JP3904924B2 - リコペンを製造する方法 - Google Patents
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Description
（発明の分野）
【０００１】
本発明は、ブラケスレア（Blakeslea）タイプのケカビ菌の液内培養物から出発して、カロテノイド類、特にリコペンを製造する新規な方法に関する。トリスポリック酸類が富化されている抽出物の添加に基づいて、リコペンの生成に増加を達成することが可能な発酵法が記載される。この方法は、野生株またはそれらの突然変異株から出発して、単一培養または混合培養で行われる。トリスポリック酸類は発酵の開始時または発酵中に加えることができる。
【０００２】
（技術状態）
カロテノイド類は果実および野菜の中に豊富に生じる化合物であって、酸化防止剤としての、およびビタミンＡ前駆体としてのそれらの性質のために、非常に多数の研究の主題となってきた。リコペンは、その酸化防止剤特性に加えて、心臓血管疾患、並びに前立腺癌や胃腸癌のようなある種のタイプの癌を予防し、また増殖の制御において活性である（スタール Ｗ．［Stahl W.］およびシース，Ｈ．［Sies, H.］、１９９６年、Arch. Biochem. Biophys.、336：1−9；クリントン，ＳＫ．［Clinton, SK.］、１９９８年、Nutr. Rev.、56：35−51）。カロテノイド類は、また、それらの色が黄色乃至赤色であるために、マーガリン、バター、サラダオイル、スープおよびソースの食品助剤および着色剤としても使用される（ペップラー ＨＪ．［Peppler HJ.］、パールマン Ｄ．［Perlman D.］（編集人）、Microbial Technology、第２版、第１巻、アカデミック・プレス社［Academic Press］、ＮＹ、第５２９〜５４４頁においてニネット Ｌ．［Ninet L.］およびレノート Ｊ．［Renaut J.］、１９７９年）。
【０００３】
リコペンは、β−カロテン（英国特許第１０３４９４４号および同第１１１４０４３号）およびキサントフィル類の生合成経路で中間体として生成せしめられるカロテノイドである。
【０００４】
リコペン調製物（preparations）はトマトから（PCT特許ＷＯ第９７／４８２８７号、欧州特許第６０８０２７号）、またはフィコマイセス（Phycomyces）、ブラケスレア（Blakeslea）およびコアネフォラ（Choanephora）のようなケカビ菌類の発酵によって（英国特許第１００８４６９号、米国特許第３０９７１４６号、同第３３６９９７４号、）特開昭４８−１６１８９号、同４８−１６１９０号およびロシア連邦特許第２１０２４１６号）得られる。
【０００５】
英国特許第１００８４６９号および米国特許第３０９７１４６号明細書は、ｐＨが７．０より高くかつ９．５以下に保持されている培地より成る、ブラケスレア・トリスポーラ菌（fungus Blakeslea trispora）の発酵法について記載している。７日間のインキュベーション後に、培地１００ｍＬ当たり９．９７ｍｇのリコペンが得られる。
【０００６】
特開昭４８−１６１８９号および同４８−１６１９０号公報は、β−カロテンの形成を防ぎ、そしてリコペンの蓄積を促進するために第三アミンが加えられる、フィコマイセス、ブラケスレアおよびコアネフォラのようなムコーラレス菌類（Mucorales fungi）による発酵法について記載している。第三アミンの例として次のものが挙げられている：ホルデニン；２−ジメチルアミノ−エタノール；３−ジメチルアミノ−１−プロパノール；１−ジメチルアミノ−２−プロパノール；２−ジエチルアミノ−エタノール；３−ジエチルアミノ−１−プロパノール；１−ジエチルアミノ−２−プロパノール；トリエチルアミン；２−ジイソプロピルアミノ−エタノール；３−ジイソプロピルアミノ−１−プロパノール；１−ジイソプロピルアミノ−２−プロパノール；２−ジ−ｎ−プロピルアミノ−エタノール；３−ジ−ｎ−プロピルアミノ−１−プロパノール；１−ジ−ｎ−プロピルアミノ−２−プロパノール；２−ジメチルアミノエチルベンゼン；２−ジエチルアミノ−エチルベンゼン；ｐ−（２−ジエチルアミノエチル）フェノール。ロシア連邦特許第２１０２４１６号明細書は、リコペンの蓄積を誘発するためにアミノメチルピリジン類およびタバコ残分を添加することを記載している。これら特許明細書に記載される物質に加えて、リコペンレベルにおいてカロテノイド類の合成を阻害することができる、ニコチン（特開平５−１３１６７号）、イミダゾール、ピリジン、モルホリン、キノリンおよびある種の置換誘導体（米国特許第３３６９９７４号；ペップラー ＨＪ．、パールマン Ｄ．（編集人）、Microbial Technology、第２版、第１巻、アカデミック・プレス社、ＮＹ、第５２９〜５４４頁におけるニネット Ｌ．、レノート Ｊ．、１９７９年）のような他の窒素化複素環式塩基の使用についての説明がある。
【０００７】
第三アミンを加えることを必要としないでリコペンを蓄積するＢ．トリスポーラの突然変異株も記載されている（メータ Ｂ．［Mehta B.］およびセルダ−オルメド Ｅ．［Cerda-Olmedo E.］、１９９５年、Appl. Microbiol. Biochenol.、42：836−838）。
【０００８】
Ｂ．トリスポーラ菌によるβ−カロテンの製造法のいずれにおいても、この菌の混合培養物が用いられ、その結果β−カロテンはその菌の（＋）株および（−）株で別個に遭遇する収量よりもはるかに高い収量で得られる（シーグラー，Ａ．［Ciegler, A.］、１９６５年、Advances in Applied Microbiology、7：1−34；プレンペル，Ｍ．［Plempel, M.］、１９６５年、Planta、65：225−231；サッター，ＲＰ．［Sutter, RP.］およびラフェルソン，ＭＥ．［Rafelson, ME.］、１９６８年、J. Bacteriology、95：426−432）。混合培養物中でのβ−カロテンの成増加は、β因子またはトリスポリック酸類と呼ばれる一系統の酸性化合物の生成と相関している（カグリオッティ Ｌ．［Caglioti L.］、カイネリ Ｇ．［Cainelli G］、カメリノ Ｂ．［Camerino B.］、モンデリ Ｒ．［Mondelli R］、プリエト Ａ．［Prieto A.］、クィリコ Ａ．［Quilico A.］、サルバトーリ Ｔ．［Salvatori T.］、セルバ Ａ．［Selva A.］、１９６６年、Tetrahedron Supplement、7：175−187）。トリスポリック酸類は、Ｂ．トリスポーラ、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Phycomyces blakesleanus）およびムコール・ムセド（Mucor mucedo）のようなムコーラレス菌類中の性ホルモンであると提案されている。それらが、β−カロテンの生成を刺激することに加えてザイゴフォア類（zygophores）の形成も刺激するからである（バン・デン・エンデ，Ｈ．［van den Ende, H.］、１９６８年、J. Bacteriology、96：1298−1303；オースチン ＤＪ．［Austin DJ.］、ブ′ロック ＪＤ．［Bu'Lock JD.］、グッデイ Ｇ．Ｗ．［Gooday G. W.］、１９６９年、Nature、223：1178−1179；レシュケ，Ｔ．［Reschke, T.］、１９６９年、Tetrahedron letters、29：3435−3439；バン・デン・エンデ，Ｈ．、ウィーチマン AHCA.［Wiechmann AHCA.］、レインゴード ＤＪ．［Reyngoud DJ.］、ヘンドリックス Ｔ．［Hendricks T.］、１９７０年、J. Bacteriology、101：423−428）。
【０００９】
化学的には、１，１，１−トリメチル−２−（３−メチルオクチル）シクロヘキサンの不飽和誘導体であるトリスポリック酸類は酸化される。これらの化合物は、ジテルペン類またはカロテノイド類の分解で作り出されまたは生成せしめられるセスキテルペン類として分類することができる。トリスポリック酸類は３種の物質、即ちトリスポリック酸Ａ、ＢおよびＣの混合物として特徴付けられてきたもので、それら酸類は（それらがβ−カロテンの合成を刺激するという事実のために）β1因子、β2因子およびβ3因子とも呼ばれる。トリスポリック酸Ｃが最も豊富であって、Ｂ．トリスポーラの混合培養物中に８０％で存在することが見いだされる（カグリオッティ Ｌ．、カイネリ Ｇ．、カメリノ Ｂ．、モンデリ Ｒ．、プリエト Ａ．、クィリコ Ａ．、サルバトーリ Ｔ．、セルバ Ａ．、１９６６年、Tetrahedron Supplement、7：175−187）。
【００１０】
トリスポリック酸類は前記の（＋）株および（−）株の両者によって生成せしめられるβ−カロテンから合成される。β−カロテンはレチナールを経由して４−ヒドロトリスポロールまで代謝される。この化合物は上記（＋）株により４−ジヒドロトリスポリック酸およびそのメチルエステルまで代謝され、また上記（−）株は上記４−ヒドロトリスポロールをトリスポロールに転化させる。これら２種の中間体は、培地中で反対の性の株に拡散した後にのみトリスポリック酸に転化される（グッデイ ＧＷ．およびカーライル ＭＪ．（Carlile MJ.）による総説、１９９７年、Mycologist、11：26−30）。即ち、上記（−）株は、上記の図式により、上記（＋）株によってトリスポリック酸に、またその逆に転化される中間体を生成させる。
【００１１】
Ｂ．トリスポーラの混合培養物から得られるトリスポリック酸類は、別の株を持つ培養物中でのβ−カロテンの生成を増加させるのに使用することができる。例えば、２１．８単位のβ因子の添加は、（−）株からはβ−カロテンの収量を４２２％増加させ、（＋）株からはその収量を７１％増加させる。しかし、（−）株の培養物中においてβ因子１単位当たりのカロテン形成（carotenogenesis）の刺激は、混合培養物中で、同様の量のβ因子によりもたらされるカロテン形成の２０〜３０％に過ぎなかった（サッター ＲＰ．およびラフェルソン ＭＥ．、１９６８年、J. Bacteriology 、95：426−432）。
【００１２】
トリスポリック酸類は、サッター Ｒ．がScience、168：1590−1592、1970で、またはサッター ＲＰ．、キャページ ＤＡ．、ハリソン ＴＬ．、キーン ＷＡ．がJ. Bacteriology 、114：1074−1082、1973で記載する方法のようないろいろな方法で精製することができる。
【００１３】
トリスポリック酸類の添加によるリコペン収量の明確な増加効果が記述されていたかどうかは分からない。リコペンの生成は、リコペンをβ−カロテンに転化させるリコペンシクラーゼ活性を抑えることに基づくもので、このことが発酵の際に低レベルのβ−カロテンをもたらす。カロテン形成を誘発する性ホルモンであるトリスポリック酸類は、β−カロテンから合成される。従って、（実施例５および６における、ASA2（＋）を持つ突然変異株・SB34（−）の場合におけるように）β−カロテンを生成させる混合培養物中ではトリスポリック酸類の添加には効果がないから、何がそれらホルモンの形成を抑えて、トリスポリック酸類によるリコペンの生成を増加させるかは、前駆体（β−カロテン）が存在しないことである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、ムコーラレス菌類（ブラケスレア、コアネフォラまたはフィコマイセス）による、さらに具体的にはＢ．トリスポーラでの発酵法におけるカロテノイド類、特にリコペンの生成を増加させることを請求することである。本発明は、Ｂ．トリスポーラ菌を発酵培地中で培養し、そして一部精製されたトリスポリック酸類（またはβ因子）（PTA）を、またはある種の他の供給源、例えばβ−カロテンの生成用培地からの未精製のトリスポリック酸類（またはβ因子）（NPTA）でさえも添加することより成る。
【００１５】
リコペンの発酵に及ぼすトリスポリック酸類の効果は、前記ホルモンはリコペンの発酵においては形成され得ない化合物であるβ−カロテンから合成されるという事実に基づく。これらの条件下では、前記の菌は上記ホルモンの合成前駆体を持っておらず、従ってカロテン形成はその最大限度までは誘発されない。
【００１６】
発酵に用いられる生物であるムコーラレス菌類、さらに具体的にはＢ．トリスポーラの株、またはその（＋）株と（−）株との混合物、或いは、それに代わって、リコペンを蓄積することができるＢ．トリスポーラの突然変異株は、これらを単離することができる。上記菌の（＋）株と（−）株とのいろいろな混合物が本発明の発酵法で用いることができる。β−カロテンの生成菌であるＢ．トリスポーラの株を用いるときは、リコペンのレベルにおいてカロテン形成を阻害することができる化合物（例えば、前記の第三アミン、その他の化合物）が加えられる。リコペンからのカロテノイド類の生合成において阻害される突然変異株を使用するときは、第三アミンや関連化合物を加えることは必要ない。上記の２つのケースのいずれにおいても、一部精製トリスポリック酸類（PTA）または未精製トリスポリック酸類（NPTA）が、それらのある種の供給源から、例えばβ−カロテンの発酵から誘導される培地から、両ケースとも０．３５ｍｇ／ｍＬのおおよその濃度で加えられる。用語・NPTAはβ−カロテン培地に相当する。トリスポリック酸類のこれら培地中における濃度は、図１からインキュベーション日数の関数として計算することができる（４日目には３５０〜４００μｇ／ｍＬとなろう）。
【００１７】
ムコーラレス菌類からのカロテノイド類の、さらに具体的にはＢ．トリスポーラの選択された株または突然変異株によるリコペンの製造法は、１種またはそれ以上の炭素源、１種またはそれ以上の窒素源、無機塩類およびチアミンを含んでいるいかなる培地中でも行うことができる。炭素源は単純なまたは複雑な栄養源として加えることができ、それにはデキストリン、澱粉、グルコース、サッカロース、フルクトース、動物油または植物油のような炭水化物または脂肪がある。培地は、また、大豆粉、トウモロコシ粉、可溶性留出物、酵母抽出物、綿実粉、ペプトン、カゼイン、硫酸アンモニウム等々のような同化可能な窒素源、同有機源または同無機源も有していなければならない。培地に加えることができる無機塩類としては、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムが挙げられる。栄養源の割合は、微生物の増殖要件に基づいて、そして生成レベルに基づいて決められる。発酵は好気性条件において液内培養で行われるのが好ましい。発酵温度は２０〜３２℃の間で変えることができるが、２５〜２８℃の範囲が好ましい。
【００１８】
０．００１〜１０００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でのトリスポリック酸類の添加は、一部精製調製物またはそれらの任意の供給源から、例えば任意のケカビ菌のβ−カロテンの発酵に由来する培地から行うことができる。添加は発酵開始から７２〜１４４時間行われるのが好ましい。
【００１９】
リコペンは細胞破裂について記述されている任意の方法により抽出されるが、その細胞破裂は、任意の溶媒に溶解され、かつ内容物が可溶性であるそれら細胞内容物を放出するのを可能にするものである。リコペンの濃度は吸光度測定法による測定で求めることができるが、液体クロマトグラフィー（HPLC）が好ましい。これら方法のいずれに関しても参考文献に記載されている。
【００２０】
使用される株は次のとおりである：β−カロテンの生成株である突然変異株：ASA2（＋）およびASA25（−）。リコペンの生成株である突然変異株：SB34（−）。この最後に挙げた突然変異株も２５％のβ−カロテンを生成させる（表１を参照されたい）。突然変異株の選択は、トリスポリック酸類自体に因るカロテン生成の増加効果の観点とは無関係である。即ち、それら化合物に因る効果はいかなる他の類似突然変異株においても再現性がある。但し、そのリコペンの基礎生成率は、例えば、親株により生ずるように、より低いだろう。親株は寄託所に寄託されていて、生育可能でかつ公に入手できる。
【００２１】
実施例１
β−カロテンおよびリコペンの発酵中におけるトリスポリック酸類の濃度の測定
【００２２】
１リットル当たり大豆粉２３ｇ；トウモロコシ粉４７ｇ；リン酸一カリウム０．５ｇ；チアミン塩酸塩０．００２ｇを含んでいる接種用培地を調製する。その初期ｐＨは６．３である。この培地を５００ｍＬの三角フラスコ中に６７ｍＬまたは１００ｍＬの速度で分配する。滅菌後に、胞子懸濁物からのＢ．トリスポーラASA2（＋）株およびＢ．トリスポーラASA25（−）株を別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００２３】
突然変異株のＢ．トリスポーラ ASA2（＋）およびＢ．トリスポーラ ASA25（−）は、ロシア（Russia）のモスクワ（Moscow）に所在するコレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ（Collection of Industrial Microorganisms：VKM）に寄託されている野生株のＢ．トリスポーラ F208（−）およびF117（＋）からのNTGによる突然変異により得られる。この両株は公に入手できる。
【００２４】
１リットル当たり大豆粉４４ｇ；トウモロコシ粉１９ｇ；二塩基性ホスフェート０．５５ｇ；チアミン塩酸塩０．００２ｇ；植物油１０％を含んでいる塩基性発酵培地を調製する。その初期ｐＨは水酸化カリウムで７．５に調整されている。この培地を２５０ｍＬの三角フラスコ中に２０ｍＬの速度で分配する。
【００２５】
β−カロテンの発酵のために、塩基性培地が入っているフラスコにＢ．トリスポーラASA2（＋）株とＢ．トリスポーラASA25（−）株との混合培養物を１０％接種する。リコペンの発酵のために、上記塩基性培地に、生合成経路をリコペンのレベルにおいて遮断する目的で、化学試剤、例えば２ｍＬ／Ｌのピリジンを加える。この培地にＢ．トリスポーラASA2（＋）株とＢ．トリスポーラASA25（−）株との混合培養物を１０％接種する。全てのフラスコを２５℃において軌道攪拌器（orbital stirrer）中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。試料を発酵２日目から初めて２４時間毎に採取し、そしてトリスポリック酸類の濃度を、β−カロテンを生成させるフラスコ中およびリコペンを生成させるフラスコ中で測定する。
【００２６】
トリスポリック酸類の濃度は、試料をｐＨ２まで酸性化した後に１容量のクロロホルムで抽出することによって測定される。その有機部分を１容量の４％重炭酸ナトリウム溶液で抽出し、その水性相を集め、そして酸性化し、次いで再びクロロホルムで抽出する。次に、そのクロロホルムを蒸発させて乾固状態に至らしめ、そしてトリスポリック酸類より成る残分をエタノール、またはトリス（Tris）−硫酸塩緩衝液中に溶解させる。そのトリスポリック酸類を、吸光係数を７０mL×mg-1×cm-1と仮定して（サッター ＲＰ．、キャページ ＤＡ．、ハリソン ＴＬ．、キーン ＷＡ．、１９７３年、J. Bacteriology 、114：1074−1082）、吸光度測定法で３２５ｎｍにおいて定量的に測定する。
【００２７】
トリスポリック酸類の濃度はβ−カロテンおよびリコペンの発酵の過程で変わり、後者では前者よりも有意に低いことが見いだされた。最大の相違は４日目に見いだされ、この場合β−カロテンの発酵での濃度は３７８μｇ／ｍＬ、リコペンの発酵での濃度は４６μｇ／ｍＬであった（おおよそ８倍の違い）（図１）。
【００２８】
実施例２
リコペンを蓄積する形のβ−カロテンの生合成における一部阻害突然変異株の発酵に及ぼすトリスポリック酸類の添加効果
【００２９】
接種用培地を実施例１に記載されたように調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラSB34（−）株を胞子懸濁物から植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００３０】
突然変異株・Ｂ．トリスポーラSB34（−）は、ロシア、モスクワのコレクション・オブ・カルチャース ＶＫＭ（Collection of Cultures VKM）に寄託されている野生株・Ｂ．トリスポーラF921（−）から出発してNTGによる突然変異により得られ、公に入手できた。
【００３１】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、一連のフラスコに、リコペンを蓄積する形のβ−カロテンの生合成において一部阻害された突然変異株であることが特徴であるＢ．トリスポーラSB34（−）株を１０％接種する。全てのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００３２】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加のないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、実施例１で説明されたように精製されたトリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。
【００３３】
一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加により、乾燥重量１グラム当たり０．１１〜０．２４ｍｇのリコペンの増加が得られる（発酵６日目には対照に比較して２．１８倍の増加、図２）。
【００３４】
実施例３
生合成が化学試剤によりリコペンレベルにおいて阻害されているβ−カロテン生成性突然変異株によるリコペンの発酵に及ぼすトリスポリック酸類の添加効果
【００３５】
接種用培地を実施例１に記載された方法で調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株を胞子懸濁物から植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００３６】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、リコペンレベルにおいてカロテノイドの生合成を阻害する化学試剤、例えばイミダゾールを０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加える。この培地にもｐＨ７．５のホスフェート緩衝剤を２５ｍＭの最終濃度まで追加し、そしてＢ．トリスポーラASA25（−）株を１０％接種する。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００３７】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加を受けていないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。
【００３８】
一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加により、乾燥重量１グラム当たり０．１６〜１．０９ｍｇのリコペンの増加が得られる（発酵６日目には対照に比較して６．８倍の増加、図３）。
【００３９】
実施例４
Ｂ．トリスポーラASA2（＋）による混合培養での突然変異株・Ｂ．トリスポーラASA25（−）の発酵に及ぼす一部精製トリスポリック酸類（PTA）または未精製トリスポリック酸類（NPTA）の添加効果
【００４０】
接種用培地を実施例１に記載されたように調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株を胞子懸濁物から別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００４１】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、イミダゾールを０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、またｐＨ７．５のホスフェート緩衝剤を２５ｍＭの最終濃度まで加える。この培地にＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００４２】
未精製トリスポリック酸類（NPTA）源を得るために、実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、混合培養物に、それぞれβ−カロテンを生成させる株であるＢ．トリスポーラASA2（＋）株およびＢ．トリスポーラASA25（−）株を１０％植える。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００４３】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加を受けていないものである。一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。未精製トリスポリック酸類（NPTA）の添加を受けているフラスコ群は４日目まで対照と同じ条件にしておかれ、次いで２０μｍのナイロンフィルターによる濾過プロセスに供される。このナイロンフィルターは、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株の菌糸を、それら株がイミダゾールの存在下で増殖した培地から分離するのを可能にする。菌糸と培地との分離は２０μｍナイロンフィルターにより並行して行われるが、この２種の株・Ｂ．トリスポーラASA2（＋）およびＢ．トリスポーラASA25（−）をβ−カロテンの生成条件で含んでいるフラスコの場合、その培地はトリスポリック酸類の未精製源（NPTA）と見なされる。菌糸と培地との分離が終わったら、イミダゾールにより増殖せしめられたＢ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株の菌糸を、イミダゾールの非存在下で増殖せしめられた同じ株の培地と混合する。イミダゾールは、トリスポリック酸類の未精製源（NPTA）と見なされる培地に、０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度が得られるように加えられる。これらのフラスコを２５℃および２５０ｒｐｍでインキュベートする。
【００４４】
一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加により、乾燥重量１グラム当たり２９．１４〜４３．５８ｍｇのリコペンの増加が得られ（発酵６日目には対照に比較して５０％の増加、図４）、またβ−カロテンの培地を添加することにより乾燥重量１グラム当たり２９．１４〜４１．０７ｍｇのリコペンの増加が得られる（発酵６日目には対照に比較して４１％の増加、図４）。この実施例は、トリスポリック酸類の効果はそれらの精製の程度とは無関係であることを示している。
【００４５】
実施例５
Ｂ．トリスポーラASA2（＋）による混合培養での突然変異株・Ｂ．トリスポーラSB34（−）の発酵に及ぼすトリスポリック酸類の添加効果
【００４６】
接種用培地を実施例１に記載された方法で調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラSB34（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株を胞子懸濁物から別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００４７】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、その培地にＢ．トリスポーラSB34（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００４８】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加を受けていないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。
【００４９】
トリスポリック酸類が富化されている調製物の添加は、突然変異株・SB34（−）の発酵が混合培養で行われるときは、リコペンの生成に有意の効果がない（図５）。
【００５０】
実施例６
Ｂ．トリスポーラSB34（−）株またはＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合発酵におけるカロテノイド類の割合の分析
【００５１】
接種用培地を実施例１に記載されたように調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラSB34（−）株、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株を胞子懸濁物から別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００５２】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、この培地を２つの群に分ける。一方のフラスコ群にＢ．トリスポーラSB34（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。他方のフラスコ群には、滅菌後に、イミダゾールを０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、またｐＨ７．５のホスフェート緩衝剤を２５ｍＭの最終濃度まで加える。この培地にＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。全てのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００５３】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加のないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。
【００５４】
液体クロマトグラフィー（HPLC）でカロテノイド類の割合を分析するために、それら培養物から発酵５日目および６日目に試料を採取する。得られた結果は表１に示される。
【００５５】
【００５６】
Ｂ．トリスポーラSB34（−）株またはＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合培養物を用いるリコペンの発酵で得られたカロテノイド類の割合の分析は、リコペンおよびβ−カロテンの割合に有意差があることを示している。これらの差異はトリスポリック酸の添加とは無関係である。Ｂ．トリスポーラSB34（−）による発酵で６日目に得られたカロテノイド類の混合物は６３％のリコペンを有するが、これに対してＢ．トリスポーラASA25（−）を用いて得られた混合物は８８％を有する（純度が２５％高い生成物を与える）。同じ混合物において、β−カロテンの割合はＢ．トリスポーラSB34（−）による発酵でトリスポーラASA25（−）による発酵におけるよりも１０倍大きい。
【００５７】
β−カロテンはトリスポリック酸類の前駆体であるので、これらのデータは次のように解釈することができるだろう：
【００５８】
１．β−カロテンの発酵とリコペンの発酵との間でトリスポリック酸類の濃度に相違がある（実施例１）。
【００５９】
２．トリスポリック酸類（精製済みまたは未精製）の添加は、トリスポーラASA25（−）をカロテノイド類の混合物がβ−カロテンをちょうど２％含んでいる（実施例４および６）マイナスの株として用いる場合、混合培養での発酵６日目にリコペンの収量に４０〜５０％の増加を与えるということ。
【００６０】
３．トリスポリック酸類の添加には、Ｂ．トリスポーラSB34（−）をカロテノイド類の混合物がβ−カロテンを２０％より多く含んでいる（実施例５および６）マイナスの株として用いる場合、混合培養に対して効果がないということ。
【００６１】
これらの結果は、混合培養物中でのリコペンの発酵に及ぼすトリスポリック酸類の効果がその生合成用前駆体の不存在に因ることを証明している。このことが理由となって、高純度のリコペンの工業的製造におけるその使用が極めて有利なのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 β−カロテンの発酵およびリコペンの発酵の過程におけるトリスポリック酸類の濃度。両発酵において、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合培養物が用いられている。リコペンの発酵（四角形）において、培地には、この場合はピリジンであるが、リコペンの蓄積を促進する化学試剤が添加されている。β−カロテンの発酵（菱形）は同じ条件であるが、ピリジンなしで行われている。横座標：日数での時間。縦座標：トリスポリック酸類の濃度（μｇ／ｍＬ）。
【図２】 リコペンレベルにおいてはβ−カロテンの合成が阻害される突然変異株Ｂ．トリスポーラSB34（−）による、トリスポリック酸類の添加ありまたは添加なしでのリコペンの生成。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で示される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。値は２つの独立試料の平均を示す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
【図３】 β−カロテンの過剰生成株である突然変異株・Ｂ．トリスポーラASA25（−）による、トリスポリック酸類の添加ありおよび添加なしでのリコペンの生成。発酵培地には、リコペンの蓄積を促進させるイミダゾールが追加されている。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で表される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。値は２つの独立試料の平均を表す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
【図４】 β−カロテンの過剰生成株である突然変異株・Ｂ．トリスポーラASA25（−）およびＢ．トリスポーラASA2（＋）の混合培養における、トリスポリック酸類の添加ありおよび添加なしでのリコペンの生成。発酵培地には、リコペンの蓄積を促進させるイミダゾールが追加されている。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で表される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。発酵４日目での未精製トリスポリック酸類の添加により得られたリコペンの収量は円形で表される。値は２つの独立試料の平均を表す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
【図５】 Ｂ．トリスポーラSB34（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合培養における、トリスポリック酸類の添加ありおよび添加なしでのリコペンの生成。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で表される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。値は２つの独立試料の平均を表す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
【０００１】
本発明は、ブラケスレア（Blakeslea）タイプのケカビ菌の液内培養物から出発して、カロテノイド類、特にリコペンを製造する新規な方法に関する。トリスポリック酸類が富化されている抽出物の添加に基づいて、リコペンの生成に増加を達成することが可能な発酵法が記載される。この方法は、野生株またはそれらの突然変異株から出発して、単一培養または混合培養で行われる。トリスポリック酸類は発酵の開始時または発酵中に加えることができる。
【０００２】
（技術状態）
カロテノイド類は果実および野菜の中に豊富に生じる化合物であって、酸化防止剤としての、およびビタミンＡ前駆体としてのそれらの性質のために、非常に多数の研究の主題となってきた。リコペンは、その酸化防止剤特性に加えて、心臓血管疾患、並びに前立腺癌や胃腸癌のようなある種のタイプの癌を予防し、また増殖の制御において活性である（スタール Ｗ．［Stahl W.］およびシース，Ｈ．［Sies, H.］、１９９６年、Arch. Biochem. Biophys.、336：1−9；クリントン，ＳＫ．［Clinton, SK.］、１９９８年、Nutr. Rev.、56：35−51）。カロテノイド類は、また、それらの色が黄色乃至赤色であるために、マーガリン、バター、サラダオイル、スープおよびソースの食品助剤および着色剤としても使用される（ペップラー ＨＪ．［Peppler HJ.］、パールマン Ｄ．［Perlman D.］（編集人）、Microbial Technology、第２版、第１巻、アカデミック・プレス社［Academic Press］、ＮＹ、第５２９〜５４４頁においてニネット Ｌ．［Ninet L.］およびレノート Ｊ．［Renaut J.］、１９７９年）。
【０００３】
リコペンは、β−カロテン（英国特許第１０３４９４４号および同第１１１４０４３号）およびキサントフィル類の生合成経路で中間体として生成せしめられるカロテノイドである。
【０００４】
リコペン調製物（preparations）はトマトから（PCT特許ＷＯ第９７／４８２８７号、欧州特許第６０８０２７号）、またはフィコマイセス（Phycomyces）、ブラケスレア（Blakeslea）およびコアネフォラ（Choanephora）のようなケカビ菌類の発酵によって（英国特許第１００８４６９号、米国特許第３０９７１４６号、同第３３６９９７４号、）特開昭４８−１６１８９号、同４８−１６１９０号およびロシア連邦特許第２１０２４１６号）得られる。
【０００５】
英国特許第１００８４６９号および米国特許第３０９７１４６号明細書は、ｐＨが７．０より高くかつ９．５以下に保持されている培地より成る、ブラケスレア・トリスポーラ菌（fungus Blakeslea trispora）の発酵法について記載している。７日間のインキュベーション後に、培地１００ｍＬ当たり９．９７ｍｇのリコペンが得られる。
【０００６】
特開昭４８−１６１８９号および同４８−１６１９０号公報は、β−カロテンの形成を防ぎ、そしてリコペンの蓄積を促進するために第三アミンが加えられる、フィコマイセス、ブラケスレアおよびコアネフォラのようなムコーラレス菌類（Mucorales fungi）による発酵法について記載している。第三アミンの例として次のものが挙げられている：ホルデニン；２−ジメチルアミノ−エタノール；３−ジメチルアミノ−１−プロパノール；１−ジメチルアミノ−２−プロパノール；２−ジエチルアミノ−エタノール；３−ジエチルアミノ−１−プロパノール；１−ジエチルアミノ−２−プロパノール；トリエチルアミン；２−ジイソプロピルアミノ−エタノール；３−ジイソプロピルアミノ−１−プロパノール；１−ジイソプロピルアミノ−２−プロパノール；２−ジ−ｎ−プロピルアミノ−エタノール；３−ジ−ｎ−プロピルアミノ−１−プロパノール；１−ジ−ｎ−プロピルアミノ−２−プロパノール；２−ジメチルアミノエチルベンゼン；２−ジエチルアミノ−エチルベンゼン；ｐ−（２−ジエチルアミノエチル）フェノール。ロシア連邦特許第２１０２４１６号明細書は、リコペンの蓄積を誘発するためにアミノメチルピリジン類およびタバコ残分を添加することを記載している。これら特許明細書に記載される物質に加えて、リコペンレベルにおいてカロテノイド類の合成を阻害することができる、ニコチン（特開平５−１３１６７号）、イミダゾール、ピリジン、モルホリン、キノリンおよびある種の置換誘導体（米国特許第３３６９９７４号；ペップラー ＨＪ．、パールマン Ｄ．（編集人）、Microbial Technology、第２版、第１巻、アカデミック・プレス社、ＮＹ、第５２９〜５４４頁におけるニネット Ｌ．、レノート Ｊ．、１９７９年）のような他の窒素化複素環式塩基の使用についての説明がある。
【０００７】
第三アミンを加えることを必要としないでリコペンを蓄積するＢ．トリスポーラの突然変異株も記載されている（メータ Ｂ．［Mehta B.］およびセルダ−オルメド Ｅ．［Cerda-Olmedo E.］、１９９５年、Appl. Microbiol. Biochenol.、42：836−838）。
【０００８】
Ｂ．トリスポーラ菌によるβ−カロテンの製造法のいずれにおいても、この菌の混合培養物が用いられ、その結果β−カロテンはその菌の（＋）株および（−）株で別個に遭遇する収量よりもはるかに高い収量で得られる（シーグラー，Ａ．［Ciegler, A.］、１９６５年、Advances in Applied Microbiology、7：1−34；プレンペル，Ｍ．［Plempel, M.］、１９６５年、Planta、65：225−231；サッター，ＲＰ．［Sutter, RP.］およびラフェルソン，ＭＥ．［Rafelson, ME.］、１９６８年、J. Bacteriology、95：426−432）。混合培養物中でのβ−カロテンの成増加は、β因子またはトリスポリック酸類と呼ばれる一系統の酸性化合物の生成と相関している（カグリオッティ Ｌ．［Caglioti L.］、カイネリ Ｇ．［Cainelli G］、カメリノ Ｂ．［Camerino B.］、モンデリ Ｒ．［Mondelli R］、プリエト Ａ．［Prieto A.］、クィリコ Ａ．［Quilico A.］、サルバトーリ Ｔ．［Salvatori T.］、セルバ Ａ．［Selva A.］、１９６６年、Tetrahedron Supplement、7：175−187）。トリスポリック酸類は、Ｂ．トリスポーラ、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Phycomyces blakesleanus）およびムコール・ムセド（Mucor mucedo）のようなムコーラレス菌類中の性ホルモンであると提案されている。それらが、β−カロテンの生成を刺激することに加えてザイゴフォア類（zygophores）の形成も刺激するからである（バン・デン・エンデ，Ｈ．［van den Ende, H.］、１９６８年、J. Bacteriology、96：1298−1303；オースチン ＤＪ．［Austin DJ.］、ブ′ロック ＪＤ．［Bu'Lock JD.］、グッデイ Ｇ．Ｗ．［Gooday G. W.］、１９６９年、Nature、223：1178−1179；レシュケ，Ｔ．［Reschke, T.］、１９６９年、Tetrahedron letters、29：3435−3439；バン・デン・エンデ，Ｈ．、ウィーチマン AHCA.［Wiechmann AHCA.］、レインゴード ＤＪ．［Reyngoud DJ.］、ヘンドリックス Ｔ．［Hendricks T.］、１９７０年、J. Bacteriology、101：423−428）。
【０００９】
化学的には、１，１，１−トリメチル−２−（３−メチルオクチル）シクロヘキサンの不飽和誘導体であるトリスポリック酸類は酸化される。これらの化合物は、ジテルペン類またはカロテノイド類の分解で作り出されまたは生成せしめられるセスキテルペン類として分類することができる。トリスポリック酸類は３種の物質、即ちトリスポリック酸Ａ、ＢおよびＣの混合物として特徴付けられてきたもので、それら酸類は（それらがβ−カロテンの合成を刺激するという事実のために）β1因子、β2因子およびβ3因子とも呼ばれる。トリスポリック酸Ｃが最も豊富であって、Ｂ．トリスポーラの混合培養物中に８０％で存在することが見いだされる（カグリオッティ Ｌ．、カイネリ Ｇ．、カメリノ Ｂ．、モンデリ Ｒ．、プリエト Ａ．、クィリコ Ａ．、サルバトーリ Ｔ．、セルバ Ａ．、１９６６年、Tetrahedron Supplement、7：175−187）。
トリスポリック酸類は前記の（＋）株および（−）株の両者によって生成せしめられるβ−カロテンから合成される。β−カロテンはレチナールを経由して４−ヒドロトリスポロールまで代謝される。この化合物は上記（＋）株により４−ジヒドロトリスポリック酸およびそのメチルエステルまで代謝され、また上記（−）株は上記４−ヒドロトリスポロールをトリスポロールに転化させる。これら２種の中間体は、培地中で反対の性の株に拡散した後にのみトリスポリック酸に転化される（グッデイ ＧＷ．およびカーライル ＭＪ．（Carlile MJ.）による総説、１９９７年、Mycologist、11：26−30）。即ち、上記（−）株は、上記の図式により、上記（＋）株によってトリスポリック酸に、またその逆に転化される中間体を生成させる。
【００１１】
Ｂ．トリスポーラの混合培養物から得られるトリスポリック酸類は、別の株を持つ培養物中でのβ−カロテンの生成を増加させるのに使用することができる。例えば、２１．８単位のβ因子の添加は、（−）株からはβ−カロテンの収量を４２２％増加させ、（＋）株からはその収量を７１％増加させる。しかし、（−）株の培養物中においてβ因子１単位当たりのカロテン形成（carotenogenesis）の刺激は、混合培養物中で、同様の量のβ因子によりもたらされるカロテン形成の２０〜３０％に過ぎなかった（サッター ＲＰ．およびラフェルソン ＭＥ．、１９６８年、J. Bacteriology 、95：426−432）。
【００１２】
トリスポリック酸類は、サッター Ｒ．がScience、168：1590−1592、1970で、またはサッター ＲＰ．、キャページ ＤＡ．、ハリソン ＴＬ．、キーン ＷＡ．がJ. Bacteriology 、114：1074−1082、1973で記載する方法のようないろいろな方法で精製することができる。
【００１３】
トリスポリック酸類の添加によるリコペン収量の明確な増加効果が記述されていたかどうかは分からない。リコペンの生成は、リコペンをβ−カロテンに転化させるリコペンシクラーゼ活性を抑えることに基づくもので、このことが発酵の際に低レベルのβ−カロテンをもたらす。カロテン形成を誘発する性ホルモンであるトリスポリック酸類は、β−カロテンから合成される。従って、（実施例５および６における、ASA2（＋）を持つ突然変異株・SB34（−）の場合におけるように）β−カロテンを生成させる混合培養物中ではトリスポリック酸類の添加には効果がないから、何がそれらホルモンの形成を抑えて、トリスポリック酸類によるリコペンの生成を増加させるかは、前駆体（β−カロテン）が存在しないことである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、ムコーラレス菌類（ブラケスレア、コアネフォラまたはフィコマイセス）による、さらに具体的にはＢ．トリスポーラでの発酵法におけるカロテノイド類、特にリコペンの生成を増加させることを請求することである。本発明は、Ｂ．トリスポーラ菌を発酵培地中で培養し、そして一部精製されたトリスポリック酸類（またはβ因子）（PTA）を、またはある種の他の供給源、例えばβ−カロテンの生成用培地からの未精製のトリスポリック酸類（またはβ因子）（NPTA）でさえも添加することより成る。
【００１５】
リコペンの発酵に及ぼすトリスポリック酸類の効果は、前記ホルモンはリコペンの発酵においては形成され得ない化合物であるβ−カロテンから合成されるという事実に基づく。これらの条件下では、前記の菌は上記ホルモンの合成前駆体を持っておらず、従ってカロテン形成はその最大限度までは誘発されない。
【００１６】
発酵に用いられる生物であるムコーラレス菌類、さらに具体的にはＢ．トリスポーラの株、またはその（＋）株と（−）株との混合物、或いは、それに代わって、リコペンを蓄積することができるＢ．トリスポーラの突然変異株は、これらを単離することができる。上記菌の（＋）株と（−）株とのいろいろな混合物が本発明の発酵法で用いることができる。β−カロテンの生成菌であるＢ．トリスポーラの株を用いるときは、リコペンのレベルにおいてカロテン形成を阻害することができる化合物（例えば、前記の第三アミン、その他の化合物）が加えられる。リコペンからのカロテノイド類の生合成において阻害される突然変異株を使用するときは、第三アミンや関連化合物を加えることは必要ない。上記の２つのケースのいずれにおいても、一部精製トリスポリック酸類（PTA）または未精製トリスポリック酸類（NPTA）が、それらのある種の供給源から、例えばβ−カロテンの発酵から誘導される培地から、両ケースとも０．３５ｍｇ／ｍＬのおおよその濃度で加えられる。用語・NPTAはβ−カロテン培地に相当する。トリスポリック酸類のこれら培地中における濃度は、図１からインキュベーション日数の関数として計算することができる（４日目には３５０〜４００μｇ／ｍＬとなろう）。
【００１７】
ムコーラレス菌類からのカロテノイド類の、さらに具体的にはＢ．トリスポーラの選択された株または突然変異株によるリコペンの製造法は、１種またはそれ以上の炭素源、１種またはそれ以上の窒素源、無機塩類およびチアミンを含んでいるいかなる培地中でも行うことができる。炭素源は単純なまたは複雑な栄養源として加えることができ、それにはデキストリン、澱粉、グルコース、サッカロース、フルクトース、動物油または植物油のような炭水化物または脂肪がある。培地は、また、大豆粉、トウモロコシ粉、可溶性留出物、酵母抽出物、綿実粉、ペプトン、カゼイン、硫酸アンモニウム等々のような同化可能な窒素源、同有機源または同無機源も有していなければならない。培地に加えることができる無機塩類としては、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムが挙げられる。栄養源の割合は、微生物の増殖要件に基づいて、そして生成レベルに基づいて決められる。発酵は好気性条件において液内培養で行われるのが好ましい。発酵温度は２０〜３２℃の間で変えることができるが、２５〜２８℃の範囲が好ましい。
【００１８】
０．００１〜１０００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でのトリスポリック酸類の添加は、一部精製調製物またはそれらの任意の供給源から、例えば任意のケカビ菌のβ−カロテンの発酵に由来する培地から行うことができる。添加は発酵開始から７２〜１４４時間行われるのが好ましい。
【００１９】
リコペンは細胞破裂について記述されている任意の方法により抽出されるが、その細胞破裂は、任意の溶媒に溶解され、かつ内容物が可溶性であるそれら細胞内容物を放出するのを可能にするものである。リコペンの濃度は吸光度測定法による測定で求めることができるが、液体クロマトグラフィー（HPLC）が好ましい。これら方法のいずれに関しても参考文献に記載されている。
【００２０】
使用される株は次のとおりである：β−カロテンの生成株である突然変異株：ASA2（＋）およびASA25（−）。リコペンの生成株である突然変異株：SB34（−）。この最後に挙げた突然変異株も２５％のβ−カロテンを生成させる（表１を参照されたい）。突然変異株の選択は、トリスポリック酸類自体に因るカロテン生成の増加効果の観点とは無関係である。即ち、それら化合物に因る効果はいかなる他の類似突然変異株においても再現性がある。但し、そのリコペンの基礎生成率は、例えば、親株により生ずるように、より低いだろう。親株は寄託所に寄託されていて、生育可能でかつ公に入手できる。
【００２１】
実施例１
β−カロテンおよびリコペンの発酵中におけるトリスポリック酸類の濃度の測定
【００２２】
１リットル当たり大豆粉２３ｇ；トウモロコシ粉４７ｇ；リン酸一カリウム０．５ｇ；チアミン塩酸塩０．００２ｇを含んでいる接種用培地を調製する。その初期ｐＨは６．３である。この培地を５００ｍＬの三角フラスコ中に６７ｍＬまたは１００ｍＬの速度で分配する。滅菌後に、胞子懸濁物からのＢ．トリスポーラASA2（＋）株およびＢ．トリスポーラASA25（−）株を別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００２３】
突然変異株のＢ．トリスポーラ ASA2（＋）およびＢ．トリスポーラ ASA25（−）は、ロシア（Russia）のモスクワ（Moscow）に所在するコレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ（Collection of Industrial Microorganisms：VKM）に寄託されている野生株のＢ．トリスポーラ F208（−）およびF117（＋）からのNTGによる突然変異により得られる。この両株は公に入手できる。
【００２４】
１リットル当たり大豆粉４４ｇ；トウモロコシ粉１９ｇ；二塩基性ホスフェート０．５５ｇ；チアミン塩酸塩０．００２ｇ；植物油１０％を含んでいる塩基性発酵培地を調製する。その初期ｐＨは水酸化カリウムで７．５に調整されている。この培地を２５０ｍＬの三角フラスコ中に２０ｍＬの速度で分配する。
【００２５】
β−カロテンの発酵のために、塩基性培地が入っているフラスコにＢ．トリスポーラASA2（＋）株とＢ．トリスポーラASA25（−）株との混合培養物を１０％接種する。リコペンの発酵のために、上記塩基性培地に、生合成経路をリコペンのレベルにおいて遮断する目的で、化学試剤、例えば２ｍＬ／Ｌのピリジンを加える。この培地にＢ．トリスポーラASA2（＋）株とＢ．トリスポーラASA25（−）株との混合培養物を１０％接種する。全てのフラスコを２５℃において軌道攪拌器（orbital stirrer）中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。試料を発酵２日目から初めて２４時間毎に採取し、そしてトリスポリック酸類の濃度を、β−カロテンを生成させるフラスコ中およびリコペンを生成させるフラスコ中で測定する。
【００２６】
トリスポリック酸類の濃度は、試料をｐＨ２まで酸性化した後に１容量のクロロホルムで抽出することによって測定される。その有機部分を１容量の４％重炭酸ナトリウム溶液で抽出し、その水性相を集め、そして酸性化し、次いで再びクロロホルムで抽出する。次に、そのクロロホルムを蒸発させて乾固状態に至らしめ、そしてトリスポリック酸類より成る残分をエタノール、またはトリス（Tris）−硫酸塩緩衝液中に溶解させる。そのトリスポリック酸類を、吸光係数を７０mL×mg-1×cm-1と仮定して（サッター ＲＰ．、キャページ ＤＡ．、ハリソン ＴＬ．、キーン ＷＡ．、１９７３年、J. Bacteriology 、114：1074−1082）、吸光度測定法で３２５ｎｍにおいて定量的に測定する。
【００２７】
トリスポリック酸類の濃度はβ−カロテンおよびリコペンの発酵の過程で変わり、後者では前者よりも有意に低いことが見いだされた。最大の相違は４日目に見いだされ、この場合β−カロテンの発酵での濃度は３７８μｇ／ｍＬ、リコペンの発酵での濃度は４６μｇ／ｍＬであった（おおよそ８倍の違い）（図１）。
【００２８】
実施例２
リコペンを蓄積する形のβ−カロテンの生合成における一部阻害突然変異株の発酵に及ぼすトリスポリック酸類の添加効果
【００２９】
接種用培地を実施例１に記載されたように調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラSB34（−）株を胞子懸濁物から植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００３０】
突然変異株・Ｂ．トリスポーラSB34（−）は、ロシア、モスクワのコレクション・オブ・カルチャース ＶＫＭ（Collection of Cultures VKM）に寄託されている野生株・Ｂ．トリスポーラF921（−）から出発してNTGによる突然変異により得られ、公に入手できた。
【００３１】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、一連のフラスコに、リコペンを蓄積する形のβ−カロテンの生合成において一部阻害された突然変異株であることが特徴であるＢ．トリスポーラSB34（−）株を１０％接種する。全てのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００３２】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加のないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、実施例１で説明されたように精製されたトリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。
【００３３】
一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加により、乾燥重量１グラム当たり０．１１〜０．２４ｍｇのリコペンの増加が得られる（発酵６日目には対照に比較して２．１８倍の増加、図２）。
【００３４】
実施例３
生合成が化学試剤によりリコペンレベルにおいて阻害されているβ−カロテン生成性突然変異株によるリコペンの発酵に及ぼすトリスポリック酸類の添加効果
【００３５】
接種用培地を実施例１に記載された方法で調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株を胞子懸濁物から植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００３６】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、リコペンレベルにおいてカロテノイドの生合成を阻害する化学試剤、例えばイミダゾールを０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加える。この培地にもｐＨ７．５のホスフェート緩衝剤を２５ｍＭの最終濃度まで追加し、そしてＢ．トリスポーラASA25（−）株を１０％接種する。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００３７】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加を受けていないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。
【００３８】
一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加により、乾燥重量１グラム当たり０．１６〜１．０９ｍｇのリコペンの増加が得られる（発酵６日目には対照に比較して６．８倍の増加、図３）。
【００３９】
実施例４
Ｂ．トリスポーラASA2（＋）による混合培養での突然変異株・Ｂ．トリスポーラASA25（−）の発酵に及ぼす一部精製トリスポリック酸類（PTA）または未精製トリスポリック酸類（NPTA）の添加効果
【００４０】
接種用培地を実施例１に記載されたように調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株を胞子懸濁物から別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００４１】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、イミダゾールを０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、またｐＨ７．５のホスフェート緩衝剤を２５ｍＭの最終濃度まで加える。この培地にＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００４２】
未精製トリスポリック酸類（NPTA）源を得るために、実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、混合培養物に、それぞれβ−カロテンを生成させる株であるＢ．トリスポーラASA2（＋）株およびＢ．トリスポーラASA25（−）株を１０％植える。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００４３】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加を受けていないものである。一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。未精製トリスポリック酸類（NPTA）の添加を受けているフラスコ群は４日目まで対照と同じ条件にしておかれ、次いで２０μｍのナイロンフィルターによる濾過プロセスに供される。このナイロンフィルターは、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株の菌糸を、それら株がイミダゾールの存在下で増殖した培地から分離するのを可能にする。菌糸と培地との分離は２０μｍナイロンフィルターにより並行して行われるが、この２種の株・Ｂ．トリスポーラASA2（＋）およびＢ．トリスポーラASA25（−）をβ−カロテンの生成条件で含んでいるフラスコの場合、その培地はトリスポリック酸類の未精製源（NPTA）と見なされる。菌糸と培地との分離が終わったら、イミダゾールにより増殖せしめられたＢ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株の菌糸を、イミダゾールの非存在下で増殖せしめられた同じ株の培地と混合する。イミダゾールは、トリスポリック酸類の未精製源（NPTA）と見なされる培地に、０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度が得られるように加えられる。これらのフラスコを２５℃および２５０ｒｐｍでインキュベートする。
【００４４】
一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加により、乾燥重量１グラム当たり２９．１４〜４３．５８ｍｇのリコペンの増加が得られ（発酵６日目には対照に比較して５０％の増加、図４）、またβ−カロテンの培地を添加することにより乾燥重量１グラム当たり２９．１４〜４１．０７ｍｇのリコペンの増加が得られる（発酵６日目には対照に比較して４１％の増加、図４）。この実施例は、トリスポリック酸類の効果はそれらの精製の程度とは無関係であることを示している。
【００４５】
実施例５
Ｂ．トリスポーラASA2（＋）による混合培養での突然変異株・Ｂ．トリスポーラSB34（−）の発酵に及ぼすトリスポリック酸類の添加効果
【００４６】
接種用培地を実施例１に記載された方法で調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラSB34（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株を胞子懸濁物から別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００４７】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、その培地にＢ．トリスポーラSB34（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。これらのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００４８】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加を受けていないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。
【００４９】
トリスポリック酸類が富化されている調製物の添加は、突然変異株・SB34（−）の発酵が混合培養で行われるときは、リコペンの生成に有意の効果がない（図５）。
【００５０】
実施例６
Ｂ．トリスポーラSB34（−）株またはＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合発酵におけるカロテノイド類の割合の分析
【００５１】
接種用培地を実施例１に記載されたように調製する。滅菌後に、Ｂ．トリスポーラSB34（−）株、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株およびＢ．トリスポーラASA2（＋）株を胞子懸濁物から別々のフラスコに植え、そして２５℃で４８時間インキュベートする。
【００５２】
実施例１に記載されたものと同じタイプの発酵培地を調製する。滅菌後に、この培地を２つの群に分ける。一方のフラスコ群にＢ．トリスポーラSB34（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。他方のフラスコ群には、滅菌後に、イミダゾールを０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、またｐＨ７．５のホスフェート緩衝剤を２５ｍＭの最終濃度まで加える。この培地にＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合物を１０％接種する。全てのフラスコを２５℃において軌道攪拌器中で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。
【００５３】
対照フラスコはトリスポリック酸類の添加のないものである。トリスポリック酸類の添加を受けているフラスコ群は、トリスポリック酸類が富化されている調製物が３５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えられているときは、４日目まで対照と同じ条件にしておかれる。トリスポリック酸類は実施例１に記載された方法と同じ方法で精製されている。
【００５４】
液体クロマトグラフィー（HPLC）でカロテノイド類の割合を分析するために、それら培養物から発酵５日目および６日目に試料を採取する。得られた結果は表１に示される。
【００５５】
Ｂ．トリスポーラSB34（−）株またはＢ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合培養物を用いるリコペンの発酵で得られたカロテノイド類の割合の分析は、リコペンおよびβ−カロテンの割合に有意差があることを示している。これらの差異はトリスポリック酸の添加とは無関係である。Ｂ．トリスポーラSB34（−）による発酵で６日目に得られたカロテノイド類の混合物は６３％のリコペンを有するが、これに対してＢ．トリスポーラASA25（−）を用いて得られた混合物は８８％を有する（純度が２５％高い生成物を与える）。同じ混合物において、β−カロテンの割合はＢ．トリスポーラSB34（−）による発酵でトリスポーラASA25（−）による発酵におけるよりも１０倍大きい。
【００５７】
β−カロテンはトリスポリック酸類の前駆体であるので、これらのデータは次のように解釈することができるだろう：
【００５８】
１．β−カロテンの発酵とリコペンの発酵との間でトリスポリック酸類の濃度に相違がある（実施例１）。
【００５９】
２．トリスポリック酸類（精製済みまたは未精製）の添加は、トリスポーラASA25（−）をカロテノイド類の混合物がβ−カロテンをちょうど２％含んでいる（実施例４および６）マイナスの株として用いる場合、混合培養での発酵６日目にリコペンの収量に４０〜５０％の増加を与えるということ。
【００６０】
３．トリスポリック酸類の添加には、Ｂ．トリスポーラSB34（−）をカロテノイド類の混合物がβ−カロテンを２０％より多く含んでいる（実施例５および６）マイナスの株として用いる場合、混合培養に対して効果がないということ。
【００６１】
これらの結果は、混合培養物中でのリコペンの発酵に及ぼすトリスポリック酸類の効果がその生合成用前駆体の不存在に因ることを証明している。このことが理由となって、高純度のリコペンの工業的製造におけるその使用が極めて有利なのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 β−カロテンの発酵およびリコペンの発酵の過程におけるトリスポリック酸類の濃度。両発酵において、Ｂ．トリスポーラASA25（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合培養物が用いられている。リコペンの発酵（四角形）において、培地には、この場合はピリジンであるが、リコペンの蓄積を促進する化学試剤が添加されている。β−カロテンの発酵（菱形）は同じ条件であるが、ピリジンなしで行われている。横座標：日数での時間。縦座標：トリスポリック酸類の濃度（μｇ／ｍＬ）。
【図２】 リコペンレベルにおいてはβ−カロテンの合成が阻害される突然変異株Ｂ．トリスポーラSB34（−）による、トリスポリック酸類の添加ありまたは添加なしでのリコペンの生成。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で示される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。値は２つの独立試料の平均を示す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
【図３】 β−カロテンの過剰生成株である突然変異株・Ｂ．トリスポーラASA25（−）による、トリスポリック酸類の添加ありおよび添加なしでのリコペンの生成。発酵培地には、リコペンの蓄積を促進させるイミダゾールが追加されている。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で表される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。値は２つの独立試料の平均を表す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
【図４】 β−カロテンの過剰生成株である突然変異株・Ｂ．トリスポーラASA25（−）およびＢ．トリスポーラASA2（＋）の混合培養における、トリスポリック酸類の添加ありおよび添加なしでのリコペンの生成。発酵培地には、リコペンの蓄積を促進させるイミダゾールが追加されている。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で表される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。発酵４日目での未精製トリスポリック酸類の添加により得られたリコペンの収量は円形で表される。値は２つの独立試料の平均を表す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
【図５】 Ｂ．トリスポーラSB34（−）株とＢ．トリスポーラASA2（＋）株との混合培養における、トリスポリック酸類の添加ありおよび添加なしでのリコペンの生成。トリスポリック酸類の添加なしでの対照発酵において得られたリコペン収量の値は菱形で表される。リコペンの収量に及ぼす、発酵４日目での一部精製トリスポリック酸類（PTA）の添加効果は四角形で示される。値は２つの独立試料の平均を表す。誤差バーは平均からの標準偏差を表す。横座標：日数での時間。縦座標：リコペンｍｇ／乾燥重量ｇ。
Claims (7)
- β−カロテンを製造するための抑制条件におけるムコーラレス菌類培養物の（＋）株および（−）株の混合培養による発酵によりリコペンを製造する方法において、トリスポリック酸類を発酵中の任意の時点に加え、β−カロテンの生合成阻害剤を発酵の任意の時点に加え、そして生成したリコペンを回収することを特徴とする上記の方法。
- 発酵の際に用いられるムコーラレス菌がブラケスレア・トリスポーラであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
- 突然変異のためにβ−カロテンの生合成能が一部または完全に阻害されている、リコペンを蓄積するＢ．トリスポーラの突然変異株を含んでいる培養物を使用することを特徴とする請求項１および２のいずれかに記載の方法。
- トリスポリック酸類の添加が、それらの達成される濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬと１０００ｍｇ／ｍＬとの間で変わるそのような方法で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 培養物に対するトリスポリック酸類の添加が発酵の開始から７２〜１４４時間行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 添加されるトリスポリック酸類が部分的に精製されていることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- トリスポリック酸類が、β−カロテンの発酵から回収された培地から精製することなく加えられることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
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