a specific person, and to induce prevention efforts. Or, it is possible to induce effective treatment by investigating whether or not the virus is resistant to the therapeutic drug through genetic mutation analysis of another living organism that causes hepatitis in the living organism, such as a virus. be able to. The present invention relates to a method for analyzing a gene of an organism, and more particularly to a method for investigating a genetic variation.
人間のゲノム地図が完成されていきながら疾病に対する危険度の測定、疾病の診断又は予診、そして薬物に対する反応の予測をより広範囲に行うことができるとの可能性が提示されている。多数の個体を対象にゲノム単位の塩基配列分析をすれば個体間の多様性を示す染色体上の位置等が表われるが、これをSNP(single nucleotide polymorphism)という。SNPは、生命体の染色体に配列されている塩基配列中一定頻度以上に現われる変異であり、人間の場合約1,000個の塩基毎に1個程度の確率で現われるといわれる。人間の染色体の大きさを考慮する場合、数百万のSNPが存在するのである。SNPは、個体間の形質差を説明する手段として考えられており、疾病の原因を突き止めて疾病を予防又は治療するのに用いることができる。 As human genome maps have been completed, the possibility of measuring the risk to a disease, diagnosing or prognosing the disease, and predicting a response to a drug is presented. When genome sequence analysis is performed on a large number of individuals, the position on the chromosome showing diversity among individuals appears. This is called SNP (single nucleotide polymorphism). SNP is a mutation that appears at a certain frequency or more in a base sequence arranged on a chromosome of a living organism, and in the case of human beings, it is said that it appears with a probability of about 1 for every 1,000 bases. When considering the size of the human chromosome, there are millions of SNPs. SNP is considered as a means of explaining the phenotypic differences between individuals, and can be used to determine the cause of the disease and prevent or treat the disease.
人間ゲノムプロジェクトにより発見されたSNP等は個体間の多様性を示すとの事実だけを示すだけで、その多様性が疾病と如何なる関連性があるのかを知らせてはいない。SNPと疾病との関係を明らかにするためには、正常人と患者に現われるSNPの変異形態を比較分析(SNPスコアリング)する過程が必要である。SNPと疾病との関係を明確に突き止めるためには、多数のSNPを分析しなければならないだけでなく、変異を誤謬なく分析することができなければならない。 The SNPs discovered by the Human Genome Project only show the fact that they show diversity among individuals, and do not tell how the diversity is related to disease. In order to clarify the relationship between SNP and disease, a process of comparative analysis (SNP scoring) of mutant forms of SNP appearing in normal persons and patients is necessary. In order to clearly determine the relationship between SNPs and diseases, not only a large number of SNPs must be analyzed, but also mutations must be able to be analyzed without error.
SNPスコアリング方法にはDNAシーケンシング、PCR−SSCP(Polymerase chain reaction−Single stranded conformation polymorphism)、アレル特異的混成化(allele specific hybridization)、オリゴリゲーション(oligo-ligation)(オリゴライゲーション)法、ミニシーケンシング(mini-sequencing)、そして酵素切断法によるもの等がある。DNAチップを利用した方法も紹介されているが、原理的にアレル特異的混成化と差がなく、ただオリゴヌクレオチドプローブ等を付着する固定相に差を置いたものである。 SNP scoring methods include DNA sequencing, PCR-SSCP (Polymerase chain reaction-Single stranded conformation polymorphism), allele specific hybridization, oligo-ligation (oligoligation) method, mini There are methods such as sequencing by mini-sequencing and enzymatic cleavage. Although a method using a DNA chip has been introduced, in principle, there is no difference from allele-specific hybridization, and only a difference is made in the stationary phase to which an oligonucleotide probe or the like is attached.
DNAシーケンシングはマキサム−ギルバート法とサンガー法があるが、現在は後者の方法が主に用いられている。この方法は、特定位置の遺伝変異の可否だけを調査するための方法であるというよりは遺伝子全体又は一部部位の塩基配列を明らかにするための方法であるが、塩基配列を明らかにすれば特定位置の遺伝変異の可否も確認することができるので、SNPスコアリングに用いることができる。しかし、調査しようとするSNPの変異だけを確認するのではなく、敢えて調査しなくてもよい周辺の塩基配列を共に読取るとの面で非効率的である。 There are Maxam-Gilbert method and Sanger method for DNA sequencing, but the latter method is mainly used at present. This method is a method for clarifying the base sequence of the entire gene or a part of the gene rather than investigating only the possibility of genetic mutation at a specific position. Since it is also possible to confirm whether or not a genetic mutation at a specific position is possible, it can be used for SNP scoring. However, it is inefficient not to confirm only the mutation of the SNP to be investigated, but to read together the surrounding base sequences that do not need to be investigated.
PCR−SSCP(Orita,M.et.al,Genomics,1989,5:8874-8879)はPCRで分析しようとするSNPを含む配列を増幅した後、それぞれのチェーンに分離させてから、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行う。1塩基の差によりDNAチェーンの2次構造が異なることになるので、この差による電気泳動移動速度の差により塩基変異の可否を調査する。
アレル特異的混成化は、ナイロンフィルタ等に付着したプローブに放射線同位元素等で標識されたサンプルDNAを混成化するが、温度等混成化の条件を調節することにより塩基変異の可否を調査する方法である。
オリゴリゲーション法(Nucleic Acid Research 24,3728,1996)は、鋳型DNAと相補的でない状態ではリゲーション(ligation)(ライゲーション)が起こらない条件で反応を行い、リゲーションが進められたのかを確認することにより塩基変異を調査する方法である。
ミニシーケンシング(Genome Research 7:606,1997)は、変異の可否を調査しようとする位置の1個の塩基のみ重合されるよう条件を合わせ、重合された1個の塩基が何であるかにより検出反応が異なるよう考案された方法でSNPスコアリングのために開発された方法である。
PCR-SSCP (Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5: 8874-8879) amplified a sequence containing SNPs to be analyzed by PCR, separated into each chain, and then polyacrylamide gel. Perform electrophoresis at Since the secondary structure of the DNA chain differs depending on the difference of one base, the possibility of base mutation is investigated based on the difference in electrophoretic migration speed due to this difference.
Allele-specific hybridization is a method in which sample DNA labeled with a radioisotope or the like is hybridized to a probe attached to a nylon filter, etc., but the possibility of base mutation is investigated by adjusting the hybridization conditions such as temperature. It is.
In the oligoligation method (Nucleic Acid Research 24, 3728, 1996), the reaction was performed under the condition that ligation (ligation) does not occur in a state that is not complementary to the template DNA, and it was confirmed whether the ligation was advanced. This is a method for investigating base mutations.
Mini-sequencing (Genome Research 7: 606, 1997) detects the presence of a single base that has been polymerized under the condition that only one base is polymerized at the position to be examined for mutation. It was developed for SNP scoring in a way that was devised to have different responses.
PCR−SSCP、アレル特異的混成化、オリゴリゲーション法等はポリアクリルアミドゲルを用いて多量のサンプルを分析するに不便であるか、又はプローブが望む位置に結合できずに発生する誤謬を確認できないという問題点がある。
ミニシーケンシングは、SNPスコアリングのため開発された技術であるため分析が簡単で多量のサンプルの分析に有利であるが、誤謬による誤った結果を確認できないという欠点を依然有しており、塩基の欠失(deletion)と挿入(insertion)を見つけ出すことができないという限界がある。
PCR-SSCP, allele-specific hybridization, oligoligation method, etc. are inconvenient to analyze a large amount of sample using polyacrylamide gel, or the error that occurs because the probe cannot bind to the desired position cannot be confirmed. There is a problem.
Mini-sequencing is a technique developed for SNP scoring, which is easy to analyze and advantageous for analyzing a large number of samples. However, it still has the disadvantage that erroneous results due to errors cannot be confirmed. There is a limitation that it is impossible to find deletions and insertions.
SNPスコアリングのため開発された技術中さらに1つの方法として酵素切断法がある(WO 01/90419)。この方法は、分析しようとする塩基配列をPCRと同一の方法で増幅するが、増幅された結果物が2つの制限酵素により切断又は認知できる塩基配列を含むようにする。増幅された結果物を2種類の制限酵素で切断して生成された断片の分子量を測定し、塩基変異の可否を測定する方法である。この分析方法はPCRによる遺伝子の増幅後直ちに制限酵素反応で断片を作ってマススペクトロメトリ等で分子量を測定するので、分析段階が簡単で迅速であるとの利点がある。しかし、WO 01/90419に記載された酵素切断法は依然誤謬による誤った分析を確認することができない。たとえば、PCR遂行時にプライマーが望まない位置に結合する場合誤った分析結果をもたらすことがあるが、望まない位置に結合したのか否かを確認することができないという問題がある。たとえば、CYP2C9の塩基変異を調査するため用いたプライマーがCYP2C8に結合することになることがあるが、この場合プライマーがCYP2C9でないCYP2C8に結合したとの事実を確認できないため、誤謬が発生したか否かの確認が困難である。さらに、1塩基が別の塩基に置換される変異は検測可能であるが、塩基の欠失(deletion)又は挿入(insertion)による変異は検測できないという問題点がある。さらに、隣接した2つ以上の塩基変異を同時に検測することができないという問題点がある。 One of the techniques developed for SNP scoring is the enzyme cleavage method (WO 01/90419). In this method, the base sequence to be analyzed is amplified by the same method as PCR, but the amplified product contains a base sequence that can be cleaved or recognized by two restriction enzymes. In this method, the amplified product is cleaved with two types of restriction enzymes, and the molecular weight of a fragment produced is measured to determine whether or not a base mutation is possible. This analysis method has an advantage that the analysis stage is simple and quick because a fragment is prepared by restriction enzyme reaction immediately after amplification of the gene by PCR and the molecular weight is measured by mass spectrometry or the like. However, the enzymatic cleavage method described in WO 01/90419 still cannot confirm a wrong analysis due to errors. For example, when a primer binds to an undesired position during PCR, an erroneous analysis result may occur, but there is a problem that it cannot be confirmed whether or not the primer has bound to an undesired position. For example, the primer used to investigate the base mutation of CYP2C9 may bind to CYP2C8. In this case, the fact that the primer bound to CYP2C8 other than CYP2C9 cannot be confirmed, so whether or not an error has occurred. It is difficult to confirm. Furthermore, although a mutation in which one base is replaced with another base can be detected, there is a problem that a mutation due to deletion or insertion of a base cannot be detected. Furthermore, there is a problem that two or more adjacent base mutations cannot be simultaneously measured.
本発明は前記の問題点を解決し、前記の必要性により考案されたもので、本発明の目的は生命体の遺伝変異を正確且つ効率的に調査することができる方法を提供することにある。 The present invention solves the above-mentioned problems and has been devised based on the above-mentioned need, and an object of the present invention is to provide a method capable of accurately and efficiently investigating a genetic variation in a living organism. .
本発明は、生命体の遺伝変異を正確且つ効率的に分析する方法を提供する。
本発明を簡単に説明すれば、本発明は幾多の試料の塩基変異調査を簡単で速やかに行いながらも、プライマーが誤った位置に結合して生成する可能性のある誤謬を検証することができるようにすることにより正確な塩基変異の調査を可能にし、32個の塩基範囲以内に隣接した幾多の塩基の変異を同時に調査するだけでなく、欠失又は挿入による遺伝変異も検測することができる方法を開発した。特に、一生命体内に幾多の遺伝型が同時に存在する場合、互いに異なる位置の塩基変異が一遺伝型に同時に存在するのか、それとも互いに異なる遺伝型に混在して存在するのかを区別することができる。たとえば、人間は同一の遺伝情報を収めている染色体が2つ(1対)ずつ存在しており、遺伝変異が起こる場合2つの染色体に全て変異があり得るが(ホモ)、1つの染色体にのみ起こることもある(ヘテロ)。隣接した2つ以上の塩基変異が全てヘテロである場合、2つの塩基変異が1つの染色体に同時に存在することがあり得るが、互いに異なる染色体に存在することもある。2通りの場合が生命体に及ぼす影響が異なる場合もあるので、これを区別する必要がある。人間を感染させるウイルスの場合も幾種類の遺伝型が混在して存在することがある。隣接した2つ以上の塩基変異が全てヘテロである場合、2つの塩基変異が1つの遺伝型に同時に存在するのか、それとも互いに異なる遺伝型に分かれて存在するのかを区別する必要がある。
The present invention provides a method for accurately and efficiently analyzing a genetic variation of an organism.
Briefly describing the present invention, the present invention can easily and quickly investigate base mutations in a large number of samples, while verifying errors that may be generated by binding of primers to wrong positions. By doing so, it is possible to investigate the exact base mutation, and not only simultaneously investigate the mutation of many adjacent bases within the range of 32 bases, but also to detect genetic mutation due to deletion or insertion. Developed a possible method. In particular, when multiple genotypes exist simultaneously in a living organism, it is possible to distinguish whether nucleotide mutations at different positions are present simultaneously in one genotype or mixed in different genotypes. . For example, humans have two (one pair) chromosomes containing the same genetic information, and if a genetic mutation occurs, all two chromosomes may have a mutation (homo), but only one chromosome It can happen (hetero). When two or more adjacent base mutations are all heterozygous, two base mutations may exist simultaneously in one chromosome, but may exist in different chromosomes. Since the two cases may have different effects on living organisms, it is necessary to distinguish them. In the case of a virus that infects humans, several types of genotypes may exist together. When two or more adjacent base mutations are all heterogeneous, it is necessary to distinguish whether two base mutations exist simultaneously in one genotype or are divided into different genotypes.
本発明は、遺伝変異を分析するためその結果物が制限酵素で切断できる部位を含むよう望む塩基配列を増幅するが、制限酵素により切断された断片の塩基の数が32個以下になるようにし、そのうち少なくとも1つの塩基はプライマーでない鋳型(template)の複製により生成されるようにし、増幅された生成物を制限酵素で切断した後分子量を測定することにより遺伝変異を分析する方法を提供する。 In the present invention, in order to analyze genetic variation, a desired base sequence is amplified so that the resultant product contains a site that can be cleaved by a restriction enzyme. However, the number of bases of a fragment cleaved by a restriction enzyme should be 32 or less. In this method, at least one base is generated by replication of a template that is not a primer, and the amplified product is cleaved with a restriction enzyme, followed by measuring the molecular weight, thereby providing a method for analyzing genetic variation.
即ち、本発明はフォワードプライマー及びリバースプライマーを利用して特定ポリヌクレオチドを増幅する段階、前記増幅された特定ポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、2〜32個塩基の大きさを有しながら変異配列を含む2種類以上の単一筋のポリヌクレオチド切片を生成する段階、及び前記切断された切片の分子量を測定する段階を含む遺伝子変異分析方法を提供する。本発明で、互いに異なる2つ以上の塩基変異中1つの変異は1つの単一筋(単一鎖)のポリヌクレオチド切片にのみ存在し、さらに他の単一筋のヌクレオチド切片には2つ以上の塩基変異を全て含むよう切断するのが好ましい。たとえば、...ATG...との配列中でAとGが変異配列である場合、制限酵素切断により生成された第1の単一筋のヌクレオチドは2つの変異配列中Aのみを含んでおり、第2の単一筋のヌクレオチドはAとGを全て含むように切断する場合である。
本発明は、遺伝変異を分析するためその生成物が制限酵素で切断できる部位を含むよう望む塩基配列を増幅するが、下記の表1のような構造の断片を作る方法を提供する。
That is, the present invention amplifies a specific polynucleotide using a forward primer and a reverse primer, cleaves the amplified specific polynucleotide with a restriction enzyme, and has a mutant sequence having a size of 2 to 32 bases. A method for gene mutation analysis comprising the steps of generating two or more types of single muscle polynucleotide sections comprising: and measuring the molecular weight of the cut sections. In the present invention, one of two or more base mutations different from each other is present only in one single-muscle (single-strand) polynucleotide section, and the other single-muscle nucleotide section has two or more bases. It is preferred to cleave to include all mutations. For example,. . . ATG. . . And A and G are mutant sequences, the first single muscle nucleotide produced by restriction enzyme cleavage contains only A in the two mutant sequences, and the second single muscle nucleotide is This is a case of cutting so as to include all of A and G.
The present invention provides a method for amplifying a desired base sequence to include a site that can be cleaved by a restriction enzyme in order to analyze a genetic variation, but producing a fragment having the structure shown in Table 1 below.
‘制限酵素認知配列’は、互いに異なる制限酵素により同時に又は隣接して認知される配列であり、切断される配列と一致しないこともある。たとえば、Fok1とBstF5Iは全てGGATG配列を認知するが、切断される位置は認知配列の3’末端からそれぞれ第9/第13と第2/第0の塩基の次である。制限酵素認知配列を認知する本発明で用いることができる2つの制限酵素は本発明の目的に用いることができる全ての制限酵素、即ち互いに同一の最適温度又は互いに異なる最適温度を有する制限酵素が可能であり、その中でも互いに異なる最適温度を有しているのがさらに好ましく、相対的に低い最適温度を有する制限酵素としてFok1、Bbv I、Bsg I、Bcg I、Bpm I、BseR I又はBae Iが好ましく、相対的に高い最適温度を有する制限酵素としてBstF5 I、Taq I、BsaB I、Btr I、BstAP I、Fau I、Bcl I、Pci I又はApo Iが好ましく、Fok1及びBstF5 I対が最も好ましい。
制限酵素Bae Iは25℃、Fok1、Bbv I、Bsg I、Bcg I、Bpm I、BseR I、Mmel I及びAvaIIは37℃の相対的に低い最適温度を有し、BstF5 I及びTaq Iは65℃、BsaB I、Btr I及びBstAP Iは60℃、Fau Iは55℃、Bcl I、Pci I及びApo Iは50℃の相対的に高い最適温度を有する。
A “restriction enzyme recognition sequence” is a sequence recognized simultaneously or adjacent to different restriction enzymes, and may not match the sequence to be cleaved. For example, Fok1 and BstF5I all recognize the GGATG sequence, but the cleaved positions are next to the 9th / 13th and 2nd / 0th bases from the 3 ′ end of the recognition sequence, respectively. The two restriction enzymes that can be used in the present invention for recognizing restriction enzyme recognition sequences are all restriction enzymes that can be used for the purpose of the present invention, that is, restriction enzymes having the same or different optimum temperatures. Among them, it is more preferable that they have optimum temperatures different from each other, and Fok1, Bbv I, Bsg I, Bcg I, Bpm I, BseR I or Bae I are restriction enzymes having relatively low optimum temperatures. Preferably, BstF5 I, Taq I, BsaB I, Btr I, BstAP I, Fau I, Bcl I, Pci I or Apo I are preferred as restriction enzymes having relatively high optimum temperatures, and Fok1 and BstF5 I pairs are most preferred. .
Restriction enzymes Bae I have 25 ° C., Fok1, Bbv I, Bsg I, Bcg I, Bpm I, BseR I, Mmel I and AvaII have a relatively low optimum temperature of 37 ° C., and BstF5 I and Taq I have 65 C, BsaB I, Btr I and BstAP I have a relatively high optimum temperature of 60 ° C., Fau I has a temperature of 55 ° C., Bcl I, Pci I and Apo I have a relatively high optimum temperature of 50 ° C.
PCR増幅に用いる2つのプライマーのうち1つはプライマー結合配列1、制限酵素認知配列、そしてプライマー結合配列2で構成されており、残りの1つはプライマー結合配列3で構成されている。
‘プライマー結合配列’は鋳型になる核酸と相補的に結合することができる配列であるが、制限酵素認知配列は核酸と相補的でない場合もある。プライマー結合配列1、2、そして3はプライマーがtemplate DNAと結合するためには少なくとも4つ以上でなければならないので、その塩基数は4つ以上でなければならず、8〜30個の大きさでtemplate DNAと最もよく結合したため、8つ以上、30個以下であるのが好ましい。‘変異前配列’は調査しようとする塩基変異の5’の方の配列である。‘変異配列’は調査しようとする塩基の変異に該当する配列である。塩基の置換、挿入、欠失が起こることもあるが、塩基数は1つのものが普通であり、2つ以上の場合もある。‘変異後配列’は変異配列の3’の方の配列である。
One of the two primers used for PCR amplification is composed of a primer binding sequence 1, a restriction enzyme recognition sequence, and a primer binding sequence 2. The remaining one is composed of a primer binding sequence 3.
A “primer binding sequence” is a sequence that can be complementarily bound to a template nucleic acid, but a restriction enzyme recognition sequence may not be complementary to a nucleic acid. Primer binding sequences 1, 2, and 3 must be at least 4 in order for the primer to bind to the template DNA, so the number of bases must be at least 4 and has a size of 8-30. It is preferable that the number is 8 or more and 30 or less because it binds best with the template DNA. The “pre-mutation sequence” is the sequence of the 5 ′ base mutation to be investigated. The “mutant sequence” is a sequence corresponding to the base mutation to be investigated. Although base substitution, insertion, and deletion may occur, the number of bases is usually one, and there may be two or more. The “post-mutation sequence” is the sequence of 3 ′ of the mutant sequence.
変異前配列と変異後配列を合わせて1つ以上であるのが好ましい。制限酵素の切断後生成される切片は変異配列を含んでいなければならず、切片の塩基数は2〜32個であるのが好ましい。より好ましくは、12個の塩基を有するのが良い。切断された切片の大きさを数値限定した理由は、マススペクトロメトリで分析する場合、分析結果が良好な切片のサイズを反映したのである。32個を超える大きさを有する切片は、マススペクトロメトリを利用して分子量を計算することにより塩基変異を調査するにはあまりにも大きいので、前記のような切片の塩基数が好ましい。さらに、1つの塩基だけで成る切片の場合は変異配列だけを含んでいるものであるので、プライマーが誤った位置に結合したのかを確認するのを困難にするので好ましくない。2つの制限酵素が同一又は隣接した部位を認知するので、2つの制限酵素のうち何れか1つの反応が進められる間にさらに他の1つの制限酵素は作用しないのが好ましい。このような場合、増幅された生成物を制限酵素で切断するとき、2つの制限酵素の最適温度に鑑み互いに異なる温度で連続して反応させることができる。若しくは、1つの制限酵素で先ず切断してから残りの酵素で切断することもできる。このとき、先に用いる制限酵素による切断が変異配列を含む切片に存在する第2の制限酵素の認知配列又は切断位置を除去又は損壊してはならない。 It is preferable that the pre-mutation sequence and the post-mutation sequence are one or more. The section generated after cleavage of the restriction enzyme must contain a mutated sequence, and the number of bases in the section is preferably 2 to 32. More preferably, it has 12 bases. The reason for numerically limiting the size of the cut section is that when analyzed by mass spectrometry, the analysis result reflects the size of the section with good results. Since the section having a size of more than 32 is too large for investigating the base mutation by calculating the molecular weight using mass spectrometry, the number of bases in the section as described above is preferable. Furthermore, since a section consisting of only one base contains only the mutated sequence, it is not preferable because it makes it difficult to confirm whether the primer is bound at the wrong position. Since the two restriction enzymes recognize the same or adjacent sites, it is preferable that the other restriction enzyme does not act while the reaction of any one of the two restriction enzymes proceeds. In such a case, when the amplified product is cleaved with a restriction enzyme, it can be continuously reacted at different temperatures in view of the optimum temperature of the two restriction enzymes. Alternatively, it is possible to first cleave with one restriction enzyme and then cleave with the remaining enzymes. At this time, the restriction sequence previously used should not remove or destroy the recognition sequence or cleavage position of the second restriction enzyme present in the section containing the mutated sequence.
本発明は、既存の塩基変異分析方法が有していた誤謬による誤った分析を検証することができ、32個塩基範囲以内に隣接した幾多の塩基の変異を同時に調査することができる。特に、塩基の変異を示す生命体の遺伝型が幾種類に存在する場合、互いに異なる位置の塩基変異が1つの遺伝型に同時に存在するのか、それとも2種類以上の遺伝型に混在され存在するのかを区別することができる。さらに、欠失又は挿入による遺伝変異も検測することができる。 The present invention can verify an erroneous analysis due to an error that the existing base mutation analysis method has, and can simultaneously investigate a number of adjacent base mutations within a range of 32 bases. In particular, when there are several types of genotypes of organisms that exhibit base mutations, whether there are base mutations at different positions in one genotype at the same time, or is there a mixture of two or more genotypes? Can be distinguished. Furthermore, genetic mutations due to deletions or insertions can also be measured.
以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
人間のmaspin遺伝子の第4のイントロンの第2741の塩基の塩基変異
人間の癌転移抑制遺伝子として知られたmaspin(serpinb5)遺伝子の第4のイントロンの第2741の塩基(rs1509477;染色体18番の第61001755の塩基)の変異を調査した。
2741th base mutation of the 4th intron of the human maspin gene 2741st base of the 4th intron of the maspin (serpinb5) gene (rs1509477; chromosome 18th) known as a human cancer metastasis suppressor gene 61001755 base) mutation was investigated.
1.PCR増幅と制限酵素切断
Template DNAの配列(5’→3’)は下記の通りである。
GTTTCACTTGATAAAGCAATAAAATGCTATTCAcAGCTGCATGAGGCTACACCCTTCTTTTGAATGCAG(配列番号1)
下線の配列等は下記のプライマー1と2が結合する部位等である。小文字で表記された塩基は‘変異配列’(以下、SNP部位に位置する塩基という)である。
プライマー1.5’‐TCACTTGATAAAGCAATAAAAggatgGCTATTCA‐3’(34mer)(配列番号2)
プライマー2.5’‐CATTCAAAAGAAGGGTGTAGCCTCATGC‐3’(28mer)(配列番号3)
小文字で表記された配列はFokI及びBstF5Iの認識配列である。
PCR buffer(1x)、MgSO4 2 mM、dNTP 200 mM、Platinum Taq Polymerase (Invitrogen、10966-026) 0.315U、プライマー1と2それぞれ0.5uM、ゲノムDNA 36ngを投入して総反応嵩を18μlに合わせる。そして、次の条件でPCR反応を行う。
94℃ 2分、
94℃ 15秒 55℃ 15秒 72℃ 30秒(10cycles)、
94℃ 15秒 60℃ 15秒 72℃ 30秒(35cycles)
1. PCR amplification and restriction enzyme cleavage
The template DNA sequence (5 ′ → 3 ′) is as follows.
GTT TCACTTGATAAAGCAAATAAATGCTATTCA cAGCT GCATGAGGCTACACCCTTCTTTTGAAT GCAG ( SEQ ID NO: 1)
The underlined sequence is the site where the following primers 1 and 2 bind. Bases written in lower case are 'mutant sequences' (hereinafter referred to as bases located at the SNP site) .
Primer 1.5'-TCACTTTGAATAAGCAATAAAAggatgGCTATTCA-3 '(34mer) ( SEQ ID NO: 2)
Primer 2.5'-CATTCAAAAGAGGGGTGTAGCCCTCATGC-3 '(28mer) ( SEQ ID NO: 3)
The sequence written in lower case is the recognition sequence for Fok I and BstF5I.
PCR buffer (1x), MgSO 4 2 mM, dNTP 200 mM, Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, 10966-026) 0.315 U, primers 1 and 2 each 0.5 uM, genomic DNA 36 ng, total reaction volume to 18 μl Match. And PCR reaction is performed on the following conditions.
94 ° C for 2 minutes,
94 ° C 15 seconds 55 ° C 15 seconds 72 ° C 30 seconds (10 cycles)
94 ℃ 15 seconds 60 ℃ 15 seconds 72 ℃ 30 seconds (35cycles)
ゲノムDNAは、血液から抽出し通常の方法により純粋分離する。たとえば、‘SDS/蛋白質分解酵素K’方法を用いることができる(Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harber, 1989)又はQIAamp DNA Mini Kit 250(Qiagen 51106)を用いて血液からDNAを分離することができる。DNAの濃度が低い場合、次のような方法でDNAを濃縮して用いることができる。DNA溶液に1/10嵩の3M Sodium acetate(pH 5.3)と2.5嵩のエタノールを投入して緩やかに混合した後、−20℃で1時間以上のあいだ放置する。4℃、13000rpmで15分間遠心分離する。上澄液を慎重に除去し70%エタノールを投入して4℃、13000rpmで10分間遠心分離する。エタノールを乾燥させた後、望む嵩の蒸留水を添加して溶解する。 Genomic DNA is extracted from blood and purely separated by conventional methods. For example, the 'SDS / protease K' method can be used (Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harber, 1989) or QIAamp DNA Mini Kit 250 (Qiagen 51106). DNA can be separated from blood. When the DNA concentration is low, the DNA can be concentrated and used by the following method. 1/10 volume of 3M Sodium acetate (pH 5.3) and 2.5 volume of ethanol are added to the DNA solution and gently mixed, and then left at -20 ° C for 1 hour or longer. Centrifuge for 15 minutes at 13000 rpm at 4 ° C. Carefully remove the supernatant, add 70% ethanol, and centrifuge at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. After the ethanol is dried, the desired volume of distilled water is added and dissolved.
PCRを介して生成される断片の配列は次の通りである(5’→3’)。
TCACTTGATAAAGCAATAAAAggatgGCTATTCA[C/T]AGCTGCATGAGGCTACACCCTTCTTTTGAATG(配列番号4)
AGTGAACTATTTCGTTATTTTcctacCGATAAGT[G/A]TCGACGTACTCCGATGTGGGAAGAAAACTTAC(配列番号5)
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認識される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される断片の配列であり、大括弧([])で表記された塩基はSNP部位に位置する塩基である。この反応物にFokI(NEB R109L)1U、BstF5I(NEB、V0031L)1U、50mM potassium acetate、20mM Tris-acetate、10mM magnesium acetate、1mM DTT(pH7.9@25℃)反応組成下で25℃で2時間、連続的に45℃でも2時間のあいだ反応を実施する。
The sequence of the fragment generated via PCR is as follows (5 ′ → 3 ′).
TCACTTTGAATAAGCAATAAAAAggatgGC TATTCA [C / T] AGCTGCCATGAGGCTACACCCTTCTTTTGAATG ( SEQ ID NO: 4)
AGTGAACTATTTCGTTATTTTcctac CGATAAGT [G / A] TCGA CGTACTCCGATGTGGAGAAAAAACTTAC ( SEQ ID NO: 5)
The site shown in lower case is a sequence recognized by Fok I and BstF5I, the underlined site is the sequence of a fragment generated by restriction enzyme cleavage, and the base shown in brackets ([]) is SNP. A base located at a site . This reaction was mixed with FokI (NEB R109L) 1U, BstF5I (NEB, V0031L) 1U, 50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT ( pH 7.9@25° C.) at 25 ° C. The reaction is carried out for 2 hours continuously at 45 ° C. for 2 hours.
酵素反応の最適化のため、増幅された生成物をFok1とBstF5Iで25℃、37℃、45℃、55℃、65℃でそれぞれ反応した結果Fok Iの場合は25℃で70%、37%で90%以上反応が進められるものと確認された。併せて、BstF5Iの場合は25℃を除いた温度で酵素反応が進められるのが確認された。したがって、FokIのみ作用することができる温度の25℃で先ず反応させてから、BstF5Iが反応することができる温度の37℃以上で反応させるのが好ましい。 In order to optimize the enzyme reaction, the amplified product was reacted with Fok1 and BstF5I at 25 ° C, 37 ° C, 45 ° C, 55 ° C, and 65 ° C. As a result, in the case of FokI, 70% and 37% at 25 ° C. It was confirmed that the reaction proceeded by 90% or more. In addition, in the case of BstF5I, it was confirmed that the enzyme reaction proceeded at a temperature excluding 25 ° C. Therefore, it is preferable that the reaction is first performed at 25 ° C. at which FokI can act alone and then at 37 ° C. or higher at which BstF5I can react.
2.精製及び脱塩
制限酵素で処理した前記の溶液からDNA切片を純粋分離した後、分子量を測定するのが好ましい。たとえば、Nucleave Genotyping Kit(Variagenics,USA)を用いることができる。先ず、制限酵素反応液に1M TEAA(Triethylammoniumacetate,pH7.6)70μlを添加して1分間放置する。Sample Preparation Plateに1M TEAA 70μlと前記の混合液90μlを順次投入して通過した後、0.1M TEAA 85μlを5回完全に通過させる。Sample Preparation Plateを1000rpmで5分間遠心分離する。Collection Plate上にSample Preparation Plateを位置させ、60% isopropanol 60μlを投入して通過させる。溶出液がCollection Plateに集まるとCollection Plateを115℃で75分間乾燥させる。
2. Purification and desalting It is preferable to measure the molecular weight after pure separation of DNA sections from the solution treated with restriction enzymes. For example, Nucleave Genotyping Kit (Variagenics, USA) can be used. First, 70 μl of 1M TEAA (Triethylammoniumacetate, pH 7.6) is added to the restriction enzyme reaction solution and left for 1 minute. 70 μl of 1M TEAA and 90 μl of the above mixed solution are sequentially put into the sample preparation plate and passed through, and then 85 μl of 0.1M TEAA is completely passed through 5 times. Centrifuge the Sample Preparation Plate at 1000 rpm for 5 minutes. Place the Sample Preparation Plate on the Collection Plate, add 60 μl of 60% isopropanol and let it pass. When the eluate is collected on the collection plate, the collection plate is dried at 115 ° C. for 75 minutes.
3.MALDI−TOFマススペクトロメトリ
Collection plateにMALDI matrix(22.8mg ammonium citrate,148.5mg hydroxypicolinic acid,1.12ml acetonitrile,7.8ml H2O)6μlを添加した後、そのうち4μlをMALDI−TOF(Biflex IV,Bruker)のAnchor chip plateに載せる。37℃で30分間乾燥させ、室温に暫く置いて熱を冷やした後、MALDI−TOFで分析する。分析方法はMALDI−TOFのマニュアルに従う。
第4のイントロンの第2741の塩基が正常の場合(C/C)、酵素切断後生成される切片の分子量は2135.4D(7mer)と4078.6(13mer)Dである(図1及び図2)。ヘテロの場合(C/T)、生成される切片の分子量は2135.4D、2150.4D(以上7mer)、4078.6D、そして4062.6D(13mer)である(図3及び図4)。一方、全てTに変異された場合(T/T)、切片の分子量は2150.4D(7mer)と4062.6D(13mer)である(図5及び図6)。
3. MALDI-TOF mass spectrometry
After adding 6 μl of MALDI matrix (22.8 mg ammonium citrate, 148.5 mg hydroxypicolinic acid, 1.12 ml acetonitrile, 7.8 ml H 2 O) to the collection plate, 4 μl of this was added to Anchor of MALDI-TOF (Biflex IV, Bruker). Place on the chip plate. The sample is dried at 37 ° C. for 30 minutes, allowed to cool to room temperature for a while, and then analyzed by MALDI-TOF. The analysis method follows the MALDI-TOF manual.
When the 2741st base of the fourth intron is normal (C / C), the molecular weights of the sections generated after enzymatic cleavage are 215.4D (7mer) and 4078.6 (13mer) D (FIGS. 1 and 2). In the case of heterogeneity (C / T), the molecular weights of the generated sections are 215.4D, 210.4D (more than 7mer), 4078.6D, and 4062.6D (13mer) (FIGS. 3 and 4). On the other hand, when all are mutated to T (T / T), the molecular weights of the sections are 210.4D (7mer) and 4062.6D (13mer) (FIGS. 5 and 6).
人間の癌転移抑制遺伝子として知られたmaspin(serpinb5)遺伝子の第4のイントロンの第3597の塩基(rs1396782;染色体18番目の第61002611の塩基)の変異
Template DNAの配列は次の通りである。
CTGGAGTATTATCCTTGCAGGCTTGATATGAAGcTTGAAATTTCTCCCCAAAGAGATTTAGTTAACAGGCAAA(配列番号6)
前記の配列で下線の部位は、下記のプライマー3と4がそれぞれ結合する部位である。小文字で表記された塩基がSNP部位に位置する塩基である。
プライマー3.5’‐GAGTATTATCCTTGCAGGCTTggatgATATGAAG‐3’(34mer)(配列番号7)
プライマー4.5’‐GCCTGTTAACTAAATCTCTTTGGGGAGAA‐3’(29mer)(配列番号8)
上記のプライマーで小文字で表記された部位はTemplate DNAに存在しない配列であり、FokI及びBstF5Iにより認識される配列である。PCR反応を含む実験方法は実施例1と同一である。
Mutation of base 3597 (rs1396782; base 18002611 of chromosome 18) of the fourth intron of the maspin (serpinb5) gene known as a human cancer metastasis suppressor gene
The sequence of Template DNA is as follows.
CTG GAGTATTATCCCTTGCAGGCTTGATATGAAG cTTGAAAT TTCTCCCCAAAGAGATTTAGTATACAGGC AAA ( SEQ ID NO: 6)
The underlined site in the above sequence is the site where the following primers 3 and 4 bind respectively. The base indicated in lower case is the base located at the SNP site .
Primer 3.5 '- GAGTATTATCCTTGCAGGCTTggatgATATGAAG - 3' ( 34mer) ( SEQ ID NO: 7)
Primer 4.5'-GCCTGTTAACTAAATCTCTTTGGGGGAGAA-3 '(29mer) ( SEQ ID NO: 8)
The site indicated in lower case in the above primer is a sequence that does not exist in Template DNA and is a sequence recognized by Fok I and BstF5I. The experimental method including the PCR reaction is the same as in Example 1.
PCRを介して生成される断片の配列は次の通りである(5’→3’)。
GAGTATTATCCTTGCAGGCTTggatgATATGAAG[C/T]TTGAAATTTCTCCCCAAAGAGATTTAGTTAACAGGC(配列番号9)
CTCATAATAGGAACGTCCGAAcctacTATACTTC[G/A]AACTTTAAAGAGGGGTTTCTCTAAATCAATTGTCCG(配列番号10)
上記の配列で小文字で示された部位は制限酵素認識配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される断片の配列であり、大括弧([])で表記された塩基はSNP部位に位置する塩基である。この反応物にFokI(NEB R109L)1U、BstF5I(NEB、V0031L)1U、50mM potassium acetate、20mM Tris-acetate、10mM magnesium acetate、1mM DTT(pH7.9@25℃)反応組成下で25℃で2時間、連続的に45℃でも2時間のあいだ反応を実施する。
The sequence of the fragment generated via PCR is as follows (5 ′ → 3 ′).
GAGTATTATCCCTTGCAGGCTTTagatgAT ATGAAG [C / T] TTGAAAATTTCTCCCCCAAAGAGATTTAGTATACAGGC ( SEQ ID NO: 9)
CTCATAATAGGAACGTCCGAAcctac TATACTC [G / A] AACT TTAAAAGGGGGTTTCTCTAAACATATTGCTC ( SEQ ID NO: 10)
The site shown in lower case in the above sequence is a restriction enzyme recognition sequence, the underlined site is the sequence of a fragment generated by cleavage of the restriction enzyme, and the base indicated in brackets ([]) is the SNP site. Is the base located at This reaction was mixed with FokI (NEB R109L) 1U, BstF5I (NEB, V0031L) 1U, 50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT ( pH 7.9@25° C.) at 25 ° C. The reaction is carried out for 2 hours continuously at 45 ° C. for 2 hours.
第4のイントロンの第3597の塩基が正常の場合(C/C)、酵素切断後生成される切片の分子量は2209.4D(7mer)と3988.6(13mer)Dである(図7)。ヘテロの場合(C/T)、生成される切片の分子量は2209.4D、2224.4D(以上7mer)、3988.6D、そして3972.6D(13mer)である(図8)。一方、全てTに変異された場合(T/T)、切片の分子量は2224.4D(7mer)と3972.6D(13mer)である(図9)。 When the 3597th base of the 4th intron is normal (C / C), the molecular weights of the sections produced after enzymatic cleavage are 2209.4D (7mer) and 3988.6 (13mer) D (FIG. 7). When heterozygous (C / T), the molecular weights of the generated sections are 2209.4D, 2224.4D (more than 7mer), 3988.6D, and 3962.6D (13mer) (FIG. 8). On the other hand, when all were mutated to T (T / T), the molecular weights of the sections were 2224.4D (7mer) and 3962.6D (13mer) (FIG. 9).
B型肝炎ウイルスDNA重合酵素のチロシン−メチオニン−アスパテート−アスパテート(YMDD)部位塩基変異
人間にB型肝炎を誘発させるB型感染ウイルスのDNA重合酵素遺伝子内に位置するYMDD部位の塩基変異を調査した。この部位の塩基変異によりB型肝炎の治療剤であるラミブジンに対する耐性が発生する。552番コドンのメチオニン(M)がバリン(V)又はイソロイシン(I)に変化した場合にラミブジンに対する耐性が生じるものと知られている。
Tyrosine-methionine-aspartate-aspartate (YMDD) site base mutation of hepatitis B virus DNA polymerase We investigated the base mutation of the YMDD site located in the DNA polymerase gene of the B virus-infected virus that induces hepatitis B in humans. . Resistance to lamivudine, a therapeutic agent for hepatitis B, is generated by base mutation at this site. It is known that resistance to lamivudine occurs when the methionine (M) of codon 552 is changed to valine (V) or isoleucine (I).
1.PCR増幅と制限酵素切断
QIAamp blood kit(Qiagen, CA)を用いてB型肝炎ウイルスのDNAを血清0.2mlから抽出し、このうち2μlをPCR増幅に用いる。
Template DNAの配列(5’→3’)は下記の通りである。
TTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTA
(配列番号11)
下線の配列等は、下記のプライマー5と6が結合する部位等である。
プライマー5.5’‐TTCCCCCACTGTTTGGCTggatgTCAGTTAT‐3’(31mer)(配列番号12)
プライマー6.5’‐TACAGACTTGGCCCCCAATACCACATGATC‐3’(30mer)(配列番号13)
プライマー5で小文字で表記された配列はFokI及びBstF5Iの認識配列でTemplate DNAにはないものを人為的に挿入した配列であり、プライマー6で下線の配列はFokIにより認識されるのを防ぐため人為的に変更した配列である。
20mM TrisHCl(pH8.4)、50mM KCl、0.2mM dNTP、0.4U Platinum Taq Polymerase(Invitrogen, 10966-026)、プライマー5と6それぞれ10pmolを含んだ反応溶液18μlを用いて次の条件でPCR反応を行う。
94℃ 2分、
94℃ 15秒 50℃ 15秒 72℃ 30秒(10cycles)、
94℃ 15秒 55℃ 15秒 72℃ 30秒(35cycles)
1. PCR amplification and restriction enzyme cleavage Hepatitis B virus DNA is extracted from 0.2 ml of serum using QIAamp blood kit (Qiagen, CA), 2 μl of which is used for PCR amplification.
The template DNA sequence (5 ′ → 3 ′) is as follows.
TTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT ATG GATGATTGGGTATTGGGGCCCAAGTCTGTA
( SEQ ID NO: 11)
The underlined sequence is the site where the following primers 5 and 6 bind.
Primer 5.5'-TTCCCCCACTGTTTGGCTggatgTCAGTTAT-3 '(31mer) (SEQ ID NO: 12)
Primer 6.5′-TACAGACTTGGCCCCACATACACCCAT G ATC-3 ′ (30mer) (SEQ ID NO: 13)
The sequence written in lower case in primer 5 is a sequence in which Fok I and BstF5I recognition sequences that are not present in Template DNA are artificially inserted. In primer 6, the underlined sequence is prevented from being recognized by Fok I. Therefore, it is an artificially modified array.
PCR using 20 mM TrisHCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP, 0.4 U Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, 10966-026), 18 μl of a reaction solution containing 10 pmol each of primers 5 and 6 under the following conditions Perform the reaction.
94 ° C for 2 minutes,
94 ° C 15 seconds 50 ° C 15 seconds 72 ° C 30 seconds (10 cycles)
94 ℃ 15 seconds 55 ℃ 15 seconds 72 ℃ 30 seconds (35cycles)
PCRを介して生成される断片の配列は次の通りである(5’→3’)。
TTCCCCCACTGTTTGGCTggatgTCAGTTATATGGATCATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTA(配列番号14)
AAGGGGGTGACAAACCGAcctacAGTCAATATACCTAGTACACCATAACCCCCGGTTCAGACAT(配列番号15)
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認識される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される断片の配列である。PCR反応物をFokI(NEB R109L)1U、BstF5I(NEB、V0031L)1U及び反応溶液(50mM potassium acetate、20mM Tris-acetate、10mM magnesium acetate、1mM DTT)10μlと混合して37℃で2時間、そして45℃で2時間のあいだ反応を実施する。37℃で2時間のあいだFokIで先ず切断した後、BstF5Iを投入して45℃で2時間のあいだ切断することもできる。
The sequence of the fragment generated via PCR is as follows (5 ′ → 3 ′).
TTCCCCCACTGTTTGGCTggatgTC AGTTATA TGGATCATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTA ( SEQ ID NO: 14)
AAGGGGGGTGACAAACCGAcctac AGTCAATATACACT AGTACACCATAACCCCCCGGTTCAGACAT ( SEQ ID NO: 15)
The site indicated in lower case is the sequence recognized by Fok I and BstF5I, and the underlined site is the sequence of the fragment produced by restriction enzyme cleavage. PCR reaction was mixed with 1U of FokI (NEB R109L), 1U of BstF5I (NEB, V0031L) and 10 μl of reaction solution (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT) at 37 ° C. for 2 hours, and The reaction is carried out at 45 ° C. for 2 hours. After first cutting with FokI for 2 hours at 37 ° C, BstF5I can be added to cut at 45 ° C for 2 hours.
2.精製及び脱塩とMALDI−TOFマススペクトロメトリ
実施例1と同様の方法で行う。
酵素切断により生成される切片の計算上の大きさと実際の分子量分析により測定した値は、0.1%以下の差を示す程度に正確に一致した(表2)。
2. Purification and desalting and MALDI-TOF mass spectrometry The same procedure as in Example 1 is performed.
The calculated size of the section produced by enzymatic cleavage and the value measured by actual molecular weight analysis agreed exactly to the extent that they showed a difference of 0.1% or less (Table 2).
C型肝炎ウイルスの5’NCR(Non Coding Region)部位の塩基変異
慢性C型肝炎の治療のためインターフェロンを用いる場合、人体のC型肝炎ウイルスの遺伝子型に従い異なる治療効果を示し、インターフェロンを用いる前に体内に存在するC型肝炎ウイルスの遺伝子型の調査が必要である。遺伝子型を明らかにするため、5’NCRの塩基変異を調査するのが有効であり、本実施例はC型肝炎ウイルスの5’NCR部位の塩基変異を分析する方法を記述したものである。
Base mutation at the 5 'NCR (Non Coding Region) site of hepatitis C virus When interferon is used for the treatment of chronic hepatitis C, it shows different therapeutic effects according to the genotype of human hepatitis C virus, before using interferon In addition, it is necessary to investigate the genotype of hepatitis C virus present in the body. In order to clarify the genotype, it is effective to investigate the 5′NCR base mutation, and this example describes a method for analyzing the base mutation at the 5′NCR site of hepatitis C virus.
1.RT PCR
QIAamp viral RNA Mini kit(Qiagen,CA)を用いてC型肝炎ウイルスのRNAを血清0.14mlから抽出し、このうち10μlをRT PCR増幅に用いる。
0.2mM dNTP、0.4μMプライマー2、10μl RNAを含んだ反応溶液を65℃で5分間反応させた後、氷に1分間放置する。この反応液に20mM TrisHCl(pH8.4)、50mM KCl、4mM DTT、0.4μMプライマー1、100U SuperScript III RNase H−Reverse Transcriptase(Invitrogen,18080-044)、20U RNaseOUT(Invitrogen,10777-019)、0.4U Platinum Taq Polymerase(Invitrogen,10966-026)を混合した反応溶液25μlを用いて次の条件でRT PCRを行う。
50℃ 45分、
94℃ 2分、
94℃ 15秒 55℃ 15秒 72℃ 15秒(35cycles)
72℃ 5分
1. RT PCR
Hepatitis C virus RNA is extracted from 0.14 ml of serum using QIAamp viral RNA Mini kit (Qiagen, CA), 10 μl of which is used for RT PCR amplification.
The reaction solution containing 0.2 mM dNTP, 0.4 μM primer 2, and 10 μl RNA is reacted at 65 ° C. for 5 minutes, and then left on ice for 1 minute. To this reaction solution, 20 mM TrisHCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 4 mM DTT, 0.4 μM primer 1, 100 U SuperScript III RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen, 18080-044), 20 U RNaseOUT (Invitrogen, 10777-019), RT PCR is performed under the following conditions using 25 μl of a reaction solution mixed with 0.4 U Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, 10966-026).
50 ° C 45 minutes,
94 ° C for 2 minutes,
94 ℃ 15 seconds 55 ℃ 15 seconds 72 ℃ 15 seconds (35cycles)
72 ° C 5 minutes
Template DNAの配列(5’→3’)は下記の通りである。
GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGT(中間省略)ACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAG(配列番号16)
下線の配列等は下記のプライマー7と8が結合する部位等である。
プライマー7.5’‐GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT‐3’(24mer)(配列番号17)
プライマー8.5’‐CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT‐3’(24mer)(配列番号18)
The template DNA sequence (5 ′ → 3 ′) is as follows.
GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGGT TAGTATGAGT (intermediate omission) ACTGCCTGATAGGGTGCTTGGCAG ( SEQ ID NO: 16)
The underlined sequence and the like are the sites where the following primers 7 and 8 bind.
Primer 7.5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3 '(24mer) (SEQ ID NO: 17)
Primer 8.5′-CTCGCAAGCACCCTATCAGGGCAGT-3 ′ (24mer) (SEQ ID NO: 18)
2.Nested PCR及び制限酵素切断
前記RT PCR反応液を1/50に希釈してそのうち2μlを20mM TrisHCl(pH8.4)、50mM KCl、0.2mM dNTP、0.4U Platinum Taq Polymerase(Invitrogen,10966-026)、プライマー9と10、11と12又は13と14をそれぞれ10pmolずつを含んだ反応溶液18μlを用いて次の3種類のPCR反応及び制限酵素処理を実施する。反応1ではプライマー9と10を、反応2ではプライマー11と12を、そして反応3ではプライマー13と14を用いる。3種類の反応全てのPCR反応温度及び時間は次の通りである。
94℃ 5分、
94℃ 30秒 55℃ 30秒 72℃ 30秒(35cycles)
72℃ 5分
2. Nested PCR and restriction enzyme cleavage The RT PCR reaction solution was diluted to 1/50, and 2 μl thereof was diluted with 20 mM TrisHCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP, 0.4 U Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, 10966-026). ) The following three kinds of PCR reactions and restriction enzyme treatments are performed using 18 μl of a reaction solution containing 10 pmol each of primers 9 and 10, 11 and 12, or 13 and 14. In reaction 1, primers 9 and 10 are used, in reaction 2 primers 11 and 12 are used, and in reaction 3 primers 13 and 14 are used. The PCR reaction temperature and time for all three reactions are as follows.
94 ° C for 5 minutes,
94 ℃ 30 seconds 55 ℃ 30 seconds 72 ℃ 30 seconds (35cycles)
72 ° C 5 minutes
1)反応<1>
RT−PCR反応液をプライマー9と10を利用してPCRを行う。Template DNAの配列(5’→3’)は下記の通りである。
CGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCC ...(中間省略)
...CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGG(配列番号19)
下線の配列等は下記のプライマー9と10が結合する部位等である。
プライマー9.5’‐CGTCTAGCCATGGCGTTAGggatgATGAGTGT‐3’(32mer)(配列番号20)
プライマー10.5’‐CCCTATCAGGCAGTACCACAAGGC‐3’(24mer)(配列番号21)
1) Reaction <1>
PCR is performed on the RT-PCR reaction solution using primers 9 and 10. The template DNA sequence (5 ′ → 3 ′) is as follows.
CGTCTAGCCATGGCGTTTAGTATGAGGT CGTGCAGCCCTCCAGGACCCC ... (intermediate omitted)
... CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAG GCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGG ( SEQ ID NO: 19)
The underlined sequence is the site where the following primers 9 and 10 bind.
Primer 9.5'-CGTCTAGCCATGGCGGTTAGggatgATGAGTGT-3 '(32mer) (SEQ ID NO: 20)
Primer 10.5′-CCCTATCAGGGCAGTACCACAAGGC-3 ′ (24mer) (SEQ ID NO: 21)
PCRを介して生成される断片の配列は次の通りである(5’→3’)。
CGTCTAGCCATGGCGTTAGggatgATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCC...(中間省略)
GCAGATCGGTACCGCAATCCCTACTACTCACAGCACGTCGGAGGTCCTGGG...(中間省略)
... CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGG(配列番号22)
... GACGATCGGCTCATCACAACCCAGCGCTTTCCGGAACACCATGACGGACTATCCC(配列番号23)
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認識される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される断片の配列である(7merと13mer)。PCR反応物をFokI(NEB R109L)1U、BstF5I(NEB V0031L)1U及び反応溶液(50mM potassium acetate、20mM Tris-acetate、10mM magnesium acetate、1mM DTT)10μlと混合して37℃で2時間、そして45℃で2時間のあいだ反応を実施する。37℃で2時間のあいだFokIで先ず切断した後、BstF5Iを投入して45℃で2時間のあいだ切断することもできる。
The sequence of the fragment generated via PCR is as follows (5 ′ → 3 ′).
CGTCTAGCCATGGCGGTTAGggatgAT GAGTGTC GTGCAGCCTCCCAGGACCC ... (intermediate omitted)
GCAGATCGGTACCCCAATCCCTAC TACTCACAGCACCGTCGGAGGTCCTGGG ... (intermediate omitted)
CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAAGCCCTGTGGTACTGCCTGATAGGG ( SEQ ID NO: 22)
... GACGATCGGCCTCATCACAACCCACGCGTTTCCGGAACACCATGACGGGACTATCCCC ( SEQ ID NO: 23)
The site indicated in lower case is the sequence recognized by Fok I and BstF5I, and the underlined site is the sequence of the fragment generated by restriction enzyme cleavage (7mer and 13mer). The PCR reaction was mixed with 1 U of FokI (NEB R109L), 1 U of BstF5I (NEB V0031L) and 10 μl of the reaction solution (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT) at 37 ° C. for 2 hours, and 45 The reaction is carried out at 2 ° C. for 2 hours. After first cutting with FokI for 2 hours at 37 ° C, BstF5I can be added to cut at 45 ° C for 2 hours.
2)反応<2>
RT−PCR反応液をプライマー11と12を利用してPCRを行う。Template DNAの配列(5’→3’)は下記の通りである。
GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCC...(中間省略)
...CCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGRGTTGGGTRGCGAA(配列番号24)
下線の配列等は下記のプライマー配列11と12が結合する部位等である。
プライマー11.5’‐GTGGTCTGtccaacCGGTGAGTACACCGGAAT‐3’(32mer)(配列番号25)
プライマー12.5’‐TTCGCRACCCAACRCTACTCCAACGGTCCGGCTAG‐3’(35mer)(配列番号26)
Rで表記された塩基はアデニン(A)又はグアニン(G)であり、それぞれの塩基が含まれた2種類のプライマーの混合物を用いる。
2) Reaction <2>
PCR is performed on the RT-PCR reaction solution using primers 11 and 12. The template DNA sequence (5 ′ → 3 ′) is as follows.
GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCCGGAAT TGCCAGGACGACCGGGTCC ... (intermediate omitted)
... CCCCCGCAAGACTC CTAGCCGAGTAGRGGTTGGGTRGCGAA ( SEQ ID NO: 24)
The underlined sequence and the like are the sites where the following primer sequences 11 and 12 bind.
Primer 11.5'-GTGGTCTGtccacCGGGTGAGTACACCCGGAAT-3 '(32mer) (SEQ ID NO: 25)
Primer 12.5′-TTCGCRACCCAACRCTCACTCCAACGGTCCCGCTAG-3 ′ (35mer) (SEQ ID NO: 26)
The base represented by R is adenine (A) or guanine (G), and a mixture of two kinds of primers containing each base is used.
PCRを介して生成される断片の配列は次の通りである(5’→3’)。
GTGGTCTGtccaacCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCC...(中間省略)
CACCAGACaggttgGCCACTCATGTGGCCTTAACGGTCCTGCTGGCCCAGG...(中間省略)
... CCCCGCAAGACTGCTAGCCGgaccgttggaGTAGRGTTGGGTRGCGAA(配列番号27)
... GGGGCGTTCTGACGATCGGCctggcaacctCATCRCAACCCARCGCTT(配列番号28)
小文字で表記された部位はMmeI及びAvaIIによって認識される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される断片の配列である(13mer、18mer、24mer、そして19mer)。PCR反応物をMmeI(NEB R0637L)1.5U、50μM SAM及び1X反応溶液(50mM potassium acetate、20mM Tris-acetate、10mM magnesium acetate、1mM DTT、pH7.9)10μlと混合して37℃で2時間、そしてAvaII(NEB、R0153S)1.5Uを投入して37℃で2時間のあいだ反応を実施する。MmeIとAvaIIを同時に投入して反応させることもできる。
The sequence of the fragment generated via PCR is as follows (5 ′ → 3 ′).
GTGGTCTGtccacCGGTGAGTACACCCGGAATTG CCAGGACGACCGG GTCC ... (intermediate omitted)
CACCAGACaggtgtGCCACTCATGTGCCCTTA ACGGTCCTGCTGGCCCAG G ... (intermediate omitted)
... CCCCGC AAGACTGCTAGCCG gaccgtttgaGTAGRGTTGGGTRGCGAA ( SEQ ID NO: 27)
... GGGG CGTTCTGACGATCGGCctg gcaacctCATCRCAACCCARCGCTT ( SEQ ID NO: 28)
The site written in lower case is the sequence recognized by Mme I and Ava II, and the underlined site is the sequence of the fragment generated by cleavage of the restriction enzyme (13mer, 18mer, 24mer, and 19mer). The PCR reaction product was mixed with 1.5 μM of MmeI (NEB R0637L), 50 μM SAM, and 1 × reaction solution (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT, pH 7.9), and mixed at 37 ° C. for 2 hours. Then, 1.5 U of AvaII (NEB, R0153S) is added and the reaction is carried out at 37 ° C. for 2 hours. MmeI and AvaII can be added and reacted simultaneously.
3)反応<3>
RT−PCR反応液をプライマー13と14を利用してPCRを行う。Template DNAの配列(5’→3’)は下記の通りである。
GACIGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGC(配列番号29)
下線の配列等は下記のプライマー13と14が結合する部位等である、
プライマー13.5’‐GACIGGGTCCTggatgTCTTGGA‐3’(23mer)(配列番号30)
プライマー14.5’‐GCGGGGGCACggatgCCCAAAT‐3’(22mer)(配列番号31)
Iで表記された塩基はイノシン(Inosine)である。
PCRを介して生成される断片の配列は次の通りである(5’→3’)。
GACIGGGTCCTggatgTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGcatccGTGCCCCCGC(配列番号32)
CTGICCCAGGAcctacAGAACCTAGTTGG GCGAGTTACGGACC TCTAAACCCgtaggCACGGGGGCG(配列番号33)
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認識される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される断片の配列である。生成される断片は3merの2種類、13merの2種類、そして14merの2種類である。PCR反応物をFokI(NEB R109L)1U、BstF5I(NEB、V0031L)1U及び反応溶液(50mM potassium acetate、20mM Tris-acetate、10mM magnesium acetate、1mM DTT)10μlと混合して37℃で2時間、そして45℃で2時間のあいだ反応を実施する。37℃で2時間のあいだFokIで先ず切断した後、BstF5Iを投入して45℃で2時間のあいだ切断することもできる。
3) Reaction <3>
PCR is performed on the RT-PCR reaction solution using primers 13 and 14. The template DNA sequence (5 ′ → 3 ′) is as follows.
GACIGGGTCCTTTCTTGGA TCAACCCGCTCAATGCCTGGAG ATTGGGCGGTGCCCCCGC ( SEQ ID NO: 29)
The underlined sequence is the site where the following primers 13 and 14 are bound,
Primer 13.5′-GACIGGGTCCCTggatgTCTGTG-3 ′ (23mer) (SEQ ID NO: 30)
Primer 14.5′-GCGGGGGCACggatgCCCAAAT-3 ′ (22mer) (SEQ ID NO: 31)
The base represented by I is inosine.
The sequence of the fragment generated via PCR is as follows (5 ′ → 3 ′).
GACIGGGTCCTggatagTC TTGGATCAAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGG catccGTGCCCCCGC ( SEQ ID NO: 32)
CTGICCCAGGAcctac AGAACCTAGTTGG GCGAGTTACGGACC TCTAAAC CCgtggCACGGGGGCG ( SEQ ID NO: 33)
The site indicated in lower case is the sequence recognized by Fok I and BstF5I, and the underlined site is the sequence of the fragment produced by restriction enzyme cleavage. There are two types of fragments , 2 types of 3mer, 2 types of 13mer, and 2 types of 14mer. PCR reaction was mixed with 1U of FokI (NEB R109L), 1U of BstF5I (NEB, V0031L) and 10 μl of reaction solution (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT) at 37 ° C. for 2 hours, and The reaction is carried out at 45 ° C. for 2 hours. After first cutting with FokI for 2 hours at 37 ° C, BstF5I can be added to cut at 45 ° C for 2 hours.
2.精製及び脱塩とMALDI−TOFマススペクトロメトリ
3つのタイプのPCR及び制限酵素切断反応液を実施例1と同様の方法で精製して分子量を測定する。
反応<1>(表3)、<2>(表4)、そして<3>(表5)により生成された切片等の大きさは、次の表3〜表5に表記した通りである。表3〜表5に示した早見表に基づき切片等の大きさを介してC型肝炎ウイルスの遺伝型を決定する。
2. Purification, Desalting and MALDI-TOF Mass Spectrometry Three types of PCR and restriction enzyme cleavage reaction solutions are purified in the same manner as in Example 1 and the molecular weight is measured.
The sizes of the sections and the like generated by the reactions <1> (Table 3), <2> (Table 4), and <3> (Table 5) are as shown in the following Tables 3 to 5. The genotype of hepatitis C virus is determined based on the size of the section based on the quick reference table shown in Tables 3 to 5.
Claims (9)
b)前記増幅された特定2本鎖ポリヌクレオチドを前記制限酵素で切断し、前記2本鎖ポリヌクレオチド断片から2〜32個塩基の大きさを有しながら一塩基多型(SNP)部位を含む2種類以上の1本鎖ポリヌクレオチド断片を生成する制限酵素切断段階、及び
c)マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量スペクトル(MALDI−TOF MS)分析により前記生成した2種類以上の1本鎖ポリヌクレオチド断片のそれぞれの分子量を測定する分子量測定段階を含む塩基変異分析方法。 a) PCR amplification of a specific polynucleotide fragment using a forward primer comprising a site recognized by two different type II restriction enzymes and a reverse primer comprising / excluding the restriction enzyme recognition site Gene amplification stage to
b) the amplified specific double-stranded polynucleotide was cut by the restriction enzyme, including single nucleotide polymorphism (SNP) site while having a size of 2 to 32 amino bases from the double-stranded polynucleotide fragment restriction enzyme cleavage step of generating two or more single-stranded polynucleotide fragments, and c) matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectra (MALDI-TOF MS) 1 present of two or more of the above generated by analysis A base mutation analysis method comprising a molecular weight measurement step of measuring the molecular weight of each of the strand polynucleotide fragments .
b)第1の制限酵素反応が進められる間に第2の制限酵素が反応するようにして前記増幅された特定2本鎖ポリヌクレオチドを前記制限酵素で切断し、前記2本鎖ポリヌクレオチド断片から2〜32個塩基の大きさを有しながらSNP部位を含む2種類以上の1本鎖ポリヌクレオチド切片を生成する制限酵素処理段階、及び
c)前記生成した1本鎖ポリヌクレオチド断片の分子量をMALDI−TOF MSで測定する分子量測定段階を含む塩基変異分析方法。 a) Gene for PCR amplification of a specific polynucleotide fragment using a forward primer comprising a site recognized by two different types of restriction enzymes and a reverse primer comprising / not containing the restriction enzyme recognition site Amplification stage,
b) The amplified specific double-stranded polynucleotide is cleaved with the restriction enzyme so that a second restriction enzyme reacts while the first restriction enzyme reaction proceeds, and the double-stranded polynucleotide fragment is cleaved. A restriction enzyme treatment step for producing two or more kinds of single-stranded polynucleotide segments having a size of 2 to 32 bases and containing a SNP site, and c) the molecular weight of the produced single-stranded polynucleotide fragment is MALDI A base mutation analysis method including a molecular weight measurement step measured by TOF MS .
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