ES2211138T3 - Nuevos cofactores de metiltransferasas. - Google Patents
Nuevos cofactores de metiltransferasas.Info
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Abstract
Derivado de aziridina ajustados a la **fórmula** en la que X es N o CH, Y es N o -CH3, R1 y R3 con independen cia entre sí son H, H3, -NH(CH2)nNHR4 o -NH(C2H5O)nC2H5NHR4 y R4 se elige entre fluoróforos, trazadores isotópicos (tags) de afinidad, agentes de reticulación, cromóforos, proteínas, péptidos, aminoácido que pueden estar eventualmente modifi cados, nucleótidos, nucleósidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos, polietilenglicol (PEG), reactivos de transfección, esferillas y agentes de intercalado, n es un número entero de 1 a 5000, y R2 se elige entre H, H3 y -CH2 CH(COOH)(NH2).
Description
Nuevos cofactores de metiltransferasas.
La presente invención se refiere a derivados de
aziridina que pueden utilizarse como cofactores de
metiltransferasas, a complejos y a composiciones que contienen
estos compuestos y a su utilización para modificar una molécula
diana.
Los ácidos nucleicos marcados de modo no
radiactivo son de un interés considerable en biología molecular,
porque pueden utilizarse en la secuenciación de DNA y pueden actuar
como sondas en ensayos Southern Blot y Northern Blot, en
hibridaciones "in situ" y en rastreos (screenings) de
colonia/placa sin los eligros sanitarios potenciales que conlleva
el material radiactivo. Actualmente se conocen en la técnica
diversos métodos de modificación covalente de DNA y RNA (revisión de
C. Kessler, en Nonisotopic DNA Probe Techniques, L.J. Kricka
(coordinador), editorial Academic Press, San Diego, 1992, pp.
29-92). Por ejemplo, pueden obtenerse
oligonucleótidos modificados por síntesis de DNA o RNA en fase
sólida y los oligonucleótidos resultantes pueden utilizarse como
cebadores (primers) para una polimerasa de DNA (P. Richterich, G.M.
Church, Methods Enzym. 218, 187-222, 1993).
Si la modificación no es capaz de resistir las condiciones de
reacción empleadas en la síntesis en fase sólida, entonces es
posible incorporar un grupo amina o tiol y realizar el marcado
posterior a la síntesis de los oligonucleótidos obtenidos son sondas
reactivas amina o tiol (D.M. Jameson, W.H. Sawyer, Methods Enzym.
246, 283-300, 1995). Por otro lado, a los
restos terminales fosfato o tiofosfato de los oligonucleótidos se
les pueden insertar varios marcadores (J.-L. Mergny y col., Nucleic
Acids Res. 22, 920-928, 1994).
Otro método descrito en la técnica es la
incorporación de desoxinucleosidotrifosfatos modificados al DNA con
polimerasas de DNA (A. Waggoner, Methods Enzym. 246,
362-373, 1995) o con
desoxinucleotidil-transferasa terminal (L.K. Riley,
M.E. Marshall, M.S. Coleman, DNA 5, 333-338,
1986; G. Trainor, M.A. Jensen, Nucleic Acids Res. 16, 11846,
1988).
Por otro lado son varias las modificaciones que
pueden incorporarse directamente al DNA o al RNA. Por ejemplo, los
restos citosina pueden modificarse por activación con bisulfito y
después adición de aminas alifáticas (R.P. Viscidi, Methods Enzym.
184, 600-607, 1990; D.E. Draper, L. Gold,
Biochemistry 19, 1774-1781, 1980). Además son
productos comerciales otros reactivos químicos para marcar el DNA y
el RNA (FastTag, Vector, Burlingame, CA; Mirus Label IT, Pan Vera
Corporation, Madison, WI). Sin embargo, estos métodos de marcado no
producen modificaciones cuantitativas ni específicas de secuencia y
por ello se obtienen mezclas complejas.
El marcado no radiactivo de proteínas es
sencillo, porque sus restos cisteína y lisina reaccionan fácilmente
con un gran abanico de reactivos de marcado (M. Brinkley,
Bioconjugate Chem. 3, 2-13, 1992; R.P.
Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals
1996, Molecular Probes Inc., Eugene, OR). No obstante, las proteínas
por lo general contienen muchos restos lisina o cisteína y el
marcado da lugar con frecuencia a mezclas complejas que resultan
difíciles de analizar. Por consiguiente, la modificación específica
de proteínas es incluso más difícil que la del DNA o del RNA. Una
estrategia para obtener proteínas marcadas específicamente consiste
en diseñar por mutagénesis una proteína que tenga un solo resto
cisteína; a continuación se modifica el resto cisteína por ejemplo
con un grupo fluorescente (G. Haran, E. Haas, B.K. Szpikowska, M.T.
Mas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
11764-11768, 1992).
Por otro lado pueden incorporarse a las proteínas
aminoácidos no naturales mediante traducción "in vitro"
(V.W. Cornish, D. Mendel, P.G. Schultz, Angew. Chem. 107,
677-690, 1995); Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
34, 620-630, 1995). Sin embargo, este método
no puede llevarse a cabo con facilidad y produce solamente una
cantidad pequeña de proteína modificada.
Otra posibilidad es la obtención de proteínas
modificadas por síntesis química de péptidos (T.W. Muir, S.B.H.
Kent, Current Opinion in Biotechnology 4,
420-427, 1993); sin embargo, en general está
limitada a la obtención de cadenas proteicas relativamente
cortas.
En Tetrahedron Lett. 28,
2469-72, 1987, se describe la síntesis y las
propiedades de reticulación de un desoxioligonucleótido que
contiene la
N^{6},N^{6}-etanodesoxiadenosina.
El objeto de la presente invención consiste en
superar los inconvenientes de los métodos conocidos y proporcionar
nuevos compuestos que permitan la modificación de biomoléculas (por
ejemplo el marcado) de un modo simple y eficaz mediante el uso de
una metiltransferasa.
Este objeto se consigue con derivados de
aziridina representados por la fórmula (I)
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en la que X es N o CH, Y es N o -CH^{3},
R^{1} y R^{3} con independencia entre sí son H, H^{3},
-NH(CH_{2})_{n}NHR^{4} o
-NH(C_{2}H_{5}O)_{n}C_{2}H_{5}NHR^{4} y
R^{4} se elige entre fluoróforos, trazadores isotópicos (tag) de
afinidad, agentes de reticulación, cromóforos, proteínas, péptidos,
aminoácido que pueden estar eventualmente modificados, nucleótidos,
nucleósidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos,
polietilenglicol (PEG), reactivos de transfección, esferillas y
agentes de intercalado y n es un número entero de 1 a 5000, y
R^{2} se elige entre H, H^{3} y
-CH_{2}CH(COOH)(NH_{2}).
En la figura 1 se representa la cromatografía de
intercambio aniónico de la reacción enzimática con
M\cdotTaqI del ejemplo 1 después de diferentes tiempos de
incubación.
En la figura 2A se representa el espectro de
masas EP-HPLC/ESI del producto
oligodesoxinucleótido doble 5\cdot4 del ejemplo 1 eluido después
de 14,6 min.
En la figura 2B se presenta el espectro de masas
ESI del producto 5 \cdot 4 obtenido por infusión directa.
En la figura 3 se presenta la cromatografía de
intercambio aniónico de la reacción enzimática con
M\cdotHhaI del ejemplo 1 después de diferentes tiempos de
incubación.
En la figura 4 se representa el espectro de masas
ESI después de una cromatografía HPLC-RP del
producto oligodesoxinucleótido doble 8\cdot7 del ejemplo 1.
En la figura 5 se representa la cromatografía de
intercambio aniónico (detección por UV y por fluorescencia) de la
reacción enzimática con M\cdotTaqI del ejemplo 2.
En la figura 6 se representa el cromatograma del
DNA plásmido marcado (ejemplo 2, marcado 3.1 con
M\cdotTaqI) de la cromatografía de intercambio aniónico
después de diferentes tiempos de incubación (6A: detección UV a 260
nm; 6B: detección por fluorescencia).
En la figura 7 se representan los cromatogramas
(7A: detección UV a 260 nm; 7B: detección por fluorescencia)
obtenidos de pUC19 no marcado (ejemplo 2, marcado 3.1 sin
M\cdotTaqI) para fines comparativos.
En la figura 8 se presentan los cromatogramas
(8A: detección UV a 260 nm; 8B: detección por fluorescencia) de
pUC19 marcado y no marcado (ejemplo 2, marcado 3.2 con y sin
M\cdotHhaI).
La presente invención se describe ahora con mayor
detalle.
Las metiltransferasas dependientes de
S-adenosil-L-metionina
(metiltransferasas dependientes de SAM) son un grupo de enzimas
importantes en el aspecto biológico. Constituyen aprox. un 3% de las
enzimas incluidas en la lista de la última versión de la obra
"Enzyme Nomenclature" de E.C. Webb, Academic Press, San Diego,
1992. Catalizan la transferencia del grupo metilo activado desde el
cofactor
S-adenosil-L-metionina
hasta los nucleófilos de azufre, nitrógeno, oxígeno y carbono de
moléculas pequeñas, fosfolípidos, proteínas, RNA y DNA. Las
metiltransferasas de DNA catalizan por ejemplo la metilación de la
posición N6 de la adenina y la posición C5 o N4 de la citosina
dentro de las secuencias específicas de DNA. Dado que las
endonucleasas de restricción son sensibles a la metilación del DNA,
las metiltransferasas de DNA pueden utilizarse para disminuir el
número de sitios de restricción del DNA (M. Nelson, I. Schildkraut,
Methods Enzymol. 155, 41-48, 1987).
La reacción de la que se sabe que se cataliza con
las metiltransferasas (mtasas) dependientes de SAM es la que se
muestra en el esquema de reacción 1, en el que el compuesto 1 es el
cofactor
S-adenosil-L-metionina
(SAM).
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Esquema de reacción
1
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Los inventores de la presente solicitud han
encontrado ahora que los derivados de aziridina de la siguiente
fórmula I actúan como cofactores de metiltransferasas dependientes
de SAM y de este modo permiten transferir grupos de mayor tamaño que
el metilo.
Los derivados de aziridina de la presente
invención se ajustan a la fórmula (I)
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en la que X es N o CH, Y es N o -CR^{3},
R^{1} y R^{3} con independencia entre sí son H, H^{3},
-NH(CH_{2})_{n}NHR^{4} o
-NH(C_{2}H_{5}O)_{n}C_{2}H_{5}NHR^{4} y
R^{4} se elige entre fluoróforos, trazadores isotópicos (tags) de
afinidad, agentes de reticulación, cromóforos, proteínas, péptidos,
aminoácido que pueden estar eventualmente modificados, nucleótidos,
nucleósidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos,
polietilenglicol (PEG), reactivos de transfección, esferillas y
agentes de intercalado y n es un número entero de 1 a 5000, y
R^{2} se elige entre H, H^{3} y
-CH_{2}CH(COOH)(NH_{2}).
Es preferido que solo uno de R^{1} y R^{3}
sea -NH(CH_{2})_{n}NHR^{4} o
-NH(C_{2}H_{5}O)_{n}C_{2}H_{5}NHR^{4}. En
los compuestos preferidos, X y/o Y son N; son especialmente
preferidos los compuestos en los que X e Y son, ambos, N.
En el grupo
-NH(CH_{2})_{n}NHR^{4}, n es con preferencia un
número entero de 2 a 20, con preferencia especial n = 3, 4 ó 5.
En el grupo
-NH(C_{2}H_{5}O)_{n}C_{2}H_{5}NHR^{4}, n
es con preferencia un número entero de 1 a 250; con mayor
preferencia, n es un número entero de 1 a 20.
El término fluoróforo empleado en esta
descripción significa una entidad química en la que los electrones
pueden estar excitados por luz de una cierta energía y los protones
de energía más baja se emiten seguidamente.
En los compuestos preferidos de la presente
invención, R^{1} y R^{2} son en cada caso H o H^{3} y X es
N.
Si por lo menos uno de R^{1} y R^{3} es
-NH(CH_{2})_{n}NHR^{4} o
-NH(C_{2}H_{5}O)_{n}C_{2}H_{5}NHR^{4},
entonces R^{4} se elige entre fluoróforos, trazadores isotópicos
(tags) de afinidad, agentes reticulantes, cromóforos, proteínas
(incluidos los anticuerpos y las enzimas), péptidos, aminoácidos,
aminoácidos modificados, nucleótidos, nucleósidos, ácidos nucleicos,
hidratos de carbono, lípidos, PEG, reactivos de transfección
(incluidas las polietileniminas, las macromoléculas, los
dendrímeros), las esferillas (p.ej. las formadas por agarosa,
sílice, nitrocelulosa, celulosa, acrilamida, látex, poliestireno,
poliacrilato, polimetacrilato, polímero de polietileno, partículas
de vidrio, silicatos, óxidos metálicos o combinaciones de los
anteriores), agentes de intercalado (incluido el bromuro de etidio,
el psoraleno y los derivados de los mismos). Son fluoróforos
preferidos el BODIPY, la cumarina, el dansilo, la fluoresceína, el
mansilo, el pireno, la rodamina, el rojo Texas, el TNS y los
fluoróforos de cianina, por ejemplo Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y
Cy7; pueden utilizarse también los derivados de estos fluoróforos.
Un significado especialmente preferido de R^{4} es el
dansilo.
dansilo.
Si R^{4} es un trazador isotópico (tag) de
afinidad, entonces será con preferencia un tag de péptido, la
biotina, la digoxigenina o el dinitrofenol; los tags de péptido
útiles son por ejemplo el his-tag o cualquier tag
que tenga propiedades quelantes de metales, que pueda utilizar en la
IMAC (immobilized metal affinity chromatography),
strep-tag, flag-tag,
c-myc-tag, epítopes o
glutationa.
Los agentes reticulanes útiles son por ejemplo la
maleimida, la yodoacetamida, los derivados de las anteriores, los
derivados de aldehído y los agentes fotorreticulantes. Son ejemplos
de agentes fotorreticulantes las arilazidas, los compuestos diazo y
los compuestos benzofenona.
La N-adenosilaziridina (compuesto
2) puede sintetizarse por ejemplo en una reacción de una sola etapa
por sustitución nucleófila del grupo tosilato de la
5'-tosiladenosina por aziridina (ver siguiente
esquema de reacción 2).
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Esquema de reacción
2
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El esquema de reacción 3 muestra la reacción
catalizada por una metiltransferasa (mtasa) empleando el cofactor
natural 1 y por otro lado empleando el nuevo cofactor 2 según la
presente invención.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema de reacción
3
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\newpage
En el siguiente esquema de reacción 4 se
representa la modificación de un oligodesoxinucleótido doble corto
(3\cdot4), formado por un oligodesoxinucleótido con una hebra más
(el 3:5'-GCCGCTCGATGCCG-3') y un
oligodesoxinucleótido complementario con una hebra menos (el
4:5'-CGGCATCGA^{Me}GCGGC-3'), con
el cofactor protonado análogo 2 que contiene aziridina mediante el
uso de la metiltransferasa de DNA del Thermus aquaticus
(M\cdotTaqI), específica de adenina. El
oligodesoxinucleótido 4 complementario con una hebra menos se elige
de modo que contenga el
N6-metiladenina-1-\beta-D-2'-desoxinucleósido
(A^{Me}) que ya no puede seguir metilándose por acción de la
M\cdotTaqI. La M\cdotTaqI cataliza normalmente la
transferencia del grupo metilo del cofactor natural 1 al grupo amino
exocíclico de la adenina dentro de la secuencia de DNA de doble
hebra 5'-TCGA-3' (ver siguiente
esquema 4) (M. McClelland, Nucleic Acids Res. 9,
6795-6804, 1981).
La estructura del producto de reacción 5\cdot4
puede verificarse por ejemplo por cromatografía HPLC en fase inversa
acoplada a una espectrometría de masas de ionización por
electropulverización (electrospray)
(HPLC-RP/EM-ESI).
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema de reacción
4
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\newpage
Los resultados experimentales demuestran que con
el cofactor no natural 2 se modifica cuantitativamente la hebra 3
más, no metilada, que contiene una adenina en la posición diana
dentro de la secuencia de reconocimiento
5'-TCGA-3' de la
M\cdotTaqI. Nuestra observación de que no se modifica la
hebra 4, que contiene la N6-metiladenina en otra
posición diana y una adenina fuera de la secuencia de
reconocimiento, viene a demostrar que la especificidad de secuencia
de la M\cdotTaqI no se modifica con el nuevo cofactor 2.
Además, la fragmentación enzimática del producto doble 5\cdot4
seguida por un análisis por cromatografía HPLC en fase inversa
proporciona un compuesto adicional, aparte de los nucleósidos
naturales dC, dA, dG, T y dA^{Me}. Este compuesto adicional se
aísla y se detecta que es un ion cargado positivamente en m/z 544,6
por espectrometría de masas con ionización de electropulverización.
La masa hallada es idéntica a la masa molecular calculada de una
2'-desoxiadenosina protonada y modificada con
N-adenosilaziridina. Este resultado pone de
manifiesto que solamente se modifica la adenina diana de la hebra 3
más. Por consiguiente, la adición catalizada por la
M\cdotTaqI del nuevo cofactor 2 sobre el DNA es
cuantitativa y específica de secuencia y de base.
Sin embargo, la presente invención no se limita a
la M\cdotTaqI, sino que permite utilizar también la
metiltransferasa de DNA específica de la C5-citosina
del Haemophilus haemolyticus (M\cdotHhaI) y
otras metiltransferasas empleando normalmente la
S-adenosil-L-metionina
(SAM) como cofactor. Esto demuestra fácilmente modificando el
oligodesoxinucleótido doble 6\cdot7 con la M\cdotHhaI.
Obviamente, la M\cdotHhaI cataliza la transferencia del
metilo activado de la SAM al átomo de carbono de la posición 5 de la
primera citosina de la secuencia de DNA 5'GCGC-3' de
doble hebra (ver parte superior del esquema 5). Los resultados
experimentales ponen de manifiesto que la M\cdotHhaI acepta
también al nuevo cofactor 2 y cataliza su inserción al
oligodesoxinucleótido doble 6\cdot7 (ver parte inferior del
esquema 5). Al igual que la reacción catalizada por la
M\cdotTaqI, la inserción catalizada por la
M\cdotHhaI es también cuantitativa.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema de reacción
5
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En esta solicitud se describe por primera vez la
transferencia de un grupo de mayor tamaño que un grupo metilo,
catalizada por dos metiltransferasas dependientes de
S-adenosil-L-metionina
distintas. Dado que la transferencia de por ejemplo el compuesto 2
induce un grupo amino secundario único en el DNA, deberían ser
factibles las posteriores reacciones de marcado con sondas reactivas
amino. Por lo tanto es posible la introducción específica en un
sitio de grupos fluorescentes, quimioluminiscentes u otros grupos
informantes (reporter).
Como alternativa, el nuevo cofactor fluorescente
9, en el que R^{1} es -NH(CH_{2})_{4}NHR^{4},
R^{2} es H, Y es N y R^{4} es un grupo dansilo fluorescente,
puede utilizarse para obtener directamente un DNA marcado de modo
específico de secuencia. Este derivado fluorescente de la
N-adenosilaziridina contiene el grupo reactivo
aziridina en la posición 5', el resto adenosilo, que actúa de ancla
molecular para la fijación de metiltransferasas al cofactor, y el
grupo fluorescente dansilo (marcador) que se fija sobre la posición
8 mediante un engarce (linker) flexible. La síntesis de este nuevo
cofactor 9 fluorescente se ilustra en el esquema 6. La reacción de
la
8-bromo-2',3'-O-isopropiliden-adenosina
con el 1,4-diaminobutano da lugar al derivado 10
protegido de la adenosina, con un engarce amino en la posición 8. La
protección transitoria del grupo hidroxi de la posición 5' con
trimetilclorosilano, la unión del cloruro de dansilo con la amina
primaria y la eliminación del grupo protector del grupo hidroxilo de
la posición 5' conduce al derivado de adenosina 11 protegido y
fluorescente. La reacción del compuesto 11 con el cloruro de mesilo
proporciona el mesilato 12. La eliminación del grupo isopropilideno
del compuesto 12 en condiciones ácidas conduce al derivado
fluorescente de adenosina 13 que se hace reaccionar con aziridina
para obtener el nuevo cofactor fluorescente 9.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema de reacción
6
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\newpage
El seguimiento de la unión del nuevo cofactor
fluorescente 9 con el oligodesoxinucleótido 3\cdot4 catalizada
por la M\cdotTaqI (esquema 7) se hace mediante
cromatografía de intercambio aniónico. Después de la fragmentación
proteolítica del complejo M\cdotTaqI-DNA
formado se genera el oligodesoxinucleótido doble 14\cdot4 marcado
con marcador fluorescente. Se verifica la estructura del producto
14\cdot4 por fragmentación enzimática seguida por cromatografía
HPLC en fase inversa. Además de los nucleósidos naturales dC, dA,
dG, T y dA^{Me}, los análisis revelan la presencia de un compuesto
fluorescente adicional, que se eluye con un tiempo de retención
mucho más elevado que el de los nucleósidos naturales, demostrando
con ello su naturaleza hidrófoba. Este compuesto fluorescente
adicional se aísla y se detecta en forma de ion cargado
positivamente de m/z = 863,1 por espectrometría de masas de
ionización por electropulverización. La masa hallada coincide con el
peso molecular calculado de 863,4 de la
2'-desoxiadenosina protonada y modificada con el
cofactor 9. Por lo tanto, la reacción de unión del nuevo cofactor
fluorescente 9 con el DNA, catalizada por la M\cdotTaqI, se
realiza de forma cuantitativa y específica de base.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema de reacción
7
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\newpage
La presente invención puede utilizarse además
para marcar moléculas de DNA de mayor tamaño. Esto se ha demostrado
marcando el plásmido pUC19 (2.686 pares de bases) con el nuevo
cofactor fluorescente 9 y con la M\cdotTaqI. La reacción de
marcado se analiza por cromatografía de intercambio aniónico después
de diferentes períodos de incubación. Los cromatogramas no cambian
cuando se utiliza la detección UV, pero si se emplea la detección
por fluorescencia, los cromatogramas presentan un incremento claro
de la señal de fluorescencia a medida que aumenta el período de
incubación. La señal UV y la señal de fluorescencia se solapan e
indican que el material de partida pUC19 (solamente absorción UV) y
el pUC19 marcado con marcador fluorescente (absorción UV y
fluorescencia) se eluyen con el mismo tiempo de retención. En un
ensayo paralelo de control sin M\cdotTaqI, no se observa
señal de fluorescencia correspondiente al pUC19 marcado con marcador
fluorescente. Este resultado viene a demostrar que la reacción de
marcado de hecho está catalizada por la M\cdotTaqI. Es
interesante notar que el nucleósido fluorescente 9 actúa también
como cofactor de la M\cdotHhaI. El análisis por
cromatografía de intercambio aniónico de la reacción de unión entre
el nucleósido fluorescente 9 y el pUC19 catalizada por la
M\cdotHhaI indica que se produce también el pUC19 marcado
con marcador fluorescente y que sin la M\cdotHhaI no tiene
lugar marcado alguno.
Las estructuras tridimensionales de varias
metiltransferasas formando complejo con el cofactor natural
(metiltransferasa M\cdotTaqI de N6-adenina
de DNA: J. Labahn, J. Granzin, G. Schluckebier, D.P. Robinson, W.E.
Jack, I. Schildkraut, W. Saenger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91, 10957-10961, 1994;metiltransferasa DpnM
de N6-adenina de DNA: P.H. Tran, Z.R. Korszun, S.
Cerritelli, S.S. Springhorn, S.A. Lacks, Structure 6,
1563-1575, 1998; metiltransferasa
M\cdotHhaI de C5-citosina de DNA: S.
Klimasauskas, S. Kumar, R.J. Roberts, X. Cheng, Cell 76,
357-369, 1994; metiltransferasa M\cdotPvuII
de N4-citosina de DNA: W. Gong, M. O'Gara, R.M.
Blumenthal, X. Cheng, Nucleic Acids Res. 25,
2702-2715, 1997; metiltransferasa ErmC'de
N6-adenina de RNA: D.E. Bussiere, S.W. Muchmore,
C.G. Dealwis, G. Schluckebier, V.L. Nienaber, R.P. Edalji, K.A.
Walter, U.S. Ladror, T.F. Holzman, C. Abad-Zapatero,
Biochemistry 37, 7103-7112, 1998;
metiltransferasa VP39 de
2'-O-nucleósido de mRNA: A.E. Hodel,
P.D. Gershorn, X. Shi, F.A. Quiocho, Cell 85,
247-256, 1996; metiltransferasa CheR de proteína:
S. Djordjevic, A.M. Stock, Structure 5,
545-558, 1997) indican que la posición 8 del anillo
adenina del cofactor natural es por lo menos parcialmente accesible
al disolvente y por ello es idóneo para la inserción de un grupo
adicional sin intervenir en gran manera en la fijación del cofactor
de estas metiltransferasas. En algunas metiltransferasas, la
posición 7 del anillo adenina del cofactor natural está incluso más
expuesto al disolvente y, por lo tanto, deberá considerarse como la
mejor opción en el momento de escoger una posición para la inserción
de grupos adicionales (Y en la fórmula I) para estas
metiltransferasas. Además, la estructura tridimensional de la
catecol-O-metiltransferasa (COMT)
formando complejo con el cofactor natural (J. Vidgren, L.A.
Svensson, A. Liljas, Nature 368, 354-358,
1994) indica que el anillo adenina del cofactor natural está
sepultado dentro de la bolsa de fijación del cofactor. En este caso,
la fijación de un grupo adicional en la posición 5' del anillo
aziridina (R^{2} en la fórmula I) parece más compatible con la
fijación del cofactor de esta metiltransferasa. Por lo tanto, los
nuevos cofactores con modificaciones en la posición 8 del anillo
adenina (R^{1} de la fórmula I), en la posición 7 del anillo
adenina (Y de la fórmula I) y en la posición 5' del anillo aziridina
(R^{2} de la fórmula I) pueden utilizarse para obtener un amplio
abanico de biomoléculas marcadas de modo específico de sitio.
Las metiltransferasas útiles de la presente
invención normalmente transfieren el grupo metilo de la SAM a una
molécula de ácido nucleico, por ejemplo DNA o RNA, a un polipéptido,
a una proteína, una enzima o una molécula pequeña. Una visión de
conjunto de las metiltransferasas dependiente de la SAM se
encontrará por ejemplo en R.M. Kagan y S. Clarke, Archives of
Biochemistry and Biophysics 310, 417-427,
1994. Este artículo proporciona además una lista de
O-metiltransferasas de molécula pequeña y
N-metiltransferasas de molécula pequeña, incluidas
por ejemplo la
catecol-O-metiltransferasa y la
glicina-N-metiltransferasa.
Son especialmente preferidas para el uso en la
presente invención las metiltransferasas que metilan el DNA, en
especial aquellas que forman parte de un sistema de modificación de
restricción de una bacteria y las metiltransferasas que metilan
proteínas en distintos aminoácidos.
La presente invención no se refiere solamente a
los derivados de aziridina propiamente dichos, sino que abarca
también el complejo de estos derivados con una metiltransferasa así
como las composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que contienen
un derivado de aziridina de la presente invención o un complejo del
mismo con una metiltransferasa.
Los derivados de aziridina de la presente
invención pueden utilizarse para modificar una molécula diana (p.ej.
el DNA o fragmentos del mismo, el RNA o fragmentos del mismo,
híbridos de DNA y RNA, polipéptidos, por ejemplo proteínas de
fusión, proteínas que contienen un sitio de metilación, polímeros
sintéticos y moléculas pequeñas, por ejemplo lípidos). Tal
modificación puede llevarse a cabo transfiriendo un derivado de
aziridina de la presente invención o una parte del mismo a la
molécula diana mediante una metiltransferasa.
La presente invención se ilustra seguidamente con
mayor detalle mediante los ejemplos siguientes.
En atmósfera de argón se añade lentamente
aziridina seca (S. Gabriel, Chem. Ber. 21,
2664-2669, 1888; S. Gabriel, R. Stelzner, Chem. Ber.
28, 2929-2938, 1895) (360 \mul, 7,2 mmoles)
a una suspensión de 5'-tosiladenosina (100 mg, 0,24
mmoles, Aldrich) en N-etildiisopropilamina (125
\mul, 0,7 mmoles) y se agita la solución resultante a temperatura
ambiente durante tres días. Se elimina el resto de aziridina sin
reaccionar a presión reducida y se disuelve el producto en bruto de
la reacción en agua (1 ml) y se neutraliza con ácido acético (1 M).
Se inyecta la solución (100 \mul de una vez) en una columna de
cromatografía HPLC de fase inversa (Hypersil-ODS, 5
\mum, 120 \ring{A}, 250 x 10 mm, Bischoff, Leonberg, Alemania)
y se eluye el producto con un gradiente lineal de acetonitrilo
(7-10% en 30 min, 2 ml/min) en tampón de
hidrogenocarbonato de trietilamonio (0,1 M, pH 8,4). Se reúnen las
fracciones que contienen producto (tiempo de retención 11,3 min,
detección UV a 259 nm), se concentran por liofilización hasta 5,5 ml
(10,5 mM, empleando \lambda = 260, \varepsilon = 15400 de
adenosina) y se almacenan a -80ºC. Rendimiento: 0,058 mmoles (24%).
Para la caracterización posterior se liofiliza por completo una
parte alícuota, obteniéndose el compuesto 2 en forma de sólido
blanco.
RMN-H^{1} (500 MHz, D_{2}O):
\delta = 1,49-1,40 (m, 2H; H de aziridina),
1,85-1,74 (m, 2H; H de aziridina), 2,74 y 2,68
(parte AB del espectro ABX, J^{3} = 4,3, 6,6 Hz, J^{2} = 13,3
Hz, 2H; 5'-H_{a}, 5'-H_{b}),
4,35 (ddd = dt, J^{3} = 4,6, 4,6, 6,7 Hz, 1H;
4'-H), 4,46 (dd = t, J^{3} = 5,1 Hz, 1H;
3'-H), 4,84 (dd = t, J^{3} = 5,3 Hz, 1H;
2'-H), 6,13 (d, J^{3} = 5,0 Hz, 1H;
1'-H), 8,30 (s, 1H; 8-H), 8,36 (s,
1H; 2-H).
EM-FAB (ácido tioglicólico): m/z
(%): 293 (100) [M^{+} + H], 250 (4) [M^{+} - C_{2}H_{4}N],
178 (11) [B^{+} + C_{2}H_{4}O], 167 (34), 165 (5), 164 (5)
[B^{+} + CH_{2}O], 158 (36) [M^{+} - B], 149 (78), 136 (91)
[BH_{2}^{+}], 102 (23); B = adenina desprotonada.
Se sintetizan los oligodesoxinucleótidos 3, 4, 6
y 7 en un sintetizador de DNA/RNA del tipo Applied Biosystems 392
aplicando la química estándar de la
\beta-cianoetil-fosforamidita. Las
síntesis se realizan por tritilación (modo "trityl on") y se
purifican los oligodesoxinucleótidos por cromatografía HPLC en fase
inversa. Se destritilan los oligodesoxinucleótidos con ácido acético
(del 80%), se prosigue su purificación por cromatografía HPLC en
fase inversa ("trityl off") y se elimina la sal por filtración
a través de gel. Los oligodesoxinucleótidos dobles 3\cdot4 y
6\cdot7 se forman por incubación a 95ºC (2 min) de cantidades
equimolares de las hebras complementarias en tampón (20 mM
Tris-acetato, 50 mM acetato potásico, 10 mM acetato
magnésico, pH 7,9 para el 3\cdot4 y 10 mM
Tris-cloruro, 50 mM cloruro sódico, 0,5 mM EDTA, pH
7,4 para el 6\cdot7), después se enfría lentamente (2 h) a
temperatura ambiente.
Se prepara la metiltransferasa
M\cdotTaqI de DNA, libre de cofactor, por el método
descrito anteriormente (B. Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E.
Weinhold, Nucleic Acids Res. 26, 1076-1083,
1998). La reacción catalizada por enzima se lleva a cabo a 37ºC en
una mezcla (500 \mul) de M\cdotTaqI (5 nmoles, 10
\muM), oligodesoxinucleótido doble 3\cdot4 (5 nmoles, 10
\muM), compuesto 2 (500 nmoles, 1 mM),
Tris-acetato (20 nM, pH 6,0), acetato potásico (50
mM), acetato magnésico (10 mM) y Triton X-100
(0,01%). El seguimiento del progreso de la reacción se realiza por
cromatografía de intercambio aniónico. Se retiran partes alícuotas
(50 \mul) de la mezcla reaccionante después de diferentes períodos
de incubación, se mezclan con una solución de urea (100 \mul, 6 M)
y se inyectan en una columna de intercambio aniónico (Poros 10 HQ,
10 \mum, 4,6 x 100 mm, PerSeptive Biosystems, Alemania). Se eluyen
los compuestos con cloruro potásico acuoso (0,5 M durante 5 min,
seguido por un gradiente lineal hasta 1 M en 30 min, 4 ml/min) en
tampón Tris-cloruro (10 mM, pH 7,6). En la figura 1
se presentan los cromatogramas de la cromatografía de intercambio
aniónicos después de diferentes períodos de incubación.
El análisis del producto oligodesoxinucleótido
doble 5\cdot4 por cromatografía HPLC en fase inversa seguida por
espectrometría de masas de ionización por electropulverización,
HPLC-RP/EM-ESI, se realiza en un
espectrómetro de masas con trampa iónica (LCQ, Finnigan MAT,
Alemania) equipado con un sistema micro-HPLC (M480 y
M300, Gynkotek, Alemania). El producto oligodesoxinucleótido doble
5\cdot4 se purifica por cromatografía de intercambio aniónico (ver
más arriba) y se elimina la sal por adición repetida de agua y
ultrafiltración (Microsep 3K, Pall Filtron, Northborough, MA,
EE.UU.). Una solución del 5\cdot4 purificado y desalinizado se
inyecta en una columna capilar (Hypersil-ODS, 3
\mum, 150 x 0,3 mm, LC Packings, Amsterdam, Holanda) y se eluye
con un gradiente lineal de acetonitrilo (7-10% en 10
min, seguido de 10-70% en 30 min, 150 \mul/min) en
tampón acetato de trietilamonio (0,1 M, pH 7,0). Los espectros de
masas ESI después de la cromatografía HPLC-RP
representados en la figura 2A se obtienen en modo ion negativo
aplicando las condiciones estándar. El cromatograma obtenido
observando la corriente iónica total se recoge en el recuadro
presentado dentro de la figura 2A.
Análisis del producto oligodesoxinucleótido doble
5\cdot4 por espectrometría de masas por ionización de
electropulverización empleando la infusión directa: el espectro de
masas ESI presentado en la figura 2B se consigue mediante un
espectrómetro de masas de campo sectorial de enfoque doble MAT 90
(Finnigan MAT, Alemania), equipado con una fuente iónica de
electropulverización ESI II y trabajando en modo ion negativo. El
5\cdot4 desalinizado (solución acuosa) y una corriente de
envoltura líquida (2-propanol) se alimentan a una
jeringuilla con bomba Harvard (Harvard Apparatus, EE.UU.). El
recuadro interior de la figura 2B muestra la expansión de la señal
del ion [5-6H]^{6-} con resolución
isotópica.
Los pesos moleculares de los
oligodesoxinucleótidos observados en los espectros de masas con
electropulverización de las figuras 2A y 2B se resumen en la tabla
1. Se incluyen también los pesos moleculares hallados de los
oligodesoxinucleótidos de partida (eductos).
Análisis del producto oligodesoxinucleótido doble
5\cdot4 por fragmentación enzimática: se disuelve el 5\cdot4
purificado y desalinizado (0,25 OD a 260 nm) en tampón fosfato
potásico (10 mM, pH 7,0, 100 \mul) que contiene cloruro magnésico
(10 mM), DNasa I (1,2 U), fosfodiesterasa de Crotalus
durissus (0,018 U), fosfodiesterasa de bazo de ternera (0,024
U) y fosfatasa alcalina (6 U) y se incuba a 37ºC durante 24 h. Se
inyecta una parte alícuota (50 \mul) en una columna de HPLC de
fase inversa (Hypersil-ODS, 5 \mum, 120
\ring{A}, 250 x 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, Alemania) y se eluyen
los productos con un gradiente lineal de acetonitrilo
(0-10,5% en 30 min, 1 ml/min) en tampón acetato de
trietilamonio (0,1 M, pH 7,0). El análisis HPLC-RP
del material digerido revela que, aparte de dC, dA, dG, T y
dA^{Me}, existe la presencia de un compuesto adicional que se
eluye entre el T y el dA^{Me}. Se aísla este compuesto adicional y
se detecta como ion cargado positivamente en m/z 544,6 por
EM-ESI (LCQ conectado a una fuente de ion de
nanoelectropulverización, Finnigan MAT, Alemania). La masa hallada
es idéntica a la masa molecular calculada de una
2'-desoxiadenosina protonada y modificada con
N-adenosilaziridina.
La metiltransferasa M\cdotHhaI de DNA
libre de cofactor se obtiene del modo descrito anteriormente (B.
Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E. Weinhold, Nucleic Acids Res.
26, 1076-1083, 1998). La reacción catalizada
por enzima se lleva a cabo a 25ºC en una mezcla (500 \mul) de
M\cdotHhaI (5 nmoles, 10 \muM), oligodesoxinucleótido
doble 6\cdot7 (5 nmoles, 10 \muM), compuesto 2 (500 nmoles, 1
mM), Tris-cloruro (10 mM, pH 7,4), cloruro sódico
(50 mM), EDTA (0,5 mM) y Triton X-100 (0,01%). El
seguimiento del progreso de la reacción se realiza por cromatografía
de intercambio aniónico. Se retiran partes alícuotas (50 \mul) de
la mezcla reaccionante después de diferentes períodos de incubación
y se inyectan en una columna de intercambio aniónico (Poros 10 HQ,
10 \mum, 4,6 x 100 mm, PerSeptive Biosystems, Alemania). Se eluyen
los compuestos con cloruro potásico acuoso (0 M durante 5 min,
seguido por un gradiente lineal hasta 0,5 M en 5 min y hasta 1 M en
30 min, 4 ml/min) en tampón Tris-cloruro (20 mM, pH
7,6). En la figura 3 se presentan los cromatogramas de la
cromatografía de intercambio aniónicos después de diferentes
períodos de incubación.
El análisis del producto oligodesoxinucleótido
doble 8\cdot7 por cromatografía HPLC en fase inversa seguida por
espectrometría de masas de ionización por electropulverización,
HPLC-RP/EM-ESI, se realiza del modo
descrito anteriormente para el análisis del 5\cdot4 (ver ejemplo
1, apartado 3.1). El espectro de masas ESI obtenido después de la
cromatografía HPLC-RP se presenta en la figura 4 y
los pesos moleculares hallados de los oligodesoxinucleótidos se
resumen en la tabla 2.
Compuesto | Carga | (m/z)_{esperado} | M_{esperado} | M_{calculado} |
8\cdot7 | 3- | 2738,4 | 8220,2 | 8215,5 |
8\cdot7 | 4- | 2054,1 | 8220,4 | 8215,5 |
8\cdot7 | 5- | 1642,8 | 8219,0 | 8215,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis del producto oligodesoxinucleótido
doble 8\cdot7 por fragmentación enzimática: la fragmentación
enzimática del 8\cdot7 se realiza del modo descrito para el
5\cdot4 (ejemplo 1, apartado 3.1). El análisis
HPLC-RP del material digerido revela que, aparte de
dC, dC^{Me}, dA, dG y T, existe la presencia de un compuesto
adicional que eluye antes del dC.
A una solución de
8-bromo-2',3'-O-isopropilen-adenosina
(M. Ikehara, H. Tada, M. Kaneko, Tetrahedron 24,
3489-3498, 1968) (628 mg, 1,6 mmoles) en DMSO seco
(10 ml) se le añade en atmósfera de argón trietilamina seca (2,26
ml, 16,3 mmoles) y 1,4-diaminobutano (0,82 ml, 8,1
mmoles). Se agita la solución a 110ºC y se hace el seguimiento del
progreso de la reacción por cromatografía de capa fina (CCF).
Pasadas 4 h se elimina el disolvente a presión reducida. Se disuelve
el residuo en agua (50 ml) y se ajusta el pH a 5,3 con ácido acético
(0,1 M). Se purifica el producto en bruto por cromatografía de
intercambio catiónico (Dowex 50 x 4 en forma H^{+}, 100 g, elución
con 600 ml de agua y después con 1000 ml de hidróxido potásico 1M).
Se extraen las fracciones que contienen producto con cloroformo y se
elimina el disolvente a presión reducida. Rendimiento: 639 mg
(100%).
R_{f} = 0,44 (butanol/ácido acético/agua
3:0,75:1,25)
RMN-H^{1} (500 MHz, CDC_{3}):
\delta = 1,33 (s, 3H; H de acetonuro), 1,48-1,55
(m, 2H), H de engarce (linker)), 1,61 (s, 3H; H de acetonuro),
1,64-1,70 (m, 2H; H de engarce),
2,66-2,73 (m, 2H; H de engarce),
3,33-3,42 (m, 2H), H de engarce),
3,77-3,91 (m, 2H; 5'-H),
4,28-4,30 (m, 1H; 4'-H), 4,99 (dd,
J^{3} = 2,7, 6,3 Hz, 1H; 3'-H), 5,08 (dd, J^{3}
= 4,8, 6,3 Hz, 1H; 2'-H), 5,39 (s, ancha, 2H;
6-NH_{2}), 6,15 (d, J^{3} = 4,5 Hz, 1H;
1'-H), 6,55-6,60 (m, 1H;
8-NH), 8,10 (s, 1H; 2-H).
RMN-C^{13} (125,7 MHz,
CDCl_{3}): \delta = 25,30 (q;
acetonuro-CH_{3}), 25,73 (t; C de engarce), 27,42
(q; acetonuro-CH_{3}), 29,60 (t; C de engarce),
40,46 (t; C de engarce), 42,69 (t; C de engarce), 61,17 (t;
5'-C), 80,59 (d; 3'-C), 82,19 (d;
2'-C), 84,48 (d; 4'-C), 89,21 (d,
1'-C), 114,50 (s;
acetonuro-C(CH_{3})_{2}), 117,68
(s; 5-C), 149,49 (d; 2-C), 149,95
(s; 8-C), 151,68 (s; 4-C), 151,72
(s; 6-C).
EM-ESI: m/z (%): 394,3 (25) [M +
H]^{+}, 222,3 (100) [adenina + aminobutilo +
H]^{+}.
A una solución del compuesto 10 (104 mg, 0,26
mmoles) en piridina seca (7 ml) se le añade lentamente en atmósfera
de argón y a 0ºC trimetilclorosilano (0,07 ml, 0,53 mmoles) y se
agita la solución resultante a temperatura ambiente durante 1 h. A
continuación se añade cloruro de dansilo (103,8 mg, 0,37 mmoles, en
3 ml de piridina) y se agita la solución a temperatura ambiente
durante 4 h. Se hace el seguimiento del progreso de la reacción por
cromatografía CCF y una vez completada la conversión se trata la
solución con agua (5 ml) a 0ºC. Se elimina el disolvente a presión
reducida y se purifica el producto en bruto por cromatografía de
columna (gel de sílice, 40 g, elución con cloruro de
metileno/metanol 19:1). Rendimiento: 50 mg (30%).
R_{f} = 0,54 (cloruro de metileno/metanol
9:1)
RMN-H^{1} (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 1,29 (s, 3H; H de
acetonuro), 1,39-1,43 (m, 2H; H de engarce),
1,47-1,50 (m, 2H; H de engarce), 1,53 (s, 3H; H de
acetonuro), 2,78-2,82 (m, 8H; H de engarce y
N(CH_{3})_{2}), 3,16-3,24 (m, 2H;
H de engarce), 3,50-3,58 (m, 2H;
5'-H), 4,12-4,14 (m, 1H;
4'-H), 4,94 (dd, J^{3} = 2,7, 6,1 Hz, 1H;
3'-H), 5,33 (dd, J^{3} = 3,7, 6,1 Hz, 1H;
2'-H), 5,41-5,44 (m, 1H;
5'-OH), 6,01 (d, J^{3} = 3,5 Hz, 1H;
1'-H), 6,49 (s, ancha, 2H;
6-NH_{2}), 6,85 (t, J^{3} = 5,0 Hz, 1H;
8-NH), 7,22 (d, J^{3} = 7,5 Hz, 1H; H aromático),
7, 54-7,61 (m, 2H; H aromático),
7,87-7,90 (m, 1H; NHSO_{2}), 7,90 (s, 1H;
2-H), 8,08 (d, J^{3} = 7,2 Hz, 1H; H aromático),
8,30 (d, J^{3} = 8,5 Hz, 1H; H aromático), 8,43 (d, J^{3} = 8,5
Hz, 1H; H aromático).
RMN-C^{13} (125,7 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 25,42 (q;
acetonuro-CH_{3}), 26,00 (t; C de engarce), 26,96
(t; C de engarce), 27,33 (q; acetonuro-CH_{3}),
41,92 (t; C de engarce), 42,43 (t; C de engarce), 45,21 (q;
N(CH_{3})_{2}), 61,40 (t; 5'-C),
81,14 (d; 3'-C), 81,50 (d; 2'-C),
85,29 (d; 4'-C), 87,85 (d; 1'-C),
113,38 (s), 115,24 (d; C aromático), 117,24 (s), 119,29 (d; C
aromático), 123,72 (d; C aromático), 127,92 (d; C aromático), 128,31
(d; C aromático), 129,26 (s), 129,48 (d; C aromático), 136,27 (s),
148,89 (d; 2-C), 149,30 (s), 151,20 (s), 151,50 (s),
152,58 (s).
EM-ESI, m/z (%): 627,1 (100) [M +
H]^{+}, 455,2 (8) [adenina + engarce + dansilo +
H]^{+}.
A una solución del compuesto 11 (181 mg, 0,32
mmoles) y dimetilaminopiridina (40 mg, 0,32 mmoles) en cloruro de
metileno seco (20 ml) se le añade en atmósfera de argón
trietilamina seca (1,1 ml, 8,0 mmoles) y se enfría la solución
resultante a 0ºC. Se añade cloruro de mesilo (200 \mul, 2,6
mmoles) y se agita la solución durante 30 min. Se interrumpe la
reacción con una solución fría de hidrogenocarbonato sódico (5 ml).
Se extrae la solución tres veces con cloroformo frío (10 ml). Se
reúnen las fases orgánicas y se elimina el disolvente a presión
reducida. Se purifica el producto en bruto por cromatografía de
columna (gel de sílice, 40 g, elución con cloruro de
metileno/metanol 97:3). Rendimiento: 96 mg (43%).
R_{f} = 0,55 (cloruro de metileno/metanol
9:1).
RMN-H^{1} (500 MHz,
CDCl_{3}): \delta = 1,37 (s, 3H; H de acetonuro),
1,45-1,48 (m, 2H; H de engarce),
1,59-1,61 (m, 5H; H de engarce y H de acetonuro),
2,85 (s, 6H; N(CH_{3})_{2}), 2,96 (s, 3H;
SO_{2}CH_{3}), 2,98-3,02 (m, 2H; H de engarce),
3,32-3,36 (m, 2H; H de engarce),
4,33-4,43 (m, 3H; 5'-H y
4'-H), 5,03 (dd, J^{3} = 9,8, 6,1 Hz, 1H;
3'-H), 5,52 (dd, J^{3} = 2,5, 6,5 Hz, 1H;
2'-H), 6,04 (d, J^{3} = 2,5 Hz, 1H;
1'-H), 6,13 (s, ancha, 2H;
6-NH_{2}), 6,91 (t, J^{3} = 5,8 Hz, 1H;
8-NH), 7,13 (d, J^{3} = 7,3 Hz, 1H; H aromático),
7,43 (t, J^{3} = 8,2 Hz, 1H; H aromático), 7,50 (t, J^{3} = 7,9
Hz, 1H; H aromático), 8,10 (s, 1H, 2-H), 8,23 (d,
J^{3} = 7,0 Hz, 1H; H aromático), 8,37 (d, J^{3} = 8,5 Hz, 1H; H
aromático), 8,51 (d, J^{3} = 8,6 Hz, 1H, H aromático).
RMN-C^{13} (125,7 MHz,
CDCl_{3}): \delta = 24,62 (q;
acetonuro-CH_{3}), 25,30 (t; C de engarce), 26,89
(t; C de engarce), 27,04 (q; acetonuro-CH_{3}),
37,50 (q; SO_{2}CH_{3}), 41,58 (t; C de engarce), 42,70 (t; C de
engarce), 45,44 (q; N(CH_{3})_{2}), 68,38 (t;
5'-C), 80,10 (d; 3'-C), 82,11 (d;
2'-C), 83,29 (d; 4'-C), 88,63 (d;
1'-C), 115,16 (d; C aromático), 118,94 (d; C
aromático), 123,23 (d; C aromático), 128,20 (d; C aromático), 129,70
(d; C aromático), 130,37 (d; C aromático), 149,78 (d;
2-C), 151,84 (s), 152,41 (s).
EM-ESI: m/z (%): 705,3 (70) [M +
H]^{+}, 609,7 (100) [ciclonucleósido +
H]^{+}.
Se disuelve el nucleósido 12 (96,2 mg, 0,14
mmoles) en ácido fórmico acuoso (al 50%, 10 ml) y se agita la
solución resultante a temperatura ambiente durante 4 h. Una vez
completada la conversión se elimina el disolvente a presión
reducida y se coevapora el disolvente restante con una mezcla de
agua y metanol (1:1, 5 ml). Se purifica el producto en bruto por
cromatografía de columna (gel de sílice, 15 g, elución con cloruro
de metileno/metanol 9:1). Rendimiento: 49,2 mg (55%).
R_{f} = 0,23 (cloruro de metileno/metanol
9:1).
RMN-H^{1} (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 1,36-1,42
(m, 2H; H de engarce), 1,47-1,53 (m, 2H; H de
engarce), 2,77-2,79 (m, 2H; H de engarce), 2,81 (s,
6H; N(CH_{3})_{2}), 3,07 (s, 3H;
SO_{2}CH_{3}), 3,17-3,20 (m, 2H; H de engarce),
4,01-4,04 (m, 1H; 4'-H),
4,33-4,47 (m, 3H; 5'-H y
3'-H), 5,08 (ddd = q, J^{3} = 5,5 Hz, 1H;
2'-H), 5,37 (d, J^{3} = 5,5 Hz, 1H; OH), 5,44 (d,
J^{3} = 5,5 Hz, 1H; OH), 5,72 (d, J^{3} = 5,1 Hz, 1H;
1'-H), 6,48 (s, ancha, 2H;
6-NH_{2}), 6,78 (t, J^{3} = 5,3 Hz, 1H;
8-NH), 7,24 (d, J^{3} = 7,8 Hz, 1H; H aromático),
7,57 (t, J^{3} = 8,3 Hz, 1H; H aromático), 7,61 (t, J^{3} = 7,8
Hz, 1H; H aromático), 7,88 (s, 1H, 2-H), 7,95 (t,
J^{3} = 5,7 Hz, 1H; NHSO_{2}), 8,08 (d, J^{3} = 6,9 Hz, 1H; H
aromático), 8,28 (d, J^{3} = 8,7 Hz, 1H; H aromático), 8,44 (d,
J^{3} = 8,7 Hz, 1H; H aromático).
RMN-C^{13} (125,7 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 27,24 (t; C de engarce),
28,06 (t; C de engarce), 37,91 (q; SO_{2}CH_{3}), 43,07 (t; C de
engarce), 43,58 (t; C de engarce), 46,41 (q;
N(CH_{3})_{2}), 71,21 (t; 5'-C),
71,45 (d; 3'-C), 71,61 (d; 2'-C),
82,20 (d; 4'-C), 88,63 (d; 1'-C),
116,44 (d; C aromático), 118,76 (s), 120,46 (d; C aromático), 124,98
(d; C aromático), 129,16 (d; C aromático), 129,54 (d; C aromático),
130,34 (s), 130,39 (d; C aromático), 130,68 (s), 137,35 (s), 149,95
(d; 2-C), 150,78 (s), 152,66 (s), 153,06 (s), 153,73
(s).
EM-ESI: m/z (%): 665,6 (85) [M +
H]^{+}, 687,4 (100) [M + Na]^{+}.
Se disuelve el nucleósido 13 (20 mg, 30
\mumoles) en aziridina seca (S. Gabriel, Chem. Ber. 21,
2664-2669, 1888; S. Gabriel, R. Stelzner, Chem. Ber.
28, 2929-2938, 1895) (1 ml) y
N-etildiisopropilamina (350 \mul) en atmósfera de
argón y se agita a temperatura ambiente durante 3 d. Se hace el
seguimiento de la reacción por cromatografía HPLC analítica de fase
inversa (Hypersil-ODS, 5 \mum, 120 \ring{A}, 250
x 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, Alemania). Se eluyen los compuestos
con acetonitrilo (0% durante 5 min, después con un gradiente lineal
hasta el 35% en 30 min y hasta el 70% en 10 min, 1 ml/min) en tampón
de acetato de trietilamonio (0,1 M, pH 7,0). Una vez se ha
completado la reacción se elimina el disolvente a presión reducida.
Se purifica el producto en bruto por cromatografía de columna (gel
de sílice, 2 g, elución con cloruro de metileno/metanol 9:1).
Rendimiento: 6,7 mg (36%).
R_{f} = 0,23 (cloruro de metileno/metanol
9:1).
RMN-H^{1} (500 Hz,
DMSO-d_{6}): \delta = 1,19-1,22
(m, 2H; H de aziridina), 1,32-1,34 (m, 2H; H de
engarce), 1,37-1,39 (m, 2H; H de engarce),
1,59-1,61 (m, 2H; H de aziridina), 1,94 (dd, J^{3}
= 3,2 Hz, J^{2} = 13,5 Hz, 1H; 5'-H_{a}),
2,74-2,79 (m, 2H; H de engarce), 2,81 (s, 6H;
N(CH_{3})_{2}), 2,91-2,95 (m, 1H;
5'-H_{b}), 3,07-3,16 (m, 2H; H de
engarce), 3,94-3,96 (m, 1H; 4'-H),
4,19-4,21 (m, 1H; 3'-H),
4,63-4,67 (m, 1H; 2'-H), 5,20 (d,
J^{3} = 4,1 Hz, 1H; OH), 5,30 (d, J^{3} = 6,8 Hz, 1H; OH), 5,90
(d, J^{3} = 7,2 Hz, 1H; 1'-H), 6,42 (s, ancha, 2H;
6-NH_{2}), 7,23 (d, J^{3} = 7,2 Hz, 1H; H
aromático), 7,55-7,61 (m, 3H; H aromático y
8-NH), 7,87 (s, 1H; 2-H), 7,95 (t,
J^{3} = 5,6 Hz, 1H; NHSO_{2}), 8,08 (d, J^{3} = 7,2 Hz, 1H; H
aromático), 8,28 (d, J^{3} = 8,6 Hz, 1H; H aromático), 8,43 (d,
J^{3} = 8,6 Hz, 1H; H aromático).
RMN-C^{13} (125,7 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 26,92 (t; C de aziridina),
27,43 (t; C de engarce), 28,01 (t; C de engarce), 30,02 (t; C de
aziridina), 43,02 (t; C de engarce), 43,65 (t; C de engarce), 46,41
(q; N(CH_{3})_{2}), 62,96 (t;
5'-C), 71,14 (d; 2'-C), 72,29 (d;
3'-C), 85,31 (d; 4'-C), 87,11 (d;
1'-C), 116,45 (d; C aromático), 118,20 (s), 120,45
(d; C aromático), 124,96 (d; C aromático), 129,16 (d; C aromático),
129,57 (d; C aromático), 130,00 (s), 130,36 (d; C aromático), 130,68
(s), 137,37 (s), 149,86 (d; 2-C), 151,49 (s), 152,42
(s), 152,66 (s), 153,43 (s).
EM-ESI: m/z (%): 612,7 (100) [M +
H]^{+}.
Se lleva a cabo esta reacción catalizada por
enzima a 37ºC en una mezcla (500 \mul) de M\cdotTaqI
libre de cofactor (5 nmoles, 10 \muM), oligodesoxinucleótido doble
3\cdot4 (5 nmoles, 10 \muM), el compuesto 9 (10 nmoles, 20
\muM), Tris-acetato (20 nM, pH 6,0), acetato
potásico (50 mM), acetato magnésico (10 mM) y Triton
X-100 (0,01%). Se hace el seguimiento de la reacción
por cromatografía de intercambio aniónico (Poros 10 HQ, 10 \mum,
4,6 x 100 mm, PerSeptive Biosystems, Alemania). Se eluyen los
compuestos con cloruro potásico acuoso (0,2 M durante 5 min, hasta
0,5 M en 5 min. y hasta 1 M en 30 min.) en tampón
Tris-cloruro (10 mM, pH 7,0). Pasados 15 min se
observa la conversión completa en un nuevo producto (que contiene
DNA y proteína) con un tiempo de retención de 7,9 min. (En un ensayo
paralelo de control sin M\cdotTaqI no se observa conversión
alguna del oligodesoxinucleótido doble 3\cdot4.) Para fragmentar
el complejo proteína-DNA obtenido se trata la
solución reaccionante con una solución de hidróxido potásico (10 M)
para ajustar el pH a 8,0. Seguidamente se añade una solución (4
\mul) de proteinasa K (31 mg/ml), Tris-cloruro (50
mM, pH 8,0) y cloruro cálcico (1 mM) y se incuba la mezcla
reaccionante a 37ºC durante 1 h. Se hace el seguimiento de la
fragmentación proteolítica por cromatografía de intercambio
aniónico, del modo descrito anteriormente. La especie fluorescente,
con un tiempo de retención de 7,9 min, desaparece y se forma un
nuevo compuesto fluorescente 14\cdot4, con un tiempo de retención
de 29,2 min (figura 5). Para la caracterización posterior se aísla
el producto 14\cdot4 por cromatografía en fase inversa (columna:
Hypersil-ODS, 5 \mum, 120 \ring{A}, 250 x 4,6
mm, Bischoff, Leonberg, Alemania; elución: tampón de acetato de
trietilamonio 0,1 M, pH 7,0, durante 5 min, seguido de un gradiente
lineal de acetonitrilo hasta el 35% en 30 min, 1 ml/min).
Análisis del producto oligodesoxinucleótido doble
14\cdot4 por fragmentación enzimática: se disuelve el 14\cdot4
purificado (0,57 OD a 260 nm) en tampón fosfato potásico (10 mM, pH
7,0, 228 \mul) que contiene cloruro magnésico (10 mM), DNasa I
(2,7 U), fosfodiesterasa de bazo de ternera (0,055 U) y fosfatasa
alcalina (13,7 U) y se incuba a 37ºC durante 20 h. Se inyecta una
parte alícuota (100 \mul) en una columna HPLC de fase inversa
(Hypersil-ODS, 5 \mum, 120 \ring{A}, 250 x 4,6
mm, Bischoff, Leonberg, Alemania) y se eluyen los productos con un
gradiente lineal de acetonitrilo (0-10,5% en 30 min,
seguido de 10,5-28% en 10 min y
28-70% en 15 min, 1 ml/min) en tampón acetato de
trietilamonio (0,1 M, pH 7,0). Aparte de dC, dA, dG, T y dA^{Me},
se encuentra un nuevo compuesto fluorescente que eluye después de 49
min. Se aísla este nuevo compuesto y se detecta como ion cargado
positivamente en m/z 863,1 por EM-ESI (LCQ conectado
a una fuente de ion de nanoelectropulverización, Finnigan MAT,
Alemania). La masa hallada es idéntica a la masa molecular calculada
(863,4) de una 2'-desoxiadenosina protonada y
modificada con el compuesto 9.
Se lleva a cabo la reacción de marcado,
catalizada por una enzima, a 65ºC en una mezcla (500 \mul) de
M\cdotTaqI libre de cofactor (133 nM), pUC19 DNA (28 nM, 4
sitios de reconocimiento para la M\cdotTaqI), compuesto 9
(20 \muM), Tris-acetato (20 mM, pH 6,0), acetato
potásico (50 mM), acetato magnésico (10 mM) y Triton
X-100 (0,01%). Se hace el seguimiento de la reacción
mediante cromatografía de intercambio aniónico (columna NUCLEOGEN
DEAE 4000-7, 7 \mum, 125 x 6,2 mm,
Machery-Nagel, Düren, Alemania). Se eluyen los
compuestos con cloruro potásico acuoso (0,2 M durante 5 min, después
con un gradiente lineal hasta 1 M en 30 min) en tampón
Tris-cloruro (10 mM, pH 7,0) que contiene
acetonitrilo (20%). En la figura 6 se presentan los cromatogramas de
la cromatografía de intercambio aniónico después de diversos
períodos de incubación (A: detección UV a 260 nm; B: detección por
fluorescencia). El desplazamiento entre la absorción UV observada y
la fluorescencia se debe a la separación espacial del detector UV y
del detector de fluorescencia. La reacción de marcado que
proporciona el pUC19 fluorescente se completa en 8 h. No se observa
la presencia de pUC19 marcado con un marcador fluorescente en un
ensayo paralelo de control que se efectúa sin M\cdotTaqI
(figuras 7A y 7B).
Se lleva a cabo la reacción de marcado,
catalizada por una enzima, a 37ºC en una mezcla (100 \mul) de
M\cdotHhaI libre de cofactor (730 nM), pUC19 DNA (40 nM, 27
sitios de reconocimiento para la M\cdotHhaI), compuesto 9
(20 \muM), Tris-cloruro (10 mM, pH 6,85), cloruro
sódico (50 mM), EDTA (0,5 mM) y
\beta-mercaptoetanol (2 mM). Se realiza un ensayo
paralelo de control sin M\cdotHhaI. Se analizan partes
alícuotas de ambas incubaciones después de 20 h de reacción mediante
cromatografía de intercambio aniónico, ya descrita anteriormente
(ver ejemplo 2, apartado 3.1). Los cromatogramas obtenidos se
presentan en la figura 8 (A: detección UV a 260 nm; B: detección por
fluorescencia). En ausencia de M\cdotHhaI no se observa la
presencia de marcador fluorescente.
Claims (25)
1. Derivado de aziridina ajustados a la fórmula
(I)
en la que X es N o CH, Y es N o -CH^{3},
R^{1} y R^{3} con independencia entre sí son H, H^{3},
-NH(CH_{2})_{n}NHR^{4} o
-NH(C_{2}H_{5}O)_{n}C_{2}H_{5}NHR^{4} y
R^{4} se elige entre fluoróforos, trazadores isotópicos (tags) de
afinidad, agentes de reticulación, cromóforos, proteínas, péptidos,
aminoácido que pueden estar eventualmente modificados, nucleótidos,
nucleósidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos,
polietilenglicol (PEG), reactivos de transfección, esferillas y
agentes de intercalado, n es un número entero de 1 a 5000, y R^{2}
se elige entre H, H^{3} y
-CH_{2}CH(COOH)(NH_{2}).
2. Derivado de aziridina de la reivindicación 1,
en el que X e Y son, ambos, N.
3. Derivado de aziridina según la reivindicación
1, en el solo uno de R^{1} y R^{3} es
-NH(CH_{2})_{n}NHR^{4} o
-NH(C_{2}H_{5}O)_{n}
C_{2}H_{5}NHR^{4} y el otro es H.
C_{2}H_{5}NHR^{4} y el otro es H.
4. Derivado de aziridina según la reivindicación
1, en el que dicho fluoróforo se elige entre BODIPY, la cumarina, el
dansilo, la fluoresceína, el mansilo, el pireno, la rodamina, el
rojo Texas, el TNS, los fluoróforos de cianina, por ejemplo Cy2,
Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7 y los derivados de los mismos.
5. Derivado de aziridina según la reivindicación
1, en el que dicho trazador isotópico (tag) es un tag péptido, la
biotina, la digoxigenina o el dinitrofenol.
6. Derivado de aziridina según la reivindicación
5, en el que dicho tag péptido es un his-tag o
cualquier tag con propiedades quelantes de metales que pueda
utilizarse en la IMAC, un strep-tag, un
flag-tag, un
c-myc-tag, epítopes o
glutationa.
7. Derivado de aziridina según la reivindicación
1, en el que dicho agente reticulante es la maleimida, la
yodoacetamida, un derivado de las anteriores o un derivado de
aldehído o un agente fotorreticulante.
8. Derivado de aziridina según la reivindicación
7, en el que dicho agente reticulante es una arilazida, un compuesto
diazo o un compuesto de benzofenona.
9. Un complejo del compuesto según una cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 8 con una metiltransferasa que
normalmente utiliza como cofactor la
S-adenosil-L-metionina
(SAM).
10. Un complejo según la reivindicación 9, en el
que dicha metiltransferasa normalmente transfiere el grupo metilo de
la SAM a una molécula de ácido nucleico, a un polipéptido, a una
proteína, a una enzima o a una molécula pequeña.
11. Un complejo según la reivindicación 10, en el
que dicha metiltransferasa metila el DNA.
12. Un complejo según la reivindicación 11, en el
que dicha metiltransferasa forma parte de un sistema de modificación
por restricción de una bacteria.
13. Un complejo según la reivindicación 10, en el
que dicha metiltransferasa metila distintos aminoácidos de
proteínas.
14. El complejo de la reivindicación 12, en el
que la metiltransferasa se elige entre las metiltransferasas de DNA:
la M\cdotTaqI y la M\cdotHhaI.
15. Un kit que contiene el compuesto según una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 y además una
metiltransferasa definida en una cualquiera de las reivindicaciones
de 9 a 14.
16. Una composición para el diagnóstico que
contiene el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 8 o un complejo definido en una cualquiera de las
reivindicaciones de 9 a 14.
17. Uso del compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 8 en calidad de cofactor de una
metiltransferasa.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que la
molécula diana de la metiltransferasa es una molécula de ácido
nucleico, un polipéptido, un polímero sintético o una molécula
pequeña.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que la
molécula de ácido nucleico es el DNA o el RNA o un híbrido de
ambos.
20. Uso según la reivindicación 18, en el que la
molécula pequeña es un lípido.
21. Uso según la reivindicación 18, en el que el
polipéptido es una proteína o una proteína de fusión que contiene un
sitio de metilación.
22. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 17 a 21, en el que la metiltransferasa es una
metiltransferasa definida en una cualquiera de las reivindicaciones
de 9 a 14.
23. Un método de obtención de una molécula diana
modificada que consiste en la incubación de la molécula diana con el
compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 en
presencia de una metiltransferasa que es capa de utilizar el
compuesto como cofactor y en condiciones que permitan la
transferencia del compuesto o de una parte del mismo a la molécula
diana.
24. El método de la reivindicación 23, en el que
la metiltransferasa es una metiltransferasa definida en una
cualquiera de las reivindicaciones de 9 a 14.
25. El método de la reivindicación 23 ó 24, en el
que la molécula diana es la definida en una cualquiera de las
reivindicaciones de 18 a 21.
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EP98114201 | 1998-07-29 |
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