JP3946242B2 - マルチウェルフィルタプレートに供給するためのアクセスホール - Google Patents

Description

本発明は、液体を保持するためのマルチウェルフィルタプレートであって、たとえばウェル内の培養培地で細胞を培養することなどによって、流体相互作用を促進するのに適したマルチウェル検査装置で使用されるものに関する。より詳細には、本発明は、ウェル内の細胞等の材料を乱すことなく、マルチウェル検査装置の供給トレイに液体を添加するか、又は当該供給トレイから液体を除去することができるマルチウェル検査装置のそのようなマルチウェルフィルタプレートに関する。

現在では、試料を検査するためのマルチウェル検査装置は、複数のウェルを有するマルチウェルフィルタプレート、供給トレイ、マルチウェル受取プレート、及び蓋を含む。マルチウェルフィルタプレートのウェルは、開口端を備えた管状部材から形成され、それに微小孔性膜等の膜が取り付けられる。管状部材は、栄養素が豊かな液体培地を含む供給トレイ内に挿入されることができ、そのため、ウェル内の細胞は膜に接することができ、そこで培養される。細胞には、培養培地から細胞への栄養素の濃度勾配によって制御される速度で、培養培地から膜を通って細胞へ栄養素が通るときに、養分が供給される。供給トレイの培養培地は、定期的に補給され、細胞の培養を維持する。培養培地の補給は迅速に且つ膜および細胞への損傷を避ける方法で、行われることが望ましい。

ウェルの膜上で所望のレベルの細胞培養を達成した後に、マルチウェルフィルタプレートは従来のアッセイ方法で使用することができる。これらのアッセイ方法は一般に、マルチウェルフィルタプレートの膜および細胞を、たとえばマルチウェルフィルタプレートの下に位置する９６ウェルプレート等、または、細胞／フィルタプレートに一致する同一数のウェルを有するプレート等のマルチウェル受取プレートのウェル内に位置決めすることによって実行される。マルチウェルフィルタプレートのウェルは、アッセイされるべき液体組成物を含む。アッセイされるべき組成物は、細胞内に拡散し、次いで膜を通り、底部受取プレート内に入る。マルチウェルフィルタプレートのウェル内にまたはマルチウェル受取プレートのウェルに結果として得られた液体生成物は、次いでアッセイされ、アッセイされている組成物が細胞バリアを浸透することができるかどうかを決定する。

薬剤発見および開発過程における重要な要素は、新しい化合物の経口吸収およびバイオアベイラビリティを決定することである。この評価をコスト効果的な高処理量で高感度なアッセイで実施するためには、細胞を含む数多くのウェルを有し、少量のアッセイ材料で済み、および自動化された生体外装置を使用することが理想的である。古典的には、生体外経口吸収特性の決定は、確定した上皮細胞株を使用し、細胞の単層を横切る薬剤の見掛けの輸送速度を測定することによって実施される。より近年では、人工膜バリアを使用して潜在的薬剤候補の受動輸送速度をランクづけ／順序づけることが可能である。これらの生体外実験から生じる値は、経口吸収速度が生体内測定によって確証されるかなり前に、もっとも成功しそうな薬剤候補をスクリーニングするための貴重な方法である。公知のまたは未知の化学化合物の薬剤吸収特性を決定するための典型的な実験は、下記のように実施される。複数ウェル装置は、確定した培養培地のフィルタの頂部に上皮細胞が接種される。同一の培地が、細胞を含む装置より下に位置しこれに流体接触する単一ウェル供給トレイにも添加される。細胞は、複数の日にわたって増殖し分化することができる。培養培地は、定期的に新鮮な培地に交換され、消費された栄養素を補給し、廃棄物および死んだ細胞を除去する。培養時間の最後に、細胞およびマルチウェル装置は等張バッファで穏やかに洗浄され、タンパクおよび残余培養培地が除去される。このときに、マルチウェルフィルタプレートはマルチウェル受取プレートに移され、アッセイされるべき化学物質は、マルチウェル受取トレイの細胞層の上かまたは細胞およびフィルタサポートの下のコンパートメントに導入される。対向するチャンバは薬剤のないバッファで満たされ、マルチウェル装置を振動させながら一般に３７℃の温度でいくらかの時間の間、インキュベートされる。複数の時間での点が所望される場合には、コンパートメントおよびバッファのいずれかから試料が取られ、除去された液体を補うために添加される。一般に、試料が下部コンパートメントから取られる場合には、フィルタプレートを最初に除去しなければならず、したがって、ウェル内の材料を汚染するリスクがある。細胞バリアを越えて輸送される薬剤／化学物質の量は、様々な分析方法によって決定することができるが、一般に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィ−質量分析−質量分析）を使用して決定される。

したがって、供給トレイに培養培地を迅速に補給するのを容易にするマルチウェル検査装置のマルチウェルフィルタプレートを、膜および膜上の細胞の一体化（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を保存する方法で、提供することが望ましい。加えて、供給トレイとともに使用した後にマルチウェル受取プレートとともに使用することができるようなマルチウェルフィルタプレートを提供することが望ましい。

本発明は、複数のウェルの各々の底部に位置決めされ留められた多孔性膜またはガラスファイバマット等の浸透可能なバリア上で細胞を培養し使用することを参照して説明される。しかし、本発明は、細胞とともに使用される必要はないことを理解すべきである。他の代表的な使用として、濾過、透析等が挙げられる。

本発明は、マルチウェル検査装置に使用される膜上の細胞等の試料を保持するための膜を各々が含む複数のウェルを具備するマルチウェルフィルタプレートを提供する。マルチウェルフィルタプレートは、まず、細胞培養が促進されるステップで供給トレイとともに使用され、次いで、試料検査が行われるマルチウェル受取プレートとともに使用される。供給トレイは培養培地の迅速な補給を促進し、一方、複数のウェルに留められた膜への損傷または膜上に位置決めされた細胞への損傷を回避する。供給トレイは、平坦なまたは傾斜した底部表面を含むことができる。底部表面は傾斜していることが好ましく、そのため、培養培地がマルチウェルフィルタプレートの１つまたはそれ以上のアクセスホールを通って供給トレイの底部表面から、好ましくは傾斜した底部表面の低点で、除去されるときに、培養培地は傾斜した底部表面の低点へ流れる。

本発明のマルチウェルフィルタプレートには、入力アクセスホールまたはスロットが設けられ、それを通して培養培地が供給トレイに供給され、また、排液アクセスホールまたはスロットが設けられ、それを通して培養培地が供給トレイから除去される。アクセスホールによって、培養培地の導入または排液のために、注射器、カニューレ、ピペット等の液体取扱装置をそれを通して挿入することが可能になり、一方、培養培地を供給トレイへ補給または供給するために、マルチウェルフィルタプレートを供給トレイから分離する必要性を回避する。あるいは、培養培地は、供給トレイの傾斜した底部表面の低点で単一のアクセスホールを通して除去され且つ添加されることの両方が可能である。更なる代替では、供給トレイへアクセスを提供する１つまたはそれ以上の開口を有するフィルタプレートの使用は、平坦な底部の供給トレイとともに使用されてもよい。

別の実施形態において、本発明は、マルチウェル検査装置に使用される膜上に細胞等の試料を保持するための膜を各々が含む複数のウェルを具備するマルチウェルフィルタプレートを提供する。マルチウェルフィルタプレートのウェルは、ウェルの壁から延在し膜から離間した少なくとも１つのシェルフを形成するように形状づけられる。そのため、シェルフは、注射器、カニューレ、ピペット等の液体取扱装置の端部のための支持表面を提供し、浸透可能なバリア典型的には膜及び培養細胞とこれらの取り扱い装置が接触するのを防止する。加えて、培養液がウェル内に注入されるときには、シェルフはデフレクタとして作用する。シェルフによって、培養細胞を乱すことなく培養液を添加することができる。

本発明のマルチウェルフィルタプレートは、マルチウェル受取プレートとともに第２のステップで使用され、そのウェルは、マルチウェルフィルタトレイのウェル内の膜または細胞と相互作用する液体を収容する。アクセスホールは、マルチウェルフィルタトレイの各ウェルに隣接して位置決めされ、マルチウェルフィルタプレートの下に位置決めされたマルチウェル受取プレートのウェルへの直接的なアクセスを提供する。

本発明は、複数のウェル内で細胞培養を行うことに関連して記載されるが、本発明は、ウェル内で膜が動くのを回避しながら、たとえば透析または拡散分離等の所望の処理を行うために液体を導入するかまたは除去するためのアクセス領域に関与する操作に適用可能であることを理解すべきである。

図１Ａおよび１Ｂを参照すると、本発明のマルチウェルフィルタプレート１０は、アクセスホール４５と各々対になっている複数のウェル４２を含むプレート４０を具備する。図１Ｂに示されるように、各ウェル４２は、微小孔性膜等の膜４３が留められた下部開口を有する管状部材４２ａを具備する。膜は形状が管状であることが好ましいが、三角形、矩形、方形または六角形等の他の形状を使用することもできる。マルチウェルフィルタプレート１０は、供給トレイ２８の排液領域３２へのアクセスを提供するアクセスホール５０を含み、そこから液体を供給トレイ２８へ供給することができ、かつ／または、供給トレイ２８から排液することができる。

好ましくは、培養培地は、フィルタプレート１０の別個のアクセスホール５２を通って補給することができる。液体培養組成物は、アクセスホール５０を通して供給トレイ２８から排液することができる。補給および排液は、従来の注射器装置で行うことができる。この実施形態に示されるように、排液領域３２が供給トレイ２８の底部表面７０の最低点に位置決めされて完全排液を容易に行うことができるように、供給トレイは傾斜した底部表面を有する。排液および補給は、マルチウェルフィルタプレート１０を供給トレイ２８に対して動かす必要なく、同時に行うことができる。着脱自在な蓋５６を使用して、マルチウェルフィルタプレート１０の周囲の雰囲気からウェル４２を隔離し、それによって、培養培地の蒸発およびウェルの汚染を低減する。傾斜した底部表面の低点で単一のアクセスホールを通って培養培地を添加し且つ除去することができることは明らかである。添加および除去のための別個の領域は、使用された培養培地を供給トレイ２８へ又は供給トレイ２８から除去するのを向上させるために洗浄作用を奏する。

代替実施形態（図示せず）において、供給プレートは平坦な底部を有してもよい。図１Ａおよび１Ｂに記載され示される他のすべての特徴は、同一のままである。

図２Ａおよび２Ｂに示される実施形態において、マルチウェルフィルタプレート１０には支柱３４および３６が設けられ、これは、マルチウェル受取プレート２９がマルチウェルフィルタプレート１０の下に位置決めされるときには、それぞれ、マルチウェル受取プレート２９のホール４６および４８に嵌合する。あるいは、図１Ａに示されるように、供給トレイ２８がマルチウェルフィルタプレート１０の下に位置決めされるときには、支柱３４および３６は、供給トレイ２８のホール４９および４７内に位置決めすることができる。支柱３４および３６は、矢印５５の方向に互いから非対称に位置決めされ（図１Ａ）、そのため、ウェル４２ａは常に上部左手位置にあり、一方、ウェル４２ｂは常に図１Ａに示される下部右手位置にある。ウェル４２ａおよび４２ｂをそのように位置決めすることによって、フィルタプレート１０のすべてのウェル４２は、その位置によって識別することができ、一方、マルチウェルフィルタプレート１０が動くのを防止し、そのため、ウェル４２内の液体が毛細管現象により吸い上げられるのを防止する。

フィルタプレート１０の使用も、図２Ａおよび２Ｂを参照して示される。図２Ａおよび２Ｂに示されるように、マルチウェルフィルタプレート１０は、９６ウェル等の複数のウェル５３を含むマルチウェル受取プレート２９上に位置決めされる。使用に際して、ウェル４２の各膜４３（図２Ｂ）が１つのみのウェル５３内に延在するように、マルチウェル受取プレート２９は位置決めされる。ウェル４２の各々は、それにアクセスホール４５を連結し、それによって、試料アッセイステップ中に使用されるマルチウェル受取プレート２９のウェル５３へのアクセスが可能になる。ウェル５３はウェル４２を収容し且つホール４５を通してそれへアクセスすることができるように形状づけられる。マルチウェルフィルタプレート１０には、マルチウェル受取プレート２９の窪み５１内に嵌合する４本のレッグを設けることができ、それによって、マルチウェルフィルタプレート１０の機械的安定性を提供する。レッグは、また、ウェル５３の底部表面との接触を避けるために膜４３を位置決めるように作用し、それによって、ウェル５３の底部表面が膜４３に接触するのを防止する。

図３を参照すると、本発明のマルチウェルフィルタプレートとともに使用される供給トレイ２８は、培養培地を収容するために、壁１２、１４、１６および１８と底部表面１９とを含む。底部表面は、排液路２１によって分離される２つの表面サブセクション２２および２４を含む。表面サブセクション２２および２４は、壁１２および１６から矢印２０および２８によって示される方向に排液路２１へ向けて下るように傾斜する。排液路２１は、矢印３３によって示されるように、底部表面の液体導入領域３０から液体排液領域３２へ流体流れを提供する。

上述の設計の代替実施形態が図４に示される。この実施形態において、フィルタプレート１０１の各ウェル１００は、連結されたアクセスホール１０２と、各ウェル１０２の下部開口１０６に形成される浸透可能なバリア層１０４と、窪み１０８と、下部開口１０６および窪み１０８の下部部分に隣接して形成されるシェルフ１１０と、を有する。図示のように、各ウェルは、マルチウェル受取プレート１１４の対応するウェル１１２内に嵌合することができる。

図５は、図１Ａのアクセスホール５２に対応するアクセスホール１１６とともに図４に記載された装置の包括的な斜視図である。

シェルフ１１０ａは従来の成型によって形成され、図６Ａを参照すると、シェルフ１１０ａはウェル壁１０３ａから延在する。

シェルフ１１０ｂは従来の成型によって形成され、図６Ｂを参照すると、ウェル壁１０３ｂの一部は窪んでいる。

図７を参照すると、本発明のマルチウェルフィルタプレートとともに使用される代替の供給トレイ２００が例示される。この実施形態には、マルチウェルフィルタプレートのウェルの膜に接触することができる距離で、供給トレイの内側支持表面から延在する突起が設けられる。図示のように、突起は支柱２０２であり、表面２０４および２０６から、図１の実施形態のウェル４２の膜４３に、または、図４のウェル１００の膜１０４に、接触することができる位置へ延在する。この接触の目的は、膜４３または１０４の底部表面から過剰液体を支柱２０２へ且つ供給トレイ２００内に排出させることである。この措置は、ピペットの分野では一般に「タッチオフ」と呼ばれ、ピペットの先端に接着する残余液体／試料を除去することを意味する。突起が同一の機能を提供する限り、突起の形状は変更してもよい。典型的な形状として、円錐、角錐、長方形およびディンプルが挙げられる。支柱２０２は、各ウェル４２または１００に隣接して位置決めされる。図示のように、供給トレイ２００も、傾斜した表面２０４および２０６を具備し、液体の流れを矢印２０８および２１０の方向におよび印２１４の方向に排液領域２１２内へと導く。しかし、所望により、平坦な底部の、または他の形状の供給トレイも等しく使用することができる。支柱２０２へ向かうマルチウェルフィルタプレートの運動は、いずれの従来の手段によって行うことが出来る。

図８に示されるように、シェルフ１１０ｃは、液体を注射器、カニューレ、ピペット等から矢印１２２によって示される方向に方向づけるように作用する凹状表面１２０を含むことができる。これは、膜１０４にかかる注射器からの液体の圧力を減少するように作用し、それによって、膜１０４の一体性を保持し、膜１０４上の細胞層の一体性を保持する。

本発明のフィルタプレートを使用するマルチウェル検査装置の上部分解図である。 図１Ａのマルチウェルフィルタプレートのウェルの部分断面図である。 マルチウェル受取プレートの上に位置する本発明のマルチウェルフィルタプレートの部分上面図である。 マルチウェルフィルタプレートおよびマルチウェル受取プレートの部分断面図である。 本発明のマルチウェルフィルタプレートとともに使用することができる供給トレイの上面図である。 マルチウェルフィルタプレートおよびマルチウェル受取プレートの部分断面図である。 本発明のマルチウェルフィルタプレートの上面図である。 本発明のマルチウェルフィルタプレートのウェルの部分断面図である。 本発明のマルチウェルフィルタプレートのウェルの部分断面図である。 本発明の単一ウェル受取プレートの上面図である。 本発明のマルチウェルフィルタプレートのウェルの部分断面図である。

Claims (5)

1. 複数のウェルおよび各ウェルと対にされたアクセスホールを有し、各ウェルが膜が固定された下部開口を有する、フィルタプレートと、
   平坦な底および４つの側面からなり、フィルタプレートのウェルがその中に延在する、供給トレイと、
   フィルタプレートを供給トレイに対して動かす必要なしに、液体を、フィルタプレートを通して供給トレイ中に通過させる、フィルタプレートの少なくとも１つの他のアクセスホールとを具備する、細胞培養を行う装置。
2. 少なくとも１つの他のアクセスホールが、少なくとも２つのそのようなアクセスホールである、請求項１に記載の装置。
3. 前記供給トレイが、液体を除去することができる排液領域と液体を供給することができる導入領域とを有する傾斜した支持表面を有し、前記傾斜支持表面は、前記導入領域から前記排液領域へ排液を行う構成に傾斜し、さらに、前記傾斜表面を囲むために前記傾斜表面を囲む壁を有し、前記傾斜支持表面は、２つの支持表面サブセクションを具備し、各々が前記壁から、前記支持表面サブセクションの両方へつながる排液路へ傾斜する、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記壁が前記支持表面から延在する方向と実質的に同一の方向に前記支持表面から延在する複数の突起を含み、前記突起は、前記壁が前記マルチウェルフィルタプレートを支持することができ、且つ、前記フィルタプレートが前記供給トレイによる支持から除去されるときに前記突起を前記フィルタプレートのウェルの各膜に接触することができる長さを有する、請求項３に記載の装置。
5. 前記突起が、支柱、角錐、方形、ディンプルおよび円錐からなる群から選択される、請求項４に記載の装置。

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