JP3888389B2 - Chromatographic data processing apparatus, chromatographic data processing method, and chromatographic analyzer - Google Patents
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Description
液体クロマトグラフなどのクロマトグラフィー技術に係り、特にデ−タ処理の方法に関する。 The present invention relates to a chromatographic technique such as a liquid chromatograph, and more particularly to a data processing method.
液体クロマトグラフ分析装置やガスクロマトグラフ分析装置などのクロマトグラフィーにおいては、測定対象の試料をカラムを通過させることで成分毎に分離を行い、分離された成分を光度計などのクロマトグラフ用検出器によって、経過時間毎の出力値を検出する。 In chromatography such as liquid chromatograph analyzers and gas chromatograph analyzers, a sample to be measured is separated for each component by passing through a column, and the separated components are separated by a chromatographic detector such as a photometer. The output value for each elapsed time is detected.
クロマトグラフ用検出器から出力される信号は、時間間隔が数百ms程度の時系列データとして記録される。これが、縦軸に信号強度,横軸に保持時間を持ついわゆるクロマトグラムである。一般に、信号強度は一定時間(時刻tj )毎にデジタル値Ij に変換され、データ処理が行われる。 The signal output from the chromatograph detector is recorded as time series data having a time interval of about several hundred ms. This is a so-called chromatogram having the signal intensity on the vertical axis and the retention time on the horizontal axis. In general, the signal intensity is converted into a digital value I j every predetermined time (time t j ), and data processing is performed.
図3に、生体液アミノ酸分析を行って得たクロマトグラムを例示する。 FIG. 3 illustrates a chromatogram obtained by conducting biological fluid amino acid analysis.
図3で示されるように、保持時間23〜34(min)の間には、Gly(グリシン)から
Tyr(チロシン)までの11成分のピークが非常に密集して存在している。この様な場合、従来であれば、各ピーク間の極小点、いわゆる“谷”から垂線をおろす垂直分割の方法を用いて面積・定量計算を行っていた。しかしこの方法は、ピークの重なりが強いほど数十%の誤差を生じ、不正確な結果を生む。従って、この様な状態のクロマトグラムをより高精度に定量分析したい場合は、分析時間を伸ばし、分離度を向上するのが一般的であった。
As shown in FIG. 3, during the retention time of 23 to 34 (min), from Gly (glycine)
Eleven component peaks up to Tyr (tyrosine) are very densely present. In such a case, conventionally, area / quantitative calculation is performed using a vertical division method in which a perpendicular line is taken from a minimum point between peaks, so-called “valley”. However, this method produces an error of several tens of percent as the peak overlap is strong and produces inaccurate results. Therefore, in order to quantitatively analyze the chromatogram in such a state with higher accuracy, it is common to extend the analysis time and improve the resolution.
また、ピークの重なりが強いときであっても分析時間を伸ばさずに定量計算を行うために、数値解析を用いてデータ処理的に定量計算を行うことも試みられている。例えば、非線形最小二乗法を用いる方法である。 Further, in order to perform quantitative calculation without extending the analysis time even when the overlap of peaks is strong, it has also been attempted to perform quantitative calculation in data processing using numerical analysis. For example, a method using a nonlinear least square method is used.
非線形最小二乗法を用いる場合、一成分のピークをフィッティングするために、独立したパラメータを最低3つ(A:面積、tR :保持時間、σ:標準偏差)変数として使用する。従って、複数の成分のピークをフィッティングするためには、成分(i)についてそれぞれAi ,tRi,σi の3つのパラメータを求めることが必要となる。 When the nonlinear least square method is used, at least three independent parameters (A: area, t R : retention time, σ: standard deviation) are used as variables in order to fit a single component peak. Therefore, in order to fit the peaks of a plurality of components, it is necessary to obtain three parameters A i , t Ri and σ i for the component (i), respectively.
非線形最小二乗法を使用する従来例として、特開平6−324029 号公報や特開昭63−
151851 号公報がある。
As conventional examples using the non-linear least square method, JP-A-6-324029 and JP-A-63-3
No. 151851 is published.
これらの例では、クロマトグラム上の重なりピークは、ガウシアン関数、或いは非対称なピークを表現できるEMG関数(指数関数的に修飾されたガウシアン:Exponentially Modified Gaussian)等の波形関数を用いてカーブ・フィッティングすることが開示されている。これらの例に示されるように、非線形最小二乗法を用いることで、重なりピークを個々のピーク波形に分解することができ、個々のピーク成分に対応するピーク面積等のピークサイズが得られ、定量計算を行える。 In these examples, the overlapping peaks on the chromatogram are curve-fitted using a waveform function such as a Gaussian function or an EMG function (Exponentially Modified Gaussian) that can represent an asymmetric peak. It is disclosed. As shown in these examples, by using the nonlinear least square method, overlapping peaks can be decomposed into individual peak waveforms, and peak sizes such as peak areas corresponding to individual peak components can be obtained and quantified. Calculations can be made.
しかし、非線形最小二乗法を用いた従来例では、ピーク波形の分解は2つまた3つ程度の重なりピークを対象としており、それ以上の重なりピークを分解することは行われていない。 However, in the conventional example using the non-linear least square method, the decomposition of the peak waveform targets two or three overlapping peaks, and no further overlapping peaks are decomposed.
これは通常、非線形最小二乗法のカーブ・フィッティングによってピーク波形の分解を行う場合は、ピーク成分数が3,4,5・・・と多くなればなるほど、フィッティング処理が収束しづらくなる、あるいはピーク分解が正しく行われない(誤差が大きくなる)、といった現象が生じてしまうためである。 Normally, when the peak waveform is decomposed by nonlinear least squares curve fitting, the larger the number of peak components is 3, 4, 5,. This is because a phenomenon occurs in which the decomposition is not performed correctly (the error increases).
例えば、図3のクロマトグラムの場合、GlyからTyrまでの11成分を一度にフィッティングしようとすると、11×3の33個のパラメータを1回で決定しなければならない。これは非線形の最小二乗法にとっては非常に困難な計算処理となり、解くためには様々な工夫が必要となる。 For example, in the case of the chromatogram of FIG. 3, if 11 components from Gly to Tyr are to be fitted at a time, 33 parameters of 11 × 3 must be determined at a time. This is a very difficult calculation process for the non-linear least-squares method, and various ideas are required to solve it.
従って、クロマトグラフ上に数多くの重なりピークが存在する場合、非線形最小二乗法を用いてカーブ・フィッティングを行おうとすると、測定者が、一々2,3ピーク分の収束可能と思われる計算領域(タイムウインドウ)を指定してやらなければならず、非常に手間がかかる上、人の手により領域が決定されるため、計算結果の信頼性にも問題があった。 Therefore, when there are a large number of overlapping peaks on the chromatograph, if the curve fitting is performed using the nonlinear least square method, the measurer will be able to converge for a few peaks one by one. Window) must be specified, which is very time consuming and the area is determined by the hand of the person, so there is a problem in the reliability of the calculation results.
本発明の目的は、複数の重なりピークが存在するクロマトグラムに対しても非線形最小二乗法を用いたカーブ・フィッティングを容易に行うことができるクロマトグラフ装置を提供することである。 An object of the present invention is to provide a chromatographic apparatus capable of easily performing curve fitting using a nonlinear least square method even for a chromatogram having a plurality of overlapping peaks.
上記目的を達成するための本発明の特徴は、測定対象試料がカラムによって分離され、当該分離された試料を検出して得られるクロマトグラムのデータ処理を行うクロマトデータ処理装置において、前記クロマトグラムの複数のピークが存在する任意の時間領域に対して、時間領域の早い方或いは時間領域の遅い方より一つのピーク毎にフィッティング処理を行い、当該処理が行われたピークを前記任意の時間領域中のクロマトグラムから減算することにより、クロマトグラムの複数のピークを分解することである。 In order to achieve the above object, the present invention is characterized in that a sample to be measured is separated by a column, and a chromatogram data processing apparatus for performing data processing of a chromatogram obtained by detecting the separated sample, For an arbitrary time domain in which multiple peaks exist, a fitting process is performed for each peak from the earlier of the time domain or the later of the time domain, and the peak subjected to the process is included in the arbitrary time domain. By subtracting from the chromatogram, the peaks of the chromatogram are resolved.
本発明によれば、複数の重なりピーク、特に3成分以上の重なりピークを有するクロマトグラムに対し、幾つかの設定条件を定義するのみで、容易にピークを分解することができる。これにより、定量分析,定性分析の精度を向上することができる。また、ベースラインの決定能力も向上する。更には、測定者のデータ処理に対する労力を大幅に低減させることができる。 According to the present invention, a peak can be easily decomposed only by defining some setting conditions for a chromatogram having a plurality of overlapping peaks, particularly, an overlapping peak of three or more components. Thereby, the precision of quantitative analysis and qualitative analysis can be improved. It also improves the ability to determine the baseline. Furthermore, the labor of the measurer for data processing can be greatly reduced.
なお、本発明の課題,作用、及び効果については後述する発明を実施するための形態の欄で詳しく説明する。 In addition, the subject, an effect | action, and effect of this invention are demonstrated in detail in the column of the form for implementing invention mentioned later.
以下、本発明の実施例を説明する。 Examples of the present invention will be described below.
図2は、本発明が適用される液体クロマトグラフの装置概要図である。まず、制御部5からの指示により送液ポンプ2によって溶離液1をカラム3に対して送液する。送液ポンプ2とカラム3の間には試料供給部8があり、試料が備えられたサンプラ7から制御部5の指示により試料が溶離液に対して供給される。試料はカラム3により分離され、UV検出器等の検出器4で検出される。検出されたデータであるクロマトグラムは、制御部5に送られ、データ解析が成され、結果がディスプレイ6上に表示され、またはプリンタ9で印刷される。
FIG. 2 is a schematic diagram of a liquid chromatograph apparatus to which the present invention is applied. First, the
次に、検出の結果として、図3のクロマトグラムが得られた場合の制御部95におけるデータ処理について説明する。 Next, data processing in the control unit 95 when the chromatogram of FIG. 3 is obtained as a result of detection will be described.
本実施例においては、主に以下の手順でクロマトグラムのデータ処理が行われる。 In the present embodiment, chromatogram data processing is mainly performed according to the following procedure.
ステップ1:フィッティングをする時間区間の指定
ステップ2:重み付けパターンの選択
ステップ3:フィッティング方向の選択
ステップ4:フィッティング実行ボタンのクリック
ステップ5:結果の表示出力
図1は、上記のクロマトグラムのデータ処理の詳細な工程を示すものである。本実施例では、2成分ずつフィッティング処理を行う例で説明する。
Step 1: Specifying the time interval for fitting Step 2: Selecting the weighting pattern Step 3: Selecting the fitting direction Step 4: Clicking the fitting execution button Step 5: Displaying the result display Figure 1 shows the data processing of the above chromatogram The detailed process is shown. In this embodiment, an example in which fitting processing is performed for each two components will be described.
まず、得られた検出結果の内、フィッティングを行うクロマトグラムを選出し、処理を開始する(100)。ここで、変数i=1とする。 First, a chromatogram to be fitted is selected from the obtained detection results, and the process is started (100). Here, it is assumed that the variable i = 1.
次に、フィッティング処理の対象となる保持時間の区間(タイムウインドウ)を設定する(101)。ここでは、図4のクロマトグラムの中で、GlyからTyrまでの11成分のピーク群を対象として設定する。 Next, a holding time interval (time window) to be subjected to the fitting process is set (101). Here, in the chromatogram of FIG. 4, a peak group of 11 components from Gly to Tyr is set as a target.
タイムウインドウの設定は、図4に示すように、ディスプレイ96上に表示されたクロマトグラムの時間軸をカーソルによりドラッグすることにより、タイムウインドウを設定する。あるいは、表示されたクロマトグラムのピークGlyとTyrをピックし、フィッティング開始ピークと終了ピークを選択することもできる。また直接、開始および終了の時間入力する方法も採れる。 As shown in FIG. 4, the time window is set by dragging the time axis of the chromatogram displayed on the display 96 with a cursor. Alternatively, the peaks Gly and Tyr of the displayed chromatogram can be picked to select the fitting start peak and end peak. In addition, it is possible to directly input the start and end times.
次に、フィッティング計算に使用する波形関数を設定する。波形関数としては、例えば、“ガウシアン”または“EMG”かを選択する。この選択は、ディスプレイ96上に図5に示すダイアログボックスから使用する波形関数を選択することによって行われる。 Next, a waveform function used for fitting calculation is set. For example, “Gaussian” or “EMG” is selected as the waveform function. This selection is performed by selecting a waveform function to be used on the display 96 from the dialog box shown in FIG.
本実施例は2成分ずつフィッティングしていくものであるが、フィッティング方向の前方ピーク、つまり、第1ピークの波形をより正確に決定するために、第2ピークの波形以降の信号の影響を小さくする必要がある。このため次に、図6(a)に示すような重み付け関数の設定を行う(103)。 In this embodiment, two components are fitted, but in order to more accurately determine the front peak in the fitting direction, that is, the waveform of the first peak, the influence of the signal after the waveform of the second peak is reduced. There is a need to. Therefore, next, the weighting function as shown in FIG. 6A is set (103).
重み付け関数は、2つのピークそれぞれに対する重み付けを示したものである。図6
(a)の例は、第1ピークのピークスタート時刻21からピークエンド(谷)時刻23までを重みw=1とし、第2ピークのピークスタート(谷)時刻23からピークエンド(谷)時刻25までは、重みwに直線的勾配をつけ、1から0まで落とした例である。尚、この重み付け関数は、種々様々なものが採用でき、以下に例を示す。
The weighting function shows the weighting for each of the two peaks. FIG.
In the example of (a), the weight w = 1 from the
図6(b):曲線的勾配にしたもの。図6(c):S字的曲線勾配にしたもの。図6
(d):第1ピークスタート点から第2ピークエンド点までを直線的勾配にしたもの。図6(e):第2ピークエンド点にも重みを0.5 掛けたもの。図6(f):第2ピーク極大点から第2ピークエンド点までを直線的勾配にしたもの。図6(g):第1ピークの左半分をより重視し、第1ピーク極大点から第2ピークエンド点までを直線的勾配にしたもの。第1ピークエンド点(第2ピークスタート点)で重みを0.5 掛けるようにする。図6(h):第1ピークエンド点(第2ピークスタート点)から第2ピークエンド点まで重み0.5 をフラットに掛けたもの。図6(i):重み付けをしない場合に等価のもの。
FIG. 6 (b): Curved gradient. FIG. 6C: S-shaped curve gradient. FIG.
(D): A linear gradient from the first peak start point to the second peak end point. FIG. 6 (e): the second peak end point multiplied by 0.5. FIG. 6F: a linear gradient from the second peak maximum point to the second peak end point. FIG. 6 (g): Emphasis on the left half of the first peak, and a linear gradient from the first peak maximum point to the second peak end point. The weight is multiplied by 0.5 at the first peak end point (second peak start point). FIG. 6 (h): A weight of 0.5 is applied flatly from the first peak end point (second peak start point) to the second peak end point. FIG. 6 (i): equivalent when weighting is not performed.
具体的には、図7に示すダイアログボックスをディスプレイ96上に表示させ、重み付けパターンを選択することにより設定する。ここで、任意設定を選択し、“オプション”ボタンを押すことで、図6に示す上記の各種のパターン関数形グラフを設定できる。図6の各種パターンは、予め制御部5内のハードディスク等の記憶装置に格納されており、図7のダイアログボックスで指定されることで、容易に記憶装置から読み出して処理に使用することができる。
Specifically, the dialog box shown in FIG. 7 is displayed on the display 96 and set by selecting a weighting pattern. Here, by selecting an arbitrary setting and pressing an “option” button, the above-described various pattern function graphs shown in FIG. 6 can be set. The various patterns in FIG. 6 are stored in advance in a storage device such as a hard disk in the
次に、フィッティングの計算を行う方向を決定する(104)。 Next, the direction in which the fitting calculation is performed is determined (104).
つまり、図3の例で言えば、前方(Gly側)から処理を行っていくか、後方(Tyr側)から行っていくかを決定する。具体的には、図7のダイアログボックスで、設定を行う。 That is, in the example of FIG. 3, it is determined whether the process is performed from the front (Gly side) or the rear (Tyr side). Specifically, the setting is performed in the dialog box of FIG.
以下は、Gly側から処理を行っていく例で説明する。 The following describes an example in which processing is performed from the Gly side.
以上でフィッティング処理に必要な条件の設定は終了である。 This completes the setting of the conditions necessary for the fitting process.
そこで、図7のダイアログボックスで“OK”ボタンが選択されると、図8に示すようなダイアログボックスが表示され、“実行”ボタンを押すことにより、フィッティングの計算処理が開始される。 Therefore, when the “OK” button is selected in the dialog box of FIG. 7, a dialog box as shown in FIG. 8 is displayed, and the calculation process of fitting is started by pressing the “execute” button.
計算処理が開始されると、まず、設定されたタイムウインドウ内のピーク数を検出し、Imax とする(106)。 When the calculation process is started, first, the number of peaks in the set time window is detected and set to Imax (106).
具体的には、設定されたタイムウインドウ内での変極点を検出し、極大点と極小点を求め、極大点をピークの頂点、極小点をピークの終点及び始点とすることで、各ピークの区間を定義する。このとき求められたピークの谷(極小点)と各点が存在する保持時間が関連付けて記憶される。 Specifically, the inflection point within the set time window is detected, the maximum point and the minimum point are obtained, the maximum point is the peak apex, and the minimum point is the peak end point and start point. Define the interval. The peak valleys (minimum points) obtained at this time are stored in association with the retention times at which the points exist.
次に、Imax とiとの差分を求める(107)。ここで、差分が3成分以上であると、工程107へ進む。 Next, the difference between Imax and i is obtained (107). If the difference is 3 or more components, the process proceeds to step 107.
工程107で、差分3以上であると判断されたときは、工程103で設定された重み付け関数の幅が、工程105で検出されたピークの谷に合わせて調整される(108)。
When it is determined in
図9に、第1回目のフィッティング処理の領域が設定されたイメージを示す。重み付け関数の幅は、図9に示すようなフィッティング領域の幅に合わせて調節される。 FIG. 9 shows an image in which an area for the first fitting process is set. The width of the weighting function is adjusted in accordance with the width of the fitting area as shown in FIG.
次に、フィッティング方向の前方2成分に対してフィッティング処理が行われる(109)。 Next, a fitting process is performed on the two front components in the fitting direction (109).
以下に、フィッティングの具体的処理について説明する。 Below, the specific process of fitting is demonstrated.
フィッティングのための波形関数f(t)には、前述のように、ガウシアンないしEMGが用いられる。まず、ガウシアンを用いた場合の例を数式1に示す。
As described above, Gaussian or EMG is used for the waveform function f (t) for fitting. First,
ここでat+bはベースラインを表す。本実施例では、2つの成分ずつのフィッティング処理を行うため、上記の数式1となるが、非線形の最小二乗法の能力さえ確保できれば、3成分に増やすことも可能である。もちろんEMGへの拡張も可能である。数式2に数式1の一つのgi(t)をEMGへ置き換える場合の例を示す。
Here, at + b represents a baseline. In this embodiment, since the fitting process is performed for each of two components,
最小二乗法は、次の数式3のS1 、または数式4のS2 を最小にするように各フィッティングパラメータAi,tRi,σi,τiを決定する。ここで、Ijは測定クロマトグラムの信号強度、jは時刻tj を表す添え字、Nは時間区間のデータ点数である。S1 及びS2 は、何れを使用しても良い。
In the least square method, the fitting parameters A i , t Ri , σ i , and τ i are determined so as to minimize S 1 of the following
ここで得られた数式1のf(t)中のtRの小さな(即ち、保持時間の早い方)gi(t)が第1ピークGlyにあたり、第1成分波形が決定する(110)。
The first component waveform is determined (110) when the smaller t R in f (t) of
次に、オリジナルの測定クロマトグラムから第1成分波形g1(t) を減算し、Gly を切り取ったクロマトグラムを作成する(111)。図10にGly を切り取ったクロマトグラムのイメージを示す。尚、ベースラインat+bは、ピーク波形に影響を与えないために、減算しないほうが望ましい。 Next, the first component waveform g 1 (t) is subtracted from the original measurement chromatogram, and a chromatogram obtained by cutting out Gly is created (111). FIG. 10 shows an image of a chromatogram obtained by cutting out Gly. Note that it is preferable not to subtract the baseline at + b because it does not affect the peak waveform.
次に、変数iをインクリメントし、工程107に戻る。 Next, the variable i is incremented and the process returns to Step 107.
以下、第1ピークのフィッティングの時と同様の手順で、Ala とCit を対象としてフィッティングを行い、第2ピークAla に該当する第2成分波形を決定する。 Thereafter, fitting is performed on Ala and Cit by the same procedure as that for fitting the first peak, and the second component waveform corresponding to the second peak Ala is determined.
この後、後方末端の2成分のLeu(ロイシン)とTyrが残った状態になるまで、順次Ala ,Cit ・・・と減算により切り出していき、残り2成分となったところで(i=2)、工程112に移行し、重み付けを行わずに、2成分のピークフィッティングを行い、最後の2成分のピーク波形を決定する(114)。そして、オリジナルクロマトグラムからこの2成分のピーク波形を減算し(115)、処理を終了する。 After that, until the two components Leu (leucine) and Tyr at the rear end are left, Ala, Cit... And subtraction are sequentially performed, and when the remaining two components are obtained (i = 2), The process proceeds to step 112, in which two-component peak fitting is performed without weighting, and the final two-component peak waveform is determined (114). Then, the peak waveform of the two components is subtracted from the original chromatogram (115), and the process is terminated.
上記の一連の処理により、タイムウインドウ内の全てのピーク波形の分解が実行されたことになる。また、上記処理によれば、全てのピーク波形を切り出された残りのクロマトグラムがベースラインとなり、ベースラインも同時に求められたこととなる。 Through the above series of processing, all peak waveforms in the time window are decomposed. Further, according to the above processing, the remaining chromatogram from which all the peak waveforms have been extracted becomes the baseline, and the baseline is also obtained at the same time.
上記処理が終了すると、上記処理によって得られた各ピーク毎のパラメータを用いて定量計算(例えば濃度)が行われる。そして、計算結果として、以下の図11のような表示が、ディスプレイ96上にピーク毎(成分毎)になされる。 When the above processing is completed, quantitative calculation (for example, concentration) is performed using the parameters for each peak obtained by the above processing. Then, as a calculation result, the following display as shown in FIG. 11 is made on the display 96 for each peak (each component).
ここで、各成分毎のパラメータは、上記処理によって不確かさ(ばらつき)が得られるため、この不確かさに基づき、定量値に対しても不確かさを算出することができる。 Here, since the uncertainty (variation) is obtained for the parameters for each component by the above processing, the uncertainty can be calculated for the quantitative value based on this uncertainty.
この定量値の不確かさが計算可能な点も、本実施例の特徴である。尚、定量値の不確かさを求める計算方法は、誤差伝播の式に従う。 A feature of this embodiment is that the uncertainty of the quantitative value can be calculated. The calculation method for determining the uncertainty of the quantitative value follows the error propagation equation.
また、フィッティングの優劣をこの定量値の不確かさの大きさで判定可能である(不確かさが小さい方が優れているといえる。)。例えば、この不確かさは、後述する前後方両端からフィッティングを行った場合の重なる部分の計算結果の優劣判定に使用できる。 In addition, the superiority or inferiority of the fitting can be determined by the magnitude of the uncertainty of the quantitative value (it can be said that the smaller the uncertainty, the better). For example, this uncertainty can be used to determine the superiority or inferiority of the calculation result of overlapping portions when fitting is performed from both front and rear ends, which will be described later.
本発明では、上記ピーク切り出しを行いながらピークの分解を行っていく上記処理を
「シークェンシング」と呼び、このシークェンシングを行うクロマトデータ処理装置を
「クロマト ピーク シークェンサ」と呼ぶ。
In the present invention, the above-described processing for performing peak decomposition while performing peak extraction is called “sequencing”, and a chromatographic data processing apparatus that performs this sequencing is called “chromatographic peak sequencer”.
以上の説明は、前方末端からのフィッティング計算であったが、図7のダイアログボックスでのフィッティング方向の設定により、後方末端からも実行できる。この場合は、第2ピークを示すg2(t) をクロマトグラムから減算し、また、重み付け関数の形状は左右逆転する。この順序であれば、図4の場合Tyr,Leu,Ile(イソロイシン) の順に、保持時間の大きいものから切り出していける。 Although the above description is the fitting calculation from the front end, it can also be executed from the rear end by setting the fitting direction in the dialog box of FIG. In this case, g 2 (t) indicating the second peak is subtracted from the chromatogram, and the shape of the weighting function is reversed left and right. In this order, in the case of FIG. 4, it can be cut out in the order of Tyr, Leu, Ile (isoleucine) from the one having the longest retention time.
理想的には、前方後方どちらからフィッティングしていっても良いのだが、実際には、両端から最も重なりの程度の強いピークまでフィッティングを行うのが望ましい。このようなフィッティングを行う場合は、図7のダイアログボックスで“自動判定”を選択する。 Ideally, the fitting may be performed from either the front or rear, but in practice, it is desirable to perform the fitting from both ends to the strongest overlapping peak. When performing such fitting, “automatic determination” is selected in the dialog box of FIG.
例えば、図3のクロマトグラムの場合、LueとIleは重なりが強いため、GlyからCysthi(シスタチオニン)かIle まで前方シークェンシングを行い、Lue かまたはIle まで後方シークェンシングを行う。こうすることにより、重なりの強いLue とIle に関しては、前方後方双方からのフィッティングの適合性を判断して、いずれかのフィッティング結果を採用・決定することができる。 For example, in the chromatogram of FIG. 3, since Lue and Ile have strong overlap, forward sequencing is performed from Gly to Cysthi (cystathionine) or Ile, and backward sequencing is performed to Lue or Ile. In this way, with regard to Lue and Ile, which have a strong overlap, it is possible to determine the suitability of fitting from both the front and rear, and to adopt and determine either fitting result.
ここで、適合性判断の指標には、上述のようにフィッティングパラメータAi,tRi,σi 自体の不確かさ(ばらつき)を用いたり、または統計学的指標χ2や、χ2の収束率を見ている計算反復回数を用いることにより判断が可能となる。また、これらのパラメータを複数組合わせて判断を行えば、より総合的な判断もできる。いずれにしても、定量計算を目的とする場合、ピーク面積値Ai が正確に求まる必要があり、この不確かさが重視されるべきである。
(重み付け関数設定の他の実施例)
また、上記の工程102で設定する重み付け関数は、ダイアログボックス上で設定を行ったが、この他にも、表1に示す表形式のプログラム設定や、図12に示すクロマトグラムに重み付け関数を重ね合わせ表示して設定を行うグラフィカル設定でも設定可能である。
Here, the uncertainties (variations) of the fitting parameters A i , t Ri , and σ i themselves are used as indices for determining suitability, or the statistical indices χ 2 and the convergence rate of χ 2 are used. Judgment can be made by using the number of calculation iterations watching If a combination of these parameters is used for determination, a more comprehensive determination can be made. In any case, for the purpose of quantitative calculation, the peak area value A i needs to be obtained accurately, and this uncertainty should be emphasized.
(Another example of weighting function setting)
The weighting function set in
表1の設定プログラムは、例として図6(g)が設定された例を示している。測定者が、“重み値”と“形状”を入力することにより、重み付け関数が定義される。この表1は、ディスプレィ上に表示される。 The setting program in Table 1 shows an example in which FIG. 6G is set as an example. When the measurer inputs “weight value” and “shape”, the weighting function is defined. This Table 1 is displayed on the display.
図12は、ディスプレィ上のグロマトグラムに重み付け関数を重ねて表示しながら、設定する方法を示している。例えば、ノウド(節)31の周辺にポインティングデバイスによってカーソルを移動し、クリックして、特徴点の第1ピーク始点を表示させる。これで、ノウド31が確定する。ノウド31を移動したければピック後離す、いわゆるドラッギングも可能である。次に、ノウド32周辺をクリックし、ノウド31から垂直であり、重み1である点までドラッグし、ノウド32を確定する。ここで自動的にノウド31からノウド32までの垂直線が描かれ、決定する。同様にノウド33,34を決定し、重み付け関数を設定できる。重み付け関数を変更したければ、任意のノウドをクリックし、ハイライトを当て、変更設定を行う。また、ノウドの削除もできる。また、任意の場所をクリックすることで新規のノウドも追加可能である。ノウド間の線分を曲線にする場合は、目的の線分をクリックし、ハイライト(表示色変更)を当て、右クリックで属性の変更設定を行う。ここで、コンケイブ,コンヴェックス等の指定ができる。
(シークェンシングの他の実施例)
上記のシークェンシングの実施例は、一度測定を行い、クロマトグラムを得てしばらく後のデータ処理であるが、このシークェンシングの処理を、試料の測定と同時に処理することもできる。以下に、その場合の実施例の説明をする。
FIG. 12 shows a method of setting while displaying the weighting function superimposed on the gamma tomogram on the display. For example, the cursor is moved around the nod (node) 31 by a pointing device and clicked to display the first peak start point of the feature point. Now, the
(Another embodiment of sequencing)
In the above-described sequencing example, the measurement is performed once and a chromatogram is obtained and data processing is performed for a while. However, the sequencing process can be performed simultaneously with the measurement of the sample. The embodiment in that case will be described below.
測定と同時のシークェンシングの処理は次のように進む。 The sequencing process at the same time as the measurement proceeds as follows.
ステップ1:フィッティングをする時間区間(タイムウインドウ)の設定
ステップ2:重み付け関数の設定
ステップ3:フィッティング方向の設定
ステップ4:試料の測定
ステップ5:フィッティング処理
ステップ6:結果の表示出力
ステップ1〜3では、表2のように予めタイムプログラムとして測定前に設定を行う。タイムウインドウの設定は、フィッティング開始からフィッティング終了の時間設定で行う。またタイムウインドウの設定は、ピーク名で“Gly”から“Tyr”のように、フィッティング開始ピークと終了ピークを選択することもできる。
Step 1: Setting the time interval (time window) for fitting Step 2: Setting the weighting function Step 3: Setting the fitting direction Step 4: Measuring the sample Step 5: Fitting process Step 6: Displaying the results Steps 1-3 Then, as shown in Table 2, the time program is set in advance before measurement. The time window is set by setting the time from the start of fitting to the end of fitting. In addition, the time window can be set by selecting a fitting start peak and an end peak such as “Gly” to “Tyr” as peak names.
以上、本発明のクロマトピークシークェンサーによれば、いくつかの条件を設定するのみで、複数のピークが重なるクロマトグラムのフィッティングが自動的に実行できる。 As described above, according to the chromatographic peak sequencer of the present invention, the fitting of a chromatogram in which a plurality of peaks overlap can be automatically executed only by setting some conditions.
また同時に高精度のベースラインの算出も行うことができる。高精度のベースライン決定機能を持っている面からも本発明のクロマトピークシークエンサは良好なデータ処理装置と考えられる。但し、ピーク波形をガウシアンやEMGに仮定してフィッティングするため、実際のピーク波形が著しくこれらの解析学的関数形より外れている場合は、注意を要する。このような場合、1成分毎の標準試料から孤立ピーク波形を得て、特定の波形関数を予め登録する必要がある。 At the same time, a highly accurate baseline can be calculated. The chromatopeak sequencer of the present invention is also considered to be a good data processing device from the aspect of having a highly accurate baseline determination function. However, since fitting is performed assuming that the peak waveform is Gaussian or EMG, care must be taken when the actual peak waveform deviates significantly from these analytical function forms. In such a case, it is necessary to obtain an isolated peak waveform from a standard sample for each component and register a specific waveform function in advance.
1…溶離液、2…送液ポンプ、3…カラム、4…検出器、5,95…制御部、6,96…ディスプレイ、7…サンプラ、8…試料供給部、9…プリンタ、21…ピークスタート時刻、23,25…ピークエンド(谷)時刻、31,32,33,34…ノウド。
DESCRIPTION OF
Claims (6)
複数のピークが存在する前記クロマトグラムに対して、フィティングすべき2つのピークが存在する任意の時間領域が指定され、時間領域の早い方或いは時間領域の遅い方よりピーク毎にフィッティング処理を行ってピーク形状を確定し、当該確定されたピーク以外の新たな時間領域が指定される処理を繰り返すことを特徴とするクロマトデータ処理装置。 In a chromatographic data processing apparatus for performing data processing of a chromatogram obtained by detecting a sample to be measured by a column and detecting the separated sample,
Arbitrary time domain where two peaks to be fitted exist is specified for the chromatogram with multiple peaks, and fitting processing is performed for each peak from the earlier of the time domain or the later of the time domain. A chromatographic data processing apparatus characterized by repeating a process of determining a peak shape and designating a new time region other than the determined peak.
前記フィッティング処理は、少なくとも面積,保持時間,標準偏差を算出することを特徴とするクロマトデータ処理装置。 In claim 1,
The chromatographic data processing apparatus characterized in that the fitting process calculates at least an area, a holding time, and a standard deviation.
前記フィッティング処理は、任意の時間領域中の早い方及び遅い方の両端から開始していくことを特徴とするクロマトデータ処理装置。 In claim 1,
2. The chromatographic data processing apparatus according to claim 1, wherein the fitting process starts from both ends of an earlier time and a later time in an arbitrary time domain.
前記データ処理手段は、
前記検出手段の検出結果として得られたクロマトグラムの複数のピークのうち2つのピークが存在する任意の保持時間領域を指定する手段と、
前記指定された保持時間領域の前方端或いは後方端の何れからフィッティング処理を行うかを指定する手段と、
当該フィッティング処理で使用する重み付け関数及び波形関数を指定する手段とを有し、
フィッティング処理が終了してピーク波形が確定されたピーク以外の新たな保持時間領域を前記表示手段に表示し、
前記任意の保持時間領域の指定と、前記フィッティング処理の方向の指定と、前記重み付け関数の指定は、前記表示手段に表示されるダイアログボックスによって行われることを特徴とするクロマトグラフ分析装置。 Sample separation means for separating the sample to be measured for each component, detection means for detecting the sample separated by the sample separation means, data processing means for obtaining the detection result of the detection means and performing data processing, and data processing In a chromatograph analyzer comprising display means for displaying results,
The data processing means includes
Means for designating any retention time region in which two of the plurality of peaks of the chromatogram obtained as a detection result of the detection means are present;
Means for designating whether the fitting process is performed from the front end or the rear end of the designated holding time region;
Means for specifying a weighting function and a waveform function used in the fitting process,
A new holding time region other than the peak for which the fitting process is finished and the peak waveform is determined is displayed on the display means,
The chromatograph analyzer is characterized in that designation of the arbitrary holding time region, designation of the direction of the fitting process, and designation of the weighting function are performed by a dialog box displayed on the display means.
前記フィッティング処理は、少なくとも面積,保持時間,標準偏差を算出することを特徴とするクロマトグラフ分析装置。 In claim 4,
The chromatographic analyzer characterized in that the fitting process calculates at least an area, a holding time, and a standard deviation.
前記重み付け関数は、前記表示手段上で、クロマトグラムと共に重ね合わせ表示され、且つ、任意に変更され得ることを特徴とするクロマトグラフ分析装置。 In claim 4,
The weighting function is superimposed and displayed together with the chromatogram on the display means, and can be arbitrarily changed.
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