JP3995888B2 - 微生物計量方法および微生物計量装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種類の微生物（その意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、細菌類および真菌類等が付着あるいは混入している可能性のある検体から、これらを発色させ、生細胞および死細胞および特定の微生物を同時に計量できる微生物計量方法および微生物計量装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の微生物計量方法および微生物計量装置は、特開平１０−３２３１９７号に記載されるように添加した化合物が微生物体内に浸透した後、微生物体内の酵素反応によって分解され、蛍光を発した微生物を検出する手段が知られており、これを生きた微生物として認識している。また、死細胞を染色する試薬を併用することで生死微生物数を把握するものである。また、他の例として特開平７−１４０１４８号に記載されるように抗体を用いて特定の微生物を発光検出するものが知られており、非特異的に染色する試薬との併用で特定の微生物と生死微生物を把握するものが知られている。
【０００３】
また、食品衛生分野等では、迅速的に特定微生物を検知することが要望されている。特定微生物として大腸菌群や特定の大腸菌、食品によっては、黄色ブドウ球菌といった特定の微生物を測定する。しかし、特定微生物が一般細菌と混在している状況下や不純物が存在している状況下では、分離手段を用い分離または分離培養するか、不純物を除去する必要があり、一般細菌と特定微生物を同時に計量することができなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の微生物計量方法および微生物計量装置では、 前者の微生物類の即時判別方法は、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光試料、及びプロピデュームイオダイドからなる蛍光染料を限定条件下で使用したものであるが、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光試料は、微生物類が発現するエステラーゼによる分解により発光する過程を必須条件としているためこの酵素活性による部分が大きい。すなわち、酵素活性の温度あるいは微生物種によって異なる基質特異性などが誤差影響因子として挙げられる。従って同一種の微生物のみが存在している環境下では高感度の測定が期待されるが、実使用環境下では過小若しくは過大評価を生じる可能性が高い。また、エステラーゼは、微生物細胞外にも産出される場合があり、その際には、背景と微生物が一体化してしまうため正確な検出ができない可能性がある。従って、プロピデュームイオダイドとの併用もしくは２重染色を行っても、必ずしも生死微生物数を把握できるものではないという課題がある。
【０００５】
また、一方、後者の微生物計数方法は、抗体を用いて特異的に微生物を検出する方法と微生物に対して非特異的に結合する染色試薬を用いたものである。抗体を使用することを必須としているが、抗体は、特異的に結合するため感度が高い一方、生死を判別できるものではない。さらに、本技術を用いた技術では、検体に含有される非特異的に染色する染色試薬で染色された微生物の生死を判別し得るものではない。
【０００６】
また、特定微生物と一般細菌を同時にかつ迅速に測定することが要望されている。
【０００７】
本発明はこのような従来の課題を解決するものであり微生物の酵素活性による誤差影響因子をなくし、正確に微生物の量を検出する微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、測定する背景と微生物の一体化を防止し、一般細菌と特定微生物と同時に測定できる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、発色を蛍光にすることで、励起光の波長と励起光によって発色する特定の波長を有する蛍光を制御することができ、検出対象の細胞を正確に計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、生死細胞の核酸に結合する化合物を使用することで、細胞単体レベルまでの生死細胞の個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、死細胞の核酸に結合する化合物を使用することで、細胞単体レベルまでの死細胞の個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また、生細胞を発色させる化合物を微生物由来物質と反応することで発色する化合物とすることで、生きている微生物のみの個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１３】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質とした化合物とすることで、より高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１４】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした化合物とすることで、より高い感度で特定微生物の有無を判断することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１５】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する化合物を検体に接触させ、その波長および発色量を検出することで、特定微生物の量を検出することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１６】
また、光源と受光手段を設けることで、自動的に迅速に微生物量を測定することができる微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の微生物計量方法および微生物計量装置は、上記目標を達成するため生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とする。
【００１８】
そして、本発明によれば多種の微生物が存在している環境下でも高感度で測定でき、実際の環境下でも評価できるもので、微生物内の物質や微生物細胞外に排出された物質に影響されないため生死細胞数を正確に把握することができるとともに本技術は非特異的に結合するもので、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することとなる。また、細胞の生死を判別できるものとなる。また、生死細胞を発色させる試薬と死細胞を発色させる試薬は、安定性が高く、保存が簡単で、低温下などの環境下でも使用することができる微生物計量方法が得られる。
【００１９】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とする。
【００２０】
そして、本発明によれば多種の細胞や微生物中から、特定の微生物も高感度で測定でき、実際の環境下でも評価できるもので、特定の微生物由来物質を測定するため、他の細胞や微生物内の物質や微生物細胞外に排出された物質に影響されないため、微生物の存在が確認できることとなるとともにさらに、前処理としての分離洗浄手段をなくし、迅速に測定することができる微生物計量方法が得られる。
【００２１】
また、発色を蛍光としたことを特徴とする。
【００２２】
そして、本発明によれば、蛍光発色した微生物のみを高感度に計量することができる微生物計量方法が得られる。
【００２３】
また、前記第１の化合物を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。
【００２４】
そして、本発明によれば、生死細胞単体レベルまでの計量が可能になり、高感度の計量が可能にできる微生物計量方法が得られる。
【００２５】
また、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。
【００２６】
そして、本発明によれば死細胞単体レベルまでの計量が可能になり、さらに高感度の計量が可能にできる微生物計量方法が得られる。
【００２７】
また、前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたことを特徴とする。さらに、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。
【００２８】
そして、これらの発明によれば、生きている微生物のみの個数を計量することができる。さらに、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることで、より高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる。
【００２９】
また、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。
【００３０】
そして、本発明によれば、特定微生物の細胞内または細胞外に発現する特定微生物由来物質を検出することで、特定微生物の有無を認識することができる微生物計量方法が得られる。そして、特定微生物由来物質として酵素タンパク質と限定することで、さらに高感度で特定微生物の有無を認識することができる微生物計量方法が得られる。
【００３１】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とする。
【００３２】
そして、本発明によれば、特定微生物に特異的に結合することで特定微生物を確実に認識し、さらに試薬の色と異なる蛍光色発色量から特定微生物の菌数を正確に把握することができる微生物計量方法が得られる。
【００３３】
また、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量する微生物計量装置を特徴とする。
【００３４】
そして、本発明によれば、さらに微生物を迅速に正確に計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞と のみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とするものであり、微生物類が発現する酵素活性に依存することなく、多種の微生物が存在している環境下でも同時高感度の測定ができ、実使用環境下で評価することができる。
【００３６】
また、微生物類が発現する酵素が微生物細胞外にも産出される場合でも、酵素と反応しないため背景と微生物の一体化を防止し、検出することができる。
【００３７】
また、抗体検出と異なり、多種の細胞と特異的に結合するため感度が高く、生死を判別することができる。例えば、生死細胞内に含まれる核酸と結合する４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と、死細胞内に含まれる核酸と結合するプロピデュームイオダイドを混合した試薬を同時に検体に接触させることで生死細胞と死細胞を同時に計量し、生死細胞の数から死細胞の数の差から生細胞の数が測定できる。さらに発色は、個々の細胞と迅速に反応するため、従来の培養法や抗体法よりも短時間で生死細胞の存在を確認することができるという作用を有する。
【００３８】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とするものであり、生死細胞と死細胞と生細胞、特定微生物を同時に測定ができることで、医療・食品衛生等の微生物汚染の計量や環境中の微生物のモニタリングが迅速に測定することができる。例えば、生死細胞計量および死細胞計量ならびに生細胞計量により、食品分野では一般細菌数が計量でき、さらに、死細胞を測定することで、殺菌後の状態を把握することもできる。また、大腸菌群は、β−ガラクトシダーゼという特異的な酵素タンパク質を排出することから、酵素タンパク質に反応する４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いることで、大腸菌群の存在が明確になり、医療、食品衛生等の微生物汚染を検査することができるという作用を有する。
【００３９】
発色を蛍光にすることで、発色する光の波長の干渉を防止し、目視でも簡単に認識することができ、さらに正確な細胞数を計量することができるという作用を有する。
【００４０】
前記第１の試薬を核酸結合性の試薬としたものであり、核酸と結合することで、生死細胞単体レベルで計量することができ、微生物からの代謝物や粉塵、無機物といった不純物の混在下でも高感度で正確に生死細胞を計量することができるという作用を有する。
【００４１】
前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたものであり、核酸と結合することで、死細胞単体レベルで計量することができ、微生物からの代謝物や粉塵、無機物といった不純物の混在下でも高感度で正確に死細胞を計量することができるという作用を有する。
【００４２】
前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたものであり、微生物の代謝物などの微生物由来物質と反応することで、生きている微生物の有無を確認することができるという作用を有する。また、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでより高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる。
【００４３】
前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたものであり、一般的に酵素タンパク質は生細胞が代謝している物質であるため、前処理として生細胞細胞膜を壊すことなく、生きた特定微生物を計量することができるという作用を有する。
【００４４】
特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とするものであり、検出試薬を検体に適宜、適当量供給でき、作業者が検体に直接的又は間接的に接触することが無く、安全性が高い高感度計量することができるという作用を有する。
【００４５】
光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量することを特徴とする装置であり、蛍光を発した細胞を簡単に計量することができ、検査時間を短縮することができるという作用を有する。
【００４６】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００４７】
まず、微生物計量方法は、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の化合物である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の化合物であるプロピデュームイオダイドを各溶液ごと若しくは混合した試薬を接触させる。４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は検体の細胞膜内を通過して核酸と結合する。また、プロピデュームイオダイドは分子量が大きいため、生細胞の細胞膜は通過できず、死細胞の核酸と結合する。
【００４８】
生死細胞の核酸と結合した４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長の光量を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長に発し、生死細胞を発色させる。また、死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時に、励起波長を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に発し、死細胞を発色させる。発色した細胞を目視や計量機器で計量し、生死細胞と死細胞の数を確認する。
【００４９】
次に、微生物計量方法について、図１に基づき説明する。微生物計量方法は、４'，６
−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を検出試薬とし、検体の細胞や微生物が付着したガラス製の付着プレート３と付着プレート３を置くプレート台４とプレート台４の下部に付着プレート３に励起光を照射する励起光光源５を設け、また、検体の細胞や微生物が蛍光発色を確認する拡大鏡を備えた蛍光受光部６と蛍光受光部６上部に蛍光波長を限定する分光フィルム７で構成されている。
【００５０】
計量方法は検出試薬として４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を混合し調製したものを用い、検体から取った細胞や微生物が含まれる溶液を付着プレート３表面に付着若しくは滴下し、付着プレート３をプレート台４に乗せ、付着プレート３表面に検出試薬を滴下する。そして、付着プレート３下部に備えた励起光光源５を点灯させ、付着プレート３上の細胞、微生物を蛍光発色させ、蛍光受光部６により蛍光発色を拡大する。さらに、特定波長のみを透過させる分光フィルム７で、蛍光を発する細胞や微生物が単体ごとに点灯する。特定波長ごとに点灯する単体を数えることで生死細胞の数や死細胞の数を計量し、存在する生細胞を算出する。そして、検体中の生細胞、死細胞数を確認することができる。
【００５１】
さらに、蛍光受光部６には、２００乃至１０００倍のレンズを備えている。
【００５２】
以下に本発明の実施例２について説明する。
【００５３】
図２に自動的に計量を行う装置の模式図を示す。図２に示すように、微生物計量装置８は、励起光を発するランプを備えた光源部９と検体から摂取した微生物と微生物の生死細胞を発色させる検出試薬である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１と微生物の死細胞を発色させる検出試薬であるプロピデュームイオダイド２を含んだ溶液を混入するガラス製の検体試薬含有部１０と発色する光を受光する受光部１１と受光部１１の光を分光する波長分光部１２と光量を計測する光量計測部１３と生細胞、死細胞の細胞数を算出する演算処理部１４と算出した細胞数を表示する表示部１５で構成されている。
【００５４】
微生物計量装置８の使用例を以下に示す。
【００５５】
微生物計量装置８の使用方法として、０．５ｇの野菜を９．５ｍｌの生理用食塩水に漬け懸濁液を作製後、１ｍｌの懸濁液と、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を検体試薬含有部１０に混入する。混入後、検体試薬含有部１０に含まれる検出試薬と懸濁液は、自動的に撹拌されることにより、検出試薬と懸濁液中の微生物細胞が結合する。そして光源部９の励起光を発するランプを点灯させ、自動的に検体に励起光を照射することにより、検出試薬と結合した生死細胞の核酸と死細胞の核酸が発色し、受光部１１に照射される。受光部１１に照射された光は、波長分光部１２で生死細胞の蛍光波長として４５０乃至４８０ｎｍと、死細胞の蛍光波長として５００乃至６２０ｎｍに分光され、光量計測部１３で光量を電気信号に変換される。変換された電気信号は、演算処理部１４で各細胞数と電気信号の検量線から各細胞数を計算され、生死細胞数から死細胞数を差し引き、生細胞数を算出する。そして表示部１５に検体試薬含有部１０に混入された１ｍｌの懸濁液中の生細胞数と死細胞数を自動的に表示することができる。
【００５６】
図３に生死細胞と電気信号出力の検量線グラフと、図４に死細胞と電気信号出力の検量線グラフを示す。
【００５７】
また、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１の滴下量もしくは懸濁液に対する添加量は、検体量に対する終濃度として１０ｎｍｏｌ以上〜１μｍｏｌ／ｍｌ以下で、最適な濃度は１００ｎｍｏｌ／ｍｌであり、プロピデュームイオダイド２の滴下量もしくは懸濁液に対する添加量は、検体量に対する終濃度として１０ｎｍｏｌ以上〜１μｍｏｌ／ｍｌ以下で、最適な濃度は１００ｎｍｏｌ／ｍｌである。
【００５８】
また、励起光光源５は、励起波長として、４００乃至７００ｎｍの波長を点灯するものを使用する。
【００５９】
本発明より検体中の細胞や微生物を、蛍光発色を用いて迅速に正確に目視レベルや自動的に微生物量を検知することができる。
【００６０】
なお、実施例１では付着プレート３にガラス製のものを用いたが、励起光を透過するアクリルやポリフィルムのような材質を用いてもよい。
【００６１】
なお、実施例１と２では、光量を電気信号に変換して細胞数を計量したが、画像を取り込み画像の点灯量で各細胞数を計量する方法を用いてもよい。
【００６２】
なお、実施例２では、ガラス製の検体試薬含有部１０を用いたが、励起波長と蛍光波長を透過する材質を用いてもよい。
【００６３】
以下に本発明の実施例３について説明する。
【００６４】
まず、微生物計量方法は、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の化合物である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の化合物であるプロピデュームイオダイドと第３の化合物である６−カルボキシフルオレセインジアセテートと第４の化合物である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドをそれぞれ混合した試薬を接触させる。生死細胞の核酸と結合した４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長を発し生死細胞の発色させる。また死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時、励起波長の光量を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に変え死細胞のみを発色させる。また、生細胞のエステラーゼと反応した６−カルボキシフルオレセインジアセテートは、エステラーゼにより分解されフルオレセインとなり、励起波長４７４ｎｍの時、励起波長を吸収して５４１ｎｍの蛍光波長を発し、生細胞のみを発色させる。また大腸菌群の代謝するβ−ガラクトシダーゼと反応した４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドは、４−メチルウンベリフェロンとなり、励起波長３９４ｎｍの時、励起波長を吸収して４８９ｎｍの蛍光波長を発し、大腸菌群を発色させる。発色した細胞数より生死細胞量と死細胞量を計量し、生細胞、死細胞の数を算出する。さらに、生細胞や特定微生物としての生きた大腸菌群の有無を確認することができる。
【００６５】
次に図５に示す本発明の微生物計量方法について説明する。微生物計量方法は、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７とを検出試薬とし、細胞や微生物が付着したガラス製の付着プレート３と付着プレート３を置くプレート台４とプレート台４の下部に付着プレート３に励起光を照射する励起光光源５と付着プレート４上部に検体中の細胞や微生物が発色を捕える拡大鏡を備えた蛍光受光部６と蛍光受光部６の上部に蛍光発色の波長を限定する分光フィルム７で構成されている。
【００６６】
計量方法としては検出試薬として４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を混合し調製したものを用い、検体から取った細胞や微生物が含まれる溶液のついた付着プレート３をプレート台４に乗せ、付着プレート３表面に検出試薬を滴下する。そして付着プレート３下部に備えた励起光光源５を点灯させ、付着プレート３上の細胞、微生物を蛍光させる。蛍光は蛍光受光部７により拡大されて透過し、特定波長のみを透過させる分光フィルム７で細胞や微生物が単体ごとに点灯する。生死細胞、死細胞を目視で確認し、さらに活性の高い生細胞や大腸菌群の有無を目視で確認することができる。
【００６７】
また、分光フィルム７は、生死細胞の計量時に、４５０乃至４８０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、死細胞の計量時に、５００乃至６２０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、生細胞の計量時に、４５０乃至５６０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、大腸菌群の計量時は、４００乃至５５０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用いる。
【００６８】
以下に本発明の実施例４について説明する。
【００６９】
自動的に計量を行う装置について図２に同様な構成のため対応させて以下に説明する。図２に示すように、微生物計量装置８は、励起光を発するランプを備えた光源部９と検体から摂取した微生物と微生物の生死細胞を発色させる検出試薬である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１と微生物の死細胞を発色させる検出試薬であるプロピデュームイオダイド２と微生物の生細胞を発色させる検出試薬である６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と大腸菌群を発色させる検出試薬である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を含んだ溶液を混入するガラス製の検体試薬含有部１０と発色する光を受光する受光部１１と受光部１１の光を分光する波長分光部１２と光量を計測する光量計測部１３と生細胞、死細胞の細胞数を算出若しくは大腸菌群の数を算出する演算処理部１４と算出した各細胞数を表示する表示部１５で構成されている。
【００７０】
微生物計量装置８の使用例を以下に示す。
【００７１】
微生物計量装置８の使用方法として、０．５ｇの野菜を９．５ｍｌの生理用食塩水に漬け懸濁液を作製後、１ｍｌの懸濁液と、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を検体試薬含有部１０に混入する。混入後、検体試薬含有部１０に含まれる検出試薬と懸濁液は、自動的に撹拌されることにより、検出試薬と懸濁液中の微生物細胞が結合する。そして光源部９の励起光を発するランプを点灯させ、自動的に検体に励起光を照射することにより、検出試薬と結合した生死細胞の核酸と死細胞の核酸が発色し、また生細胞のエステラーゼと大腸菌群の代謝するβ−ガラクトシダーゼの作用によりフルオレセインと４−メチルウンベリフェロンが発色し、受光部１１に照射される。受光部１１に照射された光は、波長分光部１２で生死細胞の蛍光波長として４６１ｎｍと、死細胞の蛍光波長として６１７ｎｍと、生細胞の蛍光波長として５４１ｎｍと大腸菌群の蛍光波長として４８９ｎｍに分光され、光量計測部１３で光量を電気信号に変換される。変換された電気信号は、演算処理部１４で各細胞数と電気信号の検量線から各細胞数を計算され、生死細胞数から死細胞数の差から生細胞数を算出する。そして表示部１５に検体試薬含有部１０に混入された１ｍｌの懸濁液中の生死細胞数と死細胞数と活性の強い生細胞数と大腸菌群数を自動的に表示することができる。
【００７２】
図６に活性の強い生細胞と電気信号出力の検量線グラフと図７に大腸菌群と電気信号出力の検量線グラフを示す。
【００７３】
本発明より検体中の細胞や微生物を、発色した蛍光波長により生死細胞量と死細胞量を計量することで、生細胞、死細胞の数を計量し、これらを迅速に目視レベルで簡単に検知することができ、さらに大腸菌群等の微生物や活性の強い生細胞量や有無を確認することができる。
【００７４】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とすることにより、生死細胞や死細胞を正確に測定することで、細胞による環境汚染状況が把握でき、汚染の防止手段をいち早く対策することができる。また、細胞に対する毒性、微生物の殺菌効果などを確認することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７５】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を 検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とすることにより、食品、水等の汚れ等の環境モニタリングがリアルタイムで行え、医療はもちろん食品衛生分野でも適用することができ、また迅速に大腸菌等の特定微生物の存在を把握できると微生物汚染による市場流通への影響をいち早く防止することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７６】
また、発色を蛍光としたことにより、作業測定者による受光時の誤認を防止し、細胞数を精度よく正確に計量することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７７】
また、前記第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことにより細胞の代謝物や汚れ物質の存在下でも正確に測定することができるため、食材、汚泥等の検体でも直接、生死細胞を測定できるため、検査時間を削減し、迅速に測定することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７８】
また、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことにより細胞の代謝物や汚れ物質の存在下でも正確に測定することができるため、食材、汚泥等の検体でも直接、死細胞のみを測定できるため、検査時間を削減し、さらに迅速に測定することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７９】
また、前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたことにより、生きている微生物の有無を確認することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。また、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでより高い感度で生きている微生物の有無を判断することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８０】
また、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことにより、特殊な微生物の有無が確認でき、微生物をモニタリングすることができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。また、前処理などの必要がなくなり、さらに検査時間を短時間にすることができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８１】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とすることにより、特定微生物のみを迅速に計量し、食品汚染状況の把握や人体への特定微生物の混入を予防することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８２】
また、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量する微生物計量装置を特徴とすることにより、人為誤差を最小限にし、検査作業経験がなくとも、簡単に計量ができるという効果のある微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の実施例１の生死細胞と死細胞の計量方法の構成図
【図２】 同実施例２の微生物計量装置の模式図
【図３】 同実施例１と２の生死細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図４】 同実施例１と２の死細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図５】 同実施例３の生死細胞と死細胞と生細胞と大腸菌群の計量方法の構成図
【図６】 同実施例３と４の活性の強い生細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図７】 同実施例３と４の大腸菌群と電気信号出力の検量線グラフ
【符号の説明】
１ ４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩
２ プロピデュームイオダイド
３ 付着プレート
４ プレート台
５ 励起光光源
６ 蛍光受光部
７ 分光フィルム
８ 微生物計量装置
９ 光源部
１０ 検体試薬含有部
１１ 受光部
１２ 波長分光部
１３ 光量計測部
１４ 演算処理部
１５ 表示部
１６ ６−カルボキシフルオレセインジアセテート
１７ ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種類の微生物（その意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、細菌類および真菌類等が付着あるいは混入している可能性のある検体から、これらを発色させ、生細胞および死細胞および特定の微生物を同時に計量できる微生物計量方法および微生物計量装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の微生物計量方法および微生物計量装置は、特開平１０−３２３１９７号に記載されるように添加した化合物が微生物体内に浸透した後、微生物体内の酵素反応によって分解され、蛍光を発した微生物を検出する手段が知られており、これを生きた微生物として認識している。また、死細胞を染色する試薬を併用することで生死微生物数を把握するものである。また、他の例として特開平７−１４０１４８号に記載されるように抗体を用いて特定の微生物を発光検出するものが知られており、非特異的に染色する試薬との併用で特定の微生物と生死微生物を把握するものが知られている。
【０００３】
また、食品衛生分野等では、迅速的に特定微生物を検知することが要望されている。特定微生物として大腸菌群や特定の大腸菌、食品によっては、黄色ブドウ球菌といった特定の微生物を測定する。しかし、特定微生物が一般細菌と混在している状況下や不純物が存在している状況下では、分離手段を用い分離または分離培養するか、不純物を除去する必要があり、一般細菌と特定微生物を同時に計量することができなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の微生物計量方法および微生物計量装置では、 前者の微生物類の即時判別方法は、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光試料、及びプロピデュームイオダイドからなる蛍光染料を限定条件下で使用したものであるが、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光試料は、微生物類が発現するエステラーゼによる分解により発光する過程を必須条件としているためこの酵素活性による部分が大きい。すなわち、酵素活性の温度あるいは微生物種によって異なる基質特異性などが誤差影響因子として挙げられる。従って同一種の微生物のみが存在している環境下では高感度の測定が期待されるが、実使用環境下では過小若しくは過大評価を生じる可能性が高い。また、エステラーゼは、微生物細胞外にも産出される場合があり、その際には、背景と微生物が一体化してしまうため正確な検出ができない可能性がある。従って、プロピデュームイオダイドとの併用もしくは２重染色を行っても、必ずしも生死微生物数を把握できるものではないという課題がある。
【０００５】
また、一方、後者の微生物計数方法は、抗体を用いて特異的に微生物を検出する方法と微生物に対して非特異的に結合する染色試薬を用いたものである。抗体を使用することを必須としているが、抗体は、特異的に結合するため感度が高い一方、生死を判別できるものではない。さらに、本技術を用いた技術では、検体に含有される非特異的に染色する染色試薬で染色された微生物の生死を判別し得るものではない。
【０００６】
また、特定微生物と一般細菌を同時にかつ迅速に測定することが要望されている。
【０００７】
本発明はこのような従来の課題を解決するものであり微生物の酵素活性による誤差影響因子をなくし、正確に微生物の量を検出する微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、測定する背景と微生物の一体化を防止し、一般細菌と特定微生物と同時に測定できる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、発色を蛍光にすることで、励起光の波長と励起光によって発色する特定の波長を有する蛍光を制御することができ、検出対象の細胞を正確に計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、生死細胞の核酸に結合する化合物を使用することで、細胞単体レベルまでの生死細胞の個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、死細胞の核酸に結合する化合物を使用することで、細胞単体レベルまでの死細胞の個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また、生細胞を発色させる化合物を微生物由来物質と反応することで発色する化合物とすることで、生きている微生物のみの個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１３】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質とした化合物とすることで、より高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１４】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした化合物とすることで、より高い感度で特定微生物の有無を判断することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１５】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する化合物を検体に接触させ、その波長および発色量を検出することで、特定微生物の量を検出することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１６】
また、光源と受光手段を設けることで、自動的に迅速に微生物量を測定することができる微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の微生物計量方法および微生物計量装置は、上記目標を達成するため生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とする。
【００１８】
そして、本発明によれば多種の微生物が存在している環境下でも高感度で測定でき、実際の環境下でも評価できるもので、微生物内の物質や微生物細胞外に排出された物質に影響されないため生死細胞数を正確に把握することができるとともに本技術は非特異的に結合するもので、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することとなる。また、細胞の生死を判別できるものとなる。また、生死細胞を発色させる試薬と死細胞を発色させる試薬は、安定性が高く、保存が簡単で、低温下などの環境下でも使用することができる微生物計量方法が得られる。
【００１９】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とする。
【００２０】
そして、本発明によれば多種の細胞や微生物中から、特定の微生物も高感度で測定でき、実際の環境下でも評価できるもので、特定の微生物由来物質を測定するため、他の細胞や微生物内の物質や微生物細胞外に排出された物質に影響されないため、微生物の存在が確認できることとなるとともにさらに、前処理としての分離洗浄手段をなくし、迅速に測定することができる微生物計量方法が得られる。
【００２１】
また、発色を蛍光としたことを特徴とする。
【００２２】
そして、本発明によれば、蛍光発色した微生物のみを高感度に計量することができる微生物計量方法が得られる。
【００２３】
また、前記第１の化合物を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。
【００２４】
そして、本発明によれば、生死細胞単体レベルまでの計量が可能になり、高感度の計量が可能にできる微生物計量方法が得られる。
【００２５】
また、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。
【００２６】
そして、本発明によれば死細胞単体レベルまでの計量が可能になり、さらに高感度の計量が可能にできる微生物計量方法が得られる。
【００２７】
また、前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたことを特徴とする。さらに、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。
【００２８】
そして、これらの発明によれば、生きている微生物のみの個数を計量することができる。さらに、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることで、より高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる。
【００２９】
また、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。
【００３０】
そして、本発明によれば、特定微生物の細胞内または細胞外に発現する特定微生物由来物質を検出することで、特定微生物の有無を認識することができる微生物計量方法が得られる。そして、特定微生物由来物質として酵素タンパク質と限定することで、さらに高感度で特定微生物の有無を認識することができる微生物計量方法が得られる。
【００３１】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とする。
【００３２】
そして、本発明によれば、特定微生物に特異的に結合することで特定微生物を確実に認識し、さらに試薬の色と異なる蛍光色発色量から特定微生物の菌数を正確に把握することができる微生物計量方法が得られる。
【００３３】
また、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量する微生物計量装置を特徴とする。
【００３４】
そして、本発明によれば、さらに微生物を迅速に正確に計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞と のみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とするものであり、微生物類が発現する酵素活性に依存することなく、多種の微生物が存在している環境下でも同時高感度の測定ができ、実使用環境下で評価することができる。
【００３６】
また、微生物類が発現する酵素が微生物細胞外にも産出される場合でも、酵素と反応しないため背景と微生物の一体化を防止し、検出することができる。
【００３７】
また、抗体検出と異なり、多種の細胞と特異的に結合するため感度が高く、生死を判別することができる。例えば、生死細胞内に含まれる核酸と結合する４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と、死細胞内に含まれる核酸と結合するプロピデュームイオダイドを混合した試薬を同時に検体に接触させることで生死細胞と死細胞を同時に計量し、生死細胞の数から死細胞の数の差から生細胞の数が測定できる。さらに発色は、個々の細胞と迅速に反応するため、従来の培養法や抗体法よりも短時間で生死細胞の存在を確認することができるという作用を有する。
【００３８】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とするものであり、生死細胞と死細胞と生細胞、特定微生物を同時に測定ができることで、医療・食品衛生等の微生物汚染の計量や環境中の微生物のモニタリングが迅速に測定することができる。例えば、生死細胞計量および死細胞計量ならびに生細胞計量により、食品分野では一般細菌数が計量でき、さらに、死細胞を測定することで、殺菌後の状態を把握することもできる。また、大腸菌群は、β−ガラクトシダーゼという特異的な酵素タンパク質を排出することから、酵素タンパク質に反応する４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いることで、大腸菌群の存在が明確になり、医療、食品衛生等の微生物汚染を検査することができるという作用を有する。
【００３９】
発色を蛍光にすることで、発色する光の波長の干渉を防止し、目視でも簡単に認識することができ、さらに正確な細胞数を計量することができるという作用を有する。
【００４０】
前記第１の試薬を核酸結合性の試薬としたものであり、核酸と結合することで、生死細胞単体レベルで計量することができ、微生物からの代謝物や粉塵、無機物といった不純物の混在下でも高感度で正確に生死細胞を計量することができるという作用を有する。
【００４１】
前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたものであり、核酸と結合することで、死細胞単体レベルで計量することができ、微生物からの代謝物や粉塵、無機物といった不純物の混在下でも高感度で正確に死細胞を計量することができるという作用を有する。
【００４２】
前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたものであり、微生物の代謝物などの微生物由来物質と反応することで、生きている微生物の有無を確認することができるという作用を有する。また、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでより高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる。
【００４３】
前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたものであり、一般的に酵素タンパク質は生細胞が代謝している物質であるため、前処理として生細胞細胞膜を壊すことなく、生きた特定微生物を計量することができるという作用を有する。
【００４４】
特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とするものであり、検出試薬を検体に適宜、適当量供給でき、作業者が検体に直接的又は間接的に接触することが無く、安全性が高い高感度計量することができるという作用を有する。
【００４５】
光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量することを特徴とする装置であり、蛍光を発した細胞を簡単に計量することができ、検査時間を短縮することができるという作用を有する。
【００４６】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００４７】
まず、微生物計量方法は、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の化合物である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の化合物であるプロピデュームイオダイドを各溶液ごと若しくは混合した試薬を接触させる。４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は検体の細胞膜内を通過して核酸と結合する。また、プロピデュームイオダイドは分子量が大きいため、生細胞の細胞膜は通過できず、死細胞の核酸と結合する。
【００４８】
生死細胞の核酸と結合した４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長の光量を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長に発し、生死細胞を発色させる。また、死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時に、励起波長を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に発し、死細胞を発色させる。発色した細胞を目視や計量機器で計量し、生死細胞と死細胞の数を確認する。
【００４９】
次に、微生物計量方法について、図１に基づき説明する。微生物計量方法は、４'，６
−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を検出試薬とし、検体の細胞や微生物が付着したガラス製の付着プレート３と付着プレート３を置くプレート台４とプレート台４の下部に付着プレート３に励起光を照射する励起光光源５を設け、また、検体の細胞や微生物が蛍光発色を確認する拡大鏡を備えた蛍光受光部６と蛍光受光部６上部に蛍光波長を限定する分光フィルム７で構成されている。
【００５０】
計量方法は検出試薬として４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を混合し調製したものを用い、検体から取った細胞や微生物が含まれる溶液を付着プレート３表面に付着若しくは滴下し、付着プレート３をプレート台４に乗せ、付着プレート３表面に検出試薬を滴下する。そして、付着プレート３下部に備えた励起光光源５を点灯させ、付着プレート３上の細胞、微生物を蛍光発色させ、蛍光受光部６により蛍光発色を拡大する。さらに、特定波長のみを透過させる分光フィルム７で、蛍光を発する細胞や微生物が単体ごとに点灯する。特定波長ごとに点灯する単体を数えることで生死細胞の数や死細胞の数を計量し、存在する生細胞を算出する。そして、検体中の生細胞、死細胞数を確認することができる。
【００５１】
さらに、蛍光受光部６には、２００乃至１０００倍のレンズを備えている。
【００５２】
以下に本発明の実施例２について説明する。
【００５３】
図２に自動的に計量を行う装置の模式図を示す。図２に示すように、微生物計量装置８は、励起光を発するランプを備えた光源部９と検体から摂取した微生物と微生物の生死細胞を発色させる検出試薬である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１と微生物の死細胞を発色させる検出試薬であるプロピデュームイオダイド２を含んだ溶液を混入するガラス製の検体試薬含有部１０と発色する光を受光する受光部１１と受光部１１の光を分光する波長分光部１２と光量を計測する光量計測部１３と生細胞、死細胞の細胞数を算出する演算処理部１４と算出した細胞数を表示する表示部１５で構成されている。
【００５４】
微生物計量装置８の使用例を以下に示す。
【００５５】
微生物計量装置８の使用方法として、０．５ｇの野菜を９．５ｍｌの生理用食塩水に漬け懸濁液を作製後、１ｍｌの懸濁液と、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を検体試薬含有部１０に混入する。混入後、検体試薬含有部１０に含まれる検出試薬と懸濁液は、自動的に撹拌されることにより、検出試薬と懸濁液中の微生物細胞が結合する。そして光源部９の励起光を発するランプを点灯させ、自動的に検体に励起光を照射することにより、検出試薬と結合した生死細胞の核酸と死細胞の核酸が発色し、受光部１１に照射される。受光部１１に照射された光は、波長分光部１２で生死細胞の蛍光波長として４５０乃至４８０ｎｍと、死細胞の蛍光波長として５００乃至６２０ｎｍに分光され、光量計測部１３で光量を電気信号に変換される。変換された電気信号は、演算処理部１４で各細胞数と電気信号の検量線から各細胞数を計算され、生死細胞数から死細胞数を差し引き、生細胞数を算出する。そして表示部１５に検体試薬含有部１０に混入された１ｍｌの懸濁液中の生細胞数と死細胞数を自動的に表示することができる。
【００５６】
図３に生死細胞と電気信号出力の検量線グラフと、図４に死細胞と電気信号出力の検量線グラフを示す。
【００５７】
また、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１の滴下量もしくは懸濁液に対する添加量は、検体量に対する終濃度として１０ｎｍｏｌ以上〜１μｍｏｌ／ｍｌ以下で、最適な濃度は１００ｎｍｏｌ／ｍｌであり、プロピデュームイオダイド２の滴下量もしくは懸濁液に対する添加量は、検体量に対する終濃度として１０ｎｍｏｌ以上〜１μｍｏｌ／ｍｌ以下で、最適な濃度は１００ｎｍｏｌ／ｍｌである。
【００５８】
また、励起光光源５は、励起波長として、４００乃至７００ｎｍの波長を点灯するものを使用する。
【００５９】
本発明より検体中の細胞や微生物を、蛍光発色を用いて迅速に正確に目視レベルや自動的に微生物量を検知することができる。
【００６０】
なお、実施例１では付着プレート３にガラス製のものを用いたが、励起光を透過するアクリルやポリフィルムのような材質を用いてもよい。
【００６１】
なお、実施例１と２では、光量を電気信号に変換して細胞数を計量したが、画像を取り込み画像の点灯量で各細胞数を計量する方法を用いてもよい。
【００６２】
なお、実施例２では、ガラス製の検体試薬含有部１０を用いたが、励起波長と蛍光波長を透過する材質を用いてもよい。
【００６３】
以下に本発明の実施例３について説明する。
【００６４】
まず、微生物計量方法は、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の化合物である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の化合物であるプロピデュームイオダイドと第３の化合物である６−カルボキシフルオレセインジアセテートと第４の化合物である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドをそれぞれ混合した試薬を接触させる。生死細胞の核酸と結合した４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長を発し生死細胞の発色させる。また死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時、励起波長の光量を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に変え死細胞のみを発色させる。また、生細胞のエステラーゼと反応した６−カルボキシフルオレセインジアセテートは、エステラーゼにより分解されフルオレセインとなり、励起波長４７４ｎｍの時、励起波長を吸収して５４１ｎｍの蛍光波長を発し、生細胞のみを発色させる。また大腸菌群の代謝するβ−ガラクトシダーゼと反応した４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドは、４−メチルウンベリフェロンとなり、励起波長３９４ｎｍの時、励起波長を吸収して４８９ｎｍの蛍光波長を発し、大腸菌群を発色させる。発色した細胞数より生死細胞量と死細胞量を計量し、生細胞、死細胞の数を算出する。さらに、生細胞や特定微生物としての生きた大腸菌群の有無を確認することができる。
【００６５】
次に図５に示す本発明の微生物計量方法について説明する。微生物計量方法は、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７とを検出試薬とし、細胞や微生物が付着したガラス製の付着プレート３と付着プレート３を置くプレート台４とプレート台４の下部に付着プレート３に励起光を照射する励起光光源５と付着プレート４上部に検体中の細胞や微生物が発色を捕える拡大鏡を備えた蛍光受光部６と蛍光受光部６の上部に蛍光発色の波長を限定する分光フィルム７で構成されている。
【００６６】
計量方法としては検出試薬として４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を混合し調製したものを用い、検体から取った細胞や微生物が含まれる溶液のついた付着プレート３をプレート台４に乗せ、付着プレート３表面に検出試薬を滴下する。そして付着プレート３下部に備えた励起光光源５を点灯させ、付着プレート３上の細胞、微生物を蛍光させる。蛍光は蛍光受光部７により拡大されて透過し、特定波長のみを透過させる分光フィルム７で細胞や微生物が単体ごとに点灯する。生死細胞、死細胞を目視で確認し、さらに活性の高い生細胞や大腸菌群の有無を目視で確認することができる。
【００６７】
また、分光フィルム７は、生死細胞の計量時に、４５０乃至４８０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、死細胞の計量時に、５００乃至６２０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、生細胞の計量時に、４５０乃至５６０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、大腸菌群の計量時は、４００乃至５５０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用いる。
【００６８】
以下に本発明の実施例４について説明する。
【００６９】
自動的に計量を行う装置について図２に同様な構成のため対応させて以下に説明する。図２に示すように、微生物計量装置８は、励起光を発するランプを備えた光源部９と検体から摂取した微生物と微生物の生死細胞を発色させる検出試薬である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１と微生物の死細胞を発色させる検出試薬であるプロピデュームイオダイド２と微生物の生細胞を発色させる検出試薬である６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と大腸菌群を発色させる検出試薬である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を含んだ溶液を混入するガラス製の検体試薬含有部１０と発色する光を受光する受光部１１と受光部１１の光を分光する波長分光部１２と光量を計測する光量計測部１３と生細胞、死細胞の細胞数を算出若しくは大腸菌群の数を算出する演算処理部１４と算出した各細胞数を表示する表示部１５で構成されている。
【００７０】
微生物計量装置８の使用例を以下に示す。
【００７１】
微生物計量装置８の使用方法として、０．５ｇの野菜を９．５ｍｌの生理用食塩水に漬け懸濁液を作製後、１ｍｌの懸濁液と、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を検体試薬含有部１０に混入する。混入後、検体試薬含有部１０に含まれる検出試薬と懸濁液は、自動的に撹拌されることにより、検出試薬と懸濁液中の微生物細胞が結合する。そして光源部９の励起光を発するランプを点灯させ、自動的に検体に励起光を照射することにより、検出試薬と結合した生死細胞の核酸と死細胞の核酸が発色し、また生細胞のエステラーゼと大腸菌群の代謝するβ−ガラクトシダーゼの作用によりフルオレセインと４−メチルウンベリフェロンが発色し、受光部１１に照射される。受光部１１に照射された光は、波長分光部１２で生死細胞の蛍光波長として４６１ｎｍと、死細胞の蛍光波長として６１７ｎｍと、生細胞の蛍光波長として５４１ｎｍと大腸菌群の蛍光波長として４８９ｎｍに分光され、光量計測部１３で光量を電気信号に変換される。変換された電気信号は、演算処理部１４で各細胞数と電気信号の検量線から各細胞数を計算され、生死細胞数から死細胞数の差から生細胞数を算出する。そして表示部１５に検体試薬含有部１０に混入された１ｍｌの懸濁液中の生死細胞数と死細胞数と活性の強い生細胞数と大腸菌群数を自動的に表示することができる。
【００７２】
図６に活性の強い生細胞と電気信号出力の検量線グラフと図７に大腸菌群と電気信号出力の検量線グラフを示す。
【００７３】
本発明より検体中の細胞や微生物を、発色した蛍光波長により生死細胞量と死細胞量を計量することで、生細胞、死細胞の数を計量し、これらを迅速に目視レベルで簡単に検知することができ、さらに大腸菌群等の微生物や活性の強い生細胞量や有無を確認することができる。
【００７４】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とすることにより、生死細胞や死細胞を正確に測定することで、細胞による環境汚染状況が把握でき、汚染の防止手段をいち早く対策することができる。また、細胞に対する毒性、微生物の殺菌効果などを確認することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７５】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を 検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とすることにより、食品、水等の汚れ等の環境モニタリングがリアルタイムで行え、医療はもちろん食品衛生分野でも適用することができ、また迅速に大腸菌等の特定微生物の存在を把握できると微生物汚染による市場流通への影響をいち早く防止することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７６】
また、発色を蛍光としたことにより、作業測定者による受光時の誤認を防止し、細胞数を精度よく正確に計量することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７７】
また、前記第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことにより細胞の代謝物や汚れ物質の存在下でも正確に測定することができるため、食材、汚泥等の検体でも直接、生死細胞を測定できるため、検査時間を削減し、迅速に測定することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７８】
また、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことにより細胞の代謝物や汚れ物質の存在下でも正確に測定することができるため、食材、汚泥等の検体でも直接、死細胞のみを測定できるため、検査時間を削減し、さらに迅速に測定することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７９】
また、前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたことにより、生きている微生物の有無を確認することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。また、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでより高い感度で生きている微生物の有無を判断することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８０】
また、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことにより、特殊な微生物の有無が確認でき、微生物をモニタリングすることができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。また、前処理などの必要がなくなり、さらに検査時間を短時間にすることができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８１】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とすることにより、特定微生物のみを迅速に計量し、食品汚染状況の把握や人体への特定微生物の混入を予防することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８２】
また、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量する微生物計量装置を特徴とすることにより、人為誤差を最小限にし、検査作業経験がなくとも、簡単に計量ができるという効果のある微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の実施例１の生死細胞と死細胞の計量方法の構成図
【図２】 同実施例２の微生物計量装置の模式図
【図３】 同実施例１と２の生死細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図４】 同実施例１と２の死細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図５】 同実施例３の生死細胞と死細胞と生細胞と大腸菌群の計量方法の構成図
【図６】 同実施例３と４の活性の強い生細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図７】 同実施例３と４の大腸菌群と電気信号出力の検量線グラフ
【符号の説明】
１ ４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩
２ プロピデュームイオダイド
３ 付着プレート
４ プレート台
５ 励起光光源
６ 蛍光受光部
７ 分光フィルム
８ 微生物計量装置
９ 光源部
１０ 検体試薬含有部
１１ 受光部
１２ 波長分光部
１３ 光量計測部
１４ 演算処理部
１５ 表示部
１６ ６−カルボキシフルオレセインジアセテート
１７ ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド
Claims (10)
- 生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とする微生物計量方法。
- 生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とする微生物計量方法。
- 発色を蛍光とした請求項１または２記載の微生物計量方法。
- 第１の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物計量方法。
- 第２の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物計量方法。
- 第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬とした請求項２記載の微生物計量方法。
- 微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項６記載の微生物計量方法。
- 特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項２記載の微生物計量方法。
- 生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出するための装置で、光源と受光手段を設け、検体の波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とする微生物計量装置。
- 生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出するための装置で、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より生死細胞と生細胞と死細胞の全てを計量する微生物計量装置。
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