JP3899360B2 - DNA amplification equipment - Google Patents

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Description

この発明は、ＤＮＡの増幅反応を行なって微量のＤＮＡを増幅するための装置に関する。   The present invention relates to an apparatus for performing a DNA amplification reaction to amplify a small amount of DNA.

近年、微量のＤＮＡを増幅する手段として、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する）が盛んに用いられている。この方法は、例えば特許文献１（特開平 6-292579 号公報）に開示されるように、まず、目的とする核酸を含有する検体に、目的とするＤＮＡの各々の鎖の両端部の塩基配列を含む２種類のプライマー、耐熱性ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を加える。次に、系の温度を制御することのみにより、ＤＮＡを解離させる（変性）工程、解離により生成した一本鎖ＤＮＡとプライマーとを結合させる（アニーリング）工程、およびプライマーが結合した一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ合成酵素により相補鎖を合成する（伸長）工程の各工程を行ない、これを１回以上繰り返す。   In recent years, the polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) has been actively used as a means for amplifying a small amount of DNA. In this method, as disclosed in, for example, Patent Document 1 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-292579), first, base sequences at both ends of each strand of the target DNA are prepared on a sample containing the target nucleic acid. Are added, two heat-resistant DNA synthases and four deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP and dTTP). Next, the step of dissociating the DNA (denaturation) only by controlling the temperature of the system, the step of binding the single-stranded DNA generated by the dissociation with the primer (annealing), and the single-stranded DNA to which the primer is bound Each step of the step of synthesizing a complementary strand with a DNA synthase (extension) is performed using as a template, and this is repeated one or more times.

このようにＰＣＲは微量のＤＮＡを効率よく増幅することが可能であるが、このＰＣＲに加えて、さらに前処理および後処理を含めて自動化しようとする試みがなされている。例えば、特許文献２（特開平 6-327476 号公報）に開示される装置では、まず、全血を遠心分離し、フェノールおよびクロロホルム溶液で抽出することにより全血中の核酸成分を精製する（前処理段階）。次いで、精製した核酸成分をバッファーに溶解し、上述の２種類のプライマー、耐熱性ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボムクレオシド三リン酸を加え、熱サイクルを実施することにより目的の核酸を増幅する（ＰＣＲ段階）。最後に、増幅した核酸が含まれる反応溶液をゲル電気泳動で処理し、プライマー等の不純物や副生物等を除去して目的の核酸を得る（後処理段階）。   As described above, PCR can efficiently amplify a small amount of DNA, but in addition to this PCR, an attempt has been made to automate further including pretreatment and posttreatment. For example, in the device disclosed in Patent Document 2 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-327476), first, whole blood is centrifuged and extracted with a phenol and chloroform solution to purify nucleic acid components in the whole blood (previous). Processing stage). Next, the purified nucleic acid component is dissolved in a buffer, the above-mentioned two kinds of primers, heat-resistant DNA synthase and four kinds of deoxyribonucleoside triphosphates are added, and the target nucleic acid is amplified by carrying out thermal cycling. (PCR stage). Finally, the reaction solution containing the amplified nucleic acid is treated by gel electrophoresis, and impurities such as primers and by-products are removed to obtain the target nucleic acid (post-treatment stage).

また、ＰＣＲを行なうための反応容器自体についてもいくつかの試みがなされている。例えば、特許文献３（特開平 7-75544号公報）に開示される装置は、２つの恒温槽を経由する毛管を設け、検体を含む混合液を単にこの毛管内に流すことにより、ＤＮＡ合成反応に必要な熱サイクルを実現している。この方法では、増幅反応を毛管内で行なうため、液流の外側と内側との温度勾配が小さくなり、系内の温度をより迅速に均一化することができるという利点がある。
特開平 6-292579 号公報 特開平 6-327476 号公報 特開平 7-75544号公報 In addition, some attempts have been made on the reaction vessel itself for performing PCR. For example, the apparatus disclosed in Patent Document 3 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-75544) provides a capillary through two thermostats, and simply allows a mixed solution containing a specimen to flow through the capillary, thereby synthesizing the DNA. The thermal cycle necessary for the is realized. In this method, since the amplification reaction is carried out in the capillary, the temperature gradient between the outside and inside of the liquid flow is reduced, and there is an advantage that the temperature in the system can be equalized more quickly.
JP-A-6-292579 JP-A-6-327476 Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-75544

上記従来のＤＮＡ増幅装置においては、反応容器を恒温槽や金属ブロックで取り巻き、この反応容器自体を加熱および冷却することによりＤＮＡ増幅反応に必要な熱サイクルを施している。したがって、これらの装置では反応溶液の温度を直接制御するのではなく、反応容器を介して間接的に制御している。加えて、これらの装置では、反応溶液が微量であることもあって反応溶液の温度を直接測定することはできない。このため、従来のＤＮＡ増幅装置は、反応溶液の温度を精密に制御することができず、信頼性に欠ける。特開平 7-75544号公報に開示される装置では、毛管内で反応を行なうことにより、反応溶液中で温度勾配が形成されることを防いでいる。しかしながら、この装置でも反応溶液の温度を直接測定することはできず、やはり温度制御が不正確になる。   In the conventional DNA amplification apparatus, the reaction vessel is surrounded by a thermostatic bath or a metal block, and the reaction vessel itself is heated and cooled to perform a thermal cycle necessary for the DNA amplification reaction. Therefore, in these apparatuses, the temperature of the reaction solution is not directly controlled but indirectly controlled via the reaction vessel. In addition, in these apparatuses, the temperature of the reaction solution cannot be directly measured because the reaction solution is very small. For this reason, the conventional DNA amplifying apparatus cannot precisely control the temperature of the reaction solution and lacks reliability. In the apparatus disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 7-75544, a temperature gradient is prevented from being formed in the reaction solution by performing the reaction in the capillary. However, this apparatus cannot directly measure the temperature of the reaction solution, and the temperature control is still inaccurate.

また、上記特開平 6-327476 号公報に開示される装置は、前処理および後処理を含めて全ての工程を自動的に行なう全自動化を実現してはいるが、反応容器の移動や分注操作等は全て機械的に行なっている。このため、装置が大型化し、コストが非常に高くなる。同様に、特開平 7-75544号公報に開示される装置でも反応溶液を循環させるために機械式ポンプを用いており、このため装置が大型化し、コストが高くなる欠点を有する。   In addition, the apparatus disclosed in the above-mentioned Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-327476 realizes full automation that automatically performs all processes including pre-processing and post-processing. All operations are performed mechanically. For this reason, an apparatus becomes large-sized and cost becomes very high. Similarly, the apparatus disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-75544 uses a mechanical pump to circulate the reaction solution. Therefore, the apparatus is disadvantageous in that the apparatus is increased in size and cost.

したがって、この発明は、反応溶液の温度を精密に制御し、ＤＮＡ増幅反応を効率よく行なうことが可能なＤＮＡ増幅装置を提供することを目的とする。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a DNA amplification apparatus capable of precisely controlling the temperature of a reaction solution and efficiently performing a DNA amplification reaction.

また、この発明は、機械的な作動部分を減少し、それにより装置全体を小型化し、かつコストを低くすることが可能なＤＮＡ増幅装置を提供することを目的とする。   Another object of the present invention is to provide a DNA amplifying device capable of reducing mechanical working parts, thereby reducing the size of the entire device and reducing the cost.

この発明によると、無機もしくは有機基板上に形成されたプレーナ状の反応セルと、この反応セルに連通する２つの流路と、この流路の各々に前記反応セルを挟んで設けられた２つ弁と、少なくとも前記反応セルの底面もしくは前記基板の反応セルが形成された面の裏面のいずれか一方に設けられた加熱手段とを具備する第１のＤＮＡ増幅装置が提供される。   According to the present invention, a planar reaction cell formed on an inorganic or organic substrate, two flow channels communicating with the reaction cell, and two channels sandwiching the reaction cell in each of the flow channels There is provided a first DNA amplification device comprising a valve and heating means provided on at least one of the bottom surface of the reaction cell and the back surface of the surface of the substrate on which the reaction cell is formed.

また、この発明の別の面によると、無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する２つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、ＤＮＡ増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、ＤＮＡ増幅に必要なプライマー、ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸と残留する成分とに分離する反応溶液分離部を具備し、該反応溶液分離部が、ゲル状化合物が充填された流路からなることを特徴とするＤＮＡ増幅装置が提供される。
According to another aspect of the present invention, a reaction portion formed on an inorganic or organic substrate, two flow paths communicating with the reaction portion, and at least a bottom surface of the reaction portion or a reaction portion of the substrate are formed. A sample provided on either one of the rear surfaces of the coated surface and capable of controlling the temperature required for DNA amplification; a sample communicating with the flow channel and separating nucleic acid from a sample prior to nucleic acid separation such as whole blood or serum; A separation unit, means for forming a reaction solution containing the separated nucleic acid, a primer necessary for DNA amplification, a DNA synthase, and four types of deoxyribotriphosphates in the reaction cell, the separation unit and the reaction unit A waste part for discarding components other than the nucleic acid separated in the separation part, and a reaction solution amplified in the reaction part and amplified in the reaction part. Nucleic acids and residues That is separated into a component comprising a reaction solution separation part, the reaction solution separation part, DNA amplification device gel compound is characterized in that it consists of a flow path that is filled is provided.

また、この発明のさらに別の面によると、無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する２つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、ＤＮＡ増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、ＤＮＡ増幅に必要なプライマー、ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸と残留する成分とに分離する反応溶液分離部を具備し、該反応溶液分離部が、150μｍ以下の流路径を有する流路からなることを特徴とするＤＮＡ増幅装置が提供される。 According to still another aspect of the present invention, there are a reaction part formed on an inorganic or organic substrate, two flow paths communicating with the reaction part, and at least a bottom surface of the reaction part or a reaction part of the substrate. A heating means provided on either one of the back surfaces of the formed surface, which can be controlled to a temperature necessary for DNA amplification, communicates with the flow path, and separates nucleic acid from a sample prior to nucleic acid separation such as whole blood or serum. A sample separation unit, means for forming a reaction solution containing the separated nucleic acid, a primer necessary for DNA amplification, a DNA synthase and four types of deoxyribotriphosphates in the reaction cell, the separation unit and the reaction unit A waste part for discarding components other than the nucleic acid separated in the separation part, and a reaction solution amplified in the reaction part for the purpose of amplifying the reaction solution Nucleic acids Comprising a reaction solution separation part for separating a component remaining, the reaction solution separation part, DNA amplification device is provided which is characterized in that it consists flow path having the flow path diameter 150 [mu] m.

本発明によれば、反応セルをプレーナ状とすることにより反応溶液をより迅速に加熱および冷却することが可能であり、ＤＮＡ増幅反応に必要な熱サイクルで問題となる、反応溶液中に生じる温度勾配を小さくすることができる。   According to the present invention, the reaction cell can be heated and cooled more quickly by making the reaction cell planar, and the temperature generated in the reaction solution becomes a problem in the thermal cycle necessary for the DNA amplification reaction. The gradient can be reduced.

以下、この発明によるＤＮＡ増幅装置を図面を参照して説明する。   Hereinafter, a DNA amplification apparatus according to the present invention will be described with reference to the drawings.

この発明による第１のＤＮＡ増幅装置の一具体例の平面図を図１に、また図１に示すＤＮＡ増幅装置のＡ−Ａ線断面図を図２にそれぞれ模式的に示す。この装置では、無機もしくは有機基板 101の上面に反応セル 102並びに流路 103および 104が形成され、さらにその上面に透明基板 105が接合されている。また、流路 103には弁 105が、流路 104には弁 106がそれぞれ設けられ、さらに基板 101の反応セル 102が形成された面の裏面に接して発熱体 108が設けられている。無機もしくは有機基板 101としては、例えば、シリコンウェハ基板、ガラス基板、アルミ、ステンレススティール等の無機基板、およびフッ素樹脂、エポキシ、ポリカーボネート等の有機基板が用いられる。反応セル 102並びに流路 103および 104は基板 101の材質に応じて様々な方法で形成することができ、例えば、基板 101としてシリコンウェハ基板を用いる場合には、シリコンウェハ上にプラズマエッチング等によって所定の形状の溝を形成した後、ガラス基板等の透明基板を陽極接合すればよい。反応セル 102はプレーナ状に形成されている。この反応セルは、その大きさを含めて、必要とする容量に応じて種々の形状が選択可能である。例えば、容量を 3μｌとする場合には、縦長 5ｍｍ、横長 3ｍｍおよび深さ 200μｍとすればよいが、反応溶液の温度をより精密に制御するためには深さは浅いほうが好ましい。発熱体 108も、ＤＮＡ増幅反応に必要な熱サイクルを遂行し得るものであれば特に限定されるものではなく、例えば、電熱ヒータ、ペルチエ素子、赤外線ランプ等を挙げることができる。   A plan view of a specific example of the first DNA amplification device according to the present invention is schematically shown in FIG. 1, and a cross-sectional view taken along line AA of the DNA amplification device shown in FIG. 1 is schematically shown in FIG. In this apparatus, a reaction cell 102 and flow paths 103 and 104 are formed on the upper surface of an inorganic or organic substrate 101, and a transparent substrate 105 is bonded to the upper surface thereof. Further, a valve 105 is provided in the flow path 103, a valve 106 is provided in the flow path 104, and a heating element 108 is provided in contact with the back surface of the surface of the substrate 101 where the reaction cell 102 is formed. As the inorganic or organic substrate 101, for example, an inorganic substrate such as a silicon wafer substrate, a glass substrate, aluminum, or stainless steel, and an organic substrate such as fluororesin, epoxy, or polycarbonate are used. The reaction cell 102 and the flow paths 103 and 104 can be formed by various methods depending on the material of the substrate 101. For example, when a silicon wafer substrate is used as the substrate 101, the reaction cell 102 and the flow paths 103 and 104 are predetermined on the silicon wafer by plasma etching or the like. After forming the groove of the shape, a transparent substrate such as a glass substrate may be anodically bonded. The reaction cell 102 is formed in a planar shape. Various shapes can be selected for this reaction cell, including its size, depending on the required capacity. For example, when the volume is 3 μl, the length may be 5 mm, the width is 3 mm, and the depth is 200 μm. However, in order to control the temperature of the reaction solution more precisely, the depth is preferably shallow. The heating element 108 is not particularly limited as long as it can perform the thermal cycle necessary for the DNA amplification reaction, and examples thereof include an electric heater, a Peltier element, and an infrared lamp.

次に、この装置を用いたＤＮＡ増幅の手順について説明する。まず、弁 106および 107を開放し、図示しない送出手段により、目的の核酸、２種類以上のプライマー、耐熱性ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を含有するバッファーを反応セル 102に導入した後、弁 106および 107を閉鎖する。次に、発熱体 108を作働させて反応セル 102中のバッファーに熱サイクルを加えて目的の核酸を増幅させる。具体的には、まず発熱体 108を発熱させてバッファー中の核酸が解離する温度（90〜94℃）にバッファーを加熱し、この温度を所定時間維持する。次に、発熱体 108の動作を停止させ、解離した核酸とプライマーとが結合する温度（約37℃）までバッファーを冷却する。解離した核酸とプライマーとが結合した後、再び発熱体 108を作働させ、耐熱性ＤＮＡ合成酵素の活性が最も高まる温度（50〜75℃）までバッファーを加熱して所定の時間維持する。これにより、プライマーが伸長し、核酸が増幅される。プライマーの伸長が終了した後、再度発熱体 108を作働させて核酸が解離する温度までバッファーを加熱し、生成した二本鎖核酸を解離させる。以下、このサイクルを所望の回数繰り返せばよい。核酸の増幅反応が終了した後、再び弁 106および 107を開放し、増幅した核酸を流路 104を介して反応セル 102から回収する。この際、続けて増幅反応を行なう場合には、回収と同時に新たなバッファーを流路 103を介して反応セル 102内に導入し、同様の熱サイクルを開始する。   Next, a procedure for DNA amplification using this apparatus will be described. First, the valves 106 and 107 are opened, and the target nucleic acid, two or more primers, a heat-resistant DNA synthase, and four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) are delivered by a delivery means (not shown). After introducing the containing buffer into reaction cell 102, valves 106 and 107 are closed. Next, the heating element 108 is operated to apply a heat cycle to the buffer in the reaction cell 102 to amplify the target nucleic acid. Specifically, the heating element 108 is first heated to heat the buffer to a temperature at which the nucleic acid in the buffer dissociates (90 to 94 ° C.), and this temperature is maintained for a predetermined time. Next, the operation of the heating element 108 is stopped, and the buffer is cooled to a temperature at which the dissociated nucleic acid and the primer are bound (about 37 ° C.). After the dissociated nucleic acid and the primer are bound, the heating element 108 is activated again, and the buffer is heated to a temperature (50 to 75 ° C.) at which the activity of the thermostable DNA synthase is maximized and maintained for a predetermined time. Thereby, the primer is extended and the nucleic acid is amplified. After the primer extension is completed, the heating element 108 is operated again to heat the buffer to a temperature at which the nucleic acid is dissociated, thereby dissociating the generated double-stranded nucleic acid. Thereafter, this cycle may be repeated a desired number of times. After the nucleic acid amplification reaction is completed, the valves 106 and 107 are opened again, and the amplified nucleic acid is recovered from the reaction cell 102 via the flow path 104. At this time, when the amplification reaction is continuously performed, a new buffer is introduced into the reaction cell 102 through the flow path 103 simultaneously with the recovery, and a similar thermal cycle is started.

この装置では、上述のように反応セル 102の形状がプレーナー状である。したがって、発熱体 108から生じた熱を反応セル中のバッファーに効率よく伝えることができ、加熱および冷却の効率を上げることが可能となる。   In this apparatus, as described above, the reaction cell 102 has a planar shape. Therefore, the heat generated from the heating element 108 can be efficiently transmitted to the buffer in the reaction cell, and the heating and cooling efficiency can be increased.

図１および図２に示す装置においては、発熱体 108は基板 101の裏面にのみ設けられているが、基板 101の裏面と基板 101の上面、すなわち反応セル 102の底面の両方に設けることもできる。この場合には、反応セル 102内のバッファーの昇降温速度を高め、それによりバッファー中の温度勾配を小さくして、ＤＮＡ増幅反応の精度を高めることができる。さらに、上記説明においては、発熱体 108の動作を停止させ、自然に放熱させることによりバッファーの冷却を行なっているが、発熱体 108としてペルチエ素子のような加熱および冷却の両動作が可能なものを用いることにより、冷却時間の短縮と、より精密な温度制御を達成することができる。   In the apparatus shown in FIGS. 1 and 2, the heating element 108 is provided only on the back surface of the substrate 101, but it can also be provided on both the back surface of the substrate 101 and the top surface of the substrate 101, that is, the bottom surface of the reaction cell 102. . In this case, the temperature increase / decrease rate of the buffer in the reaction cell 102 can be increased, thereby reducing the temperature gradient in the buffer and increasing the accuracy of the DNA amplification reaction. Furthermore, in the above description, the operation of the heating element 108 is stopped and the buffer is cooled by naturally dissipating heat. However, the heating element 108 can perform both heating and cooling operations like a Peltier element. By using, the cooling time can be shortened and more precise temperature control can be achieved.

また、この発明による第１のＤＮＡ増幅装置においては、図３および４に示すように、反応セル 102の底面に１つもしくはそれ以上の温度検出手段 301および 302を設けることができる。ここで、図３はこの発明による第１のＤＮＡ増幅装置の別の具体例を模式的に示す平面図であり、図４は図３に示される装置のＢ−Ｂ線に沿った断面を模式的に示す図である。なお、図３および４において、図１および２と同じ部材には同一の符号が付されており、以下の図面においても同一の符号は同一の部材を表わすことを原則とする。温度検出手段 301および 302としては、例えば、熱電対、ダイオード等を用いることができる。   In the first DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 3 and 4, one or more temperature detecting means 301 and 302 can be provided on the bottom surface of the reaction cell 102. Here, FIG. 3 is a plan view schematically showing another specific example of the first DNA amplification device according to the present invention, and FIG. 4 is a schematic cross section taken along line BB of the device shown in FIG. FIG. 3 and 4, the same members as those in FIGS. 1 and 2 are denoted by the same reference numerals, and in principle, the same reference numerals represent the same members in the following drawings. As the temperature detection means 301 and 302, for example, a thermocouple, a diode, or the like can be used.

このように反応セル 102の底面に温度検出手段 301および 302を設けることにより、反応セル中の反応溶液の温度を直接測定することが可能となり、ＤＮＡ増幅反応に必要な熱サイクル時の温度をより精密に制御することができる。この精密な温度制御は、特に、上記熱サイクルにおける核酸の解離工程において重要な意味を持つ。すなわち、上述のように核酸を解離させる工程においては反応セル 102中の反応溶液を高温（90〜94℃）に加熱する。このような高温では、たとえ耐熱性酵素であっても徐々に活性が失われ、94℃を越える温度では酵素が変性して活性が完全に失われてしまうため、過加熱には十分注意する必要がある。図３および４に示す装置では、温度検出手段 301および 302によって反応溶液の温度を直接測定することができるので、この測定結果を発熱体 108にフィードバックすることにより、核酸解離の効率を落とすことなく過加熱を防ぐことが可能となる。   Thus, by providing the temperature detecting means 301 and 302 on the bottom surface of the reaction cell 102, it becomes possible to directly measure the temperature of the reaction solution in the reaction cell, and the temperature during the thermal cycle necessary for the DNA amplification reaction can be further increased. It can be controlled precisely. This precise temperature control is particularly important in the nucleic acid dissociation process in the thermal cycle. That is, in the step of dissociating nucleic acids as described above, the reaction solution in the reaction cell 102 is heated to a high temperature (90 to 94 ° C.). At such high temperatures, even heat-resistant enzymes gradually lose their activity, and at temperatures above 94 ° C, the enzyme is denatured and its activity is completely lost. There is. In the apparatus shown in FIGS. 3 and 4, since the temperature of the reaction solution can be directly measured by the temperature detection means 301 and 302, the measurement result is fed back to the heating element 108 without reducing the efficiency of nucleic acid dissociation. It is possible to prevent overheating.

さらに、この発明による第１のＤＮＡ増幅装置においては、図５および図６に示すように、反応セル 102の底面に１つもしくはそれ以上の突起 501を設けることができる。ここで、図５はこの発明による第１のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図６は図５に示される装置のＣ−Ｃ線に沿った断面を模式的に示す図である。この突起 501は、プレーナー状の反応セル 102を形成する際に同時にその形状を形成してもよく、あるいはプレーナー状の反応セル 102を形成した後に予め作製した突起を接合してもよいが、基板 101と同一の材質であることが好ましい。   Furthermore, in the first DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 5 and 6, one or more protrusions 501 can be provided on the bottom surface of the reaction cell 102. Here, FIG. 5 is a plan view schematically showing still another specific example of the first DNA amplification device according to the present invention, and FIG. 6 is a sectional view taken along the line CC of the device shown in FIG. It is a figure shown typically. The protrusion 501 may be formed at the same time when the planar reaction cell 102 is formed, or a protrusion prepared in advance after the formation of the planar reaction cell 102 may be bonded to the substrate. The same material as 101 is preferable.

このように反応セル 102の底面に１つ以上の突起 501を設けることにより、反応セルの底面の表面積を増大させることができ、基板 101の裏面に設けられた発熱体 108から生じた熱を反応セル 102内の反応溶液に効率よく伝えることが可能となる。また、発熱体 108が前述のような加熱および冷却の両動作が可能なものである場合には、反応溶液の冷却もより迅速に行なうことが可能となる。したがって、図５および６に示される装置は、反応セル 102中の反応溶液の昇降温速度をより高めることができ、かつ反応溶液の温度勾配を小さくすることが可能である。このため、この装置を用いることにより、ＤＮＡ増幅反応に要する時間を短縮し、熱サイクルの温度をより精密に制御することが可能となる。   By providing one or more protrusions 501 on the bottom surface of the reaction cell 102 in this way, the surface area of the bottom surface of the reaction cell can be increased, and heat generated from the heating element 108 provided on the back surface of the substrate 101 can be reacted. This enables efficient transmission to the reaction solution in the cell 102. Further, when the heating element 108 can perform both the heating and cooling operations as described above, the reaction solution can be cooled more rapidly. Therefore, the apparatus shown in FIGS. 5 and 6 can further increase the rate of temperature rise and fall of the reaction solution in the reaction cell 102, and can reduce the temperature gradient of the reaction solution. For this reason, by using this apparatus, the time required for the DNA amplification reaction can be shortened, and the temperature of the thermal cycle can be controlled more precisely.

同様の効果は、図７および８に示すように、反応セル 102の代わりに底面の断面形状が鋸刃状もしくは波状である反応セル 701を用いることによっても達成することができる。ここで、図７はこの発明による第１のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図８は図７に示される装置のＤ−Ｄ線に沿った断面を模式的に示す図である。図７および８に示す装置においても、反応セル底面の表面積が増大し、基板 101の裏面に設けられた発熱体 108が発生する熱を、反応セル 701内の反応溶液に効率よく伝えることができる。したがって、図５および６に示される装置と同様に、ＤＮＡ増幅反応に要する時間を短縮し、熱サイクルの温度をより精密に制御することが可能となる。反応セル 701の断面形状が鋸刃状もしくは波状の底面は、図５および６に示される装置と同様に、反応セル 701を形成する際に同時にその形状を形成してもよく、あるいはまずプレーナー状の反応セルを形成した後に断面形状を鋸刃状もしくは波状に加工してもよいが、基板 101と同一の材質であることが好ましい。   Similar effects can also be achieved by using a reaction cell 701 having a sawtooth or wavy cross-sectional shape in place of the reaction cell 102 instead of the reaction cell 102 as shown in FIGS. FIG. 7 is a plan view schematically showing still another specific example of the first DNA amplifying device according to the present invention. FIG. 8 is a sectional view taken along the line DD of the device shown in FIG. It is a figure shown typically. 7 and 8, the surface area of the bottom surface of the reaction cell is increased, and the heat generated by the heating element 108 provided on the back surface of the substrate 101 can be efficiently transferred to the reaction solution in the reaction cell 701. . Therefore, similarly to the apparatus shown in FIGS. 5 and 6, the time required for the DNA amplification reaction can be shortened, and the temperature of the thermal cycle can be controlled more precisely. The bottom surface of the reaction cell 701 having a sawtooth or wavy cross section may be formed simultaneously with the formation of the reaction cell 701, as in the apparatus shown in FIGS. After the reaction cell is formed, the cross-sectional shape may be processed into a sawtooth shape or a wave shape, but the same material as the substrate 101 is preferable.

さらにまた、この発明による第１のＤＮＡ増幅装置においては、図９および図10に示すように、反応セル 102の底面に１つもしくはそれ以上の突起 901を反応溶液の流れ方向に対して斜めに配置することもできる。ここで、図９はこの発明による第１のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図10は図９に示される装置のＥ−Ｅ線に沿った断面を模式的に示す図である。この突起 901は、図５および６に示される装置と同様に、プレーナー状の反応セル 102を形成する際に同時にその形状を形成してもよく、あるいはプレーナー状の反応セル 102を形成した後に予め作製した突起を接合してもよいが、基板 101と同一の材質であることが好ましい。   Furthermore, in the first DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 9 and 10, one or more protrusions 901 are formed obliquely with respect to the flow direction of the reaction solution on the bottom surface of the reaction cell 102. It can also be arranged. Here, FIG. 9 is a plan view schematically showing still another specific example of the first DNA amplification device according to the present invention, and FIG. 10 is a sectional view taken along line EE of the device shown in FIG. It is a figure shown typically. 5 and 6, the protrusion 901 may be formed at the same time when the planar reaction cell 102 is formed, or previously formed after the planar reaction cell 102 is formed. The produced protrusions may be joined, but the same material as the substrate 101 is preferable.

前述のように、ＤＮＡ増幅反応は、核酸の解離、解離した核酸とプライマーとの結合および耐熱性ＤＮＡ合成酵素によるプライマーの伸長の３段階で進行する。このうち、解離した核酸とプライマーとの結合は、解離した核酸同志が再び結合する反応と競合することになる。一方、繰り返し行なわれる増幅反応によって、系内には核酸が徐々に増加し、プライマーは次第に減少してゆく。このため、増幅を繰り返すうちに解離した核酸がプライマーと結合せずに核酸同志で結合することが多くなり、増幅反応の効率が減少する。したがって、効率の減少を最小限に抑えるために、増幅反応を開始する際には、すなわち反応溶液が反応セル 102内に導入される際には、反応溶液中で核酸とプライマーとを可能な限り均一に分散させておくことが好ましい。図９および図10に示される装置おける反応溶液の流れ方向に対して斜めに配置された突起 901は、この反応溶液中の核酸とプライマーとをより均一に分散させる機能を果たす。すなわち、流路 103から反応セル 102に流入してきた反応溶液は、突起 901による抵抗を受けて乱流を生じ、それにより反応溶液が十分に撹拌される。したがって、図９および図10に示される装置を用いることにより、解離した核酸とプライマーとの結合反応を、ひいてはＤＮＡ増幅反応を、効率よく行なうことが可能であり、反応の精度を向上させることもできる。また、弁107 を開放して反応セル102 から反応溶液を流出させる際にもやはり突起109 によって反応溶液が撹拌され、次の精製、分析工程をむらのない状態で行なうことができる。   As described above, the DNA amplification reaction proceeds in three stages: nucleic acid dissociation, dissociation of the dissociated nucleic acid and primer, and primer extension by a thermostable DNA synthase. Among these, the bond between the dissociated nucleic acid and the primer competes with the reaction in which the dissociated nucleic acids bind again. On the other hand, due to the repeated amplification reaction, the nucleic acid gradually increases in the system and the primer gradually decreases. For this reason, the nucleic acid dissociated during repeated amplification often binds with each other without binding to the primer, and the efficiency of the amplification reaction decreases. Therefore, in order to minimize the decrease in efficiency, when starting the amplification reaction, that is, when the reaction solution is introduced into the reaction cell 102, the nucleic acid and the primer are mixed as much as possible in the reaction solution. It is preferable to disperse uniformly. Protrusions 901 arranged obliquely with respect to the flow direction of the reaction solution in the apparatus shown in FIGS. 9 and 10 function to more uniformly disperse the nucleic acids and primers in the reaction solution. That is, the reaction solution flowing into the reaction cell 102 from the flow path 103 is subjected to resistance by the protrusions 901 to generate turbulent flow, and thereby the reaction solution is sufficiently stirred. Therefore, by using the apparatus shown in FIG. 9 and FIG. 10, it is possible to efficiently perform the binding reaction between the dissociated nucleic acid and the primer, and thus the DNA amplification reaction, and to improve the accuracy of the reaction. it can. Also, when the valve 107 is opened and the reaction solution is allowed to flow out of the reaction cell 102, the reaction solution is also stirred by the protrusion 109, and the next purification and analysis steps can be performed without any unevenness.

もちろん、突起 901は反応セル 102の底面の表面積を増大させることにも貢献する。したがって、図９および10に示される装置は、図５ないし図８に示される装置と同様に、ＤＮＡ増幅反応に要する時間を短縮し、熱サイクルの温度をより精密に制御することも可能となる。   Of course, the protrusion 901 also contributes to increasing the surface area of the bottom surface of the reaction cell 102. Therefore, the apparatus shown in FIGS. 9 and 10 can shorten the time required for the DNA amplification reaction and can control the temperature of the thermal cycle more precisely, like the apparatuses shown in FIGS. .

次に、この発明による第２のＤＮＡ増幅装置の一具体例の平面図を図11に、また図11に示されるＤＮＡ増幅装置のＦ−Ｆ線断面図を図12にそれぞれ模式的に示す。この装置では、無機もしくは有機基板1101上に、２つの弁1104および1105が設けられた流路1102が形成され、その上面に透明基板1103が接合されている。弁1104と1105との間には、基板1101の裏面に接して３つの発熱体1106、1107および1108が設けられており、それぞれ発熱体の温度を個別に制御する発熱体制御装置1109、1110および1111に接続されている。また、これらの発熱体1106、1107および1108に対応して流路1102の底面には、それぞれ、反応溶液の温度を検出するための温度検出手段1112、1113および1114が設けられている。さらに、弁1104と発熱体1106の間に位置する流路1102の底面および弁1105と発熱体1108の間に位置する流路1102の底面には、それぞれ電極1115および1116が設けられ、いずれも、電極に電圧を印加することが可能であり、かつ印加した電圧を反転することが可能な電圧制御装置1117に接続されている。無機もしくは有機基板1101の材質、流路1102の形成方法、透明基板1103の材質、利用可能な発熱体、および利用可能な温度検出手段は全て、上記この発明による第１のＤＮＡ増幅装置に用いられるものと同様である。   Next, a plan view of a specific example of the second DNA amplifying apparatus according to the present invention is schematically shown in FIG. 11, and a cross-sectional view taken along line FF of the DNA amplifying apparatus shown in FIG. 11 is schematically shown in FIG. In this apparatus, a channel 1102 provided with two valves 1104 and 1105 is formed on an inorganic or organic substrate 1101, and a transparent substrate 1103 is bonded to the upper surface thereof. Three heating elements 1106, 1107, and 1108 are provided between the valves 1104 and 1105 in contact with the back surface of the substrate 1101, and heating element control devices 1109, 1110, which individually control the temperatures of the heating elements, respectively. Connected to 1111. Corresponding to these heating elements 1106, 1107 and 1108, temperature detection means 1112, 1113 and 1114 for detecting the temperature of the reaction solution are provided on the bottom surface of the flow path 1102, respectively. Furthermore, electrodes 1115 and 1116 are provided on the bottom surface of the channel 1102 positioned between the valve 1104 and the heating element 1106 and on the bottom surface of the channel 1102 positioned between the valve 1105 and the heating element 1108, respectively. It is connected to a voltage control device 1117 that can apply a voltage to the electrode and can reverse the applied voltage. The material of the inorganic or organic substrate 1101, the method of forming the flow path 1102, the material of the transparent substrate 1103, the usable heating element, and the usable temperature detecting means are all used in the first DNA amplification device according to the present invention. It is the same as that.

この第２のＤＮＡ増幅装置を用いたＤＮＡ増幅反応の手順は以下の通りである。まず、弁1104および1105を開放し、目的の核酸、２種類以上のプライマー、耐熱性ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を含有するバッファーを流路1102に導入した後、弁1104および1105を閉鎖する。次に、発熱体制御装置1109、1110および1111の制御の下で、それぞれ発熱体1106、1107および1108を作動させ、各々の発熱体に対応する位置の流路1102内のバッファーを所定の温度に加熱し、その温度を維持する。この際、温度検出手段1112、1113および1114によって各々の近傍のバッファーの温度を測定し、その情報を各発熱体制御手段にフィードバックすることにより、バッファーの温度を所定の値に正確に維持することが可能となる。また、各発熱体はその加熱温度を違えており、例えば、発熱体1106の加熱温度は核酸が解離する温度（90〜94℃）に、発熱体1107の加熱温度は耐熱性ＤＮＡ合成酵素の活性が高まり、解離した核酸と結合したプライマーが耐熱性ＤＮＡ合成酵素の作用によって伸長する温度（50〜75℃）に、さらに発熱体1108の加熱温度は解離した核酸にプライマーが結合する温度（約37℃）に設定すればよい。その後、電圧制御装置1117によって電極1115および1116に電圧を印加する。バッファー中に含まれる核酸、プライマー、ＤＮＡ合成酵素およびデオキシリボヌクオシド三リン酸はそれぞれ等電点が異なり、バッファーのｐＨによって正もしくは負の極性を示すが、バッファーのｐＨを適当に選択することにより全ての成分を正もしくは負のいずれかの極性に統一することができる。例えば、バッファー中の全ての成分が負の電荷を帯びるように調整し、電極1115が負に、電極1116が正になるように電圧を印加すると、バッファー中に含まれる成分のみが電極1116に向かって移動を始める。このとき、バッファーは移動しない。移動を始めた各成分は、まず発熱体1106の上方領域を通過する。この領域は、上述のように、核酸が解離する温度に加熱、維持されているので、移動する成分のうち核酸のみが解離反応を起こす。解離した核酸を含む各成分はさらに移動を続け、発熱体1107の上方領域を通過して発熱体1108の上方領域に到達する。この領域は、解離した核酸とプライマーとが結合反応を生じる温度に加熱、維持されており、解離した核酸とプライマーとの結合反応が生じる。ここで、電圧制御装置1117により電極1115と1116との極性を逆転させる。これにより、核酸とプライマーとの結合体を含む各成分は移動方向を逆転させ、電極1115に向かって移動を始める。逆方向に移動を始めた各成分は、まず耐熱性ＤＮＡ合成酵素の活性が高まる温度に加熱、維持された発熱体1107の上方領域を通過し、核酸に結合したプライマーが伸長する。プライマーが伸長し、二本鎖が形成された核酸を含む各成分は、さらに移動を続け、再び発熱体1106の上方領域に到達して核酸の解離が起こる。ここで再び両電極1104および1105の極性を逆転することにより、新たな熱サイクルが開始され、これを繰り返すことで核酸を増幅することができる。   The procedure of the DNA amplification reaction using this second DNA amplification apparatus is as follows. First, valves 1104 and 1105 are opened, and a buffer containing the target nucleic acid, two or more primers, a heat-resistant DNA synthase, and four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) is flowed. After introduction at 1102, valves 1104 and 1105 are closed. Next, the heating elements 1106, 1107, and 1108 are operated under the control of the heating element control devices 1109, 1110, and 1111, respectively, and the buffer in the flow path 1102 at the position corresponding to each heating element is set to a predetermined temperature. Heat and maintain that temperature. At this time, the temperature detection means 1112, 1113, and 1114 measure the temperature of each neighboring buffer, and the information is fed back to each heating element control means to accurately maintain the buffer temperature at a predetermined value. Is possible. Each heating element has a different heating temperature. For example, the heating temperature of the heating element 1106 is the temperature at which nucleic acid is dissociated (90 to 94 ° C.), and the heating temperature of the heating element 1107 is the activity of the thermostable DNA synthase. The temperature at which the primer bound to the dissociated nucleic acid is extended by the action of the thermostable DNA synthase (50 to 75 ° C.) and the heating temperature of the heating element 1108 is the temperature at which the primer binds to the dissociated nucleic acid (about 37 ℃) may be set. Thereafter, a voltage is applied to the electrodes 1115 and 1116 by the voltage controller 1117. Nucleic acid, primer, DNA synthase, and deoxyribonucleoside triphosphate contained in the buffer have different isoelectric points and show positive or negative polarity depending on the pH of the buffer. Can unify all components to either positive or negative polarity. For example, if all the components in the buffer are adjusted to be negatively charged and a voltage is applied so that the electrode 1115 is negative and the electrode 1116 is positive, only the components contained in the buffer are directed to the electrode 1116. And start moving. At this time, the buffer does not move. Each component that has started moving first passes through the upper region of the heating element 1106. Since this region is heated and maintained at a temperature at which the nucleic acid is dissociated as described above, only the nucleic acid among the moving components undergoes a dissociation reaction. Each component including the dissociated nucleic acid continues to move, passes through the upper region of the heating element 1107, and reaches the upper region of the heating element 1108. This region is heated and maintained at a temperature at which the dissociated nucleic acid and the primer cause a binding reaction, and a binding reaction between the dissociated nucleic acid and the primer occurs. Here, the polarities of the electrodes 1115 and 1116 are reversed by the voltage controller 1117. Thereby, each component including the conjugate of the nucleic acid and the primer reverses the moving direction and starts moving toward the electrode 1115. Each component that has started to move in the reverse direction first passes through the upper region of the heating element 1107, which is heated and maintained at a temperature at which the activity of the thermostable DNA synthase is increased, and the primer bound to the nucleic acid extends. Each component including the nucleic acid in which the primer is extended and the double strand is formed continues to move, reaches the upper region of the heating element 1106 again, and the nucleic acid is dissociated. Here, by reversing the polarities of the electrodes 1104 and 1105 again, a new thermal cycle is started, and the nucleic acid can be amplified by repeating this.

このように、この装置は電極に電圧を印加することによって、バッファー中に含まれる、ＤＮＡ増幅反応に必要な成分のみを移動させる。すなわち、最も容量が多く、したがって最も熱容量が大きいバッファーを加熱および冷却する必要がなく、各発熱体の上方領域のバッファーは温度測定手段の情報に基づく発熱体制御装置の作用により常に一定の温度に保たれている。異なる温度領域の間を移動する各成分の熱容量は小さく、異なる温度領域に達したときには瞬時に温度変化が完了する。このため、熱サイクルの実施に伴う温度勾配の問題が解消され、ＤＮＡ増幅反応をより精密に行なうことができる。また、機械的なバッファーの送出手段を必要としないため、装置を小型化し、コストを抑えることが可能である。   Thus, this apparatus moves only the components necessary for the DNA amplification reaction contained in the buffer by applying a voltage to the electrodes. That is, it is not necessary to heat and cool the buffer having the largest capacity and therefore the largest heat capacity, and the buffer in the upper region of each heating element is always kept at a constant temperature by the action of the heating element control device based on the information of the temperature measuring means. It is kept. The heat capacity of each component that moves between different temperature regions is small, and when it reaches a different temperature region, the temperature change is completed instantaneously. For this reason, the problem of the temperature gradient accompanying the implementation of the thermal cycle is solved, and the DNA amplification reaction can be performed more precisely. Further, since no mechanical buffer delivery means is required, the apparatus can be miniaturized and the cost can be reduced.

また、近年、熱サイクルに用いる温度を２種類、すなわち核酸が解離する温度と耐熱性酵素が最も活性化してプライマーの伸長が生じる温度とにしてＤＮＡ増幅反応を行なう研究がなされている。この方法には、熱サイクルに要する時間を短縮し、ＤＮＡ増幅反応をより短時間で行なうことができるという利点がある。この発明による第２のＤＮＡ増幅装置は、このような方法にも対応することができる。すなわち、図11および12に示される装置において、発熱体1106を核酸の解離が生じる温度に、発熱体1107をプライマーの伸長が効率的に生じる温度にそれぞれ設定し、この間でバッファー中の各成分を往復させればよい。装置をこの方法に専用の装置とする場合には、発熱体1108、発熱体制御装置1111および温度検出手段1114は省くことができる。   In recent years, studies have been carried out to conduct DNA amplification reactions using two types of temperatures used for thermal cycling, namely, the temperature at which nucleic acid is dissociated and the temperature at which the thermostable enzyme is most activated to cause primer extension. This method has the advantage that the time required for the thermal cycle can be shortened and the DNA amplification reaction can be carried out in a shorter time. The second DNA amplification apparatus according to the present invention can also cope with such a method. That is, in the apparatus shown in FIGS. 11 and 12, the heating element 1106 is set to a temperature at which nucleic acid dissociation occurs, and the heating element 1107 is set to a temperature at which primer extension occurs efficiently, and during this time, each component in the buffer is set. It is only necessary to make a round trip. When the device is a device dedicated to this method, the heating element 1108, the heating element control device 1111 and the temperature detection means 1114 can be omitted.

この発明による第２のＤＮＡ増幅装置においては、図13および14に示されるように、耐熱性酵素の活性が高まる温度に維持される発熱体1107の上方に位置する流路1102の内面、すなわち流路1102の温度検出手段1113の近傍内面に耐熱性酵素1301を固定することができる。ここで、図13はこの発明による第２のＤＮＡ増幅装置の別の具体例を模式的に示す平面図であり、図14は図13に示される装置のＧ−Ｇ線に沿った断面を模式的に示す図である。耐熱性酵素を固定する位置は、流路1102の内面であれば底面、側面および上面のいずれでもよい。流路1102の内面への耐熱性酵素を固定は、例えば、流路1102の内面をアミノ基を含有するシランカップリング剤で処理しておけば、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸ナトリウム法等の常法により行なうことができる。このように耐熱性酵素1301を固定化した装置を用いることにより、増幅しようとする核酸、２種類のプライマーおよび４種類にデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを移動させることで増幅反応を行なうことができる。   In the second DNA amplification apparatus according to the present invention, as shown in FIGS. 13 and 14, the inner surface of the flow path 1102 located above the heating element 1107 maintained at a temperature at which the activity of the thermostable enzyme is increased, that is, the flow The thermostable enzyme 1301 can be fixed to the inner surface of the passage 1102 near the temperature detecting means 1113. Here, FIG. 13 is a plan view schematically showing another specific example of the second DNA amplification apparatus according to the present invention, and FIG. 14 is a schematic cross section taken along the line GG of the apparatus shown in FIG. FIG. The position for fixing the thermostable enzyme may be any of the bottom surface, the side surface, and the top surface as long as it is the inner surface of the flow path 1102. Fixing the thermostable enzyme to the inner surface of the channel 1102, for example, by treating the inner surface of the channel 1102 with a silane coupling agent containing an amino group, the carbodiimide method, the glutaraldehyde method, the sodium periodate method It can carry out by the usual methods, such as. By using the apparatus in which the thermostable enzyme 1301 is immobilized in this way, the amplification reaction can be carried out by transferring only the deoxyribonucleoside triphosphate to the nucleic acid to be amplified, the two types of primers, and the four types.

上述のように、図11および12に示される装置においては、耐熱性ＤＮＡ合成酵素を含む増幅反応に必要な各成分を予め温度が設定、維持された領域の間を移動させることにより増幅反応を行なっている。しかしながら、耐熱性酵素は、耐熱性とはいうもののタンパク質であるため核酸が解離する温度に晒されると徐々に劣化する。したがって、熱サイクルの回数が増すに従って反応の効率が低下してしまう。すなわち、この耐熱性酵素の劣化がＤＮＡ増幅反応における増幅率の上限を決定する一つの要因となっている。図13および14に示される装置では、耐熱性酵素は常にその活性が最も高まる部位に留まっており、高温により劣化することがなく、活性を長時間に亘って維持することができる。このため、ＤＮＡ増幅反応をより効率よく、長時間に亘って行なうことが可能であり、ＤＮＡの増幅率を高めることができる。   As described above, in the apparatus shown in FIGS. 11 and 12, the amplification reaction is performed by moving each component necessary for the amplification reaction including the thermostable DNA synthase between the regions where the temperature is set and maintained in advance. Is doing. However, the thermostable enzyme is a protein, although it is thermostable, and gradually deteriorates when exposed to a temperature at which the nucleic acid is dissociated. Therefore, the efficiency of the reaction decreases as the number of thermal cycles increases. That is, the deterioration of the thermostable enzyme is one factor that determines the upper limit of the amplification rate in the DNA amplification reaction. In the apparatus shown in FIGS. 13 and 14, the thermostable enzyme always stays at the site where the activity is highest, and does not deteriorate due to high temperature, and the activity can be maintained for a long time. For this reason, the DNA amplification reaction can be carried out more efficiently over a long period of time, and the DNA amplification rate can be increased.

また、この発明による第２のＤＮＡ増幅装置においては、図15および16に示されるように、各発熱体と発熱体との間、すなわち発熱体1106と1107との間および発熱体1107と1108との間に、基板1101の裏面に接して、冷却液を循環させるための冷却液流路1501を設けることができる。ここで、図15はこの発明による第２のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図16は図15に示される装置のＨ−Ｈ線に沿った断面を模式的に示す図である。この冷却液流路1501内には、図示しないポンプ等により、少なくとも解離した核酸がプライマーと結合する温度（約37℃）よりも低温の冷却液を循環させる。   Further, in the second DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 15 and 16, between each heat generating element, that is, between the heat generating elements 1106 and 1107 and between the heat generating elements 1107 and 1108, Between them, a coolant channel 1501 for circulating the coolant can be provided in contact with the back surface of the substrate 1101. Here, FIG. 15 is a plan view schematically showing still another specific example of the second DNA amplification apparatus according to the present invention, and FIG. 16 is a sectional view taken along the line HH of the apparatus shown in FIG. It is a figure shown typically. In the coolant channel 1501, a coolant having a temperature lower than the temperature (about 37 ° C.) at which at least the dissociated nucleic acid binds to the primer is circulated by a pump (not shown).

このように各発熱体と発熱体との間に冷却液を循環させることにより、各発熱体の上方領域の流路1102内の反応溶液の温度を、隣接する発熱体の影響を受けることなくより精密に制御することが可能となる。   In this way, by circulating the coolant between each heating element, the temperature of the reaction solution in the flow path 1102 in the upper region of each heating element can be reduced without being affected by the adjacent heating element. It becomes possible to control precisely.

さらに、この発明の第２のＤＮＡ増幅装置においては、図17および18に示すように、発熱体1107と1108との間の流路1102、すなわち流路1102の温度検出手段1113と1114との間に、底面に電極1701を備えた貯留セル1702に連通する分岐流路1703を設けることもできる。ここで、図17はこの発明による第２のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図18は図17に示される装置のＩ−Ｉ線に沿った断面を模式的に示す図である。貯留セル1702にはプライマーが貯留され、貯留セル1702の底面に設けられた電極1701は電圧制御装置1117に接続されている。   Furthermore, in the second DNA amplification device of the present invention, as shown in FIGS. 17 and 18, the flow path 1102 between the heating elements 1107 and 1108, that is, between the temperature detection means 1113 and 1114 of the flow path 1102 is used. Further, a branch channel 1703 communicating with a storage cell 1702 having an electrode 1701 on the bottom surface can be provided. Here, FIG. 17 is a plan view schematically showing still another specific example of the second DNA amplification device according to the present invention, and FIG. 18 is a sectional view taken along line II of the device shown in FIG. It is a figure shown typically. A primer is stored in the storage cell 1702, and an electrode 1701 provided on the bottom surface of the storage cell 1702 is connected to the voltage control device 1117.

前述のように、ＤＮＡの増幅反応では、解離した核酸にプライマーを結合させ、耐熱性ＤＮＡ合成酵素の作用によりこのプライマーを伸長させる。したがって、一度結合したプライマーはそのまま増幅した核酸の一部として消費される。このため、増幅反応を繰り返すに従ってプライマーが減少し、プライマーが完全に消費されると増幅反応も終結する。すなわち、前述の耐熱性酵素の劣化と同様、プライマーの減少もＤＮＡ増幅反応における増幅率の上限を決定する一要素である。図17および18に示される装置では、貯留セル1702から分岐流路1703を介して流路1102にプライマーを追加供給することが可能であり、増幅反応を繰り返すに従ってプライマーが不足する問題を解消することができる。   As described above, in the DNA amplification reaction, a primer is bound to the dissociated nucleic acid, and this primer is extended by the action of a thermostable DNA synthase. Therefore, the primer once bound is consumed as part of the amplified nucleic acid. For this reason, as the amplification reaction is repeated, the number of primers decreases, and when the primers are completely consumed, the amplification reaction is terminated. That is, like the above-described deterioration of the thermostable enzyme, the decrease in the primer is one factor that determines the upper limit of the amplification rate in the DNA amplification reaction. In the apparatus shown in FIGS. 17 and 18, it is possible to supply additional primer from the storage cell 1702 to the flow path 1102 via the branch flow path 1703, and solve the problem of insufficient primer as the amplification reaction is repeated. Can do.

図17および18に示される装置を用いたＤＮＡ増幅の手順は以下の通りである。まず、図11および12に示される装置を用いたＤＮＡ増幅の手順と同様にして、流路1102のバッファーを導入し、各発熱体1106、1107および1108の上方領域の流路1102内のバッファーを所定の温度に維持した後、電極1115および1116に電圧を印加し、または反転させ、バッファー中の各成分を移動させて増幅反応を行なう。熱サイクルを適当な回数繰り返した後、新たなサイクルを開始し、発熱体1106の上方領域を通過させて核酸を解離させるところまでは同様に行なう。その後、さらに各成分を電極1116に向けて移動させ、適当な位置に到達したときに、電極1701に電極1115と同じ極性の電圧を印加する。これにより貯留セル1702に貯留されているプライマーは電極1116に向けて移動を開始する。移動を開始したプライマーは分岐流路1703を介して流路1102に流入し、発熱体1106の上方領域から流路1102を移動してきた各成分と合流する。その後は、再び同様にして熱サイクルを繰り返せばよい。   The procedure of DNA amplification using the apparatus shown in FIGS. 17 and 18 is as follows. First, in the same manner as the DNA amplification procedure using the apparatus shown in FIGS. 11 and 12, the buffer in the channel 1102 is introduced, and the buffer in the channel 1102 in the upper region of each heating element 1106, 1107 and 1108 is introduced. After maintaining the predetermined temperature, a voltage is applied to the electrodes 1115 and 1116 or inverted, and each component in the buffer is moved to perform an amplification reaction. After repeating the thermal cycle an appropriate number of times, a new cycle is started, and the same process is performed until the nucleic acid is dissociated by passing through the upper region of the heating element 1106. Thereafter, each component is further moved toward the electrode 1116, and when it reaches an appropriate position, a voltage having the same polarity as that of the electrode 1115 is applied to the electrode 1701. As a result, the primer stored in the storage cell 1702 starts moving toward the electrode 1116. The primer that has started to move flows into the flow path 1102 via the branch flow path 1703 and merges with each component that has moved through the flow path 1102 from the region above the heating element 1106. Thereafter, the heat cycle may be repeated in the same manner.

このように、図17および18に示される装置を用いることにより、ＤＮＡ増幅反応を繰り返している途中であってもプライマーを追加供給することが可能であり、プライマーの不足を回避し、ＤＮＡの増幅率を高めることができる。また、ＤＮＡの増幅反応においては、プライマーだけではなく４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸もそれぞれ消費され、増幅反応を繰り返すに従って反応の効率が低下する要因となるが、貯留セル1702にプライマーに加えて４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を貯留することにより、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の不足を回避し、増幅率をより高めることができる。   Thus, by using the apparatus shown in FIGS. 17 and 18, it is possible to supply additional primers even while the DNA amplification reaction is being repeated, avoiding the shortage of primers and amplifying DNA. The rate can be increased. In addition, in the DNA amplification reaction, not only the primer but also four types of deoxyribonucleoside triphosphates are consumed, which causes the efficiency of the reaction to decrease as the amplification reaction is repeated. By storing four types of deoxyribonucleoside triphosphates, deficiency of deoxyribonucleoside triphosphates can be avoided and the amplification factor can be further increased.

さらにまた、この発明による第２のＤＮＡ増幅装置は、図11ないし図18に示される装置を１ユニットとして、複数のユニットを分岐を有する流路で連結することもできる。図13および14に示される装置を１ユニットとして、このユニットを複数連結した具体例を図19に示す。この図では、それぞれが図13および図14に示される構造を有するユニット1901、1902および1903が、流路1904を介して連結されている。流路1904は、ユニット1901を通過した後、具体的にはユニット1901の弁1905の下流で分岐し、一方が弁1906を介してユニット1902に、他方が弁1907を介してユニット1903にそれぞれ連通している。   Furthermore, the second DNA amplifying device according to the present invention can also connect a plurality of units by a flow path having a branch, with the device shown in FIGS. 11 to 18 as one unit. FIG. 19 shows a specific example in which the apparatus shown in FIGS. In this figure, units 1901, 1902 and 1903 each having the structure shown in FIGS. 13 and 14 are connected via a flow path 1904. After passing through the unit 1901, the flow channel 1904 branches specifically downstream of the valve 1905 of the unit 1901, one communicating with the unit 1902 via the valve 1906 and the other communicating with the unit 1903 via the valve 1907. is doing.

この装置を用いたＤＮＡの増幅反応は以下の手順で行なう。まず、ユニット1901において、前述の図11および12に示される装置を用いたＤＮＡの増幅反応において説明した手順でＤＮＡの増幅反応を行なう。熱サイクルを所定の回数繰り返した後、増幅した核酸を含む各成分を発熱体1908の上方を通過させて電極1909の近傍に集める。次に、弁1905、1906および1907を開放し、電極1909および1910に印加していた電圧を遮断する、続いて、電極1909の極性を反転させ、同時に電極1911および1912に電圧を印加する。具体的には、電極1909が負に、電極1911および1912が正になるように電圧を印加する。これにより、電極1909近傍に集まっていた各成分は流路1904内を電極1911および1912に向けて移動する。各成分がユニット1902および1903内に移動したところで各電極に印加していた電圧を遮断し、弁1905、1906および1907を閉鎖する。その後、ユニット1902および1903において、前述の手順によりＤＮＡの増幅反応を行なう。   The DNA amplification reaction using this apparatus is carried out according to the following procedure. First, in the unit 1901, the DNA amplification reaction is performed according to the procedure described in the DNA amplification reaction using the apparatus shown in FIGS. After repeating the thermal cycle a predetermined number of times, each component containing the amplified nucleic acid is passed over the heating element 1908 and collected in the vicinity of the electrode 1909. Next, the valves 1905, 1906, and 1907 are opened to cut off the voltage applied to the electrodes 1909 and 1910. Subsequently, the polarity of the electrode 1909 is reversed and simultaneously the voltage is applied to the electrodes 1911 and 1912. Specifically, the voltage is applied so that the electrode 1909 is negative and the electrodes 1911 and 1912 are positive. As a result, each component gathered in the vicinity of the electrode 1909 moves in the flow path 1904 toward the electrodes 1911 and 1912. When each component moves into the units 1902 and 1903, the voltage applied to each electrode is cut off, and the valves 1905, 1906 and 1907 are closed. Thereafter, in units 1902 and 1903, a DNA amplification reaction is carried out according to the procedure described above.

耐熱性酵素の劣化およびプライマーの減少がＤＮＡ増幅反応における増幅率の上限を決定する要因となることは前述したが、増幅反応の結果生じるＤＮＡの濃度上昇もまた増幅率の上限を左右する要因となる。解離した核酸とプライマーとの結合が核酸同士の結合との競合反応であることも前に説明した。図17および18に示される装置では、増幅反応の途中でプライマーを追加供給可能なシステムを加えることによりこの問題を解決している。しかしながら、流路の容量は一定であり、核酸は増幅する一方であるため、例えプライマーの濃度を高めたとしても、核酸同士が会合して結合する機会は増加する。この装置では、ユニット1901を流出した各成分が、流路1904の分岐点でほぼ２等分されてユニット1902および1903に流入する。すなわち、ユニット1902および1903に流入する核酸の濃度は、ユニット1901における核酸の最終濃度のほぼ半分である。このため、増幅反応の最中に核酸同志が結合する確率が低下して、増幅反応をより効率的に行なうことが可能であり、その結果増幅率を高めることができる。   As described above, deterioration of the thermostable enzyme and decrease in the primer are factors that determine the upper limit of the amplification rate in the DNA amplification reaction. Become. As described above, the bond between the dissociated nucleic acid and the primer is a competitive reaction with the bond between the nucleic acids. The apparatus shown in FIGS. 17 and 18 solves this problem by adding a system capable of supplying additional primers in the middle of the amplification reaction. However, since the capacity of the flow path is constant and the nucleic acid is only amplifying, even if the concentration of the primer is increased, the opportunity for the nucleic acids to associate and bind increases. In this apparatus, each component that has flowed out of the unit 1901 is divided into two equal parts at the branch point of the flow path 1904 and flows into the units 1902 and 1903. That is, the concentration of nucleic acid flowing into units 1902 and 1903 is approximately half the final concentration of nucleic acid in unit 1901. For this reason, the probability that nucleic acids will bind together during the amplification reaction is reduced, and the amplification reaction can be performed more efficiently. As a result, the amplification factor can be increased.

なお、図19においては、ユニット1901に続くユニットの数は２つであるが、これに限定されるものではなく、流路1904をさらに分岐させてより多くのユニットに連結することもできる。また、図19においては増幅反応は２段階でおこなっているが、ユニット1902および1903の後でさらに流路1904を分岐させて複数のユニットを連結させ、より多段階で増幅反応を行なうこともできる。   In FIG. 19, the number of units following the unit 1901 is two. However, the number of units is not limited to this, and the flow channel 1904 can be further branched and connected to a larger number of units. In FIG. 19, the amplification reaction is carried out in two stages. However, after the units 1902 and 1903, the flow path 1904 can be further branched to connect a plurality of units so that the amplification reaction can be carried out in more stages. .

次に、この発明による第３のＤＮＡ増幅装置の一具体例の平面図を図20に示す。この装置では、無機もしくは有機基板2001上に、２つの弁2003および2004が設けられた流路2002が形成され、さらに基板2001の上面に接して透明基板が接合されている。弁2003と2004との間には、基板2001の裏面に接して３つの発熱体2005、2006および2007が設けられており、それぞれ発熱体の温度を個別に制御する発熱体制御装置2008、2009および2010に接続されている。また、これらの発熱体2005、2006および2007に対応して流路2002の底面には、それぞれ、反応溶液の温度を検出するための温度検出手段2011、2012および2013が設けられている。さらに、発熱体2006に対応する位置の流路2002の底面には耐熱性ＤＮＡ合成酵素2014が固定されている。また、弁2003と発熱体2005との間に位置する流路2002の底面および弁2004と発熱体2007との間に位置する流路2002の底面にはそれぞれ電極2015および2016が設けられており、さらに電極2015と弁2003との間には、底面に電極2017を備えた貯留セル2018に連通する分岐流路2019が設けられている。弁2003の上流側の流路2002の底面には電極2020が設けられ、この電極2020と弁2003との間には、基板2001の上面に接合された透明基板を貫通する試料投入口2021が設けられている。試料投入口2021は外部から試料を流路2002内に取り込むことが可能な形態をとっている。また、試料投入口2021と弁2003との間の流路2002にはゲル状化合物2022が流路2002を塞ぐ形で充填され、このゲル状化合物2022が充填された部位と弁2003との間には、弁2023を介して、底面に電極2024を備えた廃棄物セル2025に連通する分岐流路2026が設けられている。同様に、弁2004の下流側の流路2002にも電極2027が設けられ、この電極2027と弁2004との間にはＤＮＡ検出手段2028が設けられている。電極2015、2016、2017、2020、2024および2027は全て、各電極に電圧を印加することが可能であり、かつ印加した電圧を反転することが可能な電圧制御装置2029に接続されている。無機もしくは有機基板2001の材質、流路2002の形成方法、透明基板の材質、利用可能な発熱体、および利用可能な温度検出手段等は全て、上記この発明による第１のＤＮＡ増幅装置に用いられるものと同様である。流路2002に充填されるゲル状化合物2022としては、例えば、セルロース、アガロース、アルリルアミド等を用いることができる。また、ＤＮＡ検出手段2028は特に限定されるものではなく、通常ＤＮＡの検出に用いられるいかなる手段をも用いることができ、例としては紫外線吸光度検出法、屈折率検出法、蛍光検出法および楕円偏光解析法を利用するものを挙げることができる。   Next, FIG. 20 shows a plan view of a specific example of the third DNA amplification apparatus according to the present invention. In this apparatus, a flow path 2002 provided with two valves 2003 and 2004 is formed on an inorganic or organic substrate 2001, and a transparent substrate is bonded to the upper surface of the substrate 2001. Three heating elements 2005, 2006, and 2007 are provided between the valves 2003 and 2004 in contact with the back surface of the substrate 2001. The heating element control devices 2008, 2009, and 2008 that individually control the temperatures of the heating elements, respectively. Connected to 2010. Corresponding to these heating elements 2005, 2006 and 2007, temperature detection means 2011, 2012 and 2013 for detecting the temperature of the reaction solution are provided on the bottom surface of the flow path 2002, respectively. Further, a thermostable DNA synthase 2014 is fixed to the bottom surface of the flow path 2002 at a position corresponding to the heating element 2006. Electrodes 2015 and 2016 are provided on the bottom surface of the flow path 2002 located between the valve 2003 and the heating element 2005 and on the bottom surface of the flow path 2002 located between the valve 2004 and the heating element 2007, respectively. Further, between the electrode 2015 and the valve 2003, a branch channel 2019 communicating with the storage cell 2018 having the electrode 2017 on the bottom surface is provided. An electrode 2020 is provided on the bottom surface of the flow path 2002 on the upstream side of the valve 2003. Between the electrode 2020 and the valve 2003, a sample insertion port 2021 penetrating a transparent substrate bonded to the upper surface of the substrate 2001 is provided. It has been. The sample inlet 2021 has a form that allows a sample to be taken into the flow path 2002 from the outside. The flow channel 2002 between the sample inlet 2021 and the valve 2003 is filled with the gel compound 2022 so as to block the flow channel 2002, and the portion between the gel compound 2022 and the valve 2003 is filled. Is provided with a branch channel 2026 that communicates with a waste cell 2025 having an electrode 2024 on the bottom surface via a valve 2023. Similarly, an electrode 2027 is provided in the flow path 2002 on the downstream side of the valve 2004, and a DNA detection means 2028 is provided between the electrode 2027 and the valve 2004. The electrodes 2015, 2016, 2017, 2020, 2024, and 2027 are all connected to a voltage controller 2029 that can apply a voltage to each electrode and invert the applied voltage. The material of the inorganic or organic substrate 2001, the method of forming the flow path 2002, the material of the transparent substrate, the usable heating element, the usable temperature detecting means, etc. are all used in the first DNA amplification device according to the present invention. It is the same as that. As the gel compound 2022 filled in the flow path 2002, for example, cellulose, agarose, allylamide, or the like can be used. Further, the DNA detection means 2028 is not particularly limited, and any means usually used for detection of DNA can be used. Examples include ultraviolet absorbance detection method, refractive index detection method, fluorescence detection method and elliptically polarized light. The thing using an analysis method can be mentioned.

この第３のＤＮＡ増幅装置を用いたＤＮＡ増幅反応の手順は以下の通りである。まず、バッファーを満たした流路2002内に、試料投入口2021から、全血もしくは血清等の試料を導入する。次に、弁2003を閉鎖し、弁2023を開放した後、電極2020および2024に、電極2020が負に、2024が正になるように電圧を印加し、核酸を含む試料を電極2024に移動させる。流路2002を電極2024に向けて移動する試料は、ゲル状化合物2022を通過する。この際、ゲル電気泳動の原理により、核酸がゲル状化合物2022を通過するより早く、不純物であるより低分子の化合物がゲル状化合物2022を通過し、分岐流路2026を経て廃棄物セル2025に到達する。この後、目的とする核酸がゲル状化合物2022を通過し終えた時点で、弁2023を閉鎖して電極2024に印加していた電圧を遮断し、次いで弁2003を開放して電極2015に電圧を印加する。これにより、不純物が除去された、目的とする核酸のみが弁2023を通過する。また、電極2015に電圧を印加するのと同時に電極2017にも電圧を印加する。貯留セル2018には、予めＤＮＡ増幅反応に必要な２種類のプライマーおよび４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）が貯留されており、電極2017に電圧が印加されると同時に電極2015に向けて移動を開始して、分岐流路2019を介して流路2002に流入し、弁2003を通過した核酸と合流する。核酸が弁2003を通過し、貯留セル2018からの各成分と共に電極2015の近傍に集まった後、弁2003を閉鎖して電極2017および2020に印加されていた電圧を遮断し、次いで電極2016に電圧を印加すると同時に電極2015に印加される電圧の極性を反転させる。これにより、各成分は電極2016に向けて移動を開始し、以下、前述の第２のＤＮＡ増幅装置に各具体例において説明した手順によりＤＮＡの増幅反応を行なう。所定の回数熱サイクルを行なって増幅反応が終了した後、まず増幅した核酸を含む各成分を電極2016の近傍に集める。次に、電極2015に印加していた電圧を遮断して弁2004を開放し、電極2027に電圧を印加すると同時に電極2016に印加されていた電圧の極性を反転させる。これにより、増幅した核酸は電極2027に向けて移動を開始する。核酸がＤＮＡ検出手段2028の位置まで移動した時点で電極2016および電極2027に印加していた電圧を遮断し、ＤＮＡの検出を行なう。   The procedure of the DNA amplification reaction using this third DNA amplification apparatus is as follows. First, a sample such as whole blood or serum is introduced into the channel 2002 filled with the buffer from the sample inlet 2021. Next, after closing the valve 2003 and opening the valve 2023, a voltage is applied to the electrodes 2020 and 2024 so that the electrode 2020 is negative and the 2024 is positive, and the sample containing nucleic acid is moved to the electrode 2024. . A sample moving toward the electrode 2024 through the channel 2002 passes through the gel compound 2022. At this time, due to the principle of gel electrophoresis, the lower molecular weight compound, which is an impurity, passes through the gel compound 2022 faster than the nucleic acid passes through the gel compound 2022, and passes through the branch channel 2026 to the waste cell 2025. To reach. Thereafter, when the target nucleic acid has passed through the gel compound 2022, the valve 2023 is closed to cut off the voltage applied to the electrode 2024, and then the valve 2003 is opened to apply the voltage to the electrode 2015. Apply. Thereby, only the target nucleic acid from which impurities have been removed passes through the valve 2023. In addition, the voltage is applied to the electrode 2017 at the same time as the voltage is applied to the electrode 2015. In the storage cell 2018, two types of primers and four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) necessary for the DNA amplification reaction are stored in advance, and when a voltage is applied to the electrode 2017 Simultaneously, movement toward the electrode 2015 starts, flows into the flow path 2002 via the branch flow path 2019, and merges with the nucleic acid that has passed through the valve 2003. After the nucleic acid passes through the valve 2003 and collects in the vicinity of the electrode 2015 together with each component from the storage cell 2018, the valve 2003 is closed to cut off the voltage applied to the electrodes 2017 and 2020, and then to the electrode 2016 At the same time, the polarity of the voltage applied to the electrode 2015 is reversed. As a result, each component starts to move toward the electrode 2016, and thereafter, a DNA amplification reaction is performed in the above-described second DNA amplification device according to the procedure described in each specific example. After the amplification reaction is completed by performing a heat cycle a predetermined number of times, each component including the amplified nucleic acid is first collected in the vicinity of the electrode 2016. Next, the voltage applied to the electrode 2015 is cut off, the valve 2004 is opened, the voltage is applied to the electrode 2027, and at the same time, the polarity of the voltage applied to the electrode 2016 is reversed. Thereby, the amplified nucleic acid starts to move toward the electrode 2027. When the nucleic acid moves to the position of the DNA detection means 2028, the voltage applied to the electrode 2016 and the electrode 2027 is cut off to detect the DNA.

この装置では、試料の投入から、ＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを検出するまで全て電気的な動作であり、機械的な動作は必要としない。このため、装置を非常に小型化することが可能であり、コストの低下にも非常に有利である。また、同じ理由により、全自動化も容易である。   In this apparatus, everything from an input of a sample to amplification of DNA and detection of the amplified DNA is an electrical operation, and no mechanical operation is required. For this reason, it is possible to reduce the size of the apparatus, which is very advantageous for cost reduction. Also, for the same reason, full automation is easy.

図20に示される装置においては、ゲル状化合物は試料投入口2021と弁2003との間にのみ充填されているが、弁2004とＤＮＡ検出手段2028との間の流路2002に充填することもできる。このようにゲル状化合物を配置することにより、ＤＮＡ増幅後にも反応せずに残留し、ＤＮＡ検出の妨げになるプライマーやデオキシリボヌクレオシド三リン酸を分離することができ、検出の精度をより高めることができる。   In the apparatus shown in FIG. 20, the gel compound is filled only between the sample inlet 2021 and the valve 2003, but it may be filled in the flow path 2002 between the valve 2004 and the DNA detection means 2028. it can. By arranging the gel-like compound in this way, primers and deoxyribonucleoside triphosphates that remain unreacted after DNA amplification and interfere with DNA detection can be separated, and detection accuracy is further improved. Can do.

また、流路2002にゲル状化合物2022を充填する代わりに、この部分の流路の径を 150μｍ以下とすることによっても同様の効果を得ることができる。すなわち、流路の径を 150μｍ以下とすることにより、壁面との電気親和力の差により、核酸と他の不純物とを分離することができる。   Further, instead of filling the channel 2002 with the gel compound 2022, the same effect can be obtained by setting the diameter of the channel in this portion to 150 μm or less. That is, by setting the diameter of the channel to 150 μm or less, nucleic acids and other impurities can be separated due to the difference in electric affinity with the wall surface.

以上、図面に基づいてこの発明によるＤＮＡ増幅装置の実施の形態を説明したが、この発明は上述の実施の形態に限定されるものではなく、この発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能である。ここで、この発明の要旨をまとめると以下のようになる。   The embodiments of the DNA amplification device according to the present invention have been described with reference to the drawings. However, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications and applications can be made within the scope of the gist of the present invention. Is possible. Here, the gist of the present invention is summarized as follows.

（１）図１ないし10に対応
無機もしくは有機基板上に形成されたプレーナ状の反応セルと、該反応セルに連通する２つの流路と、該流路の各々に前記反応セルを挟んで設けられた２つ弁と、少なくとも前記反応セルの底面もしくは前記基板の反応セルが形成された面の裏面のいずれか一方に設けられた加熱手段とを具備するＤＮＡ増幅装置。 (1) Corresponding to FIGS. 1 to 10 A planar reaction cell formed on an inorganic or organic substrate, two flow paths communicating with the reaction cell, and the reaction cell sandwiched between each of the flow paths A DNA amplifying apparatus comprising: the two valves, and heating means provided at least on either the bottom surface of the reaction cell or the back surface of the surface of the substrate on which the reaction cell is formed.

この装置は、反応セルがプレーナ状であり、これにより反応セル内の反応溶液をより迅速に加熱および冷却することができる。また、加熱手段を反応セルの底面および基板の裏面の両方に設けた場合には、反応セル内の反応溶液の昇降温速度を高めることができる。その結果、反応溶液内の温度勾配を小さくすることが可能であり、ＤＮＡ増幅反応の精度を高めることができる。   In this apparatus, the reaction cell has a planar shape, so that the reaction solution in the reaction cell can be heated and cooled more quickly. Further, when the heating means is provided on both the bottom surface of the reaction cell and the back surface of the substrate, the rate of temperature rise and fall of the reaction solution in the reaction cell can be increased. As a result, the temperature gradient in the reaction solution can be reduced, and the accuracy of the DNA amplification reaction can be increased.

（２）図11ないし19に対応
無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路に設けられた２つの弁、該２つの弁の間の流路の底面に設けられた２つの電極、該２つの電極の間の流路の底面に設けられた少なくとも１つの温度検出手段、該少なくとも１つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なくともいずれか一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、前記２つの電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するＤＮＡ増幅装置。 (2) Corresponding to FIGS. 11 to 19 A channel provided on an inorganic or organic substrate, two valves provided in the channel, and two electrodes provided on the bottom surface of the channel between the two valves , At least one temperature detection means provided on the bottom surface of the flow path between the two electrodes, a flow path bottom face in the vicinity of each of the at least one temperature detection means, or a surface on which the flow path of the substrate is provided Heating means provided in a pair with each of the temperature detecting means on at least one of the back surfaces of the substrate, voltage control means for controlling the voltage applied to the two electrodes, and information from the temperature detecting means A DNA amplification apparatus comprising heating control means for controlling the heating means based on the above.

この装置では、流路内に満たされた反応溶液に電圧を印加し、反応溶液中の核酸、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを所定の温度に維持された複数の領域の間で移動させ、ＤＮＡの増幅反応を行なう。このため、増幅反応に必要な熱サイクルの際に生じる温度勾配の問題が解消される。また、電気的な手段で溶液中の成分のみを移動させ、溶液の移動を伴わないため、ポンプ等の機械的な作動部材を必要とせず、装置の小型化および低価格化が可能となる。   In this apparatus, a voltage is applied to the reaction solution filled in the flow path, and a plurality of regions in which only the nucleic acid, thermostable DNA synthase, primer, and deoxyribonucleoside triphosphate in the reaction solution are maintained at a predetermined temperature. The DNA amplification reaction is carried out. For this reason, the problem of the temperature gradient which arises in the case of the thermal cycle required for amplification reaction is eliminated. In addition, since only the components in the solution are moved by electrical means and the solution is not moved, a mechanical operation member such as a pump is not required, and the apparatus can be reduced in size and cost.

（３）図20に対応
無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路の底面に設けられた第１ないし第４の電極、第１の電極と第２の電極との間に設けられた第１の弁、第１の電極と第１の弁との間に設けられた試料投入口、該試料投入口と第１の弁との間に位置し、底面に第５の電極を有する不純物導入セルに連通する第１の分岐流路、該第１の分岐流路と前記試料投入口との間の流路内に設けられたゲル状化合物、第１の弁と第２の電極との間に位置し、底面に第６の電極を有する貯留セルに連通する第２の分岐流路、第２の電極と第３の電極との間の流路底面に設けられた少なくとも１つの温度検出手段、該少なくとも１つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なくともいずれか一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、第３の電極と第４の電極との間に設けられたＤＮＡ検出手段、該ＤＮＡ検出手段と第４の電極との間に設けられた第２の弁、前記第１ないし第６の電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するＤＮＡ増幅装置。 (3) Corresponding to FIG. 20 A channel provided on an inorganic or organic substrate, first to fourth electrodes provided on the bottom surface of the channel, and provided between the first electrode and the second electrode The first valve, the sample inlet provided between the first electrode and the first valve, the fifth electrode on the bottom surface, located between the sample inlet and the first valve. A first branch channel that communicates with the impurity introduction cell, a gel compound provided in the channel between the first branch channel and the sample inlet, a first valve, and a second electrode And a second branch channel communicating with a storage cell having a sixth electrode on the bottom surface, at least one provided on the bottom surface of the channel between the second electrode and the third electrode At least one of temperature detection means, a flow path bottom surface near each of the at least one temperature detection means, or a back surface of the surface on which the flow path of the substrate is provided On the other hand, heating means provided in pairs with each of the temperature detection means, DNA detection means provided between the third electrode and the fourth electrode, the DNA detection means and the fourth electrode, A second valve provided between the first and sixth electrodes, voltage control means for controlling the voltage applied to the first to sixth electrodes, and heating control for controlling the heating means based on information from the temperature detection means DNA amplification apparatus comprising means.

この装置では、試料の投入から、ＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを検出するまで全て電気的な動作で行なうことが可能であり、装置を非常に小型にすることができ、また低コスト化も可能である。さらに、機械的な部材を必要としないことから全自動化も容易である。   With this device, it is possible to carry out everything from the input of the sample to the amplification of the DNA and the detection of the amplified DNA by an electrical operation, so that the device can be made very small and the cost can be reduced. Is possible. Furthermore, since no mechanical member is required, full automation is easy.

また、この発明は以下の態様をも含むものである。   The present invention also includes the following aspects.

（４）図３および４に対応
前記（１）の装置において、反応セルの底面に少なくとも１つの温度検出手段を有するＤＮＡ増幅装置。 (4) Corresponding to FIGS. 3 and 4 In the apparatus of (1), a DNA amplification apparatus having at least one temperature detection means on the bottom surface of the reaction cell.

この装置では、反応セルの底面に設けられた少なくとも１つの温度検出手段が反応溶液の温度を直接測定する。したがって、加熱手段によって加熱される反応溶液の温度をより精密に制御することができる。   In this apparatus, at least one temperature detection means provided on the bottom surface of the reaction cell directly measures the temperature of the reaction solution. Therefore, the temperature of the reaction solution heated by the heating means can be controlled more precisely.

（５）図５および６に対応
前記（１）の装置において、反応セルの底面に少なくとも１つの突起を有するＤＮＡ増幅装置。 (5) Corresponding to FIGS. 5 and 6 In the apparatus of (1), a DNA amplification apparatus having at least one protrusion on the bottom surface of the reaction cell.

この装置では、反応セルの底面に少なくとも１つの突起を設けることにより、反応セル中の反応溶液がセル底面と接する面積を拡大している。その結果、加熱手段から生じた熱をより効率的に反応溶液に伝えることができ、反応溶液をより迅速に加熱もしくは冷却することが可能である。   In this apparatus, by providing at least one protrusion on the bottom surface of the reaction cell, the area where the reaction solution in the reaction cell is in contact with the cell bottom surface is expanded. As a result, the heat generated from the heating means can be transferred to the reaction solution more efficiently, and the reaction solution can be heated or cooled more quickly.

（６）図７および８に対応
前記（１）の装置において、反応セル底面の断面形状が鋸刃状もしくは波状であるＤＮＡ増幅装置。 (6) Corresponding to FIGS. 7 and 8 In the apparatus of (1) above, a DNA amplification apparatus in which the cross-sectional shape of the bottom surface of the reaction cell is a saw blade or a wave.

この装置も、上記（５）の装置と同様に、反応セル底面の断面形状を鋸刃状もしくは波状とすることにより、反応セル中の反応溶液がセル底面と接する面積をより拡大している。したがって、加熱手段から生じた熱をより効率的に反応溶液に伝えることができ、反応溶液をより迅速に加熱もしくは冷却することが可能である。   Similarly to the apparatus of (5), this apparatus also enlarges the area where the reaction solution in the reaction cell is in contact with the cell bottom surface by making the cross-sectional shape of the reaction cell bottom surface a saw blade or a wave. Therefore, the heat generated from the heating means can be transferred to the reaction solution more efficiently, and the reaction solution can be heated or cooled more quickly.

（７）図９および10に対応
前記（１）の装置において、反応セルの底面に１つもしくはそれ以上の突起が反応溶液の流れ方向に対して斜めに配置されたＤＮＡ増幅装置。 (7) Corresponding to FIGS. 9 and 10 In the apparatus of (1), a DNA amplifying apparatus in which one or more protrusions are arranged obliquely with respect to the flow direction of the reaction solution on the bottom surface of the reaction cell.

この装置では、反応セルに流入する反応溶液がセル底面に設けられた突起の抵抗を受けて反応セル内で撹拌される。その結果、各成分が反応溶液中で均一に分散し、ＤＮＡ増幅反応が均一に生じる。また、反応セルから反応溶液を流出させる際にもやはり突起により反応溶液が撹拌され、次の精製、分析工程をむらのない状態で行なうことができる。さらに、前記（５）および（６）の装置と同様に、反応セル底面に設けられた突起は、反応セル中の反応溶液がセル底面と接する面積を拡大する作用をする。したがって、加熱手段から生じた熱をより効率的に反応溶液に伝えることができ、反応溶液をより迅速に加熱もしくは冷却することが可能である。   In this apparatus, the reaction solution flowing into the reaction cell receives the resistance of the protrusion provided on the cell bottom surface and is stirred in the reaction cell. As a result, each component is uniformly dispersed in the reaction solution, and a DNA amplification reaction occurs uniformly. Further, when the reaction solution is allowed to flow out of the reaction cell, the reaction solution is also stirred by the protrusions, so that the subsequent purification and analysis steps can be performed without any unevenness. Further, similarly to the devices (5) and (6), the protrusion provided on the bottom surface of the reaction cell acts to expand the area where the reaction solution in the reaction cell is in contact with the bottom surface of the cell. Therefore, the heat generated from the heating means can be transferred to the reaction solution more efficiently, and the reaction solution can be heated or cooled more quickly.

（８）図11ないし19に対応
無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路に設けられた２つの弁および該２つの弁の間の流路の底面に設けられた２つの電極を具備するＤＮＡ増幅装置。 (8) Corresponding to FIGS. 11 to 19 A channel provided on an inorganic or organic substrate, two valves provided in the channel, and two electrodes provided on the bottom surface of the channel between the two valves A DNA amplification apparatus comprising:

この装置は、流路底面に設けられた２つの電極に電圧を印加することにより、反応溶液中の核酸、プライマー、耐熱性ＤＮＡ合成酵素およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを移動させる。したがって、溶液の移動を伴わないために、ＤＮＡ増幅反応に必要な熱サイクルにおいて生じる温度勾配の問題が解消される。また、溶液の移動を伴わないために、ポンプ等の機械的作動部材を必要とせず、装置の小型化および低価格化が可能となる。   This apparatus moves only the nucleic acid, primer, thermostable DNA synthase and deoxyribonucleoside triphosphate in the reaction solution by applying a voltage to the two electrodes provided on the bottom surface of the flow path. Therefore, the problem of the temperature gradient generated in the thermal cycle necessary for the DNA amplification reaction is eliminated because the solution does not move. In addition, since no movement of the solution is involved, a mechanical operating member such as a pump is not required, and the apparatus can be reduced in size and cost.

（９）図13および14に対応
前記（２）の装置において、少なくとも１つの温度検出手段が設けられた位置の流路内面に耐熱性ＤＮＡ合成酵素が固定化されているＤＮＡ増幅装置。 (9) Corresponding to FIGS. 13 and 14 In the apparatus of (2) above, a DNA amplifying apparatus in which a heat-resistant DNA synthase is immobilized on the inner surface of the flow path at a position where at least one temperature detecting means is provided.

耐熱性ＤＮＡ合成酵素は、その名の通り、核酸が解離するような温度においてもその活性をある程度維持することができるが、反応を繰り返す毎に活性が低下し、これがＤＮＡ増幅反応における増幅率の上限を決定する要因の一つとなっている。この装置では、この耐熱性ＤＮＡ合成酵素を、核酸に結合したプライマーを伸長させる温度領域の流路内壁、例えば流路底面や上面に固定化している。これにより、増幅反応に支障をきたすことなく、酵素の劣化を大幅に抑制し、ＤＮＡ増幅反応における増幅率を高めることができる。   As the name suggests, thermostable DNA synthase can maintain its activity to some extent even at temperatures at which nucleic acids are dissociated, but the activity decreases with each repetition of the reaction, and this increases the amplification rate in the DNA amplification reaction. This is one of the factors that determine the upper limit. In this apparatus, the thermostable DNA synthase is immobilized on the inner wall of the flow channel, for example, the bottom surface or the upper surface of the flow channel, in which the primer bound to the nucleic acid is extended. Thereby, degradation of an enzyme can be suppressed significantly and the amplification rate in DNA amplification reaction can be raised, without affecting the amplification reaction.

（10）図15および16に対応
前記（２）の装置において、２つ以上の加熱手段を有し、各々の加熱手段と加熱手段との間に相当する位置の、無機もしくは有機基板の上面もしくは裏面に、基板に接して設けられた冷却液流路を具備するＤＮＡ増幅装置。 (10) Corresponding to FIGS. 15 and 16 In the apparatus of (2), there are two or more heating means, and the upper surface of the inorganic or organic substrate at a position corresponding to each heating means or between the heating means or A DNA amplification apparatus comprising a coolant channel provided on the back surface in contact with the substrate.

この装置では、冷却液流路に冷却液を循環させることにより、基板上に複数設けられた加熱手段の各々を熱的に分離することができる。したがって、各加熱手段によって加熱される流路内のバッファーの温度をより精密に制御することが可能となる。   In this apparatus, each of a plurality of heating means provided on the substrate can be thermally separated by circulating the coolant in the coolant flow path. Therefore, it becomes possible to control the temperature of the buffer in the flow path heated by each heating means more precisely.

（11）図17および18に対応
前記（２）の装置において、２つ以上の加熱手段を有し、所定の加熱手段と加熱手段との間に相当する位置の流路に、底面に電極が設けられた貯留セルに連通する分岐流路が設けられているＤＮＡ増幅装置。 (11) Corresponding to FIGS. 17 and 18 In the apparatus of (2), the apparatus has two or more heating means, and an electrode is provided on the bottom surface in a flow path corresponding to a position between the predetermined heating means. A DNA amplification device provided with a branch flow path communicating with a provided storage cell.

前述のように、ＤＮＡ増幅反応における増幅率の上限を決定する要因の一つは耐熱性ＤＮＡ合成酵素の劣化であるが、他の要因としてプライマーの減少も挙げられる。解離した核酸にプライマーが結合することが耐熱性酵素がプライマーの伸長を開始する条件であるが、一度結合したプライマーはそのまま増幅した核酸の一部となるため、増幅反応を繰り返す毎にプライマーは消費されていく。したがって、プライマーが完全に消費された時点で増幅反応は終了する。   As described above, one of the factors that determine the upper limit of the amplification rate in the DNA amplification reaction is the deterioration of the thermostable DNA synthase, but other factors include a decrease in primers. Primer binding to the dissociated nucleic acid is a condition for the thermostable enzyme to start primer extension, but once the primer is bound, it becomes a part of the amplified nucleic acid, so the primer is consumed each time the amplification reaction is repeated. It will be done. Therefore, the amplification reaction ends when the primer is completely consumed.

この装置では、予め貯留セルにプライマーを貯留することにより、増幅反応の途中であってもプライマーを追加供給することが可能であり、ＤＮＡ増幅反応における増幅率を高めることができる。貯留セルから流路へのプライマーの供給は、貯留セルの底面に設けられた電極を用いて電気的に行なうことができる。   In this apparatus, by storing the primer in the storage cell in advance, it is possible to additionally supply the primer even during the amplification reaction, and the amplification factor in the DNA amplification reaction can be increased. The supply of the primer from the storage cell to the flow path can be electrically performed using an electrode provided on the bottom surface of the storage cell.

さらに、この装置では、プライマーだけではなく、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を貯留セルに貯留してもよい。この場合には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸が不足することも回避することができる。   Furthermore, in this apparatus, not only primers but also four types of deoxyribonucleoside triphosphates may be stored in a storage cell. In this case, deficiency of deoxyribonucleoside triphosphate can also be avoided.

（12）図19に対応
前記（２）、（８）、（９）、（10）または（11）の装置のいずれかを１ユニットとするユニットを少なくとも３つ有し、１つのユニットの下流側に他のユニットが分岐を有する流路によって連結されているＤＮＡ増幅装置。 (12) Corresponding to FIG. 19 At least three units each including any one of the devices (2), (8), (9), (10) or (11) are provided downstream of one unit. A DNA amplification apparatus in which other units are connected to each other by a flow path having a branch.

ＤＮＡ増幅反応における増幅率の上限を決定する要因としては、前述の耐熱性酵素の劣化およびプライマーの減少の他に、増幅反応の結果生じるＤＮＡの濃度上昇も挙げることができる。ＤＮＡの濃度が上昇すると、解離した核酸とプライマーが結合するときに核酸同士が結合する可能性が高くなる。核酸がプライマーと結合する反応と核酸同士が結合する反応とは競合するので、核酸濃度に対するプライマー濃度を高めることにより相対的に核酸同士が結合する確率は低くなる。しかし、流路の容量は一定なので、プライマーの濃度を高めることにより核酸同士の再結合を抑制するのには限りがある。   Factors that determine the upper limit of the amplification rate in the DNA amplification reaction include an increase in the concentration of DNA resulting from the amplification reaction, in addition to the aforementioned deterioration of the thermostable enzyme and the decrease in primers. When the concentration of DNA increases, the possibility that nucleic acids bind to each other when the dissociated nucleic acid and the primer bind to each other increases. Since the reaction in which the nucleic acid binds to the primer and the reaction in which the nucleic acid bind to each other compete, the probability that the nucleic acids are relatively bound to each other decreases by increasing the primer concentration relative to the nucleic acid concentration. However, since the capacity of the channel is constant, there is a limit to suppressing recombination between nucleic acids by increasing the primer concentration.

この装置は、単体でＤＮＡ増幅反応を行なうことが可能な３つ以上のユニットを有し、１つのユニットの下流側に、分岐した流路を介して、他のユニットが連結されている。この装置では、まず、上流側のユニットにおいて所定の回数ＤＮＡ増幅反応を繰り返した後、各ユニットの弁を開放し、上流側のユニットにおいて増幅した核酸を下流側のユニットに電気的に移動させる。この際、流路の分岐点において核酸はほぼ等分に分割されて下流側のユニットに導入される。例えば、下流側のユニットの数が２つである場合には、各ユニットに導入される核酸の濃度は、上流側のユニットにおける核酸の最終濃度のほぼ半分である。したがって、核酸とプライマーとが結合する際に核酸同士が結合する確率が低くなり、ＤＮＡ増幅反応を効率的に行なうことができる。   This apparatus has three or more units capable of performing a single DNA amplification reaction, and other units are connected to the downstream side of one unit via a branched flow path. In this apparatus, first, the DNA amplification reaction is repeated a predetermined number of times in the upstream unit, then the valve of each unit is opened, and the nucleic acid amplified in the upstream unit is electrically moved to the downstream unit. At this time, the nucleic acid is divided into approximately equal parts at the branch point of the flow path and introduced into the downstream unit. For example, when the number of downstream units is two, the concentration of nucleic acid introduced into each unit is approximately half of the final concentration of nucleic acid in the upstream unit. Accordingly, when the nucleic acid and the primer are bound, the probability that the nucleic acids are bound to each other is reduced, and the DNA amplification reaction can be performed efficiently.

この装置では、１つのユニットの下流側での流路の分岐数は２つ以上であればよく、特に制限はない。また、分岐したユニットの後でさらに流路を分岐して複数のユニットを設けて多段階の反応を行なうことも可能であり、その段階数にも制限はない。   In this apparatus, the number of branches of the flow path on the downstream side of one unit is not particularly limited as long as it is two or more. Further, after the branched unit, the flow path can be further branched to provide a plurality of units to perform a multistage reaction, and the number of stages is not limited.

（13）
前記（３）の装置において、第１の分岐流路と試料投入口との間の流路にゲル状化合物を充填する代わりに、径が 150μｍ以下の流路を設けたＤＮＡ増幅装置。 (13)
The DNA amplification apparatus according to (3), wherein a flow path having a diameter of 150 μm or less is provided instead of filling the flow path between the first branch flow path and the sample inlet with a gel compound.

前記（３）の装置においては、試料投入口から投入された試料から不純物を除去するために、アフィニティを利用したキャピラリ電気泳動を利用している。キャピラリ電気泳動には、このアフィニティを利用するものの他に、毛管内の電気親和力を利用するものがある。この装置は、流路の径を 150μｍ以下とすることにより、この電気親和力を利用したキャピラリ電気泳動を利用して不純物の分離を行なう。したがって、ゲル状化合物のような担体は不要であり、装置構成をより単純化し、コストをさらに低くすることができる。   In the apparatus (3), capillary electrophoresis utilizing affinity is used to remove impurities from the sample introduced from the sample inlet. Some capillary electrophoresis uses the affinity in the capillary in addition to the one that uses this affinity. In this apparatus, by setting the diameter of the flow path to 150 μm or less, impurities are separated using capillary electrophoresis using this electric affinity. Therefore, a carrier such as a gel-like compound is unnecessary, and the apparatus configuration can be further simplified and the cost can be further reduced.

本発明に従えば、無機もしくは有機基板上に形成されたプレーナ状の反応セルと、該反応セルに連通する２つの流路と、該流路の各々に前記反応セルを挟んで設けられた２つ弁と、少なくとも前記反応セルの底面もしくは前記基板の反応セルが形成された面の裏面のいずれか一方に設けられた加熱手段とを具備するＤＮＡ増幅装置が提供される。   According to the present invention, a planar reaction cell formed on an inorganic or organic substrate, two flow paths communicating with the reaction cell, and 2 provided between each of the flow paths with the reaction cell interposed therebetween. There is provided a DNA amplification apparatus comprising a valve and heating means provided on at least one of the bottom surface of the reaction cell and the back surface of the surface of the substrate on which the reaction cell is formed.

また、本発明の他の面から、無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路に設けられた２つの弁、該２つの弁の間の流路の底面に設けられた２つの電極、該２つの電極の間の流路の底面に設けられた少なくとも１つの温度検出手段、該少なくとも１つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なくともいずれか一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、前記２つの電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するＤＮＡ増幅装置が提供される。   Further, from another aspect of the present invention, the flow path provided on the inorganic or organic substrate, the two valves provided in the flow path, and the two provided on the bottom face of the flow path between the two valves An electrode, at least one temperature detection means provided on the bottom surface of the flow path between the two electrodes, a flow path bottom face near each of the at least one temperature detection means, or a flow path of the substrate. A heating means provided in a pair with each of the temperature detection means on at least one of the back surfaces of the surface, a voltage control means for controlling a voltage applied to the two electrodes, and a temperature detection means There is provided a DNA amplification device comprising a heating control means for controlling the heating means based on information.

本発明のさらに他の面から、無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路の底面に設けられた第１ないし第４の電極、第１の電極と第２の電極との間に設けられた第１の弁、第１の電極と第１の弁との間に設けられた試料投入口、該試料投入口と第１の弁との間に位置し、底面に第５の電極を有する不純物導入セルに連通する第１の分岐流路、該第１の分岐流路と前記試料投入口との間の流路内に設けられたゲル状化合物、第１の弁と第２の電極との間に位置し、底面に第６の電極を有する貯留セルに連通する第２の分岐流路、第２の電極と第３の電極との間の流路底面に設けられた少なくとも１つの温度検出手段、該少なくとも１つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なくともいずれか一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、第３の電極と第４の電極との間に設けられたＤＮＡ検出手段、該ＤＮＡ検出手段と第４の電極との間に設けられた第２の弁、前記第１ないし第６の電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するＤＮＡ増幅装置が提供される。   From still another aspect of the present invention, the flow path provided on the inorganic or organic substrate, the first to fourth electrodes provided on the bottom surface of the flow path, and between the first electrode and the second electrode The first valve provided on the first electrode, the sample inlet provided between the first electrode and the first valve, and located between the sample inlet and the first valve, A first branch channel communicating with an impurity introduction cell having an electrode; a gel compound provided in a channel between the first branch channel and the sample inlet; a first valve and a second valve; At least a second branch channel that is located between the second electrode and communicates with a storage cell having a sixth electrode on the bottom surface, and is provided on the bottom surface of the channel between the second electrode and the third electrode. One temperature detection unit, a small number of channel bottoms in the vicinity of each of the at least one temperature detection unit or the back surface of the surface on which the substrate channel is provided Are either a heating means provided in a pair with each of the temperature detection means, a DNA detection means provided between the third electrode and the fourth electrode, the DNA detection means and the fourth The heating means is controlled based on information from a second valve provided between the electrodes, a voltage control means for controlling a voltage applied to the first to sixth electrodes, and a temperature detection means. There is provided a DNA amplification device comprising a heating control means.

［発明の効果］
以上のように、この発明による第１のＤＮＡ増幅装置は、反応セルをプレーナ状とすることにより反応溶液をより迅速に加熱および冷却することが可能であり、ＤＮＡ増幅反応に必要な熱サイクルで問題となる、反応溶液中に生じる温度勾配を小さくすることができる。また、加熱手段を設ける部位および加熱手段の材質を適当に選択することにより、さらに迅速に加熱および冷却を行なうことも可能である。 [The invention's effect]
As described above, the first DNA amplifying device according to the present invention can heat and cool the reaction solution more quickly by making the reaction cell planar, and can perform the thermal cycle necessary for the DNA amplification reaction. The temperature gradient generated in the reaction solution, which is a problem, can be reduced. In addition, heating and cooling can be performed more rapidly by appropriately selecting the portion where the heating means is provided and the material of the heating means.

また、この発明による第２のＤＮＡ増幅装置は、流路内に満たされた反応溶液に電圧を印加し、反応溶液中の核酸、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを所定の温度に維持された複数の領域の間で移動させてＤＮＡの増幅反応を行なう。このため、最も熱容量の大きい溶媒を加熱、冷却する必要がなく、熱サイクルの際に生じる温度勾配の問題を解消することができる。また、電気的な手段で溶液中の成分のみを移動させ、溶液の移動を伴わないため、ポンプ等の機械的な作動部材が不要であり、装置の小型化および低価格化が可能となる。   The second DNA amplification device according to the present invention applies a voltage to the reaction solution filled in the flow path, and only the nucleic acid, heat-resistant DNA synthase, primer, and deoxyribonucleoside triphosphate in the reaction solution are predetermined. The DNA amplification reaction is carried out by moving between a plurality of regions maintained at the above temperature. For this reason, it is not necessary to heat and cool the solvent having the largest heat capacity, and the problem of the temperature gradient that occurs during the thermal cycle can be solved. In addition, since only the components in the solution are moved by electric means and the solution is not moved, a mechanical operating member such as a pump is unnecessary, and the apparatus can be reduced in size and cost.

さらに、この発明による第３のＤＮＡ装置では、試料の投入から、ＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを検出するまで全て電気的な動作で行なうことが可能であり、装置を非常に小型にすることができ、また低コスト化も可能である。さらに、機械的な部材を必要としないことから全自動化も容易である。   Furthermore, in the third DNA apparatus according to the present invention, it is possible to carry out everything from the input of the sample to the amplification of the DNA and the detection of the amplified DNA, and the apparatus can be made very compact. In addition, the cost can be reduced. Furthermore, since no mechanical member is required, full automation is easy.

この発明による第１のＤＡＮ増幅装置の一具体例の平面図。The top view of one specific example of the 1st DAN amplifier by this invention. 図１に示す装置のＡ−Ａ線断面図。The AA sectional view taken on the line of the apparatus shown in FIG. この発明による第１のＤＮＡ増幅装置の別の具体例の平面図。The top view of another specific example of the 1st DNA amplification apparatus by this invention. 図３に示す装置のＢ−Ｂ線断面図。BB sectional drawing of the apparatus shown in FIG. この発明による第１のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例の平面図。The top view of another specific example of the 1st DNA amplification apparatus by this invention. 図５に示す装置のＣ−Ｃ線断面図。CC sectional view of the apparatus shown in FIG. この発明による第１のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例の平面図。The top view of another specific example of the 1st DNA amplification apparatus by this invention. 図７に示す装置のＤ−Ｄ線断面図。The DD sectional view taken on the line of the apparatus shown in FIG. この発明による第１のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例の平面図。The top view of another specific example of the 1st DNA amplification apparatus by this invention. 図９に示す装置のＥ−Ｅ線断面図。EE sectional view taken on the line of the apparatus shown in FIG. この発明による第２のＤＮＡ増幅装置の一具体例の平面図。The top view of one specific example of the 2nd DNA amplification apparatus by this invention. 図11に示す装置のＦ−Ｆ線断面図。FIG. 12 is a cross-sectional view of the device shown in FIG. この発明による第２のＤＮＡ増幅装置の別の具体例の平面図。The top view of another specific example of the 2nd DNA amplification apparatus by this invention. 図13に示す装置のＧ−Ｇ線断面図。FIG. 14 is a sectional view of the device shown in FIG. この発明による第２のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例の平面図。The top view of another specific example of the 2nd DNA amplification apparatus by this invention. 図15に示す装置のＨ−Ｈ線断面図。FIG. 16 is a cross-sectional view of the device shown in FIG. この発明による第２のＤＮＡ増幅装置のさらに別の具体例の平面図。The top view of another specific example of the 2nd DNA amplification apparatus by this invention. 図17に示す装置のＩ−Ｉ線断面図。FIG. 18 is a sectional view taken along line II of the apparatus shown in FIG. 図11ないし図18に示す装置のいずれかを１ユニットとする複数のユニットを、１つのユニットの下流に、分岐した流路を介して連結してなる装置の平面図。FIG. 19 is a plan view of an apparatus formed by connecting a plurality of units, each of which is one of the apparatuses shown in FIGS. 11 to 18, downstream of one unit via a branched flow path. この発明による第３のＤＮＡ増幅装置の一具体例の平面図。The top view of one specific example of the 3rd DNA amplification apparatus by this invention.

符号の説明Explanation of symbols

101、1101、2001…無機もしくは有機基板、 102、 701…反応セル、 103、 104、1102、2002…流路、 105、1103…透明基板、 106、 107、1104、1105、1905、1906、1907、2003、2004、2023…弁、 108、1106、1107、1108、1908、2005、2006、2007…加熱手段、 301、 302、1112、1113、1114、2011、2012、2013…温度検出手段、 501、 901…突起、1109、1110、1111、2008、2009、2010…発熱体制御手段、1115、1116、1701、1909、1910、1911、1912、2015、2016、2017、2020、2024、2027…電極、1117、2029…電圧制御手段、1301、2014…耐熱性ＤＮＡ合成酵素、1501…冷却液流路、1702、2018…貯留セル、1703、1904、2019、2026…分岐流路、1901、1902、1903…ユニット、2021…試料投入口、2022…ゲル状化合物、2025…不純物セル、2028…ＤＮＡ検出手段。    101, 1101, 2001 ... inorganic or organic substrate, 102, 701 ... reaction cell, 103, 104, 1102, 2002 ... flow path, 105, 1103 ... transparent substrate, 106, 107, 1104, 1105, 1905, 1906, 1907, 2003, 2004, 2023 ... Valve, 108, 1106, 1107, 1108, 1908, 2005, 2006, 2007 ... Heating means, 301, 302, 1112, 1113, 1114, 2011, 2012, 2013 ... Temperature detection means, 501, 901 ... Protrusions, 1109, 1110, 1111, 2008, 2009, 2010 ... Heat control means, 1115, 1116, 1701, 1909, 1910, 1911, 1912, 2015, 2016, 2017, 2020, 2024, 2027 ... electrodes, 1117, 2029 ... Voltage control means, 1301, 2014 ... Thermostable DNA synthase, 1501 ... Coolant flow path, 1702, 2018 ... Storage cell, 1703, 1904, 2019, 2026 ... Branch flow path, 1901, 1902, 1903 ... Unit, 2021 ... Sample inlet, 2022 ... Gel compound, 2025 ... Impurity cell, 2028 ... DNA detection means.

Claims (2)

無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する２つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、ＤＮＡ増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、ＤＮＡ増幅に必要なプライマー、ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸と残留する成分とに分離する反応溶液分離部を具備し、
該反応溶液分離部が、ゲル状化合物が充填された流路からなることを特徴とするＤＮＡ増幅装置。 Provided on one of the reaction part formed on the inorganic or organic substrate, the two flow paths communicating with the reaction part, and at least the bottom surface of the reaction part or the back surface of the surface on which the reaction part of the substrate is formed A heating means that can be controlled to a temperature necessary for DNA amplification, a sample separation section that communicates with the flow path, separates nucleic acid from a sample prior to nucleic acid separation such as whole blood or serum, the separated nucleic acid, and DNA amplification Means for forming a reaction solution containing the necessary primer, DNA synthase and four types of deoxyribotriphosphates in the reaction cell, and communicating between the separation part and the reaction part via a branch path, A waste part for discarding components other than the nucleic acid separated in the separation part, and a reaction solution that communicates with the flow path and separates the amplified reaction solution in the reaction part into the amplified target nucleic acid and the remaining components. Separation Equipped with,
The DNA amplification apparatus, wherein the reaction solution separation unit comprises a channel filled with a gel compound . 無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する２つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、ＤＮＡ増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、ＤＮＡ増幅に必要なプライマー、ＤＮＡ合成酵素および４種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸と残留する成分とに分離する反応溶液分離部を具備し、
該反応溶液分離部が、150μｍ以下の流路径を有する流路からなることを特徴とするＤＮＡ増幅装置。 Provided on one of the reaction part formed on the inorganic or organic substrate, the two flow paths communicating with the reaction part, and at least the bottom surface of the reaction part or the back surface of the surface on which the reaction part of the substrate is formed A heating means that can be controlled to a temperature required for DNA amplification, a sample separation section that communicates with the flow path, separates nucleic acid from a sample prior to nucleic acid separation such as whole blood or serum, the separated nucleic acid, and DNA amplification Means for forming a reaction solution containing a primer, a DNA synthesizing enzyme and four types of deoxyribotriphosphates necessary for the reaction in the reaction cell, and a communication between the separation unit and the reaction unit via a branch path, A waste part that discards components other than the nucleic acid separated by the separation part, and a reaction solution that communicates with the flow path and separates the amplified reaction solution in the reaction part into the amplified target nucleic acid and the remaining components. Separation Equipped with,
The DNA amplification apparatus, wherein the reaction solution separation part is composed of a channel having a channel diameter of 150 μm or less .
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