JP3914284B2 - 線維芽細胞増殖因子複合体 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、創傷治癒促進剤等の細胞増殖促進剤として有効な線維芽細胞増殖因子(以下、FGFと称す)複合体、その製造法およびこの複合体を有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
FGFは、線維芽細胞や血管内皮細胞などの増殖因子として古くから注目されている一連の蛋白質群であり、その等電点に基づいて塩基性FGF(bFGF)と酸性FGF(aFGF)とに大別される。これらのうちbFGFは、細胞増殖促進活性が強く、また強力な血管新生作用を有することが知られている。これらの作用は組織障害の修復に必須であり、損傷部位の治癒促進においてbFGFは重要な役割を果たしていると考えられている。
【0003】
bFGFは、ヘパリン結合部位を有しており、ヘパリン様多糖と複合体を形成することが知られている。また、bFGFはグリコサミノグリカンと複合体を形成し、これにより標的細胞の膜受容体に結合して細胞増殖活性を発現するとの報告がある〔クラグスバーン、セル(Cell):67巻、229頁(1991年)〕。さらに、グリコサミノグリカンと複合体を形成することにより、bFGFの溶液中での安定性が向上することが報告されている(特開平2−40399号公報参照)。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
このように、bFGFとグリコサミノグリカンとの複合体は、優れた特性を有するものであるが、グリコサミノグリカンはbFGFの細胞増殖活性自体を増強する作用を有しておらず、また、グリコサミノグリカンは高価であるため、bFGFとの複合体を低コストで大量に供給することが困難であるという問題点を有する。
従って、本発明は、安価で大量供給が可能なFGF活性増強物質とFGFとの複合体、その製造法およびこの複合体を有効成分とし、創傷治癒促進剤等として有効な線維芽細胞増殖促進剤を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、褐藻または紅藻類、特にモズクの抽出物であるフコイダンに、胃潰瘍に対する優れた治癒促進効果を見出している(特開平7−138166号公報参照)。その後の検討で、フコイダンが水性媒体中でFGFと結合し複合体を形成すること、さらに得られた複合体が優れた細胞増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、線維芽細胞増殖因子とフコイダンとの複合体を有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤を提供するものである。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるFGFとしては、bFGFでもaFGFでもよいが、フコイダンとの結合効率の点からbFGFが好ましい。
【0008】
FGFとして具体的には哺乳動物由来のもの、すなわち、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ等の脳下垂体などの各種臓器から抽出されるものなどが挙げられる。
【0009】
本発明で用いるフコイダンとしては、市販の試薬や精製品を用いてもよく、これを豊富に含有する紅藻類または褐藻類から熱水または希塩酸水溶液により抽出される抽出物またはその精製物を用いてもよい。褐藻類としてはモズク、ウミウチワ、ワカメ、ヒバマタ、ヒマンスリア、ビフカリア、フカス・ベシクロサス等が挙げられる。
紅藻類や褐藻類から抽出されたフコイダンは、通常、10万前後の分子量を有し、約50〜60%またはそれ以上がフコースからなり、若干のウロン酸を含む。構成糖の一部は硫酸エステル化されている。本発明においてはモズクから抽出されるフコイダンを用いることが好ましい。
【0010】
紅藻類や褐藻類からフコイダンを抽出するには、特開平7−138166号公報に記載の熱水抽出法または酸抽出法に従って行えばよく、必要に応じて同公報記載の方法により精製し、精製物とすることができる。
【0011】
FGFとフコイダンとの複合体は、FGFとフコイダンとを水性媒体中で単に混合することにより製造することができる。FGFとフコイダンの使用量は、FGF1モルに対してフコイダン2〜20モルが好ましく、5〜10モルが特に好ましい。
【0012】
水性媒体中におけるFGFの濃度は0.0001〜0.1W/V%が好ましく、0.001W/V%付近が特に好ましい。
また、水性媒体中におけるフコイダンの濃度は0.001〜1W/V%が好ましく、0.01W/V%付近が特に好ましい。
【0013】
FGFとフコイダンとを水性媒体中で混合するには、それぞれの水性媒体溶液を混合するか、一方を水性媒体に溶解し、次いで他方を投入するなどの方法により行うことができる。FGFとフコイダンとの混合はpH3〜10において行うことが好ましく、pH5〜9が特に好ましい。水性媒体として水(好ましくは注射用蒸留水)を用いる場合はトリス−塩酸あるいはリン酸2ナトリウム−リン酸1カリウム等を用いてpHを調整する。また、PBS(生理的リン酸緩衝液)(pH7.5)等のあらかじめpHが調整されたものを水性媒体として用いてもよい。
【0014】
混合の際の温度は2〜40℃が好ましく、25〜35℃付近が特に好ましい。複合体形成に要する時間は2〜24時間程度であり、例えば混合温度が約37℃では約2時間、混合温度が約4℃では約24時間で複合体が形成される。
【0015】
このようにして得られる複合体は、線維芽細胞の増殖を促進させる作用を有し、安全性も高いので、これを有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤は、創傷治癒促進剤、火傷の治療剤として用いることができる。これらの医薬等とする場合の剤形や投与量は任意に選定することができる。一般的には、前記複合体に許容できる液状または固体状の担体を配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等に製剤して使用するのが適当である。
【0016】
前記複合体の成人1日当たりの好適投与量は、体重1kgあたり約1〜500mg、好ましくは5〜50mgであり、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【0017】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0018】
試験例1
bFGFとフコイダンの結合性を検討するにあたり、まずフコイダンの固相化を行った。フコイダンは疎水基を持たない化合物であるため、蛋白などを固相化する通常の方法では、プラスチックプレートに固相化することはできない。そこで、フコイダンの還元末端をアミノ化して活性化プレートに結合させる以下の形式でELISA用固相化プレートを作製した。
【0019】
50mg/mlフコイダン水溶液5mlに10mg/ml NaBH4溶液100μl を加え、3時間室温で放置し、還元末端フコース残基を開環した。透析にて脱塩後、0.2M過ヨウ素酸溶液200μl 、50mMイミダゾール塩酸1mlを加え、氷上で1時間遮光放置することにより末端をアルデヒド基とした。透析後、20mg/mlジアミノプロパノール1mlを加え、60℃で1時間反応しシッフ塩基を形成させた。この後、10mg/ml NaBH3CN20μl を加え、60℃で18時間反応させた。反応溶液をCovaLink(Nunk Inter Med社製;活性化型96穴プレート)に50μl ずつ分注し、室温で18時間放置してフコイダンをプレートにカップリングさせた。その後、5%BSA溶液にてブロッキングし、乾燥させて保存した。
【0020】
上記の方法にて作製したフコイダン固相化プレートを用い、bFGFに対するフコイダンの結合性の検討をELISA(酵素免疫測定法)にて行った。対照として、ヘパリン結合部位を持たないEGFに対するフコイダンの結合性についても同時に検討した。
【0021】
まず、フコイダン固相化プレートに、bFGF(ヒト由来遺伝子組換え;Sigma Immuno Chemicals社製)およびEGF(ヒト由来遺伝子組換え;Sigma Immuno Chemicals社製)の溶液(0〜1μg /ml in PBS)を100μl 分注した。37℃で1時間放置した後3回洗浄し、2,000倍希釈した一次抗体溶液(抗ウシbFGFウサギIgG;R & D systems社製および抗ヒトEGF マウスIgG;Becton Dickinson社製)を100μl 分注し、37℃で90分間放置した。洗浄後、2,000倍希釈した二次抗体溶液(パーオキシダーゼ結合抗ウサギIgG ヤギIgG;Cappel社製およびパーオキシダーゼ結合抗マウスIgGヤギIgG;Cappel社製)を100μl 分注し、37℃で60分間放置した。洗浄後、発色基質を添加し、反応後1%SDS溶液を加えて反応を停止させ、波長405nmにおける吸光度を測定した。結果より、bFGF添加群では用量依存的に吸光度が上昇することから、フコイダンとのbFGFとの結合が確認できる(図1)。
【0022】
製造実施例1
上記試験にて、フコイダンがbFGFとの親和製を有することが判明した。そこで、以下の方法にてモズクフコイダン−bFGF複合体を調製した。bFGFの10mM燐酸緩衝液溶液(pH7.5)に、モル比5倍等量のフコイダンを添加し、37℃で2時間反応させたところ、溶液中のほとんどのbFGFがフコイダンとの複合体を形成した。
【0023】
試験例2
製造実施例1で得られたモズクフコイダン−bFGF複合体について、細胞増殖活性をbFGFのそれと比較した。本実験には、bFGFの力価測定に使用されている3T3−SV−40(3T3 Swiss albino SV40 transformed;マウス由来線維芽細胞cell line)を使用した。細胞増殖活性は、チトクローム系由来の還元活性にて評価した(WST1法)。具体的方法は次のとおりである。
【0024】
3日間、SFM 101培地(日水製薬社製;1%FCSを含む)にて前培養した3T3細胞を、1×104cells/mlに調整し、24穴プレートに1mlづつ分注した。そこに、bFGFまたは5倍等量のフコイダンとプレインキュベートしたbFGFを、bFGF換算量で0、1、5、10ng/wellとなるよう添加し、CO2インキュベーターで培養した。3日後に上清を吸引し、WST1溶液を1ml加えて1時間CO2インキュベーターで培養した。WST1溶液とは、16.7mgのWST1(Dojindo社製)を含むEagle MEM培地(日水製薬社製;10%FCS)4.5mlに、0.5mlの0.7mg/ml 1−メトキシメチルフェナジニウムメチル硫酸(Dojindo社製)溶液を混合したものをいう。インキュベート後、測定波長450nm、対照波長620nmにて吸光度を測定して細胞数の指標とした。t検定の結果、bFGF添加群に比較して、フコイダン−bFGF複合体添加群では有意に細胞増殖が促進されていることがわかる(図2)。
【0025】
【発明の効果】
本発明のFGF複合体は強力な細胞増殖促進作用を有し、創傷治癒促進剤等として有効である。
【図面の簡単な説明】
【図1】フコイダン固相化プレートに対するbFGFの結合性を示すグラフである。
【図2】bFGF細胞増殖活性に及ぼすフコイダンの影響を示すグラフである。
Claims (1)
- 線維芽細胞増殖因子とフコイダンとの複合体を有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤。
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