JP3923076B2 - 特定位にとり込まれたマーカー基およびハプテンを有するオリゴマー担体分子 - Google Patents
特定位にとり込まれたマーカー基およびハプテンを有するオリゴマー担体分子 Download PDFInfo
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Description
体液、特にヒト血清中の免疫グロブリンの検出は微生物、特にウイルス、例えば、HIV、肝炎ウイルス等による感染を診断するのに使用される。試験試料中の特定の免疫グロブリンの存在は、特定の免疫グロブリンと反応する一種または数種の抗原との反応により通常検出される。試料液中の特定の免疫グロブリンの検出方法は感度が良く、信頼でき、簡単かつ迅速である必要がある。
更に別の免疫学的方法は、分析物に免疫学的に類似するハプテンと分析物が、受容体、例えば、抗体の結合部位について競合するような方法で分析物が定性的また定量的に検出される競合イムノアッセイである。この場合、分析類似体は標識形態または固相に結合できる形態で通常使用される。
近年、非放射性マーカー基に基づく多くの検出系が開発されており、この場合、試験試料中の分析物、例えば、特定の抗体の存在が光学的(ルミネセントまたは蛍光)検出系、NMR-活性検出系または金属−沈殿検出系で測定し得る。EP-A-0307149は、2種の組換えポリペプチドが抗原として使用され、そのうちの一つが固相に固定され、かつ他の抗原がマーカー基を有し、それにより両方の組換え抗原が試験の特異性を増大するために異なる生物中で発現される抗体に関する免疫学的試験を開示している。
EP-A-0366673は、抗体が、精製された標識抗原および固相結合された形態の同精製抗原との反応により検出される、試料中の抗体の検出方法を開示している。例えば、ヒトIgGが抗原として開示されている。
EP-A-0386713は2種の固体担体を使用するHIVに対する抗体の検出方法を記載しており、この方法では種々のHIV抗原を2種の固体担体に固定し、その担体のそれぞれを試料のアリコートおよび標識HIV抗原と接触させ、抗体の存在を試験の少なくとも一つで陽性反応により検出する。組換え生産されたポリペプチドがHIV抗原として開示されている。
EP-A-0507586は特定の免疫グロブリンに対する免疫学的試験を行う方法を記載しており、この方法では試料が免疫グロブリンを結合できる2種の抗原と接触させられ、第一抗原は固相担体への結合に適した基を有し、かつ第二抗原はマーカー基を有する。マーカー基は直接的マーカー基、例えば、酵素、色素体、金属粒子であってもよく、または間接的マーカー基、即ち、抗原に結合されたマーカー基がマーカー基に対する受容体(これは代わりにシグナル発生基を有する)と反応し得る。フルオレセイン誘導体がこのような間接的マーカー基の例として挙げられ、その受容体は酵素に結合している抗体であり、B型肝炎表面抗原の如きポリペプチドが抗原として開示されている。SH基がフルオレセインを結合するのに使用される誘導体化によりこの抗原に導入される。
EP-A-0507587はIgM抗体の検出に特に適している方法を開示しており、この方法では試料が検出すべき抗体に対する標識抗原および検出すべき抗体に対して向けられた、かつ固相に結合できる二次抗体とともにインキュベートされる。
EP-A-0199804およびEP-A-0580979はルミネセント金属キレート基、特にルテニウムキレート基およびオスミウムキレート基で標識された抗原を使用する検出の免疫学的方法を開示する。免疫グロブリンが活性化金属錯体との反応により統計的に標識される抗原として使用される。
EP-A-0178450は、免疫学的活性物質、例えば、抗体が結合し得る金属キレート、特にルテニウム錯体を開示する。結合が免疫反応性物質と金属キレートの統計的反応により得られる。
EP-A-0255534は金属キレート結合した抗原または抗体を使用するルミネセンスイムノアッセイを開示する。例えば、結合は金属キレート活性エステル誘導体と抗体の統計的反応により得られる。
WO 90/05301は(i)添加された分析物、(ii)分析物の結合パートナーまたは(iii)(i)または(ii)に結合し得る反応性成分に結合されるルミネセント金属キレートを使用するエレクトロケミルミネセンスによる分析物の検出方法および定量測定方法を開示する。ルミネセンスは金属キレートに結合して活性化され、必要により磁性微粒子に結合した後に測定される。
従来技術から知られている抗体を検出するための免疫学的方法において、通常組換えDNA方法により生産されるポリペプチド抗原が通常使用される。しかしながら、このようなポリペプチド抗原を使用する時に問題が起こり得る。こうして、組換えポリペプチドはしばしば融合ポリペプチドの形態でのみ生産でき、その場合、融合部分は試験で偽陽性結果を導き得る。加えて、組換え発現により生産されたポリペプチドはしばしば試料液中で非常に低い安定性を有するにすぎず、凝集する傾向がある。更なる欠点は、マーカー基をこのようなポリペプチドに選択的かつ再生的に導入することがしばしば可能ではないことである。更に、組換えポリペプチド抗原の生産は高コストを要し、かつ組換えポリペプチドの異なるロット中で免疫反応性の大きな変化が生じ得る。
感度および正確さについて非常に高い要件を要する競合イムノアッセイでさえも、エストラジオールまたはテストステロンのような非常に低い濃度でのみ存在する分析物を特にエレクトロケミルミネセンスに基づく検出系で検出する時に既知の抗原を使用して必要とされる低い検出限界を得ることはしばしば非常に困難である。
それ故、本発明の目的は、免疫学的試験のための抗原が簡単かつ有効な方法で生産し得る方法を提供することであり、この場合、従来技術から知られている抗原の欠点が少なくとも一部排除される。加えて、その方法は抗原へのマーカー基の選択的かつ再生性の導入を可能にすべきである。
この問題は、1−10のハプテン分子および反応性側鎖基に結合された1−10のマーカー基または固相結合基を含む、最高100のモノマー単位を有するポリマー担体を含んでなる複合体により解決され、そのモノマー単位はアミノ酸、ヌクレオチドおよびペプチド核酸から選ばれる。
1−10のハプテン分子および特定数のマーカー基または固相結合基を含む、本発明の複合体を免疫学的検出方法において抗原として使用する場合、驚くことに、かなり高い感度および正確さを得ると同時に既知のモノマー抗原および多量体抗原に較べて低下された低い検出限界を得ることが可能である。更に、本発明の複合体は固相合成、例えば、ペプチド固相合成により簡単な方法で構築し得る。ハプテン分子またはマーカー基もしくは固相結合基により誘導体化される、このモノマー単位、例えば、アミノ酸誘導体は所定の位置にとり込まれる。加えて、遊離官能基を有するモノマーが位置する担体鎖の位置で固相合成の完結後に付加的なハプテンまたはマーカー基もしくは固相結合基を選択的にとり込むことが可能である。これは複合体へのハプテン分子およびマーカー基または固相結合基の特定かつ再生性のとり込みを可能にする。複合体の個々の基の間の距離は正確に特定でき、必要により変化し得る。シグナルクエンチングは、シグナル強さがマーカー基の数に比例して増大するように複合体のマーカー基の距離を選択することにより低く保ち得る。また、マーカー基の特定の空間配向は、例えば、らせん担体の場合にシグナル強さの改良に寄与する。それ故、マーカー基の間の距離はらせん担体、例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸の場合3−6または/および13−16のモノマー単位であることが好ましい。
複合体の主鎖を形成するポリマー担体分子は100のモノマー単位、好ましくは3−80のモノマー単位、特に好ましくは5−60のモノマー単位の最大長さを有する。
モノマー単位はアミノ酸、ヌクレオチドおよびペプチド核酸から選ばれる。ポリマー担体はアミノ酸から成るペプチド鎖、好ましくは線状ペプチド鎖を含むことが好ましい。しかしながら、担体はまたハプテン分子およびマーカー基または固相結合基が反応性側鎖基に結合されるオリゴヌクレオチドであってもよい。
加えて、ポリマー担体はペプチド核酸を含むことができる。ペプチド核酸は式
(CH2)k-CHR'-N[CO-(CH2)i-L]-CH2-(CH2)m-NH-CO-
(式中、Lは水素、フェニル、天然性ヌクレオベースおよび非天然性ヌクレオベースからなる群から選ばれ、R'は水素およびアミノ酸、好ましくはαアミノ酸(これは天然性または非天然性である)の側鎖を含む群から選ばれ、kおよびmはそれぞれ独立に0または1であり、かつiは独立に0〜5である)
の同じモノマー単位または異なるモノマー単位からつくられたポリアミド主鎖を含む。ハプテン分子およびマーカー基または固相結合基はペプチド核酸のヌクレオベースまたは/およびアミノ酸側鎖に結合し得る。ペプチド核酸およびそれらの製造がWO92/20703に記載されている。この開示がここに参考にされる。
ペプチド核酸の場合でさえも、担体は一本鎖または二本鎖として存在し得る。少なくとも一つのPNAストランド、例えば、PNAストランドと核酸ストランド、例えば、DNAストランドを有する二本鎖担体が特に好ましい。
複合体は1−10のハプテン分子、好ましくは1−6のハプテン分子、特に好ましくは1または2のハプテン分子を含む。ハプテンは100-2000 Daの分子量を有する免疫反応性分子であることが好ましい。このようなハプテンは薬理活性物質、例えば、抗生物質、オピエート、アンフェタミン、バルビツレート、細胞増殖抑制剤(例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バンコマイシン等)、パラセタモル、サリチレート、フェニトイン、キニンおよびキニン誘導体、テオフィリン等、ホルモンおよび代謝産物、例えば、ステロール、胆汁酸、性ホルモン(例えば、エストラジオール、エストリオール、テストステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびこれらの誘導体)、コルチコイド(例えば、コルチゾル、コルチコステロン、コルチゾンおよびこれらの誘導体)、カルデノリドおよびカルデノリド−グリコシド(例えば、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ストロファンシン、ブファジエノリド等)、ステロイド−サポゲニン、ステロイドアルカロイド、ペプチドホルモン、クレアチニン、甲状腺ホルモン(例えば、T3、T4)、神経伝達物質(例えば、セロトニン、コリン、γ−アミノ酪酸)、ビタミンおよび媒介物質、例えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ロイコエンジインおよびトロンボキサンから選ばれる。
一方、ハプテンはまた好ましくは30までのアミノ酸の長さを有する免疫反応性ペプチドエピトープから選ばれる。このようなペプチドエピトープは、例えば、病原生物、例えば、バクテリア、ウイルスおよび原生動物または自己免疫抗原から誘導し得る。免疫反応性ペプチドエピトープは、例えば、ウイルス抗原、例えば、HIV I、HIV IIまたはC型肝炎ウイルス(HCV)のアミノ酸配列から誘導し得る。
加えて、ハプテンはまた試料中で検出される核酸配列に相補性である好ましくは50までのヌクレオチドの長さを有する核酸から選ばれる。最後に、ハプテンはまた50までのモノマー単位の長さを有するペプチド核酸から選ばれる。
更に、本発明の複合体は1−10、好ましくは2−8のマーカー基または固相結合基を含む。マーカー基の好ましい例はルミネセント金属キレートおよび蛍光標識である。固相結合基の好ましい例はビオチンおよびビオチン類似体、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジンと特異的に反応し得るデスチオビオチンおよびイミノビオチンである。
ハプテン分子およびマーカー基または固相結合基は反応性アミノまたは/およびチオール側鎖基を介して、特に好ましくは反応性一級アミノ側鎖基を介して担体鎖に結合されることが好ましい。このような側鎖基は、適当なモノマー、例えば、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシンまたはシステインの如きアミノ酸を担体鎖にとり込むことにより生じ得る。
本発明の或る実施態様では、ハプテンおよびマーカー基または固相結合基と担体鎖の間にスペーサーをとり込むことが好ましいかもしれない。スペーサーは好ましくは可撓性であり、好ましくは3−30の原子の鎖長を有する。スペーサーは親水性基、例えば、オキシアルキレン側鎖基または/およびヒドロキシ側鎖基を含むことが特に好ましい。
好ましいマーカー基はルミネセント金属キレート、即ち、検出できるルミネセンス反応を生じることができる金属キレートである。このルミネセンス反応は、例えば、蛍光測定またはエレクトロケミルミネセンス測定により検出し得る。これらの金属キレートの金属は、例えば、遷移金属または稀土類金属である。金属はルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンであることが好ましい。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。
金属と一緒に金属キレートを形成するリガンドは通常多座リガンド、即ち、幾つかの配位部位を有するリガンドである。多座リガンドは、例えば、芳香族リガンドおよび脂肪族リガンドを含む。好適な芳香族多座リガンドは芳香族複素環リガンドを含む。好ましい芳香族複素環リガンドは窒素を含むポリ複素環、例えば、ビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリルである。これらのリガンドは、例えば、置換基、例えば、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジウム、ウレイド、硫黄を含む基、リンを含む基およびN−ヒドロキシ−スクシンイミドのカルボキシレートエステルを含むことができる。好ましいリガンドはC2-C3アルキレンオキシ基、C2-C3アルキレンチオ基およびC2-C3アルキレンアミノ基、特にエチレンオキシ基を含む。キレートはまた一つまたは幾つかの単座リガンドを含むことができる。単座リガンドの例として、一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハロゲニド並びに脂肪族、芳香族および複素環のホスフィン、アミン、スチルベンおよびアルシンが挙げられる。
ルミネセント金属キレートはビピリジルリガンドまたはフェナントロリルリガンドを有する金属キレートから選ばれることが特に好ましい。好適な金属キレートおよびその製造の例がEP-A-0178450、EP-A-0255534、EP-A-0580979およびWO90/05301に記載されている。これらの開示がここに参考にされる。ルテニウム−(ビピリジル)3キレートが最も好ましい金属キレートである。これらのキレートは、例えば、Igen Inc.社(Rockville,MD,USA)から活性エステル誘導体の形態で市販されている。
マーカー基としてエレクトロケミルミネセンス反応により検出できるルミネセント金属錯体を使用する場合、担体鎖または/および金属錯体と担体の間のスペーサーへの少なくとも一つの正電荷または/および負電荷担体、例えば、アミノ基またはカルボキシレート基のとり込みが有利であると判明した。担体鎖は、例えば、合成中のグルタミン酸またはアスパラギン酸のとり込みにより生じ得る一つまたは幾つかの負電荷を含むことが特に好ましい。またその他のマーカー基または固相結合基、例えば、蛍光基またはビオチンの場合、電荷担体を担体鎖または/およびスペーサー中にとり込むことが有利であるかもしれない。
好ましいマーカー基の更に別の例は蛍光標識、例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、レゾルフィン、シアニンおよびこれらの誘導体である。蛍光マーカー基を使用する場合、エネルギー伝達による蛍光クエンチングを阻止するために空間配向およびスペーシングに関して蛍光マーカー基を固定する担体主鎖のらせん構造を使用することが有利であると判明した。好適ならせん構造を生じるモノマーの例はプロリンまたはプロリン側鎖基を有するペプチド核酸誘導体である。
本発明の複合体は、モノマー単位から成るポリマー担体、好ましくはペプチド担体を固相で合成し、(a)その合成中に、モノマー誘導体をハプテン分子または/およびマーカー基もしくは固相結合基に共有結合される担体の所定の位置に導入し、または/および(b)その合成後に、活性化されたハプテン分子または/およびマーカー分子もしくは固相結合基を担体の反応性側鎖基に結合する方法により製造される。
本発明の方法の別法(a)では、モノマー誘導体が固相合成中に導入され、これが好ましくはリシンまたはオルニチンの如き塩基性アミノ酸の一級アミノ側鎖基を介して、またはシステインの如きアミノ酸のチオール側鎖基を介してハプテン分子または/およびマーカー基もしくは固相結合基に共有結合される。相当するモノマー誘導体は、例えば、活性化されたハプテン分子または活性化されたマーカー基もしくは固相結合基、例えば、活性エステル誘導体を遊離一級アミノ基に、またはマレイミド誘導体を必要により部分的に保護されていてもよいモノマー誘導体、例えば、アミノ酸誘導体に結合することにより合成される。好ましい金属キレート結合されたシリン誘導体が図1に示される。図2はビオチニル化されたリシン誘導体を示す。
本発明の意味内で“活性エステル”という用語は、ペプチドのその他の反応性基と干渉する副反応が起こり得ないような条件下でペプチドの遊離アミノ基と反応し得る活性化されたエステル基を含む。N−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルが活性エステル誘導体として使用されることが好ましい。また、類似のp−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イミダゾリルエステルまたはN−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルがN−ヒドロキシスクシンイミドエステルの他に使用し得る。
オリゴヌクレオチド担体へのとり込みに適しているハプテンの誘導体、マーカー基および固相結合基の合成が、例として蛍光色素5−カルボキシフルオレセインを使用し、これをホスホルアミジト誘導体に変換する、Theisenら(Tetrahedron Letters 33(1992),5033-5036)に記載されている。このホスホルアミジト誘導体はオリゴヌクレオチドの5'末端または/および3'末端で、またはオリゴヌクレオチド配列内にとり込まれ得る。
本発明の方法の別法(b)によれば、導入された基が固相合成に使用されたモノマー誘導体の保護基の開裂後に、好ましくは担体のアミノ側鎖基または/およびチオール側鎖基、特に好ましくは一級アミノ側鎖基に結合される。
ハプテンおよびマーカー基または固相結合基は別法(a)に従って、即ち、それぞれの場合に導入される基に結合されるモノマー誘導体を固相合成中に使用することにより導入されることが好ましい。この別法によれば、例えば、ルミネセント金属キレート、ビオチンまたはペプチドハプテンが問題なく導入し得る。しかしながら、感受性蛍光色素もしくは標識またはその他のハプテン、例えば、ステロイドの場合、この操作は不適当である。何となれば、これらの物質は固相合成の条件下で分解し得るからである。この場合、複合体は別法(b)に従って、即ち、意図された担体分子へのその後の結合により合成される。勿論、別法(a)および(b)の組み合わせを使用することがまた可能である。
2種の異なる基、例えば、ハプテンおよびマーカー基またはハプテンおよび固相結合基を別法(b)に従って、即ち、合成の完結後に導入することがまた可能である。これに関して、別法(b)に記載の方法は、例えば、導入される第一基がアミノ側鎖基に結合され、導入される第二基が担体分子のチオール側鎖基に結合されるような方法で行い得る。一方、導入される両方の基がそれぞれ担体の所定の一級アミノ側鎖基に選択的に結合でき、この場合、第一保護基を有するモノマー誘導体がハプテン分子が結合される担体の位置でアミノ側鎖基について使用され、またアミノ側鎖基について第二保護基を有するモノマー誘導体が、マーカー基または固相結合基が結合される担体の位置で使用され、第一保護基および第二保護基は、それが保護基の選択的開裂ひいては二つの反応工程における選択的結合を可能にするように選ばれる。この目的のために、第一保護基および第二保護基は酸不安定性アミノ保護基、例えば、Bocまたは酸安定性保護基、例えば、フェニルアセチルから選択し得る。
本発明の方法において、所望のモノマー配列を有する担体分子が固相で合成される。ペプチド担体は、市販のペプチド合成装置(例えば、Applied Biosystemsからの装置A431またはA433)を使用して製造されることが好ましい。その合成は、好ましくはアミノ酸誘導体を使用してペプチドのカルボキシル末端で開始する既知の方法に従って行われる。結合に必要とされるアミノ末端基がフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)残基で誘導体化されるアミノ酸誘導体が使用されることが好ましい。使用されるアミノ酸の反応性側鎖基は、ペプチド合成の完結後に容易に開裂し得る保護基を含む。これの好ましい例はトリフェニルメチル(Trt)、t−ブチルエーテル(tBu)、t−ブチルエステル(OtBu)、tert.-ブトキシカルボニル(Boc)、2,2,5,7,8-ペンタ-メチルクロマン-6-スルホニル(Pmc)またはフェニルアセチルの如き保護基である。
ハプテンまたは標識を導入することが意図されているペプチドの位置に配置される一級アミノ側鎖基を有するリシン残基またはその他のアミノ酸誘導体のアミノ側鎖基は別法(a)に従って導入される基に共有結合される。
20の天然アミノ酸の他に、ペプチドはまた人工アミノ酸、例えば、β−アラニン、γ−アミノ−酪酸、ε−アミノ−カプロン酸、ノルロイシンまたはオルニチンを含むことができる。これらの人工アミノ酸は天然アミノ酸と同様に保護形態で合成に使用される。
本発明の方法の別法(b)によれば、ハプテンまたは標識が、ペプチドを保護基の開裂後にそれぞれの場合に所望される活性化された基(これはペプチドの遊離一級アミノ基と反応する)と反応させることにより導入される。1.5〜4当量の活性エステルが遊離一級アミノ基に対し使用されることが好ましい。続いて、反応生成物が好ましくはHPLCにより精製される。別法(b)による二つの異なる活性化された基の導入は、先に説明したように二つの選択的に開裂できる保護基を使用することにより達成される。
複合体のペプチド主鎖は免疫反応性アミノ酸配列、即ち、免疫学的検出方法における抗原としての複合体の意図される適用において試験操作に干渉しないアミノ酸配列を有する。
一方、担体分子の主鎖はまたヌクレオチドまたはペプチド核酸を含むことができる。オリゴヌクレオチド担体分子の合成は市販のDNA合成装置中で行い得る。ハプテン分子およびマーカー基または固相結合基はホスホルアミジト誘導体(Theisenら,上記文献;Applied Biosystems,User Bu-lletin 67,FAM Amidite, 1992年5月)として導入されることが好ましく、または/およびそれらは続いて遊離反応性側鎖に結合される。ペプチド核酸をベースとする担体分子は、例えば、WO92/20703に記載された方法に従って固相ペプチド合成と同様に合成される。ハプテン分子またはマーカー基もしくは固相結合基はペプチドおよびオリゴヌクレオチド担体について記載された方法に従って導入し得る。
また、本発明は、ハプテン分子が免疫反応性分子である場合に免疫学的方法における抗原としての複合体の使用またはハプテンが核酸である場合にDNA診断のための複合体の使用に関する。
二種以上のハプテン分子を含む複合体はポリハプテンとして免疫学的検出方法に使用し得る。
本発明の好ましい実施態様は試料液中の特定の抗体の測定のための免疫学的方法における複合体の使用に関する。微生物、例えば、バクテリア、ウイルスまたは原生動物による感染を指示するこのような抗体が測定されることが好ましい。ウイルスに対し向けられる抗体、例えば、HIVまたは肝炎ウイルスに対し向けられる抗体が測定されることが特に好ましい。試料液は血清であることが好ましく、ヒト血清であることが特に好ましい。加えて、本発明の複合体はブリッジ試験法で免疫学的方法に使用されることが好ましい。
したがって、本発明は、a)測定すべき抗体に対する少なくとも一つの本発明の複合体とともに試料液をインキュベートし、b)その抗体を上記ペプチド複合体との結合によって検出することを特徴とする、液体試料中の特異的抗体の免疫学的定量方法に関する。
本発明の免疫学的定量方法は、実際、公知の検査法に従って、例えば単一の反応相の均一系イムノアッセイとして、あるいは2つ以上の反応相の不均一系イムノアッセイとして行うことができる。抗体の存在が固相の存在下で検出される不均一系検査法を用いることが望ましい。このような検査法の一実施態様は、いわゆる二抗原ブリッジテスト法である。この場合、試料液を反応性の固相の存在下で、測定すべき抗体に対する二抗原とともにインキュベートする。ここで、二抗原のうちの第一抗原はマーカー基を有し、第二抗原は固相に結合しているか、または固相に結合可能な形態で存在する。第一または/および第二抗原は、本発明の複合体である。試料液中の測定すべき抗体は、任意の方法でインキュベーション液から固相を分離した後、固相または/および液相の標識を定量することによって検出される。第一抗原はルミネセンス金属キレートまたは蛍光基で標識された複合体であることが望ましい。第二抗原は好ましくはビオチンで標識され、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆された固相に結合可能である。
検査手順は、好ましくは第一抗原、抗体および固相に結合した第二抗原からなる、標識化され固定化された複合体を得るために、試料液を標識された第一抗原および固相に結合した第二抗原と混合することを含んでなる。抗体検出のためのほかの検査法と比べて、ブリッジテスト法は感度の上昇(すなわちIgG,IgM,IgA,IgEといったすべての免疫グロブリンクラスが検出される)、ならびに特異性の向上(すなわち非特異的反応性が低下する)をもたらす。
本発明の第二の好ましい態様は、競合イムノアッセイにおける複合体の利用に関する。競合イムノアッセイは通常、比較的低分子の分析物の検出に用いられ、原則的に二つの検査法、「標識抗体」法および「標識アナログ」法、で実施することが可能である。「標識抗体」法において、測定すべき分析物を含有する試料液を、分析物と免疫学的に競合する固相に結合可能なハプテン、および標識されたレセプター、たとえばハプテンおよび分析物に対する抗体、とともにインキュベートする。この検査法において、固相に結合する標識は、分析物の濃度に反比例する。「標識アナログ」法においては、測定すべき被検体を含有する試料液を、分析物と免疫学的に競合する標識されたハプテン、および固相に対して結合可能であって、分析物およびハプテンに対するレセプターとともにインキュベートする。固相に結合した標識ハプテンの量は、測定すべき遊離の分析物の濃度に反比例する。
本発明は、競合イムノアッセイの原理に基づいて、「標識アナログ」法によって試料液中の分析物を検出する方法に関するが、その方法の特徴は、(a)反応性固相の存在下で、試料液を、マーカー基を含有する本発明の複合体、および固相に結合し、または固相に結合可能であって、分析物および複合体のハプテン成分との特異的免疫反応に加わることができるレセプターとともにインキュベートすること、(b)固相を任意の方法でインキュベーション液から分離すること、および(c)固相または/およびインキュベーション液における複合体のマーカー成分を測定することによって、試料液中の分析物の存在または/およびその量を決定することである。固定化を可能にするレセプターとしてビオチニル化抗体またはビオチニル化抗体断片が好ましく用いられ、反応性固相としてストレプトアビジンまたはアビジンで被覆された固相が好ましく用いられる。
本発明のさらに別の主題は、競合イムノアッセイの原理に基づいて、「標識抗体」法によって試料液体中の分析物を検出する方法であるが、その方法の特徴は、(a)反応性固相の存在下で、試料液を、固相結合基を含有する本発明の複合体、およびマーカー基を有し、分析物および複合体のハプテン成分との特異的免疫反応に加わることができるレセプターとともにインキュベートすること、(b)固相を任意の方法でインキュベーション液から分離すること、および(c)固相または/およびインキュベーション液におけるレセプターのマーカー成分を測定することによって、試料液中の分析物の存在または/およびその量を決定することである。ビオチニル化複合体およびストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相が好ましく用いられる。標識レセプターとしては、抗体または抗体断片が好ましく用いられる。
ルミネセンス金属キレート基は、ルミネセンス核種が電気化学的に電極表面に生じる、電気化学ルミネセンスによって、好ましく検出される。ルミネセンスは、定性的に、または/および定量的に、検出することが可能である。ルミネセンスアッセイを実施した例は、EP-A-0 580 979,WO 90/05301,WO 90/11511およびWO 92/14138に見いだされる。これにより上記に開示したルミネセンスアッセイの方法および装置を参照する。電気化学ルミネセンスアッセイにおいて、固相は好ましくは微粒子からなり、特に好ましくは固相上で第二抗原と相互作用するような被覆を施された磁性微粒子からなる。微粒子は好ましくはストレプトアビジンで被覆される。
電気化学ルミネセンスは好ましくは、例えばアミンのような、金属複合体のための還元剤の存在下で測定される。脂肪族アミンが望ましいが、特にアルキル基がそれぞれ1個から3個までの炭素原子を有するような第一級、第二級、および第三級アルキルアミンが望ましい。トリプロピルアミンが特に好ましい。しかしながら、アミンはアニリンまたはヘテロ環式アミンのような芳香族アミンでもよい。
さらに、たとえば、エトキシル化フェノールのような非−イオン系界面活性剤を増幅剤として所望により存在させることも選択可能である。こうした物質は、たとえばTriton X100またはTriton N-401の名称で市販されている。
一方、ルミネセンス金属キレート基を蛍光によって検出することも可能であり、この場合、金属キレートは適当な波長の光の照射よって励起され、その結果生じた蛍光放射を測定する。蛍光アッセイを実施した例は、EP-A-0 178 450およびEP-A-0 255 534にみられる。これにより上記開示を参照する。
ルミネセンス金属キレートと同様に本発明の複合体の望ましいマーカー基である蛍光基の検出は、上記のように、常法による励起および蛍光測定によって行うことができる。
本発明のさらなる主題は、標識を有するか、または固相に結合可能である、少なくとも一つの本発明の複合体を含有する免疫学的試薬である。二抗原ブリッジテストの原理に基づいて特異抗体を免疫学的に定量するために試薬は、(a)本発明の標識複合体、または/および(b)固相に結合しているか、あるいは固相に結合可能な形態で存在する。本発明のもう一つの複合体を含有する。
競合イムノアッセイの原理に基づいて分析物、特に比較的低分子の分析物、を定量するための試薬は、レセプターとの結合に関して定量すべき分析物と免疫学的に競合する、標識された複合体(「標識アナログ」法)、または固相に結合可能な複合体(「標識抗体」法)を含有する。競合イムノアッセイの試薬は、好ましくは定量すべき分析物および本発明の複合体と免疫学的に反応することができる、標識されたレセプター(「標識抗体」法)または固相に結合可能なレセプター(「標識アナログ」法)のいずれかを、本発明の複合体から空間的に分離された状態で、含有する。
本発明は下記の実施例および図面によっていっそう明快に説明される。図面は下記を示す:
図1 金属キレート−リシン誘導体
図2 ビオチン−リシン誘導体
図3 本発明の複合体
図4 対照複合体
実施例1
金属キレート−リシン誘導体の調製
EP-A-0 580 979記載のルテニウム複合体、Ru(ビピリジン)2(ビピリジン-CO-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)6mmolを50mlジメチルホルムアミドに溶解し、α−Fmocリシン溶液を滴下して添加した。溶媒を除去した後、残渣を少量のアセトンに溶解し、300mlクロロホルムと混合し、短時間に加熱して沸騰させた。溶媒を分離した後、図1に示す化合物を個体として得た。
実施例2
金属キレート標識、ビオチニル化ペプチドの調製
たとえば、Applied Biosystems製A431またはA433といったバッチペプチド合成装置を用いたフルオレニルメチルオキシカルボニル−(Fmoc)固相ペプチド合成法によって、金属キレートで標識され、さらにビオチニル化されたペプチドを調製した。このために、表1に示すアミノ酸誘導体を、それぞれについて4.0当量使用した:
ペプチド配列への金属キレートおよびビオチン基の導入は、金属キレートと結合した、またはビオチンと結合したアミノ酸誘導体を直接組み込む(たとえば、金属キレート活性エステルでε−誘導体化されたリシン残基を介して(図1)、またはビオチン−誘導体化されたリシン残基を介して(図2)配列内に組み込む、あるいは、対応するα−誘導体化アミノ酸残基によってN-末端に組み込む)ことによって行われた。
アミノ酸、またはアミノ酸誘導体をN-メチルピロリドンに溶解した。0.4-0.7mmol/g負荷された(JACS 95(1973),1328)400-500mgの4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノエチル)-フェノキシレジン(Tetrahedron Letters 28(1987),2107)上でペプチドを合成した。反応溶媒としてジメチルホルムアミド中で、Fmoc-アミノ酸誘導体に対して4当量のジシクロヘキシルカルボジイミド、および4当量のN-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて結合反応を20分間行った。20%ピペリジン/ジメチルホルムアミド溶液を用いて、それぞれの合成ステップ後20分間でFmoc基を切断した。
20mlトリフルオロ酢酸、0.5mlエタンジチオール、1mlチオアニソール、1.5gフェノールおよび1ml水を用いて、室温40分間で、支持体からのペプチドの遊離、および酸に不安定な保護基の切断を行った。次に、反応溶液を300ml冷ジイソプロピルエーテルと混合し、0℃で40分間保持して、ペプチドを完全に沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルで再度洗浄し、少量の50%酢酸に溶解して、凍結乾燥した。得られた粗製品を、適当な濃度勾配(溶出液A:水、0.1%トリフルオロ酢酸、溶出液B:アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸)を用いた、delta-PAK RP C18材(カラム50X300mm,100Å,15μ)上での調製用HPLCによって約120分間で精製した。溶出された物質を、イオンスプレー質量分析法によって同定した。
酸に安定なフェニルアセチル保護基は、固定化された、または可溶性のペニシリンG-アミダーゼを用いて有機溶媒成分を有する水性溶液中で、室温で酵素的に除去した。
実施例3
ハプテンとの結合
金属キレートで標識された、またはビオチニル化されたペプチドをジメチルホルムアミドに溶解し、活性化したハプテン(たとえば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を、結合可能なペプチド上の位置(たとえば、リシンのアミノ側鎖基)に対してわずかに過剰に(約30%)添加した。室温で1時間攪拌し、高真空下で溶媒を除去し、ペプチドを調製用HPLCで精製した。
標識基として図1に示す金属キレート−リシン誘導体を、ハプテンとしてエストラジオール(E2)を用いた以下の構造を有する複合体を調製した:
I:AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)UEUK(E2)-NH2
II:AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)U-NH2
複合体Iを図3に示す。ペプチド鎖のアミノ末端はアセチル基(Ac)で保護されている。カルボニル末端は酸アミド基として存在する。
金属キレートおよびハプテン分子は、それぞれリシンのε-アミノ側鎖基を介してペプチド鎖に結合される。
複合体Iの配列を有する複合体は、ハプテン分子としてテストステロンを用いたアナログ法で合成される。
合成された複合体の構造は、1H-NMR(500MHz)によって調べられ、確認された。
実施例4
血清中のエストラジオールの定量
ヒト血清中のエストラジオールを定量するために、「標識アナログ」法に基づく競合二段階アッセイを行った。このために、90μl溶液1(50mmol/l 4-モルフォリンエタンスルホン酸(MES),pH6.8にそれぞれ溶解した0.69nmol/lの本発明の複合体I(図1)または1.68nmol/lの対照複合体(図4)、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%Thesit、0.01%メチルイソチアゾロン、0.1%オキシピリオン、30ng/ml脱離試薬ジヒドロテストステロン)を、ポリエチレン容器の中で37℃、10分間、50μl試料(血清試料またはエストラジオール標準)とともにインキュベートした。次に、90μl溶液2(50mmol/l MESバッファー、pH6.0に溶解した0.7μg/mlまたは1.4μg/mlビオチンおよびポリクローナル抗−エストラジオールウサギFab'の複合体)および50μlビーズ懸濁液(720μg/mlストレプトアビジン−被覆磁粒子、Dynal Company)を連続して添加した。
37℃でさらに10分間インキュベートした後、150μlの混合物を測定セルに移した。そこで、ビーズ粒子とそれに付着したルテニウム標識を電極表面で磁性によって濃縮し、電気化学的に発生した化学ルミネセンスのシグナルを28℃で検出した。
表2に示す上記実験の結果は、本発明の複合体が対照の複合体と比較して感度と低検出限界に関して検査性能を相当に向上させたことを示す。
Claims (3)
- 反応性基に結合した1〜10のハプテン分子および1〜10のマーカー基もしくは固相結合基を含有する、最大で100のモノマー単位からなるポリマー担体を含んでなる複合体の製造方法であって、
該モノマー単位はアミノ酸であり、
モノマー単位から成る該ポリマー担体を固相で合成し、この場合、
(a)その合成中に、アミノ側鎖基を介してハプテン分子または/およびマーカー基もしくは固相結合基に共有結合されたモノマー誘導体を担体の所定の位置に導入し、または/および
(b)その合成中に、アミノ側鎖基を介して結合した保護基を有するモノマー誘導体を担体上の所定の位置に導入し、その合成後に、モノマー誘導体の保護基を開裂して、ハプテン分子または/およびマーカー基もしくは固相結合基で置換する(この場合、アミノ側鎖基のための第一保護基を有するモノマー誘導体をハプテン分子が結合する担体の位置に使用し、アミノ側鎖基のための第二保護基を有するモノマー誘導体をマーカー基もしくは固相結合基が結合する担体の位置に使用し、かつ第一および第二保護基が保護基の選択的開裂を可能にするように選択される)、
上記方法。 - 上記別法(a)において、ハプテン分子または/およびマーカー基もしくは固相結合基がそれぞれモノマー誘導体の一級アミノ基に結合する、請求項1記載の方法。
- 上記別法(b)の合成後において、ハプテン分子または/およびマーカー基もしくは固相結合基が担体の一級アミノ側鎖基に結合する、請求項1または2に記載の方法。
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