JP2848457B2 - オリゴマー化受容体を用いる測定方法 - Google Patents

オリゴマー化受容体を用いる測定方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンドイッチアッ
セイの原理に従って分析物を免疫測定する方法、並びに
そのための適当な結合性物質に関する。特に、本発明
は、測定範囲を拡大しかつフック効果(Hook effect) を
低減することを目的としたサンドイッチアッセイの改良
に関する。
【０００２】
【従来の技術】イムノアッセイによる抗原物質の定量は
公知である。このためには、分析物の同一のまたは異な
るエピトープに特異的な２つの抗体を、測定すべき分析
物を含有するサンプルとインキュベートする、いわゆる
サンドイッチアッセイがしばしば用いられている。この
方法では、第１の可溶性抗体がシグナル発生系、すなわ
ち標識、と直接または間接に結合されるが、（不均一ア
ッセイにおける）第２の抗体は固相に結合した状態で存
在するか、または適当にコーティングされた固相に結合
し得るビオチンなどの結合成分を有する。
【０００３】多くの診断上重要なタンパク質の濃度は広
範囲に変化し、このことは、分析にとって広い測定範囲
が望ましいどころか不可欠でさえあることを意味する。
こうしたタンパク質の例はαフェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌パラメーター、
それに妊娠性タンパク質のヒト絨毛性ゴナドトロピン
（ＨＣＧ）である。この種の分析物を測定するとき、う
まくモニターすることができるように高濃度範囲で正確
な値を得ることが診断上重要である一方で、定性的に正
しい診断（あり／なし）を行って根本的な治療結果へと
導くことができるように低濃度範囲でも正確な測定を実
施できなければならない。
【０００４】検査すべきサンプル中の分析物の高濃度に
関係した問題はいわゆるフック効果であり、このフック
効果は分析物の濃度が非常に高いときに起こる検出可能
シグナルの減少として理解されている。これが起こる理
由は、通常、不均一サンドイッチアッセイ様式では、サ
ンドイッチ複合体を形成させてほぼ完全に検出できるよ
うに、可溶性抗体と固相抗体が分析物に対して過剰に存
在するが、分析物が高濃度である場合には、限られた数
の抗体が莫大な数の分析物分子と直面することにある。
極端な場合には、固相抗体が不足して分析物が部分的に
しか結合できなかったり、さらに、可溶性の検出抗体と
分析物との複合体の形成により標識抗体が過剰の分析物
によって捕捉されるので、固相に結合した分析物部分が
完全には検出されなかったりする。これは結果的に測定
シグナルを減少させて、偽陰性の検査結果をもたらすこ
とになる。
【０００５】この問題の一つの解決策は、当然のことな
がら、検査すべきサンプルを適度に希釈することであ
る。しかしながら、実際には、希釈の開始点からどの程
度まで希釈する必要があるのか不明であるので、これは
異なる濃度について幾つか測定を行わねばならないこと
を意味し、コストおよび作業量の増加ゆえに望ましいこ
とではない。
【０００６】この問題に対する別の解決策は、サンドイ
ッチアッセイで用いる両方の抗体の濃度を高めることで
ある。ところが、これは例えば追加の干渉の可能性、高
いブランク値、好ましくない形状の標準曲線といった多
くの欠点をもたらす。その上、個々の測定コストも増加
するため、この解決策も満足のゆくものとは見なされな
い。
【０００７】更なる解決策は米国特許第4,743,542 号に
開示されている。この特許は、未標識の第１もしくは第
２抗体またはこれらの混合物を添加することで、分析物
の高濃度において標準曲線を線形にすることを教示して
いる。これはより低い測定範囲では感度を低下させる
が、より高い分析物濃度では感度を増強させ、結果的に
標準曲線の全体的な線形をもたらす。
【０００８】しかしながら、米国特許第4,743,542 号に
よる方法の欠点は、比較的低い測定範囲で感度が低下す
ることである。このような低下は、例えば妊娠している
か否かを調べるＨＣＧ検査において、より低い測定範囲
での正確な検査結果が必要とされる場合に特に重大であ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、従来技術の欠点を少なくとも部分的に取り除
き、特に、広い測定範囲にわたって定量的に正確な測定
を可能にすると同時に、より低い濃度範囲で良好な結果
を得ることを可能にする分析物の免疫測定法を提供する
ことであった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この目的は、第１の受容
体が可溶性であり、第２の受容体が（ａ）固相に結合し
ているか、（ｂ）固相に結合し得るものである、測定す
べき分析物と結合し得る少なくとも２つの受容体と、サ
ンプル液とを、固相の存在下でインキュベートし、固相
および／または液相中の標識を測定することにより分析
物を検出することからなるサンドイッチアッセイの原理
に従って、サンプル液中の分析物を免疫測定する方法で
あって、第１の受容体が抗体、抗体断片およびそれらの
混合物から選択される結合性分子のオリゴマーであるこ
とを特徴とする前記方法により本発明に従って達成され
る。
【００１１】驚いたことに、可溶性のオリゴマー抗体を
用いると、フック効果を低減させることができ、それゆ
え測定範囲を延長させ得ることが判明した。一般的に、
より低い測定範囲における感度は保持され、向上するこ
とさえある。本明細書においては、Kayser (Fresenius
"Zeitschrift fur analytische Chemie", Vol. 209,N
o. 1, pp. 1-18, 1965)による検出ＬＬＤの下限が低測
定範囲における感度の尺度として用いられる。
【００１２】本発明により用いられる第１の受容体は抗
体および／または抗体断片から選択される結合性分子の
オリゴマーであるが、以後、簡略化するために「オリゴ
マー抗体」と記す。接頭語「第１」または「第２」の抗
体は本明細書では単に区別の目的で用いられ、例えば添
加順序などを意味するものではない。本発明における
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体のような単
一特異性を有する抗体のみならず、ポリクローナル抗血
清のような同一抗原の異なるエピトープに対する抗体の
混合物をも含むと理解される。「抗体断片」は、少なく
とも１つのパラトープを保持する、完全な抗体から誘導
された分子として理解され、例えば抗体の酵素的もしく
は化学的処理により、または遺伝子工学的操作により得
られる分子である。特に、抗体断片はＦ（ａｂ’）2 断
片であると理解される。
【００１３】完全な抗体またはＦ（ａｂ’）2 断片に対
するオリゴマー化度は少なくとも２であり、すなわち、
本発明によるオリゴマー抗体のパラトープの最小数は４
である。最小オリゴマー化度は好ましくは２〜３であ
る。最大オリゴマー化度は１５までであり、１０までが
好ましく、８までがより好ましい。オリゴマー化度は最
も好ましくは２〜８で、４〜６が特に好ましいものであ
る。
【００１４】本発明による方法では、オリゴマー第１受
容体を標識された形で用いるのが好ましい。これは、第
１受容体が標識基と直接または間接に結合されることを
意味する。これに関して、直接結合は検出可能な物質ま
たは適当な基質と反応して検出可能な物質を生成する分
子の共有結合による取り込みとして理解される。後者の
例は、例えば、該受容体と場合によりスペーサーを介し
て共有結合される酵素である。間接結合は、本発明によ
る第１の受容体と検出可能な物質または該物質を生成す
る分子がビオチン／アビジンのような特異的結合対を介
して互いと結合できる配置を表す。
【００１５】本発明方法における標識基は当技術分野で
知られている標識から選択することができる。例を挙げ
ると、放射性標識、酵素標識または発光標識がある。酵
素標識の好適な例はアルカリホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼおよびガラクトシダーゼである。発光標識とし
て好ましいものは、エクオリンのようなカルシウムで活
性化される発光タンパク質および電気化学発光標識であ
る。発光反応によって測定される標識が特に好ましく、
発光金属キレート標識基が標識基として最適である。
【００１６】発光金属キレートは検出可能な発光反応を
生じる金属キレートである。この発光反応の検出は例え
ば蛍光の測定または電気化学発光により行われる。これ
ら金属キレートの金属は例えば遷移金属または希土類金
属である。金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、
レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、
パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムま
たはタングステンである。ルテニウム、レニウム、イリ
ジウムおよびオスミウムが特に好ましく、ルテニウムが
最適である。
【００１７】金属と一緒になって金属キレートを形成す
る配位子は通常、多座配位子、すなわち複数の配位位置
を有する配位子である。多座配位子は例えば芳香族およ
び脂肪族配位子を含む。適当な芳香族多座配位子として
芳香族複素環配位子がある。好適な複素環配位子はＮ−
含有ポリ複素環、例えばビピリジル、ビピラジル、ター
ピリジルおよびフェナントロリルである。これらの配位
子は例えばアルキル、置換アルキル、アリール、置換ア
リール、アラルキル、カルボキシレート、カルボキシア
ルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキ
シ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニ
ル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含有
基、リン含有基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのカル
ボン酸エステルなどの置換基を含有することができる。
キレートは１つまたは複数の一座配位子を含んでいても
よい。一座配位子の例として、一酸化炭素、シアン化
物、イソシアン化物、ハロゲン化物、脂肪族、芳香族お
よび複素環式ホスフィン、アミン、スチルベンおよびア
ルシンがある。
【００１８】発光金属キレートは、特に好ましくは、ビ
ピリジルまたはフェナントロリル配位子を含有する金属
キレートから選択される。適当な金属キレートの例およ
びその製法はEP-A-0 178 450、EP-A-0 255 534、EP-A-0
580 979およびWO 90/05301に記載されている。これら
の開示内容を参照されたい。最適な金属キレートはルテ
ニウム（ビピリジル）3 キレートである。これらのキレ
ートは活性エステル誘導体の形で、例えば Igen Inc.
(Rockville, MD, USA) から販売されている。
【００１９】本発明の方法で用いる標識された受容体は
１個または複数の標識基を含有する。第１のオリゴマー
受容体１分子あたり複数の標識基が用いられる場合、標
識基の数は２から２０、より好ましくは２より多く１０
以下である。
【００２０】本発明の方法で用いる第２の受容体は固相
に結合されているか、固相に結合可能である。本明細書
中で「固相に結合されている」とは、アッセイ前に吸
着、共有結合または特異的結合対などによる巨大分子担
体への結合によって行われる固定化として理解される。
したがって、「固相に結合可能」とは、ビオチン／アビ
ジンのような適当な特異的結合対の特異的相互作用によ
ってアッセイ中に生じる固定化として理解される。第２
の受容体は好ましくは特異的結合対によって固相に結合
されている。特に好ましくは、第２の受容体がビオチン
化され、そして固相がアビジンおよび／またはストレプ
トアビジンでコーティングされる。
【００２１】第２の受容体のタイプは本発明の方法では
特に決まっておらず、それゆえ、第２の受容体はそれが
測定すべき分析物と特異的に結合できるという条件で多
数の分子から選ぶことができる。第２の受容体として使
用するのに適した物質は、例えば、本発明の意味内のオ
リゴマー抗体、抗体、抗体断片、細胞受容体、酵素、核
酸、および特定の空間的構造または化学的親和性のため
に分析物と結合可能な他の物質である。
【００２２】本発明の方法では、正確な実験デザインに
応じて、固相として従来の固相が用いられる。これらに
は、例えばポリスチレンビーズや粒状の磁気材料といっ
た微細な分散材料、一般的にはキュベットの壁面やマイ
クロタイタープレートのような反応容器の表面、そして
特殊な用途の場合にはチップ、センサーまたは膜が含ま
れる。本発明方法の目下好適な実施態様において、固相
は第２の受容体と結合可能なコーティングを含む粒状の
磁気材料である。
【００２３】本発明方法の正確な手順は、サンドイッチ
アッセイの既知のプロトコールに合致し、当業者の知る
ところである。一般的には、測定すべき分析物を含有す
るサンプルを、任意の順序で、第１の受容体、第２の受
容体および固相とともに適当な条件下に十分な時間イン
キュベートして、固定化されたサンドイッチ複合体が確
実に形成されるようにする。その後、形成された分析物
含有サンドイッチ複合体を遊離の標識抗体から分離し、
場合により適当な検出基質の添加後に、定性的または定
量的に測定する。
【００２４】本発明方法の好適な実施態様では、検査す
べきサンプルを、まず初めに、ルテニウムキレート標識
オリゴマー抗体およびビオチン化抗体と混合してインキ
ュベートする。第２工程で、アビジンまたはストレプト
アビジンをコーティングした磁気ビーズを加え、さらに
インキュベートする。その後混合物を磁石の上を通過さ
せる。すなわち、形成された複合体を残りのサンプルお
よび未結合の標識抗体から分離し、分離した複合体をト
リプロピルアミン（ＴＰＡ）のような還元剤と任意に界
面活性剤を含有する溶液で再度洗浄する。この洗浄過程
はサンドイッチ複合体中に結合されているルテニウム以
外の全てのルテニウムを除去する。したがって、測定さ
れたＲｕ濃度が分析物の濃度に直接比例する。電圧をか
けると、ルテニウムとＴＰＡとが反応して発光反応が起
こる。
【００２５】場合により、標識した第１の抗体を用いる
とき、未標識の分析物特異的受容体、例えば未標識のモ
ノマー抗体および／またはオリゴマー抗体がさらに存在
してもよい。
【００２６】本発明の更なる面によると、本発明は、少
なくとも２つの抗体、抗体断片またはこれらの混合物の
コンジュゲート（該結合性分子が直接一緒に共有結合さ
れている）からなるオリゴマー抗体であって、オリゴマ
ー化度が２〜１５であることを特徴とするオリゴマー抗
体に関する。
【００２７】結合性分子の直接結合とは、抗体または抗
体断片が単純な化学結合によってまたは適当な二官能性
リンカー／スペーサー分子を介して一緒に結合されてい
ることを意味する。これを実施するための多くの方法お
よび適当なスペーサー分子が当業者に知られている。例
えば、化学的リンカーとして、ビス（マレインイミド）
−メチルエステル、ジメチルスベルイミデート、ジスク
シンイミジルスベレート、グルタルジアルデヒド、Ｎ−
スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルスク
シンイミド、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチ
ル）−アミノベンゾエート、マレインイミドヘキサノイ
ル−スクシンイミデートとＳ−アセチル−メルカプトコ
ハク酸無水物との組合せ、または類似の化合物が考えら
れる。
【００２８】好適な実施態様において、本発明によるオ
リゴマー抗体は、本発明の第１の面に従って、少なくと
も１個の、場合により数個の標識基が与えられる。標識
としては発光金属キレート標識が好ましく、特に好まし
くはオリゴマー抗体はルテニル化される。すなわち、金
属キレートがルテニウムキレートである。金属と一緒に
金属キレートを形成する配位子は通常多座配位子、つま
り複数の配位位置を有する配位子である。このような配
位子および金属キレートは例えばDE-A-44 30 998.8に記
載されており、その開示を参照されたい。最も好適な金
属キレートはルテニウム（ビピリジル）3 キレートであ
る。
【００２９】本発明の別の面は、抗体および／または抗
体断片を互いと共有結合させることを特徴とするオリゴ
マー抗体の製造方法に関する。このために、抗体（断
片）は、例えば上記の二官能性スペーサー分子の一つと
反応させるなどの適当な方法で官能化する。適当な反応
条件は一般に当技術分野で知られており、ここにその詳
細を記載する必要はない（実施例１参照）。
【００３０】本発明のさらに他の面は、上で定義したオ
リゴマー抗体のサンドイッチアッセイにおける検出試薬
としての使用に関する。さらに、オリゴマー抗体は免疫
学的測定方法においてフック効果を低減および／または
回避するために使用される。
【００３１】本発明のさらに他の面は、本発明の方法を
実施するのに適した、分析物の免疫学的測定用の試薬キ
ットに関する。かかるキットは、本発明の方法で用いる
上で定義した標識オリゴマー抗体と第２の受容体、すな
わち固相結合受容体または好ましくは固相に結合可能な
受容体（例えば、抗体および／または抗体断片）を含有
する。オリゴマー抗体と第２の受容体は本発明による試
薬キット中に別々に存在しても、単一の試薬として一緒
に存在してもよい。このキットは適当な固相、基質溶液
などの他の試薬類を含むことができ、その場合これらは
一般に空間的に分離される。本発明の方法を以下の実施
例を用いてより詳しく説明する。
【００３２】
【実施例】実施例１ ビオチン化抗体、オリゴマー抗体および標識抗体の製造 １．モノマービオチン化抗ＨＣＧ抗体 モノクローナル抗HCG-M-1F7.9 IgG (Boehringer Mannhe
im GmbH)を10mg/ml の濃度で0.1Mリン酸カリウム緩衝液
(pH8.4) 中に溶解した。６倍モル量のビオチン-DDS
* （ジメチルスルホキシド中に溶解；16.3mg/ml)を加え
た。25℃で90分攪拌した後、10μl の1Mリシンを加えて
反応を停止させた。これを25mMリン酸カリウム／50mM N
aCl(pH7.0)に対して透析し、生成物を凍結乾燥した。*
ビオチン(DDS) ＝ビオチニル−アミノ−３，６−ジオキ
サオクタニル−アミノカルボニルヘプタン酸−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル（DE 4302241 A1 参
照）。
【００３３】２．オリゴマールテニル化抗ＨＣＧ抗体 ａ）ルテニウム標識基 Igen Inc. Co. (Rockville, USA)から入手できる活性エ
ステル Ru(bpy)3 2+ -NHS (ルテニウム(2,2'-ビピリジ
ル)2(4-[3-(N- ヒドロキシスクシンイミジルカルボキ
シ) プロピル]-4'- メチル-2,2'-ビピリジン)2+ ) を用
いて抗体および抗体断片を標識した。 ｂ）抗HCG-F(ab')2 断片の製造 Johnstone と Thorpe の方法 (Immunochemistry in Pra
ctice, p. 61 f, Blackwell Scientific, 1987) にした
がって300mg のモノクローナル抗HCG-M-INN22-IgG 抗体
をペプシンで開裂し、F(ab')2 断片をS 200 クロマトグ
ラフィーで精製した。収量: 128mg のF(ab')2 。
【００３４】ｃ）オリゴマー抗体断片の製造および単離 100mg の抗HCG-M-INN22 F(ab')2 断片を1.5ml の0.15M
リン酸カリウム緩衝液(pH8.3) 中に溶解した。使用直前
に、27.6mgのジスクシンイミジル−スベレート(DSS) を
１mlのジメチルスルホキシド中に溶解した。10分間隔で
５μl のDSS 溶液をF(ab')2 溶液に攪拌下加えた。全反
応時間75分後、F(ab')2 の架橋反応を15μl の1Mリシン
溶液により停止させた。抗HCG-M-INN22 F(ab')2 の粗製
重合物はセファクリル(Sephacryl) S300HR (Pharmacia,
Upsala)でゲルクロマトグラフィーにかけて、分子量 2
00,000、400,000 、500,000 〜800,000 および＞800,00
0 の画分に分離した。≦800,000 の重合物が好適であ
る。
【００３５】ｄ）ルテニル化オリゴマー抗体断片の製造 ５mgの抗HCG-M-INN22 F(ab')2 オリゴマー (分子量 40
0,000) を１mlの0.15Mリン酸カリウム緩衝液、0.15M Na
Cl (pH7.8)中に溶解した。使用直前に、５mgのRu(bpy)3
2+-NHS を0.75mlの無水ジメチルスルホキシド中に溶解
した。Ru(bpy)3 2 +-NHS の分子量1057およびF(ab')2 モ
ノマーの分子量100,000 に基づいて3.3:１のモル比を得
るために、0.174mg のRu(bpy)3 2+-NHS (59.4 μl)をピ
ペットでF(ab')2 溶液に攪拌下加えた。この反応容器を
25℃で60分インキュベートし、10μl の1Mリシン溶液を
加えて反応を停止させた。次いで、この混合物を25mMリ
ン酸カリウム／0.1M NaCl(pH7.0)に対して24時間透析
し、凍結乾燥した。
【００３６】収量：4.4mg の抗HCG-M-INN22-F(ab')2-Ru
(bpy)3 2+オリゴマー(400,000) 。455nm(ε=13.7)での吸
光度測定により、取り込まれた標識のモル比はRu:F(a
b')2=2.2〜2.8 であった。同様にして、分子量 200,000
および500,000 〜800,000 のオリゴマー抗体断片をルテ
ニウム標識基と結合させた。
【００３７】実施例２ オリゴマー抗体を用いるＨＣＧの検出 標識したオリゴマールテニル化抗体およびモノマービオ
チン化抗体を含有する次の２つの溶液を調製した。 溶液１：実施例１に従って得られるモノクローナルRu(b
py)3標識抗HCG F(ab')2 抗体断片をオリゴマー受容体
（以後AB-BPRU と言う）として用いた。オリゴマー化度
５〜７でルテニル化度 3.3のAB-BPRU を用いた。溶液１
を調製するために、3.0 μl/mlのAB-BPRU を、0.1%ウシ
免疫グロブリン(IgG) 、3.5%ウシ血清アルブミン(BSA)
および150mmol/l NaClを含有する40mmol/lリン酸塩緩衝
液 (pH=6.5) 中に溶解して混合した。 溶液２：モノマービオチン化抗HCG 抗体(IgG)(ビオチン
化度 = 1:10)を、0.1%ウシIgG、2.0% BSAおよび150mmol
NaClを含有する80mmol/lリン酸塩緩衝液(pH=7.0)中に
5.0 μg/mlの濃度で溶解した。
【００３８】100 μl の溶液１と100 μl の溶液２を混
合し、25μl の分析すべきサンプル（ヒト血清）を加
え、この混合物を37℃で５分インキュベートした。その
後、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズの懸
濁液（鉄コアをもつ、ビオチン結合能 450〜650ng/ml、
該溶液の濃度 720μg/ml) 35μl を加え、さらに５分イ
ンキュベートした。続いてビーズを分離し、トリプロピ
ルアミン含有溶液で洗浄し、電気化学発光を測定した。
本実施例ではビーズとしてDynabeads M-280 ストレプト
アビジン (Dynal A.S., Oslo, Norway) 、すなわちスト
レプトアビジンを共有結合させてある粒径 2.8μm の超
常磁性ポリスチレン粒子を用いた。その結果は次のよう
なものである。すなわち、12,000 mIU/ml HCG までの測
定範囲が得られ、500,000 mIU/mlのHCG を含有するサン
プルは測定範囲を越えると認められた（フック効果）。
検出下限は＜0.1 mIU/ml HCGであった。この応用例にお
いて、この測定範囲は未希釈のヒト血清を正確に測定で
きる範囲であると言える。
【００３９】実施例３ 測定範囲に及ぼすオリゴマー化度の影響 実験の手順は実施例２に記載したとおりであり、オリゴ
マー化度が以下のように異なるAB-BPRU 3.13μg/mlを溶
液１で用いた。 P1 分子量＞800,000 P2 500,000 〜800,000 P3 400,000 P4 200,000 P5 100,000 (= F(ab')2) 結果を表１に示す。表１から、架橋度（＝分子量）が増
加するにつれて、高い方の標準のシグナルは増加する
が、ブランク値（ゼロ標準ａのシグナル）は一定のまま
であることがわかる。それゆえ、試験の感度がよくな
る。すなわち、オリゴマー化度の増加により、検出下限
を保持する一方で、より広い測定範囲が得られる。
【００４０】
【表１】
【００４１】実施例４ モノマーモノクローナル抗体を用いるＨＣＧの検出（比
較例） 未標識抗体の添加 米国特許第4,743,542 号に記載の方法にしたがう本実施
例では、ルテニル化度1:8 のモノマーモノクローナル抗
体 MAB<HCG>-BPRUを溶液１中で２μg/mlの濃度で用い
た。溶液２ではビオチン化モノクローナル抗体を２μg/
mlの濃度で用いた。さらに、試験溶液に異なる量（２、
４、８および16μg/ml) の未標識モノマーモノクローナ
ル抗HCG 抗体を加えて、この抗体を２、４、８および16
μg/mlの濃度で試験混合物中に存在させた。HCG 濃度が
異なる３つのヒト血清、すなわちHS1 (2941 mIU/ml) 、
HS2 (50,000 mIU/ml) および HS3 (500,000 mIU/ml、フ
ック効果サンプル) 、ならびに 0.0（標準ａ）および1
3.0 mIU/ml （標準ｂ）のHCGを含有する２つの標準品を
試験した。結果を表２にまとめてある。
【００４２】
【表２】 * それぞれの濃度の未標識抗体における測定範囲を２μ
g/mlの未標識抗体を用いたときの測定範囲で割った商。
【００４３】測定範囲は未標識抗体の量が増加するにつ
れて増加することがわかった。同時に、標準ｂおよび他
のヒト血清のシグナルが減少するのに対し、標準ａ（ゼ
ロ血清、ブランク値）のシグナルは実質的に不変のまま
である。その結果、測定範囲の下方部分における区別が
できなくなる。標準ｂ／ａの商は、確かな診断のために
は少なくとも1.9 〜2.0 の範囲となるべきであるが、２
μg/mlの未標識抗体を加えたとき、すでにこの値以下で
ある。妊娠の可能性についての診断を下すことができな
い。
【００４４】実施例５ モノマーポリクローナル抗体を用いるＨＣＧの検出（比
較例） 未標識抗体の添加 実施例４と同様な手順であったが、未標識抗体としてポ
リクローナル抗体PAB<β-HCG>S-(PA)-IgG(DE) を用い
た。結果は実施例４の結果に実質的に一致したものの、
測定範囲は1.35倍だけ増加した。下方のシグナル範囲で
の確かな区別は可能でない。標準ｂ／ａの商は、２μg/
mlの未標識PAB を加えたとき、1.33であり、より高いPA
B 濃度ではさらに低下する（16μg/ml：ｂ／ａ＝0.9
4）。
【００４５】実施例６ オリゴマーモノクローナル抗体を用いるＨＣＧの検出 未標識抗体の添加 手順は実施例２に従うもので、本発明によるルテニル化
オリゴマー抗体（オリゴマー化度：約４〜８）を１、２
および４μg/mlの濃度で検出抗体として用いた。結果を
表３にまとめてある。
【００４６】
【表３】 * それぞれの濃度の未標識抗体における測定範囲を１μ
g/mlの未標識抗体を用いたときの測定範囲で割った商。
【００４７】ブランク値（標準ａ）および他のサンプル
（ヒト血清と標準品）のシグナルレベルはAB-BPRU 濃度
が増加するにつれて増加する。表から明らかなように、
標準ｂ／ａの商は約2.0 またはそれ以上に保持され、そ
れゆえ、より低い濃度範囲での良好な測定が確実とな
る。同時に、AB-BPRU 濃度が増加するにつれて測定範囲
がかなり増加し、本実施例ではほぼ比例して増加する
（抗体濃度が倍増すると、おおむね測定範囲が倍増す
る）。より低いＨＣＧ濃度範囲における測定の正確度を
保持したままで測定範囲が増加するので、この場合には
測定範囲が実際に十分な程度にまで拡張されたことにな
る。
【００４８】実施例７ ＴＳＨの検出 オリゴマーおよびモノマーのモノクローナル抗体の比較 ＴＳＨ試験は甲状腺の機能を診断するために用いられ
る。血清のＴＳＨ値の増加のみならず大幅な低下も診断
上重要である。こうした理由のために、下方範囲におけ
るこの試験の高い精密度のみならず、低標準ａと２番目
に低い標準ｂとの良好な区別も重要となる。最低標準値
で割った最高値の商である比ｅ／ａは、全測定範囲のパ
ラメーターとして利用できる。この商は可能なかぎり高
い方がよい。ＨＣＧ試験で用いたものと同様の系におい
て次の試薬類を用いた。 R1：リン酸塩緩衝液, 50mmol, pH=7.4; 各0.1%のMIT お
よびオキシペロイン（保存用）, 2%ウシ血清アルブミ
ン, 1%ウシIgG およびルテニル化モノクローナル抗体 M
AB<TSH>-m-Fab-BP-Ru(濃度：オリゴマーの場合が 2.0μ
g/mlで、モノマーの場合が 0.2〜1.0 μg/ml) 。 R2：R1と同様の試薬, MAB-BPRUの代わりに1.7 μg/mlの
濃度のビオチン化モノマー抗体 MAB<TSH>F(ab')b-Bi(dd
s)を用いる。 ビーズ：ビオチン結合能が700 μg/mlである、鉄コアを
有する微粒子を用いる。反応を実施するにあたり、70μ
l のサンプル、80μl のR1および80μl のR2をピペット
で注入し、注意深く混合して、10分インキュベートし
た。次に50μl のビーズを加え、さらに10分インキュベ
ートした。その後反応混合物をＨＣＧにおいて記載した
ような電極上に置き、微粒子を磁石により保持させて洗
浄した。続いて電気化学反応を起こさせ、光シグナルを
定量的に測定した。結果を表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】モノマーAB-RU の濃度が増加するにつれ
て、標準ａのシグナルも標準ｅのシグナルも増加する。
商ｂ／ａはほとんど変わらず、下方範囲における分解能
（ｂ−ａ）は向上せず、また、測定範囲の動力学も改善
されない（ｅ／ａがほぼ一定）。これらはオリゴマーAB
-RU を添加するときだけ改善される。同様の結果が他の
ロットの微粒子においても得られた。測定の精密度およ
び正確度は、方法の比較から明らかなように、オリゴマ
ー抗体の使用により改善される。
【００５１】実施例８ 未標識抗体 (F(ab')2)の存在下または不在下でのオリゴ
マー抗体によるＨＣＧの検出 R1：重合度５〜７、ルテニル化度3.3 である F(ab')2と
しての MAB<HCG>-ルテニウム(II)トリス-(ビピリジル)-
NHS-オリゴ 3.0μg/mlを、0.1%ウシIgG および3%ウシ血
清アルブミン(BSA) を含有する40mmol/lリン酸塩緩衝液
(pH=7.5)中に溶解し、混合する。 R2：上記の試薬においてMAB-PBRUの代わりにビオチン化
度 1:10 のMAB<HCG>-IgG- ビオチン化 5.0μg/mlを用い
る。 R3：４μg/mlの未標識ポリクローナル PAB<HCG>-IgG を
試薬R1にさらに加え、混合する。 ０から20,000 mIU/ml の濃度を有する一連のＨＣＧ標準
品を、未標識モノクローナル抗体を添加しないで（R1,
R2, ビーズ）および添加して（R2, R3, ビーズ）実施例
７に記載したような実験系で分析した。試薬R2およびR3
を使用するときは、R1およびR2を使用するときより平坦
な標準曲線が得られることが判明した。しかし、測定範
囲は系R2, R3（未標識抗体の添加）におけるよりも大き
かった。
【００５２】
【発明の効果】以上説明したように、サンドイッチアッ
セイにおいて標識された検出分子として抗体および／ま
たは抗体断片から選択される結合性分子のオリゴマーを
用いることにより、広い測定範囲にわたって抗原を定量
的に正確に測定できると同時に、より低い濃度範囲で良
好な結果を得ることが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノーバート フランケン ドイツ連邦共和国 ディー−82319 ス ターンバーグ リエデセルシュトラーセ 45 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543 515 G01N 33/563 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第１の受容体が可溶性であり、第２の受
    容体が（ａ）固相に結合しているか、（ｂ）固相に結合
    し得るものである、測定すべき分析物と結合し得る少な
    くとも２つの受容体と、サンプル液とを、固相の存在下
    でインキュベートし、固相および／または液相中の標識
    を測定することにより分析物を検出することからなるサ
    ンドイッチアッセイの原理に従って、サンプル液中の分
    析物を免疫測定する方法であって、第１の受容体が抗
    体、抗体断片およびそれらの混合物から選択される結合
    性分子のオリゴマーであることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 第１の受容体のオリゴマー化度が２〜１
    ５である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 第１の受容体が１〜２０の標識基を有す
    る、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 標識基が発光金属キレート標識基であ
    る、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 固相が粒状の磁気材料から構成され、第
    ２の受容体または第２の受容体と結合し得る物質でコー
    ティングされている、請求項１〜４のいずれか１つに記
    載の方法。
  6. 【請求項６】 標識した第１の受容体および未標識の分
    析物特異的受容体の存在下で前記の測定を実施する、請
    求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 【請求項７】 少なくとも２つの抗体、抗体断片および
    ／またはそれらの混合物のコンジュゲートからなるオリ
    ゴマー抗体であって、オリゴマー化度が２〜１５である
    ことを特徴とするオリゴマー抗体。
  8. 【請求項８】 少なくとも１つの標識基を有する、請求
    項７に記載のオリゴマー抗体。
  9. 【請求項９】 標識基が発光金属キレート標識基であ
    る、請求項８に記載のオリゴマー抗体。
  10. 【請求項１０】 標識基の数が２〜２０である、請求項
    ８または９に記載のオリゴマー抗体。
  11. 【請求項１１】 抗体および／または抗体断片を互いと
    共有結合させることを含んでなる、請求項７〜１０のい
    ずれか１つに記載のオリゴマー抗体の製造方法。
  12. 【請求項１２】 サンドイッチアッセイ用の検出試薬と
    しての請求項７〜１０のいずれか１つに記載のオリゴマ
    ー抗体の使用。
  13. 【請求項１３】 免疫学的方法におけるフック効果(Hoo
    k effect) を低減および／または回避するための請求項
    ７〜１０のいずれか１つに記載のオリゴマー抗体の使
    用。
  14. 【請求項１４】 抗原を免疫測定するための試薬キット
    であって、請求項７〜１０のいずれか１つに記載のオリ
    ゴマー抗体、および固相に結合しているか、固相に結合
    し得る抗体を含んでなる試薬キット。
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