JP3995888B2

JP3995888B2 - Microbial weighing method and microorganism weighing device

Info

Publication number: JP3995888B2
Application number: JP2001016665A
Authority: JP
Inventors: 寛仁島北; 義和田代; 一男梨本
Original assignee: 松下エコシステムズ株式会社
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2021-01-25
Also published as: JP2001286296A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種類の微生物（その意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）、即ち、細菌類および真菌類等が付着あるいは混入している可能性のある検体から、これらを発色させ、生細胞および死細胞および特定の微生物を同時に計量できる微生物計量方法および微生物計量装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の微生物計量方法および微生物計量装置は、特開平１０−３２３１９７号に記載されるように添加した化合物が微生物体内に浸透した後、微生物体内の酵素反応によって分解され、蛍光を発した微生物を検出する手段が知られており、これを生きた微生物として認識している。また、死細胞を染色する試薬を併用することで生死微生物数を把握するものである。また、他の例として特開平７−１４０１４８号に記載されるように抗体を用いて特定の微生物を発光検出するものが知られており、非特異的に染色する試薬との併用で特定の微生物と生死微生物を把握するものが知られている。
【０００３】
また、食品衛生分野等では、迅速的に特定微生物を検知することが要望されている。特定微生物として大腸菌群や特定の大腸菌、食品によっては、黄色ブドウ球菌といった特定の微生物を測定する。しかし、特定微生物が一般細菌と混在している状況下や不純物が存在している状況下では、分離手段を用い分離または分離培養するか、不純物を除去する必要があり、一般細菌と特定微生物を同時に計量することができなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の微生物計量方法および微生物計量装置では、前者の微生物類の即時判別方法は、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光試料、及びプロピデュームイオダイドからなる蛍光染料を限定条件下で使用したものであるが、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光試料は、微生物類が発現するエステラーゼによる分解により発光する過程を必須条件としているためこの酵素活性による部分が大きい。すなわち、酵素活性の温度あるいは微生物種によって異なる基質特異性などが誤差影響因子として挙げられる。従って同一種の微生物のみが存在している環境下では高感度の測定が期待されるが、実使用環境下では過小若しくは過大評価を生じる可能性が高い。また、エステラーゼは、微生物細胞外にも産出される場合があり、その際には、背景と微生物が一体化してしまうため正確な検出ができない可能性がある。従って、プロピデュームイオダイドとの併用もしくは２重染色を行っても、必ずしも生死微生物数を把握できるものではないという課題がある。
【０００５】
また、一方、後者の微生物計数方法は、抗体を用いて特異的に微生物を検出する方法と微生物に対して非特異的に結合する染色試薬を用いたものである。抗体を使用することを必須としているが、抗体は、特異的に結合するため感度が高い一方、生死を判別できるものではない。さらに、本技術を用いた技術では、検体に含有される非特異的に染色する染色試薬で染色された微生物の生死を判別し得るものではない。
【０００６】
また、特定微生物と一般細菌を同時にかつ迅速に測定することが要望されている。
【０００７】
本発明はこのような従来の課題を解決するものであり微生物の酵素活性による誤差影響因子をなくし、正確に微生物の量を検出する微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、測定する背景と微生物の一体化を防止し、一般細菌と特定微生物と同時に測定できる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、発色を蛍光にすることで、励起光の波長と励起光によって発色する特定の波長を有する蛍光を制御することができ、検出対象の細胞を正確に計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、生死細胞の核酸に結合する化合物を使用することで、細胞単体レベルまでの生死細胞の個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、死細胞の核酸に結合する化合物を使用することで、細胞単体レベルまでの死細胞の個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また、生細胞を発色させる化合物を微生物由来物質と反応することで発色する化合物とすることで、生きている微生物のみの個数を計量することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１３】
また、微生物由来物質を酵素タンパク質とした化合物とすることで、より高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１４】
また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした化合物とすることで、より高い感度で特定微生物の有無を判断することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１５】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する化合物を検体に接触させ、その波長および発色量を検出することで、特定微生物の量を検出することができる微生物計量方法を提供することを目的とする。
【００１６】
また、光源と受光手段を設けることで、自動的に迅速に微生物量を測定することができる微生物計量装置を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の微生物計量方法および微生物計量装置は、上記目標を達成するため生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とする。
【００１８】
そして、本発明によれば多種の微生物が存在している環境下でも高感度で測定でき、実際の環境下でも評価できるもので、微生物内の物質や微生物細胞外に排出された物質に影響されないため生死細胞数を正確に把握することができるとともに本技術は非特異的に結合するもので、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することとなる。また、細胞の生死を判別できるものとなる。また、生死細胞を発色させる試薬と死細胞を発色させる試薬は、安定性が高く、保存が簡単で、低温下などの環境下でも使用することができる微生物計量方法が得られる。
【００１９】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とする。
【００２０】
そして、本発明によれば多種の細胞や微生物中から、特定の微生物も高感度で測定でき、実際の環境下でも評価できるもので、特定の微生物由来物質を測定するため、他の細胞や微生物内の物質や微生物細胞外に排出された物質に影響されないため、微生物の存在が確認できることとなるとともにさらに、前処理としての分離洗浄手段をなくし、迅速に測定することができる微生物計量方法が得られる。
【００２１】
また、発色を蛍光としたことを特徴とする。
【００２２】
そして、本発明によれば、蛍光発色した微生物のみを高感度に計量することができる微生物計量方法が得られる。
【００２３】
また、前記第１の化合物を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。
【００２４】
そして、本発明によれば、生死細胞単体レベルまでの計量が可能になり、高感度の計量が可能にできる微生物計量方法が得られる。
【００２５】
また、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことを特徴とする。
【００２６】
そして、本発明によれば死細胞単体レベルまでの計量が可能になり、さらに高感度の計量が可能にできる微生物計量方法が得られる。
【００２７】
また、前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたことを特徴とする。さらに、微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。
【００２８】
そして、これらの発明によれば、生きている微生物のみの個数を計量することができる。さらに、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることで、より高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる。
【００２９】
また、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことを特徴とする。
【００３０】
そして、本発明によれば、特定微生物の細胞内または細胞外に発現する特定微生物由来物質を検出することで、特定微生物の有無を認識することができる微生物計量方法が得られる。そして、特定微生物由来物質として酵素タンパク質と限定することで、さらに高感度で特定微生物の有無を認識することができる微生物計量方法が得られる。
【００３１】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とする。
【００３２】
そして、本発明によれば、特定微生物に特異的に結合することで特定微生物を確実に認識し、さらに試薬の色と異なる蛍光色発色量から特定微生物の菌数を正確に把握することができる微生物計量方法が得られる。
【００３３】
また、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量する微生物計量装置を特徴とする。
【００３４】
そして、本発明によれば、さらに微生物を迅速に正確に計量することができる微生物計量装置が得られる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とするものであり、微生物類が発現する酵素活性に依存することなく、多種の微生物が存在している環境下でも同時高感度の測定ができ、実使用環境下で評価することができる。
【００３６】
また、微生物類が発現する酵素が微生物細胞外にも産出される場合でも、酵素と反応しないため背景と微生物の一体化を防止し、検出することができる。
【００３７】
また、抗体検出と異なり、多種の細胞と特異的に結合するため感度が高く、生死を判別することができる。例えば、生死細胞内に含まれる核酸と結合する４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と、死細胞内に含まれる核酸と結合するプロピデュームイオダイドを混合した試薬を同時に検体に接触させることで生死細胞と死細胞を同時に計量し、生死細胞の数から死細胞の数の差から生細胞の数が測定できる。さらに発色は、個々の細胞と迅速に反応するため、従来の培養法や抗体法よりも短時間で生死細胞の存在を確認することができるという作用を有する。
【００３８】
生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とするものであり、生死細胞と死細胞と生細胞、特定微生物を同時に測定ができることで、医療・食品衛生等の微生物汚染の計量や環境中の微生物のモニタリングが迅速に測定することができる。例えば、生死細胞計量および死細胞計量ならびに生細胞計量により、食品分野では一般細菌数が計量でき、さらに、死細胞を測定することで、殺菌後の状態を把握することもできる。また、大腸菌群は、β−ガラクトシダーゼという特異的な酵素タンパク質を排出することから、酵素タンパク質に反応する４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いることで、大腸菌群の存在が明確になり、医療、食品衛生等の微生物汚染を検査することができるという作用を有する。
【００３９】
発色を蛍光にすることで、発色する光の波長の干渉を防止し、目視でも簡単に認識することができ、さらに正確な細胞数を計量することができるという作用を有する。
【００４０】
前記第１の試薬を核酸結合性の試薬としたものであり、核酸と結合することで、生死細胞単体レベルで計量することができ、微生物からの代謝物や粉塵、無機物といった不純物の混在下でも高感度で正確に生死細胞を計量することができるという作用を有する。
【００４１】
前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたものであり、核酸と結合することで、死細胞単体レベルで計量することができ、微生物からの代謝物や粉塵、無機物といった不純物の混在下でも高感度で正確に死細胞を計量することができるという作用を有する。
【００４２】
前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたものであり、微生物の代謝物などの微生物由来物質と反応することで、生きている微生物の有無を確認することができるという作用を有する。また、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでより高い感度で生きている微生物の有無を判断することができる。
【００４３】
前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたものであり、一般的に酵素タンパク質は生細胞が代謝している物質であるため、前処理として生細胞細胞膜を壊すことなく、生きた特定微生物を計量することができるという作用を有する。
【００４４】
特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とするものであり、検出試薬を検体に適宜、適当量供給でき、作業者が検体に直接的又は間接的に接触することが無く、安全性が高い高感度計量することができるという作用を有する。
【００４５】
光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量することを特徴とする装置であり、蛍光を発した細胞を簡単に計量することができ、検査時間を短縮することができるという作用を有する。
【００４６】
【実施例】
以下に本発明の実施例１について説明する。
【００４７】
まず、微生物計量方法は、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の化合物である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の化合物であるプロピデュームイオダイドを各溶液ごと若しくは混合した試薬を接触させる。４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は検体の細胞膜内を通過して核酸と結合する。また、プロピデュームイオダイドは分子量が大きいため、生細胞の細胞膜は通過できず、死細胞の核酸と結合する。
【００４８】
生死細胞の核酸と結合した４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長の光量を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長に発し、生死細胞を発色させる。また、死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時に、励起波長を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に発し、死細胞を発色させる。発色した細胞を目視や計量機器で計量し、生死細胞と死細胞の数を確認する。
【００４９】
次に、微生物計量方法について、図１に基づき説明する。微生物計量方法は、４'，６
−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を検出試薬とし、検体の細胞や微生物が付着したガラス製の付着プレート３と付着プレート３を置くプレート台４とプレート台４の下部に付着プレート３に励起光を照射する励起光光源５を設け、また、検体の細胞や微生物が蛍光発色を確認する拡大鏡を備えた蛍光受光部６と蛍光受光部６上部に蛍光波長を限定する分光フィルム７で構成されている。
【００５０】
計量方法は検出試薬として４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を混合し調製したものを用い、検体から取った細胞や微生物が含まれる溶液を付着プレート３表面に付着若しくは滴下し、付着プレート３をプレート台４に乗せ、付着プレート３表面に検出試薬を滴下する。そして、付着プレート３下部に備えた励起光光源５を点灯させ、付着プレート３上の細胞、微生物を蛍光発色させ、蛍光受光部６により蛍光発色を拡大する。さらに、特定波長のみを透過させる分光フィルム７で、蛍光を発する細胞や微生物が単体ごとに点灯する。特定波長ごとに点灯する単体を数えることで生死細胞の数や死細胞の数を計量し、存在する生細胞を算出する。そして、検体中の生細胞、死細胞数を確認することができる。
【００５１】
さらに、蛍光受光部６には、２００乃至１０００倍のレンズを備えている。
【００５２】
以下に本発明の実施例２について説明する。
【００５３】
図２に自動的に計量を行う装置の模式図を示す。図２に示すように、微生物計量装置８は、励起光を発するランプを備えた光源部９と検体から摂取した微生物と微生物の生死細胞を発色させる検出試薬である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１と微生物の死細胞を発色させる検出試薬であるプロピデュームイオダイド２を含んだ溶液を混入するガラス製の検体試薬含有部１０と発色する光を受光する受光部１１と受光部１１の光を分光する波長分光部１２と光量を計測する光量計測部１３と生細胞、死細胞の細胞数を算出する演算処理部１４と算出した細胞数を表示する表示部１５で構成されている。
【００５４】
微生物計量装置８の使用例を以下に示す。
【００５５】
微生物計量装置８の使用方法として、０．５ｇの野菜を９．５ｍｌの生理用食塩水に漬け懸濁液を作製後、１ｍｌの懸濁液と、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２を検体試薬含有部１０に混入する。混入後、検体試薬含有部１０に含まれる検出試薬と懸濁液は、自動的に撹拌されることにより、検出試薬と懸濁液中の微生物細胞が結合する。そして光源部９の励起光を発するランプを点灯させ、自動的に検体に励起光を照射することにより、検出試薬と結合した生死細胞の核酸と死細胞の核酸が発色し、受光部１１に照射される。受光部１１に照射された光は、波長分光部１２で生死細胞の蛍光波長として４５０乃至４８０ｎｍと、死細胞の蛍光波長として５００乃至６２０ｎｍに分光され、光量計測部１３で光量を電気信号に変換される。変換された電気信号は、演算処理部１４で各細胞数と電気信号の検量線から各細胞数を計算され、生死細胞数から死細胞数を差し引き、生細胞数を算出する。そして表示部１５に検体試薬含有部１０に混入された１ｍｌの懸濁液中の生細胞数と死細胞数を自動的に表示することができる。
【００５６】
図３に生死細胞と電気信号出力の検量線グラフと、図４に死細胞と電気信号出力の検量線グラフを示す。
【００５７】
また、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１の滴下量もしくは懸濁液に対する添加量は、検体量に対する終濃度として１０ｎｍｏｌ以上〜１μｍｏｌ／ｍｌ以下で、最適な濃度は１００ｎｍｏｌ／ｍｌであり、プロピデュームイオダイド２の滴下量もしくは懸濁液に対する添加量は、検体量に対する終濃度として１０ｎｍｏｌ以上〜１μｍｏｌ／ｍｌ以下で、最適な濃度は１００ｎｍｏｌ／ｍｌである。
【００５８】
また、励起光光源５は、励起波長として、４００乃至７００ｎｍの波長を点灯するものを使用する。
【００５９】
本発明より検体中の細胞や微生物を、蛍光発色を用いて迅速に正確に目視レベルや自動的に微生物量を検知することができる。
【００６０】
なお、実施例１では付着プレート３にガラス製のものを用いたが、励起光を透過するアクリルやポリフィルムのような材質を用いてもよい。
【００６１】
なお、実施例１と２では、光量を電気信号に変換して細胞数を計量したが、画像を取り込み画像の点灯量で各細胞数を計量する方法を用いてもよい。
【００６２】
なお、実施例２では、ガラス製の検体試薬含有部１０を用いたが、励起波長と蛍光波長を透過する材質を用いてもよい。
【００６３】
以下に本発明の実施例３について説明する。
【００６４】
まず、微生物計量方法は、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の化合物である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の化合物であるプロピデュームイオダイドと第３の化合物である６−カルボキシフルオレセインジアセテートと第４の化合物である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドをそれぞれ混合した試薬を接触させる。生死細胞の核酸と結合した４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長を発し生死細胞の発色させる。また死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時、励起波長の光量を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に変え死細胞のみを発色させる。また、生細胞のエステラーゼと反応した６−カルボキシフルオレセインジアセテートは、エステラーゼにより分解されフルオレセインとなり、励起波長４７４ｎｍの時、励起波長を吸収して５４１ｎｍの蛍光波長を発し、生細胞のみを発色させる。また大腸菌群の代謝するβ−ガラクトシダーゼと反応した４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドは、４−メチルウンベリフェロンとなり、励起波長３９４ｎｍの時、励起波長を吸収して４８９ｎｍの蛍光波長を発し、大腸菌群を発色させる。発色した細胞数より生死細胞量と死細胞量を計量し、生細胞、死細胞の数を算出する。さらに、生細胞や特定微生物としての生きた大腸菌群の有無を確認することができる。
【００６５】
次に図５に示す本発明の微生物計量方法について説明する。微生物計量方法は、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７とを検出試薬とし、細胞や微生物が付着したガラス製の付着プレート３と付着プレート３を置くプレート台４とプレート台４の下部に付着プレート３に励起光を照射する励起光光源５と付着プレート４上部に検体中の細胞や微生物が発色を捕える拡大鏡を備えた蛍光受光部６と蛍光受光部６の上部に蛍光発色の波長を限定する分光フィルム７で構成されている。
【００６６】
計量方法としては検出試薬として４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を混合し調製したものを用い、検体から取った細胞や微生物が含まれる溶液のついた付着プレート３をプレート台４に乗せ、付着プレート３表面に検出試薬を滴下する。そして付着プレート３下部に備えた励起光光源５を点灯させ、付着プレート３上の細胞、微生物を蛍光させる。蛍光は蛍光受光部７により拡大されて透過し、特定波長のみを透過させる分光フィルム７で細胞や微生物が単体ごとに点灯する。生死細胞、死細胞を目視で確認し、さらに活性の高い生細胞や大腸菌群の有無を目視で確認することができる。
【００６７】
また、分光フィルム７は、生死細胞の計量時に、４５０乃至４８０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、死細胞の計量時に、５００乃至６２０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、生細胞の計量時に、４５０乃至５６０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用い、大腸菌群の計量時は、４００乃至５５０ｎｍの蛍光波長を透過するものを用いる。
【００６８】
以下に本発明の実施例４について説明する。
【００６９】
自動的に計量を行う装置について図２に同様な構成のため対応させて以下に説明する。図２に示すように、微生物計量装置８は、励起光を発するランプを備えた光源部９と検体から摂取した微生物と微生物の生死細胞を発色させる検出試薬である４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１と微生物の死細胞を発色させる検出試薬であるプロピデュームイオダイド２と微生物の生細胞を発色させる検出試薬である６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と大腸菌群を発色させる検出試薬である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を含んだ溶液を混入するガラス製の検体試薬含有部１０と発色する光を受光する受光部１１と受光部１１の光を分光する波長分光部１２と光量を計測する光量計測部１３と生細胞、死細胞の細胞数を算出若しくは大腸菌群の数を算出する演算処理部１４と算出した各細胞数を表示する表示部１５で構成されている。
【００７０】
微生物計量装置８の使用例を以下に示す。
【００７１】
微生物計量装置８の使用方法として、０．５ｇの野菜を９．５ｍｌの生理用食塩水に漬け懸濁液を作製後、１ｍｌの懸濁液と、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩１とプロピデュームイオダイド２と６−カルボキシフルオレセインジアセテート１６と４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド１７を検体試薬含有部１０に混入する。混入後、検体試薬含有部１０に含まれる検出試薬と懸濁液は、自動的に撹拌されることにより、検出試薬と懸濁液中の微生物細胞が結合する。そして光源部９の励起光を発するランプを点灯させ、自動的に検体に励起光を照射することにより、検出試薬と結合した生死細胞の核酸と死細胞の核酸が発色し、また生細胞のエステラーゼと大腸菌群の代謝するβ−ガラクトシダーゼの作用によりフルオレセインと４−メチルウンベリフェロンが発色し、受光部１１に照射される。受光部１１に照射された光は、波長分光部１２で生死細胞の蛍光波長として４６１ｎｍと、死細胞の蛍光波長として６１７ｎｍと、生細胞の蛍光波長として５４１ｎｍと大腸菌群の蛍光波長として４８９ｎｍに分光され、光量計測部１３で光量を電気信号に変換される。変換された電気信号は、演算処理部１４で各細胞数と電気信号の検量線から各細胞数を計算され、生死細胞数から死細胞数の差から生細胞数を算出する。そして表示部１５に検体試薬含有部１０に混入された１ｍｌの懸濁液中の生死細胞数と死細胞数と活性の強い生細胞数と大腸菌群数を自動的に表示することができる。
【００７２】
図６に活性の強い生細胞と電気信号出力の検量線グラフと図７に大腸菌群と電気信号出力の検量線グラフを示す。
【００７３】
本発明より検体中の細胞や微生物を、発色した蛍光波長により生死細胞量と死細胞量を計量することで、生細胞、死細胞の数を計量し、これらを迅速に目視レベルで簡単に検知することができ、さらに大腸菌群等の微生物や活性の強い生細胞量や有無を確認することができる。
【００７４】
【発明の効果】
以上の実施例から明らかなように、本発明によれば生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とすることにより、生死細胞や死細胞を正確に測定することで、細胞による環境汚染状況が把握でき、汚染の防止手段をいち早く対策することができる。また、細胞に対する毒性、微生物の殺菌効果などを確認することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７５】
また、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とすることにより、食品、水等の汚れ等の環境モニタリングがリアルタイムで行え、医療はもちろん食品衛生分野でも適用することができ、また迅速に大腸菌等の特定微生物の存在を把握できると微生物汚染による市場流通への影響をいち早く防止することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７６】
また、発色を蛍光としたことにより、作業測定者による受光時の誤認を防止し、細胞数を精度よく正確に計量することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７７】
また、前記第１の試薬を核酸結合性の試薬としたことにより細胞の代謝物や汚れ物質の存在下でも正確に測定することができるため、食材、汚泥等の検体でも直接、生死細胞を測定できるため、検査時間を削減し、迅速に測定することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７８】
また、前記第２の試薬を核酸結合性の試薬としたことにより細胞の代謝物や汚れ物質の存在下でも正確に測定することができるため、食材、汚泥等の検体でも直接、死細胞のみを測定できるため、検査時間を削減し、さらに迅速に測定することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００７９】
また、前記第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬としたことにより、生きている微生物の有無を確認することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。また、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでより高い感度で生きている微生物の有無を判断することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８０】
また、前記特定微生物由来物質を酵素タンパク質としたことにより、特殊な微生物の有無が確認でき、微生物をモニタリングすることができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。また、前処理などの必要がなくなり、さらに検査時間を短時間にすることができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８１】
また、特定微生物由来物質と反応することで発色する試薬を検体に接触させ、その波長および発色量から特定微生物を検出することを特徴とすることにより、特定微生物のみを迅速に計量し、食品汚染状況の把握や人体への特定微生物の混入を予防することができるという効果のある微生物計量方法を提供できる。
【００８２】
また、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より細胞を計量する微生物計量装置を特徴とすることにより、人為誤差を最小限にし、検査作業経験がなくとも、簡単に計量ができるという効果のある微生物計量装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１の生死細胞と死細胞の計量方法の構成図
【図２】同実施例２の微生物計量装置の模式図
【図３】同実施例１と２の生死細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図４】同実施例１と２の死細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図５】同実施例３の生死細胞と死細胞と生細胞と大腸菌群の計量方法の構成図
【図６】同実施例３と４の活性の強い生細胞と電気信号出力の検量線グラフ
【図７】同実施例３と４の大腸菌群と電気信号出力の検量線グラフ
【符号の説明】
１４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩
２プロピデュームイオダイド
３付着プレート
４プレート台
５励起光光源
６蛍光受光部
７分光フィルム
８微生物計量装置
９光源部
１０検体試薬含有部
１１受光部
１２波長分光部
１３光量計測部
１４演算処理部
１５表示部
１６６−カルボキシフルオレセインジアセテート
１７４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention develops a color from a plurality of types of microorganisms (meaning, a concept including at least bacteria and fungi), that is, bacteria or fungi that may be attached or mixed in. The present invention relates to a microorganism weighing method and a microorganism weighing apparatus capable of simultaneously weighing live and dead cells and specific microorganisms.
[0002]
[Prior art]
  Conventionally, this kind of microbial measuring method and microbial measuring device, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-323197, after the added compound penetrates into the microbial body, it is decomposed by an enzymatic reaction in the microbial body and emits fluorescence. Means for detecting microorganisms are known and recognized as living microorganisms. Moreover, the number of living and dead microorganisms is grasped by using a reagent for staining dead cells together. As another example, there is known a method for detecting luminescence of a specific microorganism using an antibody as described in JP-A-7-140148, and the specific microorganism can be used in combination with a non-specific staining reagent. It is known to grasp the life and death microorganisms.
[0003]
  Moreover, in the food sanitation field etc., it is desired to detect specific microorganisms quickly. Specific microorganisms such as Staphylococcus aureus are measured depending on the coliform group, specific E. coli, and food as specific microorganisms. However, under circumstances where specific microorganisms are mixed with general bacteria or where impurities are present, it is necessary to separate or cultivate using separation means, or to remove impurities. We could not weigh at the same time.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
  In such a conventional microorganism measuring method and microorganism measuring apparatus, the former method for immediately distinguishing microorganisms uses a fluorescent sample made of fluorescein or a derivative thereof and a fluorescent dye made of propidium iodide under limited conditions. However, a fluorescent sample made of fluorescein or a derivative thereof has a large part due to the enzyme activity because it has a process of emitting light by degradation by esterase expressed by microorganisms. That is, the substrate temperature that varies depending on the temperature of the enzyme activity or the microbial species can be cited as an error affecting factor. Therefore, high-sensitivity measurement is expected in an environment where only the same type of microorganism is present, but there is a high possibility of underestimation or overestimation in an actual use environment. In addition, esterase may be produced outside the microbial cell, and in this case, the background and the microorganism are integrated, and thus there is a possibility that accurate detection cannot be performed. Therefore, there is a problem that the number of viable and dead microorganisms cannot always be grasped even if combined with double dyeing or double staining is performed.
[0005]
  On the other hand, the latter microorganism counting method uses a method of specifically detecting a microorganism using an antibody and a staining reagent that binds non-specifically to the microorganism. Although it is essential to use an antibody, an antibody has high sensitivity because it binds specifically, but cannot distinguish between life and death. Furthermore, the technique using this technique cannot distinguish between the life and death of microorganisms stained with a non-specific staining reagent contained in a specimen.
[0006]
  Moreover, it is desired to measure specific microorganisms and general bacteria simultaneously and rapidly.
[0007]
  An object of the present invention is to solve such a conventional problem, and to provide a microbial measuring method that accurately detects the amount of microorganisms by eliminating an error influencing factor due to enzyme activity of microorganisms.
[0008]
  It is another object of the present invention to provide a method for measuring microorganisms that can prevent the integration of microorganisms and the background to be measured, and that can be measured simultaneously with general bacteria and specific microorganisms.
[0009]
  In addition, by providing fluorescence as the color, it is possible to control the fluorescence having the wavelength of the excitation light and the specific wavelength that is colored by the excitation light, and provide a microorganism weighing method capable of accurately measuring the cells to be detected. The purpose is to do.
[0010]
  Another object of the present invention is to provide a microorganism measuring method that can measure the number of living and dead cells up to a single cell level by using a compound that binds to the nucleic acid of a living and dead cell.
[0011]
  It is another object of the present invention to provide a method for measuring microorganisms that can measure the number of dead cells up to the level of a single cell by using a compound that binds to nucleic acid of dead cells.
[0012]
  Another object of the present invention is to provide a method for measuring microorganisms that can measure only the number of living microorganisms by using a compound that develops color of living cells as a compound that develops color by reacting with a microorganism-derived substance.
[0013]
  It is another object of the present invention to provide a method for measuring microorganisms that can determine the presence or absence of living microorganisms with higher sensitivity by using a compound having a microorganism-derived substance as an enzyme protein.
[0014]
  Another object of the present invention is to provide a method for measuring microorganisms that can determine the presence or absence of a specific microorganism with higher sensitivity by using a compound having a specific microorganism-derived substance as an enzyme protein.
[0015]
  Another object of the present invention is to provide a microorganism measuring method that can detect the amount of a specific microorganism by contacting a compound that develops color by reacting with a substance derived from a specific microorganism, and detecting the wavelength and color development amount. And
[0016]
  It is another object of the present invention to provide a microorganism measuring apparatus that can automatically and quickly measure the amount of microorganisms by providing a light source and a light receiving means.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
  The microorganism weighing method and the microorganism weighing device of the present invention are provided with a living and dead cell in order to achieve the above goal.Any of the living and dead cellsThe first colorreagentAnd dead cellsReacts only with dead cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentreagentWhenBothTheCheck for the presence of microorganismsContact the specimen,Color the viable and dead cells with the first reagent, color the dead cells with the second reagent,From the difference in wavelength and color developmentBy detecting both live and dead cells at the same time and subtracting dead cells from the detected live and dead cells,Of living and dead cellsallAre detected simultaneously.
[0018]
  According to the present invention, it can be measured with high sensitivity even in an environment where various microorganisms exist, and can be evaluated in an actual environment, and is not affected by substances inside microorganisms or substances discharged outside microorganism cells. Therefore, it is possible to accurately grasp the number of living and dead cells and this technology binds non-specifically,All of living and dead cells and living and dead cellsThesimultaneousWill be detected. In addition, it is possible to discriminate whether cells are alive or dead. It also develops viable and dead cellsreagentAnd develop dead cellsreagentProvides a method for measuring microorganisms that is highly stable, easy to store, and can be used in environments such as low temperatures.
[0019]
  Also, live and dead cellsAny of the living and dead cellsThe first colorreagentWhenOnly dead cells react with dead cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentWith reagentsLiving cellsReacts only with live cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentreagentAnd one or more types, and a specific microorganism-derived substanceonlyBy reactingOnly specific microorganism-derived substancesAt least one kind of the fourth color which develops color at a wavelength different from that of the color development.reagentTheCheck for the presence of microorganismsFrom the difference in wavelength and amount of color developed by contacting the sampleWith living and dead cellsOf living and dead cellsallAlternatively, either one and a specific microorganism are detected simultaneously.
[0020]
  According to the present invention, a specific microorganism can be measured with high sensitivity from various cells and microorganisms, and can be evaluated under an actual environment. In order to measure a specific microorganism-derived substance, other cells and microorganisms can be measured. In addition, the presence of microorganisms can be confirmed, and there is no separation and washing means as a pretreatment, and a microorganism measurement method that can be measured quickly is obtained. It is done.
[0021]
  Further, the color development is fluorescent.
[0022]
  And according to this invention, the microorganisms measuring method which can measure only the microorganisms which carried out fluorescence coloring with high sensitivity is obtained.
[0023]
  In addition, the first compound has a nucleic acid binding property.reagentIt is characterized by that.
[0024]
  And according to this invention, the measurement to the level of a living and dead cell is attained, and the microorganisms measuring method which can enable highly sensitive measurement is obtained.
[0025]
  In addition, the secondreagentThe nucleic acid bindingreagentIt is characterized by that.
[0026]
  According to the present invention, it is possible to measure to the level of a dead cell, and to obtain a microorganism measuring method that enables highly sensitive measurement.
[0027]
  In addition, the thirdreagentDevelops color by reacting with microbial substances in the samplereagentIt is characterized by that. Furthermore, the microorganism-derived substance is an enzyme protein.
[0028]
  According to these inventions, the number of living microorganisms alone can be measured. Furthermore, the presence or absence of living microorganisms with higher sensitivity can be determined by using the microorganism-derived substance as an enzyme protein.
[0029]
  Further, the specific microorganism-derived substance is an enzyme protein.
[0030]
  And according to this invention, the microorganisms measuring method which can recognize the presence or absence of a specific microorganism is obtained by detecting the substance derived from the specific microorganism expressed inside or outside the cell of a specific microorganism. Then, by limiting to a specific microorganism-derived substance as an enzyme protein, a microorganism weighing method capable of recognizing the presence or absence of the specific microorganism with higher sensitivity can be obtained.
[0031]
  It also develops color by reacting with specific microorganism-derived substancesreagentAnd a specific microorganism is detected from the wavelength and color development amount.
[0032]
  And according to this invention, a specific microorganism is reliably recognized by couple | bonding specifically with a specific microorganism, and also the number of bacteria of a specific microorganism can be correctly grasped | ascertained from the fluorescence color development amount different from the color of a reagent. A microbial weighing method is obtained.
[0033]
  Further, the present invention is characterized by a microorganism measuring device that includes a light source and a light receiving means, and measures cells based on a wavelength difference of a specimen and a fluorescence coloring amount.
[0034]
  And according to this invention, the microorganisms measuring device which can measure microorganisms quickly and correctly can be obtained.
[0035]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  Life and death cellsAny of the living and dead cellsThe first colorreagentAnd dead cellsWhen Only dead cells that react onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentreagentWhenBothTheCheck for the presence of microorganismsContact the specimen,Color the viable and dead cells with the first reagent, color the dead cells with the second reagent,From the difference in wavelength and color developmentBy detecting both live and dead cells at the same time and subtracting dead cells from the detected live and dead cells,Of living and dead cellsallIn the environment where various microorganisms exist, it does not depend on the enzyme activity expressed by the microorganisms.simultaneousIt can measure with high sensitivity and can be evaluated under actual use environment.
[0036]
  Further, even when an enzyme expressed by microorganisms is produced outside the microorganism cell, it does not react with the enzyme, so that the background and the microorganism can be prevented from being integrated and detected.
[0037]
  In addition, unlike antibody detection, since it specifically binds to various cells, it has high sensitivity and can discriminate between life and death. For example, a reagent prepared by mixing 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride that binds to nucleic acid contained in living and dead cells and propidium iodide that binds to nucleic acid contained in dead cells is analyzed simultaneously. The number of viable cells can be measured from the difference between the number of live cells and dead cells and the number of dead cells. Furthermore, since the color development reacts rapidly with individual cells, it has the effect that the existence of viable and dead cells can be confirmed in a shorter time than conventional culture methods and antibody methods.
[0038]
  Life and death cellsAny of the living and dead cellsThe first colorreagentWhenOnly dead cells react with dead cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentWith reagentsLiving cellsReacts only with live cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentreagentAnd one or more types, and a specific microorganism-derived substanceonlyBy reactingOnly specific microorganism-derived substancesAt least one kind of the fourth color which develops color at a wavelength different from that of the color development.reagentTheCheck for the presence of microorganismsFrom the difference in wavelength and amount of color developed by contacting the sampleWith living and dead cellsOf living and dead cellsallOr, it is characterized by the simultaneous detection of either one and a specific microorganism, and the measurement of living and dead cells, dead cells and living cells, and specific microorganisms can be performed at the same time. Monitoring of the microorganisms in it can be measured quickly. For example, the number of general bacteria can be measured in the food field by live cell count, dead cell count and live cell count, and furthermore, the state after sterilization can be grasped by measuring dead cells. In addition, since the coliform group excretes a specific enzyme protein called β-galactosidase, the presence of the coliform group is clarified by using 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside that reacts with the enzyme protein. Therefore, it has an effect that it can inspect microbial contamination such as medical care and food hygiene.
[0039]
  By making the color development fluorescent, interference of the wavelength of the light to be developed can be prevented, it can be easily recognized visually, and an accurate cell count can be measured.
[0040]
  The firstreagentThe nucleic acid bindingreagentIt can be measured at the level of living and dead cells by binding to nucleic acid, and it can accurately measure live and dead cells with high sensitivity even in the presence of impurities such as metabolites, dust, and inorganic substances from microorganisms. Has the effect of being able to
[0041]
  The secondreagentThe nucleic acid bindingreagentIt can be measured at the level of a single dead cell by binding to nucleic acid, and accurately measures dead cells with high sensitivity even in the presence of impurities such as metabolites, dust, and inorganic substances from microorganisms. Has the effect of being able to
[0042]
  The thirdreagentDevelops color by reacting with microbial substances in the samplereagentIt has the effect that the presence or absence of living microorganisms can be confirmed by reacting with microorganism-derived substances such as metabolites of microorganisms. Moreover, the presence or absence of a living microorganism can be determined with higher sensitivity by using a microorganism-derived substance as an enzyme protein.
[0043]
  The specific microorganism-derived substance is an enzyme protein. Generally, since an enzyme protein is a substance that is metabolized by living cells, the living specific microorganism is measured without breaking the living cell membrane as a pretreatment. It has the effect of being able to.
[0044]
  Colored by reacting with specific microorganism-derived substancesreagentIt is characterized in that a specific microorganism is detected from its wavelength and color development amount, and an appropriate amount of a detection reagent can be supplied to the sample as appropriate, so that the operator can directly or indirectly contact the sample. It has the effect of being able to perform highly sensitive weighing with high safety.
[0045]
  It is a device that is equipped with a light source and light receiving means, and measures the cells based on the wavelength difference of the specimen and the amount of fluorescent coloration. It can easily measure the cells that emit fluorescence and shorten the examination time. Has the effect of being able to.
[0046]
【Example】
  Embodiment 1 of the present invention will be described below.
[0047]
  First, in the method for measuring microorganisms, a first compound, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride and a second compound, propidium iodide, are added to cells or specimens to which microorganisms are attached. Each reagent or mixed reagent is brought into contact. 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride passes through the cell membrane of the specimen and binds to the nucleic acid. Propidium iodide has a large molecular weight, so it cannot pass through the cell membrane of living cells and binds to nucleic acids of dead cells.
[0048]
  The 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride bound to the nucleic acid of the living and dead cells absorbs the amount of light at the excitation wavelength at the excitation wavelength of 359 nm and emits it to the fluorescence wavelength of 461 nm, thereby coloring the living and dead cells. Propidium iodide combined with dead cell nucleic acid absorbs the excitation wavelength and emits it at a fluorescence wavelength of 617 nm when the excitation wavelength is 535 nm, thereby coloring the dead cell. Weigh the colored cells visually or with a weighing device to check the number of living and dead cells.
[0049]
  Next, the microorganism weighing method will be described with reference to FIG. Microbial weighing method is 4 ', 6
A plate base 4 and a plate base 4 on which a glass attachment plate 3 to which the cells and microorganisms of the sample are attached and the attachment plate 3 are placed using diamidino-2-phenylindole dihydrochloride 1 and propidium iodide 2 as detection reagents. Is provided with an excitation light source 5 for irradiating the attachment plate 3 with excitation light, and a fluorescence light receiving part 6 having a magnifier for confirming the fluorescence coloration of the cells and microorganisms of the specimen and the fluorescence wavelength above the fluorescence light receiving part 6. It is comprised with the spectral film 7 which restricts.
[0050]
  The measurement method uses a mixture of 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride 1 and propidium iodide 2 as a detection reagent, and attaches a solution containing cells and microorganisms taken from the specimen. Adhering or dropping onto the surface of the plate 3, the attaching plate 3 is placed on the plate base 4, and the detection reagent is dropped onto the surface of the attaching plate 3. Then, the excitation light source 5 provided at the lower part of the attachment plate 3 is turned on, the cells and microorganisms on the attachment plate 3 are fluorescently colored, and the fluorescent light receiving unit 6 expands the fluorescent color development. Furthermore, the fluorescent film 7 that transmits only a specific wavelength turns on cells or microorganisms that emit fluorescence. Counting the number of living and dead cells and the number of dead cells by counting the number of single units that light up for each specific wavelength, and calculating the number of living cells. And the number of living cells and dead cells in the specimen can be confirmed.
[0051]
  Further, the fluorescent light receiving unit 6 is provided with a lens of 200 to 1000 times.
[0052]
  Example 2 of the present invention will be described below.
[0053]
  FIG. 2 shows a schematic diagram of an apparatus for automatically weighing. As shown in FIG. 2, the microorganism measuring device 8 includes a light source unit 9 having a lamp that emits excitation light, and a 4 ′, 6-diamidino-2 which is a detection reagent that develops microorganisms ingested from a specimen and living and dead cells of the microorganisms. A glass-made specimen reagent containing portion 10 in which a solution containing phenylindole dihydrochloride 1 and propidium iodide 2 which is a detection reagent that develops dead cells of microorganisms is mixed, and a light receiving portion 11 that receives the colored light. And a wavelength spectroscopic unit 12 that splits the light of the light receiving unit 11, a light amount measuring unit 13 that measures the amount of light, an arithmetic processing unit 14 that calculates the number of living cells and dead cells, and a display unit 15 that displays the calculated number of cells. It is configured.
[0054]
  An example of use of the microorganism weighing device 8 is shown below.
[0055]
  As a method of using the microorganism measuring device 8, 0.5 g of vegetables are immersed in 9.5 ml of physiological saline to prepare a suspension, and then 1 ml of the suspension and 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride 1 and propidium iodide 2 are mixed in the specimen reagent containing part 10. After mixing, the detection reagent and the suspension contained in the specimen reagent containing unit 10 are automatically stirred, so that the detection reagent and the microbial cells in the suspension are combined. Then, the lamp that emits the excitation light of the light source unit 9 is turned on, and the specimen is automatically irradiated with the excitation light, whereby the nucleic acid of the living and dead cells combined with the detection reagent and the nucleic acid of the dead cell are colored, and the light receiving unit 11 is irradiated. Is done. The light irradiated to the light receiving unit 11 is split into 450 to 480 nm as the fluorescence wavelength of the living and dead cells and 500 to 620 nm as the fluorescence wavelength of the dead cells in the wavelength spectroscopic unit 12, and the light amount measuring unit 13 converts the light amount into an electrical signal. Is done. The converted electric signal is calculated by the arithmetic processing unit 14 from the number of cells and the calibration curve of the electric signal, and the number of dead cells is subtracted from the number of living and dead cells to calculate the number of living cells. The display unit 15 can automatically display the number of living cells and the number of dead cells in the 1 ml suspension mixed in the specimen reagent containing unit 10.
[0056]
  FIG. 3 shows a calibration curve graph of live cells and electric signal output, and FIG. 4 shows a calibration curve graph of dead cells and electric signal output.
[0057]
  The amount of 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride 1 added dropwise or added to the suspension is 10 nmol to 1 μmol / ml as the final concentration with respect to the sample amount, and the optimum concentration is 100 nmol / ml. The final concentration of Propidium Iodide 2 or the amount added to the suspension is 10 nmol to 1 μmol / ml, and the optimum concentration is 100 nmol / ml.
[0058]
  Moreover, the excitation light source 5 uses what turns on the wavelength of 400 to 700 nm as an excitation wavelength.
[0059]
  According to the present invention, it is possible to quickly and accurately detect the level of microorganisms and the amount of microorganisms quickly and accurately using fluorescent color development.
[0060]
  In the first embodiment, the attachment plate 3 is made of glass, but a material such as acrylic or poly film that transmits excitation light may be used.
[0061]
  In Examples 1 and 2, the number of cells is measured by converting the light amount into an electrical signal. However, a method may be used in which an image is captured and the number of each cell is measured by the lighting amount of the image.
[0062]
  In Example 2, the specimen reagent containing portion 10 made of glass is used. However, a material that transmits the excitation wavelength and the fluorescence wavelength may be used.
[0063]
  Example 3 of the present invention will be described below.
[0064]
  First, the method for measuring microorganisms includes a first compound 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride and a second compound propidium iodide and a third compound on a specimen to which cells or microorganisms are attached. The reagent which mixed 6-carboxyfluorescein diacetate which is the compound of (4), and 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside which is the fourth compound is brought into contact. The 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride bound to the nucleic acid of the living and dead cells absorbs the excitation wavelength when the excitation wavelength is 359 nm and emits a fluorescence wavelength of 461 nm to cause the living and dead cells to develop color. Propidium iodide combined with dead cell nucleic acid absorbs the amount of light at the excitation wavelength when the excitation wavelength is 535 nm and changes the fluorescence wavelength to 617 nm to cause only dead cells to develop color. In addition, 6-carboxyfluorescein diacetate that has reacted with the esterase of living cells is decomposed by esterase to become fluorescein, and when the excitation wavelength is 474 nm, it absorbs the excitation wavelength and emits a fluorescence wavelength of 541 nm, thereby developing only the living cells. Further, 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside reacted with β-galactosidase metabolized by Escherichia coli group becomes 4-methylumbelliferone, and when the excitation wavelength is 394 nm, the excitation wavelength is absorbed and the fluorescence wavelength is 489 nm. To cause coloration of coliforms. The number of viable and dead cells is measured from the number of colored cells, and the number of live and dead cells is calculated. Furthermore, the presence or absence of living coliforms as living cells or specific microorganisms can be confirmed.
[0065]
  Next, the microorganism weighing method of the present invention shown in FIG. 5 will be described. The microbial weighing method comprises 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride 1, propidium iodide 2, 6-carboxyfluorescein diacetate 16 and 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside 17. Is used as a detection reagent, a glass attachment plate 3 to which cells and microorganisms are attached, a plate base 4 on which the attachment plate 3 is placed, an excitation light source 5 that irradiates the attachment plate 3 with excitation light on the bottom of the plate base 4, and an attachment plate 4 The fluorescent light receiving unit 6 is provided with a magnifying glass that captures the color of cells and microorganisms in the specimen at the top, and the spectral film 7 that limits the wavelength of the fluorescent color development above the fluorescent light receiving unit 6.
[0066]
  As a measuring method, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride 1, propidome iodide 2, 6-carboxyfluorescein diacetate 16 and 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside were used as detection reagents. The adhering plate 3 with a solution containing cells and microorganisms taken from the specimen is placed on the plate table 4 and a detection reagent is dropped onto the surface of the adhering plate 3. Then, the excitation light source 5 provided at the lower part of the attachment plate 3 is turned on to fluoresce cells and microorganisms on the attachment plate 3. The fluorescence is magnified and transmitted by the fluorescence light receiving unit 7, and cells and microorganisms are lit on a single unit by the spectral film 7 that transmits only a specific wavelength. Viable and dead cells and dead cells can be visually confirmed, and the presence or absence of highly active live cells and coliforms can be visually confirmed.
[0067]
  The spectroscopic film 7 uses a material that transmits a fluorescent wavelength of 450 to 480 nm when measuring live cells, and a material that transmits a fluorescent wavelength of 500 to 620 nm when measuring dead cells. , A substance that transmits a fluorescence wavelength of 450 to 560 nm is used, and a substance that transmits a fluorescence wavelength of 400 to 550 nm is used when measuring coliform bacteria.
[0068]
  Embodiment 4 of the present invention will be described below.
[0069]
  An apparatus that automatically performs weighing will be described below with reference to FIG. As shown in FIG. 2, the microorganism measuring device 8 includes a light source unit 9 having a lamp that emits excitation light, and a 4 ′, 6-diamidino-2 which is a detection reagent that develops microorganisms ingested from a specimen and living and dead cells of the microorganisms. Color development of phenylindole dihydrochloride 1 and propidium iodide 2 which is a detection reagent for coloring dead cells of microorganisms, 6-carboxyfluorescein diacetate 16 which is a detection reagent for coloring living cells of microorganisms and coliforms Spectroscopic analysis of the light from the light-receiving unit 11 and the light-receiving unit 11 that receives the colored sample reagent containing portion 10 mixed with a solution containing 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside 17 as a detection reagent. A wavelength spectroscopic unit 12 that performs measurement, a light amount measurement unit 13 that measures the amount of light, and a calculation processing unit 14 that calculates the number of living cells and dead cells or calculates the number of coliforms. And a display unit 15 for displaying the number of the cells.
[0070]
  An example of use of the microorganism weighing device 8 is shown below.
[0071]
  As a method of using the microorganism measuring device 8, 0.5 g of vegetables are immersed in 9.5 ml of physiological saline to prepare a suspension, and then 1 ml of the suspension and 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride 1, propidium iodide 2, 6-carboxyfluorescein diacetate 16 and 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside 17 are mixed in the specimen reagent containing part 10. After mixing, the detection reagent and the suspension contained in the specimen reagent containing unit 10 are automatically stirred, so that the detection reagent and the microbial cells in the suspension are combined. Then, the lamp for emitting the excitation light of the light source unit 9 is turned on, and the specimen is automatically irradiated with the excitation light, whereby the nucleic acid of the living and dead cells combined with the detection reagent and the nucleic acid of the dead cell are colored, and the esterase of the living cells. Fluorescein and 4-methylumbelliferone are colored by the action of β-galactosidase metabolized by Escherichia coli and the light receiving unit 11 is irradiated. The light irradiated to the light receiving unit 11 is split into 461 nm as the fluorescence wavelength of the living and dead cells, 617 nm as the fluorescence wavelength of the dead cells, 541 nm as the fluorescence wavelength of the living cells, and 489 nm as the fluorescence wavelength of the coliform group. Then, the light quantity measurement unit 13 converts the light quantity into an electrical signal. The converted electrical signal is calculated by the arithmetic processing unit 14 from the number of cells and the calibration curve of the electrical signal, and the number of living cells is calculated from the difference between the number of living cells and the number of dead cells. The display unit 15 can automatically display the number of viable and dead cells, the number of dead cells, the number of viable cells with high activity, and the number of coliforms in the 1 ml suspension mixed in the sample reagent containing unit 10.
[0072]
  FIG. 6 shows a calibration curve graph of live cells with strong activity and electrical signal output, and FIG. 7 shows a calibration curve graph of coliform bacteria and electrical signal output.
[0073]
  According to the present invention, the number of living and dead cells is measured by measuring the number of viable and dead cells based on the developed fluorescence wavelength, and the number of living and dead cells can be measured quickly and easily at the visual level. In addition, it is possible to confirm the amount or presence of microorganisms such as coliforms and viable cells with strong activity.
[0074]
【The invention's effect】
  As is clear from the above examples, according to the present invention, live and dead cellsAny of the living and dead cellsThe first colorreagentAnd dead cellsReacts only with dead cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentreagentWhenBothTheCheck for the presence of microorganismsContact the specimen,Color the viable and dead cells with the first reagent, color the dead cells with the second reagent,Simultaneous detection of both live and dead cells from the difference in wavelength and color developmentBy subtracting dead cells from detected live and dead cells, all live and dead cells and all live and dead cells can be detected simultaneouslyBy measuring the viable and dead cells and the dead cells accurately, it is possible to grasp the state of environmental pollution caused by the cells and to quickly take measures to prevent contamination. In addition, it is possible to provide a method for measuring microorganisms that is effective in confirming the toxicity to cells and the bactericidal effect of microorganisms.
[0075]
  Also, live and dead cellsAny of the living and dead cellsThe first colorreagentWhenOnly dead cells react with dead cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentWith reagentsLiving cellsReacts only with live cells onlyTo develop a color at a wavelength different from that of the color developmentreagentAnd one or more types, and a specific microorganism-derived substanceonlyBy reactingOnly specific microorganism-derived substancesAt least one kind of the fourth color which develops color at a wavelength different from that of the color development.reagentTheThe presence or absence of microorganisms inspectFrom the difference in wavelength and amount of color developed by contacting the sampleWith living and dead cellsOf living and dead cellsallOr, it is characterized by detecting either one of them and a specific microorganism at the same time, so that environmental monitoring of food, water, etc. can be performed in real time, and it can be applied in the field of food hygiene as well as medical treatment. If the presence of specific microorganisms such as Escherichia coli can be grasped, it is possible to provide an effective microorganism weighing method that can quickly prevent the influence of microbial contamination on the market distribution.
[0076]
  In addition, since the color development is fluorescent, it is possible to provide a microorganism measuring method that is effective in preventing erroneous recognition at the time of light reception by a work measurer and measuring the number of cells accurately and accurately.
[0077]
  In addition, the firstreagentThe nucleic acid bindingreagentThis enables accurate measurement even in the presence of cellular metabolites and soil substances, so it is possible to directly measure viable and dead cells even in samples such as foodstuffs and sludges, reducing test time and measuring quickly. Therefore, it is possible to provide a method for measuring microorganisms that is effective.
[0078]
  In addition, the secondreagentThe nucleic acid bindingreagentThis enables accurate measurement even in the presence of cellular metabolites and soil substances, so that only dead cells can be measured directly in food, sludge, and other specimens, reducing test time and increasing speed. It is possible to provide a microorganism weighing method having an effect that it can be measured.
[0079]
  In addition, the thirdreagentDevelops color by reacting with microbial substances in the samplereagentThus, it is possible to provide a method for measuring microorganisms that is effective in confirming the presence or absence of living microorganisms. Moreover, the microorganism measuring method which has the effect of being able to judge the presence or absence of the living microorganisms with higher sensitivity can be provided by using the microorganism-derived substance as an enzyme protein.
[0080]
  Moreover, by using the specific microorganism-derived substance as an enzyme protein, it is possible to confirm the presence or absence of special microorganisms, and to provide a microorganism measuring method that is effective in monitoring microorganisms. In addition, it is possible to provide a microorganism measuring method that eliminates the need for pretreatment and that can further reduce the inspection time.
[0081]
  It also develops color by reacting with specific microorganism-derived substancesreagentIs characterized by detecting specific microorganisms from the wavelength and amount of color developed, thereby quickly measuring only specific microorganisms to prevent food contamination and mixing of specific microorganisms into the human body. Therefore, it is possible to provide a method for measuring microorganisms that is effective.
[0082]
  In addition, by providing a light source and light receiving means, and a microbiological weighing device that measures cells based on the difference in wavelength of the specimen and the amount of fluorescent color, the human error is minimized, making it easy to measure without any experience in testing. It is possible to provide a microorganism weighing device that is effective.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a configuration diagram of a measuring method for living and dead cells and dead cells in Example 1 of the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram of the microorganism weighing device of the second embodiment.
FIG. 3 is a calibration curve graph of live and dead cells and electrical signal output of Examples 1 and 2
FIG. 4 is a calibration curve graph of dead cells and electrical signal output in Examples 1 and 2;
FIG. 5 is a configuration diagram of a measuring method for living and dead cells, dead cells, living cells, and coliform bacteria in Example 3.
FIG. 6 is a calibration curve graph of live cells with strong activity and electrical signal output of Examples 3 and 4;
FIG. 7 is a calibration curve graph of E. coli group and electric signal output of Examples 3 and 4
[Explanation of symbols]
1 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride
2 Propidum Iodide
3 Adhering plate
4 Plate stand
5 Excitation light source
6 Fluorescence detector
7 Spectral film
8 Microorganism weighing device
9 Light source
10 Sample reagent containing part
11 Light receiver
12 Wavelength Spectrometer
13 Light intensity measurement unit
14 Arithmetic processing part
15 Display section
16 6-carboxyfluorescein diacetate
17 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactoside

Claims

生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、生死細胞を第１の試薬で発色させ、死細胞を第２の試薬で発色させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出することを特徴とする微生物計量方法。 Both microorganisms and second reagents to be developed with any react to the first reagent and dead cells only react with a wavelength different from the color only dead cells to be developed any viability cell viability Cell Make contact with the specimen to be tested for presence / absence , color viable cells with the first reagent, color the dead cells with the second reagent, and detect both viable and dead cells at the same time from the difference in wavelength and amount of color development A method for measuring microorganisms , comprising: subtracting dead cells from the detected live and dead cells to simultaneously detect all the live and dead cells and live and dead cells.

生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とする微生物計量方法。 A second reagent and living cells to be colored with the chromophore different wavelengths only dead cells react only with the first reagent and dead cells also be colored any one react to death cells viability cells only reaction Then, only a specific microorganism-derived substance is reacted with only one or a plurality of kinds of the third reagent that develops only living cells at a wavelength different from that of the color, and a wavelength different from that of the specific microorganism. at least one kind of fourth reagent into contact with the specimen to examine the presence or absence of microorganisms, all or one with a particular microorganism viability and living cells and dead cells from the wavelength difference and color quantity simultaneous in color development A method for measuring microorganisms, comprising detecting the microorganisms.

発色を蛍光とした請求項１または２記載の微生物計量方法。 The method for measuring microorganisms according to claim 1 or 2, wherein the color development is fluorescence.

第１の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物計量方法。The method for measuring microorganisms according to any one of claims 1 to 3, wherein the first reagent is a nucleic acid binding reagent .

第２の試薬を核酸結合性の試薬とした請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物計量方法。The method for measuring microorganisms according to any one of claims 1 to 4, wherein the second reagent is a nucleic acid binding reagent .

第３の試薬を検体中の微生物由来物質と反応することで発色する試薬とした請求項２記載の微生物計量方法。 Reagent claims 2 microorganism weighing method according to color by the third reagent reacts with microbial substance in a sample.

微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項６記載の微生物計量方法。 The method for measuring microorganisms according to claim 6, wherein the microorganism-derived substance is an enzyme protein.

特定微生物由来物質を酵素タンパク質とした請求項２記載の微生物計量方法。 The microorganism weighing method according to claim 2, wherein the specific microorganism-derived substance is an enzyme protein.

生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と生細胞とのみ反応して生細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質とのみ反応することで特定微生物由来物質のみを前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出するための装置で、光源と受光手段を設け、検体の波長差および発色量から生死細胞と生細胞と死細胞の全てまたはいずれか一方と特定微生物を同時検出することを特徴とする微生物計量装置。 Only the first reagent that reacts with any of the living and dead cells and develops both the living and dead cells and only the dead cells and reacts only with the second reagent and the living cells that develops only the dead cells with a wavelength different from that of the aforementioned development. Then, only a specific microorganism-derived substance is reacted with only one or a plurality of kinds of the third reagent that develops only living cells at a wavelength different from that of the color, and a wavelength different from that of the specific microorganism. At least one or more types of the fourth reagent that develops color is brought into contact with the specimen to be examined for the presence or absence of microorganisms, and from the wavelength difference and color development amount, all or any one of living and dead cells, living cells and dead cells, and a specific microorganism are simultaneously used. in the apparatus for detecting the light source and the light receiving means is provided, and characterized by simultaneous detection of all or one with a specific microbial viability cells and live and dead cells from the wavelength difference and the amount of color developed sample That microorganisms metering device.

生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれをも発色させる第１の試薬と死細胞とのみ反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬との両方を微生物の有無を検査する検体に接触させ、その波長差および発色量の差から生死細胞と死細胞の両方を同時に検出し、検出した生死細胞から死細胞を差し引くことで、生死細胞と生細胞と死細胞の全てを同時検出するための装置で、光源と受光手段を設け、検体の波長差および蛍光発色量より生死細胞と生細胞と死細胞の全てを計量する微生物計量装置。 Both microorganisms and second reagents to be developed with any react to the first reagent and dead cells only react with a wavelength different from the color only dead cells to be developed any viability cell viability Cell By contacting the specimen to be examined for presence or absence, simultaneously detecting both live and dead cells from the difference in wavelength and color development , subtracting dead cells from the detected live and dead cells , live and dead cells and live and dead cells A device for detecting all of the cells simultaneously, comprising a light source and a light receiving means, and measuring a living cell, a living cell, and a dead cell based on a wavelength difference of the specimen and a fluorescence color development amount.