JP2004242607A

JP2004242607A - Reactor

Info

Publication number: JP2004242607A
Application number: JP2003037361A
Authority: JP
Inventors: Kohei Nozawa; 康平野澤
Original assignee: Sanyo Electric Co Ltd
Current assignee: Sanyo Electric Co Ltd
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2004-09-02

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a reactor of a nucleic acid by which the movement of a sample is easily controlled and a product in a sufficient amount can be obtained. <P>SOLUTION: A buffer for PCR is injected from a sample-introducing part 7, and air is extracted from a PCR reacting part 9 and a main passage 11. A DNA or the like of an amplification object is fed to the sample-introducing part 7. Electrodes 10a and 10d are energized by using the electrodes 10a and 10d as an anode and a cathode respectively to introduce the reactive component to the PCR reacting part 9, and the amplification reaction of the DNA at the PCR reacting part 9 is progressed by the control of the temperature by a heating and cooling unit. During the period, the energizing by using the electrode 10c as the anode and the electrode 10d as the cathode is continued. When the DNA amplification reaction is finished, the energizing by using the electrode 10b as the cathode and the electrode 10d as the anode is carried out to introduce the obtained PCR product to a sample-collecting part 8 and to collect the product. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、反応装置に関し、特に本発明は核酸の反応を行うための反応装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生化学、分子生物学の研究、検査で使用される様々な機器の機能、分析を１枚の微少なチップ、すなわちマイクロチップ上に集積させる技術の研究開発が行われている。このようなマイクロチップはμＴＡＳ（ＭｉｃｒｏｔｏｔａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｙｓｔｅｍ：マイクロトータル・アナリティカル・システム）と称される。μＴＡＳは、半導体微細加工技術などを用いてガラスやシリコンなどの基板上にμｇあるいはμｌのスケールの反応溶液や分析手段を設け、マイクロチップ上で反応・分析を行うものである。このような技術の利点として、試薬、試料、および廃液が少量であること、自動化することにより高速処理が可能であること、システムの小型化が可能であることなどを挙げることができる。
【０００３】
一方、生化学、分子生物学の分野で核酸の増幅方法としてＰＣＲ法（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）が一般的に用いられている（特許文献１）。たとえばＤＮＡ分析を行うためにはＤＮＡを増幅する必要があるが、このＰＣＲ法によれば、増幅しようとするＤＮＡ、すなわち鋳型ＤＮＡの両端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変成工程、アニーリング（塩基対形成）工程および伸張反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することが可能となる。
【０００４】
また、ＰＣＲ法による核酸の増幅機能をマイクロチップに持たせ、マイクロチップ上でＤＮＡ増幅を行うことが提案されている（特許文献２）。図１は、ＤＮＡ増幅機能を備えた従来のマイクロチップを模式的に示す図である。マイクロチップ１上にはリザーバー２が設けられており、サンプルや反応溶液がリザーバー２に注入される。次に、サンプルや反応溶液は、キャピラリー構造を有する流路５を経て流路５の一部分に設けられた反応部６へ圧力送液される。反応部６には温度調節部３が設けられており、反応部６の温度が制御され、ＰＣＲ反応が進行する。このようにして得られたＰＣＲ産物は圧送され、ＰＣＲ産物回収部４へ送られる。
【０００５】
しかし、従来のＤＮＡ増幅機能を備えたマイクロチップは、サンプルや反応溶液の流路と反応部とを兼ねた単管キャピラリー構造を採用していたため、次のような課題を有していた。
【０００６】
まず、キャピラリーの一部分を反応容器として用いるため、反応容器の容量が極端に少なく、増幅により得られるＤＮＡ量が少なかった。また、反応溶液に圧力を付与し、反応部まで送液する必要があるが、この際の細かい制御が困難であった。
【０００７】
また、反応液を反応部で反応させる間、反応部に反応液を保持するためにエアーまたはオイルでシールしなければならないため、エアーまたはオイルを送り、制御する装置が別途必要となり、装置が複雑化していた。
【０００８】
さらに、同一のマイクロチップ上でＰＣＲ産物を分析に供することも可能であるが、この場合、分析前にはバッファーを交換する必要がある。しかし、従来のマイクロチップの構造では、バッファーの交換の自動化は困難であった。そのため、当該分析の条件を最適化するためには手作業が必要であった。
【０００９】
【特許文献１】
米国特許第５３３３６７５号明細書
【特許文献２】
特開２００２−２０７０３１号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、試料の移動を容易に制御することができる核酸の反応装置を提供することにある。また、本発明の別の目的は、必要充分な量の生成物を得ることができる核酸の反応装置を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、試料を確実に反応部に保持し、効率良く反応を行うことができる核酸の反応装置を提供することにある。また、本発明のさらにまた別の目的は、試料を反応部に保持しながら流路中の移動相の置換を行うことができる核酸の反応装置を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、試料導入部および試料回収部を有する主流路と、該主流路の前記試料導入部から前記試料回収部に至る領域から分岐して設けられた副流路と、前記副流路に設けられた反応部と、前記試料導入部、前記試料回収部および前記反応部に、それぞれ独立に電位を与える電位付与手段と、を有することを特徴とする反応装置が提供される。
【００１２】
本発明に係る反応装置には、主流路から分岐して副流路が設けられており、副流路に反応部が設けられている。このような構成とすることにより、主流路とは別個に、副流路および反応部の形状や大きさの設計を行うことが可能となる。このため、主流路をキャピラリー等容量の少ない構成とした場合にも、反応部の容量を大きくすることができる。よって、大量増幅にも適用することが可能である。
【００１３】
また、本発明に係る反応装置では、試料導入部、試料回収部、および反応部のそれぞれに独立に電位を与えることができるため、電位を制御することにより、試料導入部に導入された試料を反応部に移動させ、反応中は試料を反応部に維持し、反応後は生成物を試料回収部に移動させるという一連のステップを、効率よく行うことができる。また、電位を制御することにより、圧力送液等の方法と比較し、微量の試料の送液を確実に制御することができる。また、試料を移動中に混合させることもできるため、効率がよい。さらに、電位を制御して、試料を反応部に維持することができるため、反応部のみを加熱する装置構成とすることが可能となる。したがって、主流路にゲルを用いた分析部など、耐熱性の低い領域が設けられている場合にも、装置全体を加熱する必要がないため、耐熱性の低い領域を保護することができる。
【００１４】
また、副流路に反応部が設けられているため、反応部に試料を保持した状態で、試料導入部と試料回収部との間で主流路のバッファー交換を容易に実施することができる。したがって、たとえば生体試料から目的成分の抽出、分離、反応、分析等のステップを連続的に行う場合にも、それぞれのステップに最適な条件で実施することが可能である。
【００１５】
さらに、反応部に連通する副流路中の液体が試料の蒸発を防止する構成となっているため、試料導入部、試料回収部は開放系とすることができる。
【００１６】
本発明の反応装置において、前記反応部に加熱手段が設けられた構成とすることができる。こうすることにより、反応部での反応温度を変化させることができる。したがって、より一層反応に適した条件で反応させることが可能となり、反応を確実に行うことができる。
【００１７】
本発明の反応装置において、前記主流路および前記副流路が、板状基材中に設けられた構成とすることができる。こうすることにより、使用目的に応じた主流路および副流路をさらに容易に製造することが可能となる。また、目的に応じた設計の幅、長さ等を有する流路を容易に製造することができる。
【００１８】
本発明の反応装置において、前記電位付与手段は、前記試料導入部、前記試料回収部および前記反応部にそれぞれ設けられた電極と、各電極間に電圧を印加する電源と、を含むことができる。こうすることにより、試料導入部、試料回収部、反応部のそれぞれ独立により一層確実かつ容易に電位を付与することができる。したがって、試料導入部に導入された試料を反応部に移動させ、反応中は試料を反応部に維持し、反応後は生成物を試料回収部に移動させるという一連のステップを、さらに確実に行うことが可能となる。
【００１９】
本発明の反応装置において、前記試料導入部から前記反応部に至る経路と、前記反応部から前記試料回収部に至る経路とが、密閉構造を有する構成とすることができる。こうすることにより、反応部に保持された試料が副流路およびそれに連通する主流路を蓋として保持されるため、反応部の試料の蒸発を抑制し、確実に保持することが可能である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本実施形態は、生化学反応を行うマイクロチップに関する。以下、生化学反応がＰＣＲ法による核酸の増幅である場合を例に、好ましい実施形態について説明する。
【００２１】
図２は本実施形態に係るマイクロチップ１３の構成を示す上面図である。また図３は、図２のマイクロチップ１３の基板１５およびカバー１６の構成を示す斜視図である。図３（ａ）に示される基板１５の上面に図３（ｂ）に示されるカバー１６を重ねることにより、図２のマイクロチップ１３が得られる。
【００２２】
図３（ａ）に示すように、基板１５には、試料導入部７、試料回収部８、およびこれらを連通させる主流路１１が形成されている。また、主流路１１から分岐して副流路１２が形成されており、副流路１２はＰＣＲ反応部９に連通する。ここで、後述するように、ＰＣＲ反応部９は最高９５℃まで達するため、基板１５には高温に耐え得る材料、たとえばガラス、石英、シリコン、耐熱性プラスチックなどを用いる。基板１５の材料への各部材形成方法として、たとえばエッチング、レーザ加工、フォトリソグラフィー等の方法を採用することができる。
【００２３】
また、図３（ｂ）に示すように、カバー１６には、基板１５の上面に設置した際に試料導入部７および試料回収部８に重なるように、孔が設けられている。また、試料導入部７、試料回収部８、主流路１１の他端、およびＰＣＲ反応部９に重なる位置に、それぞれ電極１０ａ、電極１０ｂ、電極１０ｃ、および電極１０ｄが貫通して設けられている。電極１０ａおよび電極１０ｂの下端は、基板１５の試料導入部７および試料回収部８の底部より上部に位置するような構成とする。また、電極１０ｃおよび電極１０ｄの下端は、それぞれ副流路１２およびＰＣＲ反応部９の底部より上部に位置するような構成とする。これらの電極を駆動装置にセットすることによって、任意の電極間に電圧を付与することが可能となる。
【００２４】
なお、これらの電極として、たとえば導電性の金属や炭素材料を用いることができる。また、カバー１６には、たとえば基板１５に用いることができる材料を用いる。カバー１６に電極を貫装するための孔を形成し、各電極を貫通させて固定することにより、容易に各電極を設けることができる。
【００２５】
また、基板１５に設けられたＰＣＲ反応部９と主流路１１はカバー１６により密閉されている一方、試料導入部７および試料回収部８は開放されている。なお、ＰＣＲ反応部９に栓やシール等により開閉が可能な空気穴（不図示）を設けてもよい。こうすれば、空気穴を開放した状態でＰＣＲ反応部９にバッファー等を充填し、満たされた段階で空気穴を閉鎖すると密閉系が得られるため、バッファー等のＰＣＲ反応部９への充填が容易となる。
【００２６】
なお、図２中に波線で示した領域は、マイクロチップを駆動装置（不図示）にセットした際に、駆動装置に備えられている加熱冷却ユニットが位置する領域を表している。マイクロチップを駆動装置にセットした状態で、ＰＣＲ反応部９と加熱冷却ユニットとが密着するようになっており、ＰＣＲ反応部９の温度を制御できるようになっている。また、この際の熱交換が効率良く進行するように、ＰＣＲ反応部９は図２に示されるような底面積の大きい直方体となっている。
【００２７】
次に、図２を参照して、マイクロチップ１３の動作についてＤＮＡの増幅を例として説明する。
【００２８】
まず、試料導入部７よりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用バッファーを注入する。ここで、試料導入部７および試料回収部８は、バッファーのリザーバーとしての機能も兼ね備えている。試料導入部７および試料回収部８に注入されたバッファーの液面がＰＣＲ反応部９および主流路１１の高さよりも高くなるようにする。また適宜ＰＣＲ反応部９および主流路１１中の気泡を除去する。こうすることにより、試料導入部７、試料回収部８、ＰＣＲ反応部９および主流路１１に液体が均一に行き渡り、以降の処理を円滑、確実に進めることができる。
【００２９】
次に、増幅しようとする領域を有するＤＮＡ、増幅しようとする領域の両端に相補的なプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を所定量ずつ試料導入部７に投入する。
【００３０】
その後、電極１０ａおよび１０ｄをそれぞれ陰極および陽極として通電すると、マイナスに帯電したＤＮＡ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸が電極１０ｄに向かって移動する。このように、図２のマイクロチップではＤＮＡやプライマー等が確実にＰＣＲ反応部９へと誘導される。その後、ＰＣＲ反応部９においてＤＮＡ増幅反応を行うが、この間は電極１０ｃを陰極、電極１０ｄを陽極として電流を流す。こうして、ＤＮＡやプライマー等がＰＣＲ反応部９の外部へと拡散することを防止する。なお、図２の各電極間に形成する電界強度は、たとえば０．１Ｖ／ｃｍ以上２０Ｖ／ｃｍ以下とする。本実施形態に係る核酸増幅装置では、従来電気泳動等を行う際に流す電流に比べて微弱な電流によって確実にＰＣＲ反応部９に試料を保持させることが可能となる。
【００３１】
ＰＣＲ反応部９でのＤＮＡ増幅反応は、加熱冷却ユニットによる温度制御に従って進行する。すなわち、ＰＣＲ反応部９をたとえば９５℃で２分間保つことにより２本鎖ＤＮＡを１本鎖に変性させ、次いでＰＣＲ反応部９をたとえば５０〜６０℃付近で２分間保つことにより１本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる。その後、ＰＣＲ反応部９をたとえば７４℃で３分間保つことにより、ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸張反応を進行させる。以上を１サイクルとして、これをたとえば３０サイクル繰り返す。
【００３２】
ＤＮＡ増幅反応が終了した後は、電極１０ｂおよび１０ｄをそれぞれ陽極および陰極として電流を流すことにより、ＰＣＲ反応により得られたＰＣＲ産物を試料回収部８へ誘導し、回収する。
【００３３】
また、得られたＰＣＲ産物の分析等を行うためにバッファーの交換をする必要がある場合には、ＰＣＲ反応終了後、電極１０ｃを陰極、電極１０ｄを陽極とし、ＰＣＲ産物をＰＣＲ反応部９内に保持した状態で、交換前のバッファーを圧力送液することにより試料導入部７から試料回収部８へとフラッシュする。その後、交換するバッファーを試料導入部７から注入する。そして、上述の場合と同様にＰＣＲ産物を試料回収部８へ誘導することによりバッファーが交換されたＰＣＲ産物を得ることができる。
【００３４】
このように、図２のマイクロチップでは、ＰＣＲ反応部９が従来のキャピラリー内でＰＣＲ反応を行うマイクロチップに比べて大きく、またＰＣＲ反応部９が良好に温度制御されるため、種々の実験に利用するために十分な量のＤＮＡが得られる。また、主流路１１およびＰＣＲ反応部９が密閉された構成となっているため、簡易な構成でありながらＰＣＲ反応部９に反応液を維持することができる。さらに、ＰＣＲ産物を試料回収部８に保持させた状態での圧力送液により、容易にバッファー交換を行うことができる。したがって、μＴＡＳ等のマイクロ化学反応リアクタに搭載した際にもＰＣＲ産物の処理や分析などのステップを最適なバッファー条件で連続的に実施することができる設計となっている。
【００３５】
以上、ＤＮＡの増幅を例に図２のマイクロチップの動作について説明したが、増幅対象の核酸がＲＮＡである場合についても、同様に適用可能である。
【００３６】
なお、図２のマイクロチップでは、ＰＣＲ反応部９を一箇所にのみ設けた場合を示したが、複数とすることもできる。図６は、３つのＰＣＲ反応部を含むマイクロチップの構成を示す上面図である。試料導入部７と試料回収部８は主流路２１により連通されている。また、副流路２２、副流路２３、および副流路２４にはＰＣＲ反応部９ａ、９ｂおよび９ｃが連通している。ＰＣＲ反応部９ａ、９ｂおよび９ｃには、電極１０ｄ、１０ｆおよび１０ｈが設けられている。また、電極１０ｄ、１０ｆおよび１０ｈと対向する位置に電極１０ｃ、１０ｅおよび１０ｇが設けられている。マイクロチップをこのような構成とした場合、複数の試料を同時にまたは連続して処理することが可能となるため、より一層効率良く核酸を増幅することができる。
【００３７】
なお、本実施形態において、各電極に印加する電圧を制御することによりＤＮＡをキャピラリーの一端に移動させ、これを保持することにより、ＤＮＡの保持された一端のみを加熱しても効率よくＰＣＲ反応が進行することが、実験例により実証された。以下このような実験例について説明する。
【００３８】
（実験例１）
本実験例では、図２の構成のマイクロチップに先立ち、ＰＣＲ反応用キャピラリーを用い、これを加熱冷却ユニットに密着させてＰＣＲ反応を行った。図４は、本実験例に用いた加熱冷却ユニット１０１を示す図である。図４の加熱冷却ユニット１０１の作製は以下のようにして行った。
【００３９】
まず、２０ｍｍ×２０ｍｍのアルミ角材を長さ６５ｍｍに切断し、断面の一部を図４のように１０ｍ×１０ｍｍ角削除した。得られたＬ字型のアルミブロックに、幅ａ＝１．５ｍｍ、深さｂ＝２．５ｍｍの短スリット１０３および長スリット１０５をそれぞれ形成した。得られた加熱冷却ユニット１０１は、所定の反応温度に加熱してＰＣＲ反応に用いた。加熱冷却ユニット１０１は３個用意し、それぞれ９４℃、４４℃、および７２℃に設定されたヒートブロック上に固定した。
【００４０】
また、図５は本実験例に用いたＰＣＲ反応用キャピラリーを示す図である。図５のＰＣＲ反応用キャピラリーは、内径１ｍｍのキャピラリー１０７に正極１１１および負極１１３となる電極１０９が設けられた電極付キャピラリーチューブである。
【００４１】
図５のＰＣＲ反応用キャピラリーを加熱冷却ユニット１０１の長スリット１０５に設置することにより、キャピラリー全体が加熱される。また。加熱冷却ユニット１０１の短スリット１０３に設置することにより、正極１１１または負極１１３のいずれかのみを選択的に加熱することができる。
【００４２】
図５のＰＣＲ反応用キャピラリーに、ＴａＫａＲａ社製ＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｒ０１１）の増幅コントロール反応液（５００ｂｐまたは６０００ｂｐ）を充填した。そして、ＰＣＲ反応用キャピラリーに５Ｖの電圧を印加し、正極１１１側の末端１ｃｍを各加熱冷却ユニット１０１の短スリット１０３に固定し、ＰＣＲ反応を行った。このとき、正極１１１と負極１１３との間に、２０Ｖの電圧を印加した。反応条件は、９４℃、２分間の変性、５５℃、２分間のアニーリング、および７２℃、３分間の鎖伸張反応とし、これを１サイクルとして３０サイクル繰り返した。
【００４３】
増幅後のＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供したところ、５００ｂｐ、６０００ｂｐのいずれの場合についても、効率よくＰＣＲ増幅がなされていることが明らかになった。
【００４４】
（実験例２）
実験例１において、ＰＣＲ反応用キャピラリーに電圧を印加せずに、ＰＣＲ反応を行った。このとき、ＰＣＲ反応用キャピラリーを加熱冷却ユニット１０１の長スリット１０５に固定した。反応条件は実験例１と同様である。
【００４５】
増幅後のＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供したところ、５００ｂｐ、６０００ｂｐのいずれの場合についても、効率よくＰＣＲ増幅がなされていた。
【００４６】
（実験例３）
実験例１において、ＰＣＲ反応用キャピラリーに電圧を印加せずに、ＰＣＲ反応を行った。このとき実験例１と同様に、ＰＣＲ反応用キャピラリーを加熱冷却ユニット１０１の短スリット１０３に固定した。反応条件は実験例１と同様である。
【００４７】
増幅後のＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供したところ、５００ｂｐ、６０００ｂｐのいずれの場合についても、ＰＣＲ増幅が不十分であった。これは、短スリット１０３を用いたにも関わらず、ＰＣＲ反応用キャピラリーに電圧を印加しなかったため、加熱された部位に反応成分が誘導されず、加熱が不十分となったためであると考えられる。
【００４８】
（実験例４）
実験例１と同様にしてＰＣＲ反応を行った。ただし、本実験例においてはＰＣＲ反応用キャピラリーの負極１１３側の末端１ｃｍを各加熱冷却ユニット１０１の短スリット１０３に固定した。
【００４９】
増幅後のＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供したところ、５００ｂｐ、６０００ｂｐのいずれの場合についても、ＰＣＲ増幅が不十分であった。これは、反応成分は正極１１１側に誘導されるにも関わらず負極１１３側の末端１ｃｍを各加熱冷却ユニット１０１の短スリット１０３に固定したため、反応成分の加熱が不十分であったためと考えられる。
【００５０】
以上の実験例より、キャピラリー１０７に電圧を付与せずに全体を加熱した場合と同様に、キャピラリー１０７の両端に電圧を印加し、正極側のみを加熱した場合についても効率よくＰＣＲ反応が行われることが明らかになった。これは、キャピラリー１０７の両端に電圧を印加することにより反応成分が正極側に誘導され、誘導された正極側の末端が効率よく加熱されたためであると考えられる。したがって、実験例１を図２の構成のマイクロチップに適用することにより、ＤＮＡ増幅を効率よく行うマイクロチップが得られる。
【００５１】
以上、実施形態をもとに本発明を説明した。本発明はこの実施形態に限定されることなく、その様々な変形例もまた、本発明の態様として有効である。たとえば、図２のマイクロチップでは、ＰＣＲ反応部９においてＰＣＲ法により核酸を増幅するが、ＰＣＲ法以外の方法により核酸を増幅する態様としてもよい。また、核酸の増幅に限らず、核酸に対して行う酵素反応等、核酸の種々の反応に適用することが可能である。
【００５２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、試料の移動を容易に制御することができる核酸の反応装置が実現される。また本発明によれば、必要充分な量の生成物を得ることができる核酸の反応装置が実現される。また本発明によれば、試料を確実に反応部に保持し、効率良く反応を行うことができる核酸の反応装置が実現される。さらに本発明によれば、試料を反応部に保持しながら流路中の移動相の置換を行うことができる核酸の反応装置が実現される。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の核酸増幅機能を備えたマイクロチップを示す上面図である。
【図２】実施の形態に係るマイクロチップの構成を示す上面図である。
【図３】図２のマイクロチップの基板およびカバーの構成を示す斜視図である。
【図４】実施の形態に係る加熱冷却ユニットの構成を示す斜視図である。
【図５】実施の形態に係るＰＣＲ反応用キャピラリーの構成を示す正面図である。
【図６】実施の形態に係るマイクロチップの構成を示す上面図である。
【符号の説明】
１、１３、１４マイクロチップ、２リザーバー、３温度調節部、４ＰＣＲ産物回収部、５流路、６反応部、７試料導入部、８試料回収部、９、９ａ、９ｂ、９ｃＰＣＲ反応部、１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ、１０ｅ、１０ｆ、１０ｇ、１０ｈ電極、１１、２１主流路、１２、２２、２３、２４副流路、１５基板、１６カバー、１０１加熱冷却ユニット、１０３短スリット、１０５長スリット、１０７キャピラリー、１０９電極、１１１正極、１１３負極。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a reaction apparatus, and more particularly, to a reaction apparatus for performing a nucleic acid reaction.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art In recent years, research and development of technology for integrating functions and analyzes of various devices used in research and testing of biochemistry and molecular biology on one microchip, that is, a microchip, has been performed. Such a microchip is called μTAS (Micrototal Analytical System: micro total analytical system). In the μTAS, a reaction solution or analysis means of a scale of μg or μl is provided on a substrate such as glass or silicon using a semiconductor fine processing technology or the like, and a reaction and analysis are performed on a microchip. Advantages of such a technique include that the amount of reagents, samples, and waste liquids is small, that high-speed processing is possible by automation, that the system can be downsized, and the like.
[0003]
On the other hand, in the fields of biochemistry and molecular biology, a PCR method (Polymerase Chain Reaction: polymerase chain reaction) is generally used as a nucleic acid amplification method (Patent Document 1). For example, in order to perform DNA analysis, it is necessary to amplify the DNA. According to this PCR method, a primer having a base sequence complementary to the base sequence at both ends of the DNA to be amplified, ie, the template DNA, and a heat-resistant primer By using a DNA polymerase and repeating a cycle consisting of a thermal denaturation step, an annealing (base pair formation) step and an extension reaction step, a DNA fragment substantially the same as the template DNA can be amplified.
[0004]
In addition, it has been proposed that a microchip be provided with a function of amplifying a nucleic acid by a PCR method to perform DNA amplification on the microchip (Patent Document 2). FIG. 1 is a diagram schematically showing a conventional microchip having a DNA amplification function. A reservoir 2 is provided on the microchip 1, and a sample or a reaction solution is injected into the reservoir 2. Next, the sample and the reaction solution are pressure-fed to the reaction part 6 provided in a part of the flow path 5 via the flow path 5 having a capillary structure. The reaction section 6 is provided with a temperature control section 3, and the temperature of the reaction section 6 is controlled so that the PCR reaction proceeds. The PCR product thus obtained is sent under pressure and sent to the PCR product recovery section 4.
[0005]
However, a conventional microchip having a DNA amplification function has the following problems because it employs a single-tube capillary structure that also serves as a flow path for a sample or a reaction solution and a reaction section.
[0006]
First, since a part of the capillary was used as a reaction vessel, the capacity of the reaction vessel was extremely small, and the amount of DNA obtained by amplification was small. Further, it is necessary to apply pressure to the reaction solution and send it to the reaction section, but it is difficult to perform detailed control at this time.
[0007]
In addition, during the reaction of the reaction liquid in the reaction section, the reaction section must be sealed with air or oil in order to hold the reaction liquid. Had been transformed.
[0008]
Furthermore, it is possible to use the PCR product for analysis on the same microchip, but in this case, it is necessary to exchange buffers before analysis. However, with the conventional microchip structure, it was difficult to automate buffer exchange. Therefore, manual work was required to optimize the conditions of the analysis.
[0009]
[Patent Document 1]
US Patent No. 5,333,675 [Patent Document 2]
JP 2002-207031 A
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a nucleic acid reaction device that can easily control the movement of a sample. It is another object of the present invention to provide a nucleic acid reaction apparatus capable of obtaining a necessary and sufficient amount of a product. It is still another object of the present invention to provide a nucleic acid reaction apparatus capable of securely holding a sample in a reaction section and efficiently performing a reaction. It is still another object of the present invention to provide a nucleic acid reaction device capable of replacing a mobile phase in a flow channel while holding a sample in a reaction section.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
According to the present invention, a main flow path having a sample introduction part and a sample collection part, a sub flow path provided by branching from a region of the main flow path from the sample introduction part to the sample collection part, and the sub flow path A reaction apparatus is provided, comprising: a reaction section provided in a path; and potential applying means for independently applying a potential to the sample introduction section, the sample collection section, and the reaction section.
[0012]
The reaction device according to the present invention is provided with a sub flow path branched from the main flow path, and a reaction section is provided in the sub flow path. With such a configuration, it is possible to design the shape and size of the sub flow path and the reaction section separately from the main flow path. For this reason, even when the main flow path is configured to have a small capacity such as a capillary, the capacity of the reaction section can be increased. Therefore, the present invention can be applied to mass amplification.
[0013]
Further, in the reaction device according to the present invention, since a potential can be independently applied to each of the sample introduction section, the sample collection section, and the reaction section, by controlling the potential, the sample introduced into the sample introduction section can be controlled. A series of steps of moving the sample to the reaction section, maintaining the sample in the reaction section during the reaction, and moving the product to the sample recovery section after the reaction can be efficiently performed. In addition, by controlling the potential, it is possible to reliably control the sending of a small amount of sample as compared with a method such as pressure sending. Further, since the sample can be mixed during the movement, the efficiency is high. Furthermore, since the potential can be controlled and the sample can be maintained in the reaction section, it is possible to adopt a configuration in which only the reaction section is heated. Therefore, even when an area having low heat resistance such as an analysis section using gel is provided in the main flow path, it is not necessary to heat the entire apparatus, so that the area having low heat resistance can be protected.
[0014]
In addition, since the reaction section is provided in the sub-flow path, the buffer exchange of the main flow path can be easily performed between the sample introduction section and the sample collection section while the sample is held in the reaction section. Therefore, for example, even when steps such as extraction, separation, reaction, and analysis of a target component from a biological sample are continuously performed, the steps can be performed under conditions that are optimal for each step.
[0015]
Furthermore, since the liquid in the sub-flow path communicating with the reaction unit is configured to prevent the evaporation of the sample, the sample introduction unit and the sample collection unit can be open systems.
[0016]
In the reaction apparatus of the present invention, the reaction section may be provided with a heating means. By doing so, the reaction temperature in the reaction section can be changed. Therefore, the reaction can be carried out under conditions more suitable for the reaction, and the reaction can be performed reliably.
[0017]
In the reaction device of the present invention, the main flow path and the sub flow path may be provided in a plate-shaped substrate. This makes it easier to manufacture the main flow path and the sub flow path according to the purpose of use. Further, it is possible to easily manufacture a flow channel having a width, a length, and the like designed according to the purpose.
[0018]
In the reaction device according to the aspect of the invention, the potential applying unit may include electrodes provided in the sample introduction unit, the sample collection unit, and the reaction unit, respectively, and a power supply that applies a voltage between the electrodes. . This makes it possible to more reliably and easily apply a potential independently of the sample introduction unit, the sample collection unit, and the reaction unit. Therefore, a series of steps of moving the sample introduced into the sample introduction part to the reaction part, maintaining the sample in the reaction part during the reaction, and moving the product to the sample collection part after the reaction is performed more reliably. It becomes possible.
[0019]
In the reaction apparatus of the present invention, the path from the sample introduction section to the reaction section and the path from the reaction section to the sample collection section may have a closed structure. By doing so, the sample held in the reaction section is held as the sub-flow path and the main flow path communicating therewith as a lid, so that evaporation of the sample in the reaction section can be suppressed, and the sample can be reliably held.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
This embodiment relates to a microchip that performs a biochemical reaction. Hereinafter, a preferred embodiment will be described by taking, as an example, a case where the biochemical reaction is amplification of a nucleic acid by a PCR method.
[0021]
FIG. 2 is a top view showing the configuration of the microchip 13 according to the present embodiment. FIG. 3 is a perspective view showing the configuration of the substrate 15 and the cover 16 of the microchip 13 in FIG. By overlaying the cover 16 shown in FIG. 3B on the upper surface of the substrate 15 shown in FIG. 3A, the microchip 13 shown in FIG. 2 is obtained.
[0022]
As shown in FIG. 3A, the substrate 15 is provided with a sample introduction section 7, a sample collection section 8, and a main flow path 11 for communicating these. Further, a sub flow path 12 is formed branching from the main flow path 11, and the sub flow path 12 communicates with the PCR reaction section 9. Here, as will be described later, since the PCR reaction section 9 reaches a maximum of 95 ° C., the substrate 15 is made of a material that can withstand high temperatures, for example, glass, quartz, silicon, heat-resistant plastic, or the like. As a method of forming each member on the material of the substrate 15, for example, a method such as etching, laser processing, photolithography, or the like can be employed.
[0023]
As shown in FIG. 3B, the cover 16 is provided with holes so as to overlap the sample introduction unit 7 and the sample collection unit 8 when the cover 16 is installed on the upper surface of the substrate 15. Further, electrodes 10 a, 10 b, 10 c, and 10 d are provided to penetrate the sample introduction unit 7, the sample collection unit 8, the other end of the main channel 11, and the position overlapping with the PCR reaction unit 9, respectively. . The lower ends of the electrodes 10 a and 10 b are configured to be located above the bottoms of the sample introduction section 7 and the sample recovery section 8 of the substrate 15. The lower ends of the electrode 10c and the electrode 10d are configured to be located above the sub flow path 12 and the bottom of the PCR reaction section 9, respectively. By setting these electrodes in the driving device, it is possible to apply a voltage between any electrodes.
[0024]
In addition, as these electrodes, for example, a conductive metal or carbon material can be used. For the cover 16, for example, a material that can be used for the substrate 15 is used. Each electrode can be easily provided by forming a hole for penetrating the electrode in the cover 16 and penetrating and fixing each electrode.
[0025]
The PCR reaction section 9 and the main flow channel 11 provided on the substrate 15 are closed by a cover 16, while the sample introduction section 7 and the sample collection section 8 are open. Note that the PCR reaction section 9 may be provided with an air hole (not shown) that can be opened and closed with a stopper, a seal, or the like. In this way, a buffer or the like is filled in the PCR reaction section 9 with the air hole opened, and a closed system is obtained by closing the air hole when the PCR reaction section 9 is filled, so that the buffer and the like can be filled in the PCR reaction section 9. It will be easier.
[0026]
The area indicated by the dashed line in FIG. 2 indicates the area where the heating / cooling unit provided in the driving device is located when the microchip is set in the driving device (not shown). With the microchip set in the driving device, the PCR reaction unit 9 and the heating / cooling unit are in close contact with each other, so that the temperature of the PCR reaction unit 9 can be controlled. In addition, the PCR reaction section 9 is a rectangular parallelepiped having a large bottom area as shown in FIG. 2 so that the heat exchange at this time proceeds efficiently.
[0027]
Next, the operation of the microchip 13 will be described with reference to FIG.
[0028]
First, a polymerase chain reaction (PCR) buffer is injected from the sample introduction unit 7. Here, the sample introduction unit 7 and the sample recovery unit 8 also have a function as a buffer reservoir. The liquid level of the buffer injected into the sample introduction part 7 and the sample recovery part 8 is set higher than the height of the PCR reaction part 9 and the main flow path 11. In addition, air bubbles in the PCR reaction section 9 and the main channel 11 are appropriately removed. By doing so, the liquid is uniformly distributed to the sample introduction unit 7, the sample recovery unit 8, the PCR reaction unit 9, and the main flow path 11, and the subsequent processing can be smoothly and reliably proceeded.
[0029]
Next, DNA having a region to be amplified, primers complementary to both ends of the region to be amplified, a heat-resistant DNA polymerase, and four types of 5 ′ deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Are charged into the sample introduction unit 7 by a predetermined amount.
[0030]
Thereafter, when the electrodes 10a and 10d are energized as a cathode and an anode, respectively, the negatively charged DNA, primer, heat-resistant DNA polymerase and four types of 5 'deoxyribonucleotide triphosphate move toward the electrode 10d. Thus, in the microchip of FIG. 2, DNA, primers, and the like are reliably guided to the PCR reaction section 9. Thereafter, a DNA amplification reaction is performed in the PCR reaction section 9, and during this time, current is caused to flow using the electrode 10c as a cathode and the electrode 10d as an anode. Thus, diffusion of DNA, primers, etc. to the outside of the PCR reaction section 9 is prevented. The electric field intensity formed between the electrodes in FIG. 2 is, for example, 0.1 V / cm or more and 20 V / cm or less. In the nucleic acid amplifying device according to the present embodiment, it is possible to reliably hold the sample in the PCR reaction unit 9 with a current that is weaker than the current that flows when performing conventional electrophoresis or the like.
[0031]
The DNA amplification reaction in the PCR reaction section 9 proceeds according to the temperature control by the heating / cooling unit. That is, the double-stranded DNA is denatured into a single strand by keeping the PCR reaction section 9 at, for example, 95 ° C. for 2 minutes, and then, by keeping the PCR reaction section 9 at, for example, about 50 to 60 ° C. for 2 minutes. Let the primers anneal. Thereafter, by keeping the PCR reaction section 9 at, for example, 74 ° C. for 3 minutes, the chain extension reaction by the DNA polymerase proceeds. This is repeated as one cycle, for example, 30 cycles are repeated.
[0032]
After the completion of the DNA amplification reaction, the PCR product obtained by the PCR reaction is guided to the sample collection section 8 and collected by applying current using the electrodes 10b and 10d as an anode and a cathode, respectively.
[0033]
When it is necessary to exchange buffers for analysis of the obtained PCR product, after the PCR reaction is completed, the electrode 10c is used as a cathode and the electrode 10d is used as an anode. In this state, the buffer before replacement is fed under pressure to flush from the sample introduction unit 7 to the sample collection unit 8. Thereafter, the buffer to be exchanged is injected from the sample introduction unit 7. Then, by inducing the PCR product into the sample collection unit 8 in the same manner as described above, the PCR product in which the buffer has been exchanged can be obtained.
[0034]
As described above, in the microchip of FIG. 2, the PCR reaction section 9 is larger than the conventional microchip that performs a PCR reaction in a capillary, and the temperature of the PCR reaction section 9 is well controlled. A sufficient amount of DNA is obtained for use. In addition, since the main flow path 11 and the PCR reaction section 9 are configured to be sealed, the reaction solution can be maintained in the PCR reaction section 9 with a simple configuration. Furthermore, buffer exchange can be easily performed by pressure feeding while the PCR product is held in the sample collection unit 8. Therefore, the design is such that steps such as processing and analysis of PCR products can be continuously performed under optimal buffer conditions even when mounted on a microchemical reaction reactor such as μTAS.
[0035]
Although the operation of the microchip of FIG. 2 has been described above by taking DNA amplification as an example, the present invention can be similarly applied to a case where the nucleic acid to be amplified is RNA.
[0036]
In addition, in the microchip of FIG. 2, the case where the PCR reaction unit 9 is provided only at one place is shown, but a plurality may be provided. FIG. 6 is a top view illustrating a configuration of a microchip including three PCR reaction units. The sample introduction section 7 and the sample collection section 8 are connected by a main flow path 21. The PCR reaction sections 9a, 9b, and 9c communicate with the sub flow path 22, the sub flow path 23, and the sub flow path 24. The PCR reaction sections 9a, 9b and 9c are provided with electrodes 10d, 10f and 10h. Further, electrodes 10c, 10e and 10g are provided at positions facing the electrodes 10d, 10f and 10h. When the microchip has such a configuration, a plurality of samples can be processed simultaneously or continuously, so that nucleic acids can be more efficiently amplified.
[0037]
In this embodiment, the DNA is moved to one end of the capillary by controlling the voltage applied to each electrode, and by holding this, the PCR reaction can be efficiently performed even if only the held one end of the DNA is heated. Progress was demonstrated by experimental examples. Hereinafter, such experimental examples will be described.
[0038]
(Experimental example 1)
In the present experimental example, prior to the microchip having the configuration shown in FIG. 2, a PCR reaction capillary was used, and this was brought into close contact with a heating / cooling unit to perform a PCR reaction. FIG. 4 is a diagram illustrating the heating / cooling unit 101 used in the present experimental example. The production of the heating / cooling unit 101 of FIG. 4 was performed as follows.
[0039]
First, a 20 mm × 20 mm aluminum square was cut to a length of 65 mm, and a part of the cross section was deleted by a 10 × 10 mm square as shown in FIG. A short slit 103 and a long slit 105 each having a width a = 1.5 mm and a depth b = 2.5 mm were formed in the obtained L-shaped aluminum block. The obtained heating / cooling unit 101 was heated to a predetermined reaction temperature and used for a PCR reaction. Three heating / cooling units 101 were prepared and fixed on a heat block set at 94 ° C., 44 ° C., and 72 ° C., respectively.
[0040]
FIG. 5 is a diagram showing the capillary for PCR reaction used in this experimental example. The capillary for PCR reaction in FIG. 5 is a capillary tube with electrodes in which a capillary 107 having an inner diameter of 1 mm is provided with an electrode 109 serving as a positive electrode 111 and a negative electrode 113.
[0041]
By placing the PCR reaction capillary of FIG. 5 in the long slit 105 of the heating / cooling unit 101, the entire capillary is heated. Also. By installing in the short slit 103 of the heating and cooling unit 101, only either the positive electrode 111 or the negative electrode 113 can be selectively heated.
[0042]
The PCR reaction capillary of FIG. 5 was filled with an amplification control reaction solution (500 bp or 6000 bp) of TaKaRa PCR Amplification Kit (R011). Then, a voltage of 5 V was applied to the PCR reaction capillary, and the terminal 1 cm on the positive electrode 111 side was fixed to the short slit 103 of each heating / cooling unit 101 to perform a PCR reaction. At this time, a voltage of 20 V was applied between the positive electrode 111 and the negative electrode 113. The reaction conditions were denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, annealing at 55 ° C. for 2 minutes, and chain extension reaction at 72 ° C. for 3 minutes. One cycle was repeated 30 times.
[0043]
When the amplified PCR product was subjected to agarose electrophoresis, it was found that the PCR was efficiently amplified in both cases of 500 bp and 6000 bp.
[0044]
(Experimental example 2)
In Experimental Example 1, a PCR reaction was performed without applying a voltage to the PCR reaction capillary. At this time, the capillary for PCR reaction was fixed to the long slit 105 of the heating / cooling unit 101. The reaction conditions are the same as in Experimental Example 1.
[0045]
When the amplified PCR product was subjected to agarose electrophoresis, the PCR was efficiently amplified in both cases of 500 bp and 6000 bp.
[0046]
(Experimental example 3)
In Experimental Example 1, a PCR reaction was performed without applying a voltage to the PCR reaction capillary. At this time, the capillary for PCR reaction was fixed to the short slit 103 of the heating / cooling unit 101 in the same manner as in Experimental Example 1. The reaction conditions are the same as in Experimental Example 1.
[0047]
When the amplified PCR product was subjected to agarose electrophoresis, PCR amplification was insufficient in both cases of 500 bp and 6000 bp. This is considered to be because, despite the use of the short slit 103, no voltage was applied to the capillary for PCR reaction, so that the reaction components were not induced in the heated site and heating was insufficient. .
[0048]
(Experimental example 4)
A PCR reaction was performed in the same manner as in Experimental Example 1. However, in this experimental example, the terminal 1 cm on the negative electrode 113 side of the capillary for PCR reaction was fixed to the short slit 103 of each heating and cooling unit 101.
[0049]
When the amplified PCR product was subjected to agarose electrophoresis, PCR amplification was insufficient in both cases of 500 bp and 6000 bp. This is probably because the reaction component was guided to the positive electrode 111 side, but the terminal 1 cm on the negative electrode 113 side was fixed to the short slit 103 of each heating and cooling unit 101, so that the heating of the reaction component was insufficient. .
[0050]
According to the above experimental example, similarly to the case where the whole is heated without applying a voltage to the capillary 107, the PCR reaction is efficiently performed even when the voltage is applied to both ends of the capillary 107 and only the positive electrode side is heated. It became clear. This is considered to be because the reaction component was induced to the positive electrode side by applying a voltage to both ends of the capillary 107, and the induced terminal on the positive electrode side was efficiently heated. Therefore, by applying Experimental Example 1 to the microchip having the configuration shown in FIG. 2, a microchip that efficiently performs DNA amplification can be obtained.
[0051]
The present invention has been described based on the embodiments. The present invention is not limited to this embodiment, and various modifications thereof are also effective as aspects of the present invention. For example, in the microchip of FIG. 2, the nucleic acid is amplified by the PCR method in the PCR reaction unit 9, but the nucleic acid may be amplified by a method other than the PCR method. Further, the present invention is not limited to nucleic acid amplification, and can be applied to various nucleic acid reactions such as an enzymatic reaction performed on the nucleic acid.
[0052]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a nucleic acid reaction device capable of easily controlling the movement of a sample is realized. Further, according to the present invention, a nucleic acid reaction device capable of obtaining a necessary and sufficient amount of a product is realized. Further, according to the present invention, a nucleic acid reaction device capable of securely holding a sample in a reaction section and efficiently performing a reaction is realized. Further, according to the present invention, a nucleic acid reaction device capable of replacing a mobile phase in a flow channel while holding a sample in a reaction section is realized.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a top view showing a conventional microchip having a nucleic acid amplification function.
FIG. 2 is a top view illustrating a configuration of a microchip according to an embodiment.
FIG. 3 is a perspective view showing a configuration of a substrate and a cover of the microchip of FIG. 2;
FIG. 4 is a perspective view showing a configuration of a heating / cooling unit according to the embodiment.
FIG. 5 is a front view showing a configuration of a capillary for PCR reaction according to the embodiment.
FIG. 6 is a top view illustrating a configuration of a microchip according to an embodiment.
[Explanation of symbols]
1, 13, 14 microchip, 2 reservoir, 3 temperature control section, 4 PCR product recovery section, 5 flow path, 6 reaction section, 7 sample introduction section, 8 sample recovery section, 9, 9a, 9b, 9c PCR reaction section , 10a, 10b, 10c, 10d, 10e, 10f, 10g, 10h Electrode, 11, 21 main flow path, 12, 22, 23, 24 sub flow path, 15 substrate, 16 cover, 101 heating / cooling unit, 103 short slit, 105 long slit, 107 capillary, 109 electrode, 111 positive electrode, 113 negative electrode.

Claims

試料導入部および試料回収部を有する主流路と、
該主流路の前記試料導入部から前記試料回収部に至る領域から分岐して設けられた副流路と、
前記副流路に設けられた反応部と、
前記試料導入部、前記試料回収部および前記反応部に、それぞれ独立に電位を与える電位付与手段と、
を有することを特徴とする核酸の反応装置。A main flow path having a sample introduction section and a sample collection section,
A sub flow path provided by branching from a region of the main flow path from the sample introduction unit to the sample collection unit;
A reaction unit provided in the sub-flow path,
A potential applying unit that independently applies a potential to the sample introduction unit, the sample collection unit, and the reaction unit,
An apparatus for reacting nucleic acids, comprising:

請求項１に記載の核酸の反応装置において、前記反応部に加熱手段が設けられたことを特徴とする核酸の反応装置。The nucleic acid reaction device according to claim 1, wherein a heating means is provided in the reaction section.

請求項１または２に記載の核酸の反応装置において、前記主流路および前記副流路が、板状基材中に設けられたことを特徴とする核酸の反応装置。The nucleic acid reaction device according to claim 1 or 2, wherein the main flow path and the sub flow path are provided in a plate-shaped substrate.

請求項１乃至３いずれかに記載の核酸の反応装置において、前記電位付与手段は、前記試料導入部、前記試料回収部および前記反応部にそれぞれ設けられた電極と、各電極間に電圧を印加する電源と、を含むことを特徴とする核酸の反応装置。4. The nucleic acid reaction device according to claim 1, wherein the potential applying unit applies a voltage between the electrodes provided in the sample introduction unit, the sample collection unit, and the reaction unit, and a voltage between the electrodes. 5. A reaction device for nucleic acids, comprising:

請求項１乃至４いずれかに記載の核酸の反応装置において、前記試料導入部から前記反応部に至る経路と、前記反応部から前記試料回収部に至る経路とが、密閉構造を有することを特徴とする核酸の反応装置。5. The nucleic acid reaction device according to claim 1, wherein a path from the sample introduction section to the reaction section and a path from the reaction section to the sample collection section have a sealed structure. Nucleic acid reaction device.