JP3865436B2 - 分岐シクロデキストリンの製造方法 - Google Patents
分岐シクロデキストリンの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3865436B2 JP3865436B2 JP19953496A JP19953496A JP3865436B2 JP 3865436 B2 JP3865436 B2 JP 3865436B2 JP 19953496 A JP19953496 A JP 19953496A JP 19953496 A JP19953496 A JP 19953496A JP 3865436 B2 JP3865436 B2 JP 3865436B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- reaction
- acetylglucosaminyl
- product
- bonded
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B30/00—Preparation of starch, degraded or non-chemically modified starch, amylose, or amylopectin
- C08B30/12—Degraded, destructured or non-chemically modified starch, e.g. mechanically, enzymatically or by irradiation; Bleaching of starch
- C08B30/18—Dextrin, e.g. yellow canari, white dextrin, amylodextrin or maltodextrin; Methods of depolymerisation, e.g. by irradiation or mechanically
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
- C08B37/0012—Cyclodextrin [CD], e.g. cycle with 6 units (alpha), with 7 units (beta) and with 8 units (gamma), large-ring cyclodextrin or cycloamylose with 9 units or more; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
- A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分岐シクロデキストリンの製造方法に関し、詳しくは、酵素反応を利用した、シクロデキストリン（以下、ＣＤと略記することがある。）のＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基を結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤ、ＣＤの水酸基にβ結合でグルコサミニル基を結合させたグルコサミニル−ＣＤおよびその塩、ＣＤのＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルガラクトサミニル基を結合させたＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤおよびＣＤのＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でガラクトサミニル基を結合させたガラクトサミニル−ＣＤおよびその塩の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＤは、グルコースがα−１，４結合で連なった環状デキストリンで、グルコース６，７，８個より成るそれぞれα−，β−およびγ−ＣＤが良く知られている。最近ではＣＤの溶解度を改善するため、これらＣＤにα−１，６結合でグルコシル基やマルトシル基などの置換基を結合させた分岐ＣＤが合成されている。
これらＣＤおよび分岐ＣＤには分子内部に空洞があり、しかもこの空洞内部が疎水性になっているため、包接作用があり、各種油性物質を取り込む性質を有している。ＣＤおよび分岐ＣＤは、このような性質をもっているため、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く使用されている。
特に医薬品工業の分野では、難水溶性薬剤を分岐ＣＤに包接させることにより溶解度を上昇させ、結果として薬剤のバイオアベイラビリティーが増加することが注目されている。
【０００３】
また、薬剤の副作用を少なくするため、糖質の細胞認識性に着目して、これをドラッグ・デリバリー・システムの薬剤運搬体の標識細胞へのセンサーとして利用する研究が活発に行われている。特に、ガラクトースは肝臓組織に、マンノースは肝臓実質細胞，肝臓非実質細胞，マクロファージに強い親和性を示すことが良く知られている。
すでに我々は、酵素の糖転移反応または縮合反応を利用してＣＤのグルコシル基にガラクトシル基またはマンノシル基が結合しているガラクトシル−ＣＤ，マンノシル−ＣＤの開発に成功している。また、分岐ＣＤの側鎖のグルコシル基にガラクトシル基またはマンノシル基が結合しているガラクトシル−分岐ＣＤ，マンノシル−分岐ＣＤの開発に成功している。
【０００４】
一方、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびその脱アセチル化物であるグルコサミンはカニ，エビの主要な外殻成分であるキチンの構成糖であるが、細胞認識に重要な役割を示す糖鎖の基本的な構成糖でもある。
同様に、Ｎ−アセチルグルコサミンのアナログであるＮ−アセチルガラクトサミンも細胞認識に重要な役割を示す糖鎖の基本的な構成糖である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ＣＤの有する包接作用とＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンの上記の特質を利用して、ドラッグ・デリバリー・システムに応用すること、難溶性薬剤の可溶化に応用することを目的としてＮ−アセチルグルコサミニル基をＣＤに結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤの合成を試みた。
以前、本発明者らは、リゾチームをはじめとしたＮ−アセチルグルコサミニル基転移酵素がＮ−アセチルキトオリゴ糖化合物から分岐ＣＤの分岐側鎖の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基を転移結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−分岐ＣＤを効率よく合成することを見出した（特願平７−１５４１０２号明細書）。
しかしながら、上記の合成方法は、糖供与体として用いるＮ−アセチルキトオリゴ糖が高価であるという問題がある。
また、リゾチームをはじめとしたＮ−アセチルグルコサミニル基転移酵素は分岐ＣＤを受容体とし、分岐側鎖部分にＮ−アセチルグルコサミニル基を結合することは可能であったが、分岐側鎖を有しないα−、β−およびγ−ＣＤには直接Ｎ−アセチルグルコサミニル基を結合させることはできなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは鋭意努力を重ねた結果、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼがＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンとＣＤの混合溶液からＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤを効率よく合成することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成したのである。
【０００７】
すなわち、本発明はＣＤとＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンを含有する溶液に、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させて縮合反応を行うことを特徴とする、ＣＤのＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基，グルコサミニル基，Ｎ−アセチルガラクトサミニル基およびガラクトサミニル基のいずれかが結合している分岐ＣＤおよびその塩の製造方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の分岐ＣＤは、いずれも新規物質であり、その具体例を示すと、例えば６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−γ−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−γ−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−γ−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−γ−ＣＤなどを挙げることができる。
これらのうちの代表的な化合物の構造式（構造式１〜１２）を下記に示す。なお、式中のｎは５〜７を示す。
【０００９】
【化１】
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
【化４】
【００１３】
【化５】
【００１４】
【化６】
【００１５】
【化７】
【００１６】
【化８】
【００１７】
【化９】
【００１８】
【化１０】
【００１９】
【化１１】
【００２０】
【化１２】
【００２１】
本発明の分岐ＣＤは、ＣＤとＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンを含有する溶液に、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させ、さらに必要に応じて脱アセチル化することによって得られる。
ここで、脱アセチル化方法としては、例えばアルカリ溶液を作用させる方法（Sannan,T., K.Kurita, Y.Iwakura: Makromol. Chem., 177,3589-3600(1976)) 、イオン交換樹脂を使用する方法等の既知の方法を適用することができる。
【００２２】
本発明において、ＣＤとしてはα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤが主に使用されるが、これらＣＤの水酸基にα１，６結合でグルコシル−ＣＤ，マルトシル−ＣＤ，マンノシル−ＣＤ，ガラクトシル−ＣＤなどの置換基が結合した分岐側鎖を有するものでもよい。また、これらの混合物であってもよい。
本発明に用いるＮ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンは、純度の高いものを用いることが望ましいが、オリゴ糖を含むものでも使用することができる。
【００２３】
次に、本発明に用いる酵素としては、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをはじめとしてＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンとＣＤを含有する溶液に作用させたときに縮合反応、つまり加水分解反応の逆反応によって、そのＮ−アセチルグルコサミニル基もしくはＮ−アセチルガラクトサミニル基をＣＤにβ結合で結合させ、Ｎ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤを合成するものであれば、いずれの酵素も使用可能である。
本発明に用いる酵素は、自然界に広く分布しているものである。例えばＮ−アセチルヘキソサミニダーゼは、タチナタマメ等の植物に含まれている植物由来の酵素があり、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては、牛腎臓に含まれる動物由来のものやアスペルギルス・ニガーの生産する微生物由来のものなどがある。Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ホラ貝に含まれる動物由来、アクレモニウムに含まれる微生物由来のものなどがある。
【００２４】
本発明の反応系において、ＣＤとＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン含む溶液（水溶液または懸濁液）は、ＣＤの濃度が約１〜４０％（ｗ／ｗ）、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンの濃度が約５〜５０％（ｗ／ｗ）であることが望ましく、かつＣＤに対するＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンの比率（重量）は、０．１〜５０倍の範囲、好ましくは１〜５倍の範囲とするのが適当である。
反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜７、温度は２０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃に調整して反応させることが適当である。
使用する酵素量は反応時間と密接な関係があるので、通常は反応が５〜２００時間、好ましくは１０〜５０時間で終了するような酵素量とすればよいが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明において、脱アセチル化反応は前記したように常法により行えばよく、例えば上記方法にて調製したＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤをアルカリ溶液で処理すればよい。このときの処理条件は、既知の方法に従えばよい。例えば、脱アセチル化の反応系はＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤの濃度を０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲とするのが適当である。
脱アセチル化反応の際に用いるアルカリ溶液としては、水酸化ナトリウム溶液が好ましいものではあるが、脱アセチル化反応が進行するものであればこれに限定されるものではない。
また、反応温度，濃度，アルカリ溶液の種類等は相互に密接に影響を受けるので、通常は水酸化ナトリウム溶液濃度０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、温度１０〜１００℃、反応時間０．１〜１２０時間の範囲とするのが適当であるが、これらに限定されるものではない。
脱アセチル化反応終了後は、酸を滴下することによって中和、脱塩した後、必要に応じて、精製し目的物とすればよい。
【００２６】
以上のような方法で反応させて得られた液を、カラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにかけて、生成物を分画・分取した後、ＦＡＢ−ＭＳによる分子量測定および核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により構造解析を行った結果、前記の構造式１〜１２に代表される分岐ＣＤであることを確認した。
【００２７】
【実施例】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）縮合反応
Ｎ−アセチルグルコサミン１．１１ｇ，α−ＣＤ１．２２ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに、タチナタ豆由来のＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。
反応液の一部をアミド系カラム（東ソー（株）社製、Ａｍｉｄｅ−８０）および逆相カラム（ＹＭＣ（株）社製、ＯＤＳ−ＡＱ３０３）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を図１および２に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ａを１００ｍｇ、生成物Ｂを５ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ａは、図３に示すように、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１１７５であることがわかった。また、13Ｃ−ＮＭＲ解析により、この物質は図４に示すように、α−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎアセチルグルコサミニル−αＣＤ（前記構造式１の化合物；ｎ＝５）であることが確認された。
【００２８】
一方、生成物Ｂは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１１７５であることがわかった。また、少量の生成物Ｂを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解してＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った。
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンとα−ＣＤ等モルに分解された。このことから、転移生成物Ｂはα−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式５もしくは９の化合物；ｎ＝５）であることが判明した。
【００２９】
実施例２
（１）縮合反応
Ｎ−アセチルグルコサミン１．１１ｇとβ−ＣＤ０．５６７ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに、実施例１で用いたＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。反応液の一部をアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図５に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ｃを４０ｍｇと生成物Ｄを３ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ｃは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１３３７であることがわかった。したがって、実施例１の結果も踏まえて、この生成物Ｃはβ−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式１の化合物；ｎ＝６）であることが確認された。
【００３０】
一方、生成物Ｄは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１３３７であることがわかった。また、少量の生成物Ｄを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った。
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−ＣＤ等モルに分解された。このことから、実施例１の結果も踏まえて、生成物Ｄはβ−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（構造式５もしくは９の化合物；ｎ＝６）であること推察された。
【００３１】
実施例３
Ｎ−アセチルグルコサミン１．１１ｇとγ−ＣＤ１．６２ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに、実施例１で用いたＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。反応液の一部をアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図６に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ｅを２００ｍｇ、生成物Ｆを６ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ｅは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１４９９であることがわかった。したがって、実施例１の結果も踏まえて、この生成物Ｅはγ−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式１の化合物；ｎ＝７）であることが確認された。
【００３２】
一方、生成物Ｆは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１４９９であることがわかった。また、少量の生成物Ｆを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った。
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンとγ−ＣＤ等モルに分解された。このことから、実施例１の結果も踏まえて、生成物Ｆはγ−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式５もしくは９の化合物；ｎ＝７）であること推察された。
【００３３】
実施例４
（１）縮合反応
Ｎ−アセチルガラクトサミン１．１１ｇとα−ＣＤ１．２２ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに実施例１で用いたＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。反応液の一部をアミド系カラムおよび逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図７および８に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ｇを８３ｍｇ、生成物Ｈを５ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ｇは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１１７５であることがわかった。また、この物質は、13Ｃ−ＮＭＲ解析により、図９に示すように、α−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルガラクトサミニル基が結合した化合物６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−αＣＤ（前記構造式２の化合物；ｎ＝５）であることが確認された。
【００３４】
一方、生成物Ｈは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１１７５であることがわかった。また、少量の生成物Ｈを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った結果、Ｎ−アセチルガラクトサミンとα−ＣＤ等モルに分解された。このことから、生成物Ｈはα−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルガラクトサミニル基が結合した化合物（構造式６もしくは１０の化合物；ｎ＝５）であることがわかった。
【００３５】
実施例５
実施例１で得られたＮ−アセチルグルコサミニル−αＣＤ（前記構造式１の化合物；ｎ＝５）２５ｍｇを濃度１％となるように２０％水酸化ナトリウム溶液を調製し、８０℃で３時間反応を行った。
反応終了後、濃塩酸を滴下してｐＨを中性まで下げた。脱塩装置（旭化成株式会社製、マイクロアシライザーＧ１）を用いて反応液から塩を除き、脱アセチル化物、つまりα−ＣＤの６位の水酸基にβ結合でグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式３の化合物；ｎ＝５）を２０ｍｇ得た。
【００３６】
実施例６
実施例４で得られたＮ−アセチルガラクトサミニル−αＣＤ（前記構造式２の化合物；ｎ＝５）２５ｍｇを濃度１％となるように２０％水酸化ナトリウム溶液を調製し、８０℃で３時間反応させた。
反応終了後、濃塩酸を滴下してｐＨを中性まで下げた。脱塩装置（旭化成株式会社製、マイクロアシライザ−Ｇ１）を用いて反応液から塩を除き、脱アセチル化物、つまりα−ＣＤの６位の水酸基にβ結合でガラクトサミニル基が結合した化合物（前記構造式４の化合物；ｎ＝５）を２０ｍｇを得た。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素の縮合反応を利用して、ＣＤ分子中のＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基またはＮ−アセチルガラクトサミニル基が結合している新規分岐ＣＤを効率よく得ることができる。また、これらを脱アセチル化処理することによって、ＣＤ分子中のＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でグルコサミニル基またはガラクトサミニル基が結合している新規分岐ＣＤを効率よく得ることができる。
本発明の新規分岐ＣＤは、医薬品分野の他に食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図２】 実施例１の反応液の逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図３】 実施例１の反応生成物ＡのＦＡＢ−ＭＳスペクトルである。
【図４】 実施例１の反応生成物Ａの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】 実施例２の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図６】 実施例３の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図７】 実施例４の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図８】 実施例４の反応液の逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図９】 実施例４の反応生成物Ｇの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、分岐シクロデキストリンの製造方法に関し、詳しくは、酵素反応を利用した、シクロデキストリン（以下、ＣＤと略記することがある。）のＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基を結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤ、ＣＤの水酸基にβ結合でグルコサミニル基を結合させたグルコサミニル−ＣＤおよびその塩、ＣＤのＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルガラクトサミニル基を結合させたＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤおよびＣＤのＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でガラクトサミニル基を結合させたガラクトサミニル−ＣＤおよびその塩の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＤは、グルコースがα−１，４結合で連なった環状デキストリンで、グルコース６，７，８個より成るそれぞれα−，β−およびγ−ＣＤが良く知られている。最近ではＣＤの溶解度を改善するため、これらＣＤにα−１，６結合でグルコシル基やマルトシル基などの置換基を結合させた分岐ＣＤが合成されている。
これらＣＤおよび分岐ＣＤには分子内部に空洞があり、しかもこの空洞内部が疎水性になっているため、包接作用があり、各種油性物質を取り込む性質を有している。ＣＤおよび分岐ＣＤは、このような性質をもっているため、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く使用されている。
特に医薬品工業の分野では、難水溶性薬剤を分岐ＣＤに包接させることにより溶解度を上昇させ、結果として薬剤のバイオアベイラビリティーが増加することが注目されている。
【０００３】
また、薬剤の副作用を少なくするため、糖質の細胞認識性に着目して、これをドラッグ・デリバリー・システムの薬剤運搬体の標識細胞へのセンサーとして利用する研究が活発に行われている。特に、ガラクトースは肝臓組織に、マンノースは肝臓実質細胞，肝臓非実質細胞，マクロファージに強い親和性を示すことが良く知られている。
すでに我々は、酵素の糖転移反応または縮合反応を利用してＣＤのグルコシル基にガラクトシル基またはマンノシル基が結合しているガラクトシル−ＣＤ，マンノシル−ＣＤの開発に成功している。また、分岐ＣＤの側鎖のグルコシル基にガラクトシル基またはマンノシル基が結合しているガラクトシル−分岐ＣＤ，マンノシル−分岐ＣＤの開発に成功している。
【０００４】
一方、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびその脱アセチル化物であるグルコサミンはカニ，エビの主要な外殻成分であるキチンの構成糖であるが、細胞認識に重要な役割を示す糖鎖の基本的な構成糖でもある。
同様に、Ｎ−アセチルグルコサミンのアナログであるＮ−アセチルガラクトサミンも細胞認識に重要な役割を示す糖鎖の基本的な構成糖である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ＣＤの有する包接作用とＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンの上記の特質を利用して、ドラッグ・デリバリー・システムに応用すること、難溶性薬剤の可溶化に応用することを目的としてＮ−アセチルグルコサミニル基をＣＤに結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤの合成を試みた。
以前、本発明者らは、リゾチームをはじめとしたＮ−アセチルグルコサミニル基転移酵素がＮ−アセチルキトオリゴ糖化合物から分岐ＣＤの分岐側鎖の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基を転移結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−分岐ＣＤを効率よく合成することを見出した（特願平７−１５４１０２号明細書）。
しかしながら、上記の合成方法は、糖供与体として用いるＮ−アセチルキトオリゴ糖が高価であるという問題がある。
また、リゾチームをはじめとしたＮ−アセチルグルコサミニル基転移酵素は分岐ＣＤを受容体とし、分岐側鎖部分にＮ−アセチルグルコサミニル基を結合することは可能であったが、分岐側鎖を有しないα−、β−およびγ−ＣＤには直接Ｎ−アセチルグルコサミニル基を結合させることはできなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは鋭意努力を重ねた結果、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼがＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンとＣＤの混合溶液からＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤを効率よく合成することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成したのである。
【０００７】
すなわち、本発明はＣＤとＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンを含有する溶液に、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させて縮合反応を行うことを特徴とする、ＣＤのＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基，グルコサミニル基，Ｎ−アセチルガラクトサミニル基およびガラクトサミニル基のいずれかが結合している分岐ＣＤおよびその塩の製造方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の分岐ＣＤは、いずれも新規物質であり、その具体例を示すと、例えば６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−γ−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−γ−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−γ−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−α−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−β−ＣＤ，６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−γ−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−α−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−β−ＣＤ，３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−グルコサミニル−γ−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−α−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−β−ＣＤ，２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトサミニル−γ−ＣＤなどを挙げることができる。
これらのうちの代表的な化合物の構造式（構造式１〜１２）を下記に示す。なお、式中のｎは５〜７を示す。
【０００９】
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
本発明の分岐ＣＤは、ＣＤとＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンを含有する溶液に、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させ、さらに必要に応じて脱アセチル化することによって得られる。
ここで、脱アセチル化方法としては、例えばアルカリ溶液を作用させる方法（Sannan,T., K.Kurita, Y.Iwakura: Makromol. Chem., 177,3589-3600(1976)) 、イオン交換樹脂を使用する方法等の既知の方法を適用することができる。
【００２２】
本発明において、ＣＤとしてはα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤが主に使用されるが、これらＣＤの水酸基にα１，６結合でグルコシル−ＣＤ，マルトシル−ＣＤ，マンノシル−ＣＤ，ガラクトシル−ＣＤなどの置換基が結合した分岐側鎖を有するものでもよい。また、これらの混合物であってもよい。
本発明に用いるＮ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンは、純度の高いものを用いることが望ましいが、オリゴ糖を含むものでも使用することができる。
【００２３】
次に、本発明に用いる酵素としては、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをはじめとしてＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンとＣＤを含有する溶液に作用させたときに縮合反応、つまり加水分解反応の逆反応によって、そのＮ−アセチルグルコサミニル基もしくはＮ−アセチルガラクトサミニル基をＣＤにβ結合で結合させ、Ｎ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤを合成するものであれば、いずれの酵素も使用可能である。
本発明に用いる酵素は、自然界に広く分布しているものである。例えばＮ−アセチルヘキソサミニダーゼは、タチナタマメ等の植物に含まれている植物由来の酵素があり、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては、牛腎臓に含まれる動物由来のものやアスペルギルス・ニガーの生産する微生物由来のものなどがある。Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ホラ貝に含まれる動物由来、アクレモニウムに含まれる微生物由来のものなどがある。
【００２４】
本発明の反応系において、ＣＤとＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン含む溶液（水溶液または懸濁液）は、ＣＤの濃度が約１〜４０％（ｗ／ｗ）、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンの濃度が約５〜５０％（ｗ／ｗ）であることが望ましく、かつＣＤに対するＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンの比率（重量）は、０．１〜５０倍の範囲、好ましくは１〜５倍の範囲とするのが適当である。
反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜７、温度は２０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃に調整して反応させることが適当である。
使用する酵素量は反応時間と密接な関係があるので、通常は反応が５〜２００時間、好ましくは１０〜５０時間で終了するような酵素量とすればよいが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明において、脱アセチル化反応は前記したように常法により行えばよく、例えば上記方法にて調製したＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤをアルカリ溶液で処理すればよい。このときの処理条件は、既知の方法に従えばよい。例えば、脱アセチル化の反応系はＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤもしくはＮ−アセチルガラクトサミニル−ＣＤの濃度を０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲とするのが適当である。
脱アセチル化反応の際に用いるアルカリ溶液としては、水酸化ナトリウム溶液が好ましいものではあるが、脱アセチル化反応が進行するものであればこれに限定されるものではない。
また、反応温度，濃度，アルカリ溶液の種類等は相互に密接に影響を受けるので、通常は水酸化ナトリウム溶液濃度０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、温度１０〜１００℃、反応時間０．１〜１２０時間の範囲とするのが適当であるが、これらに限定されるものではない。
脱アセチル化反応終了後は、酸を滴下することによって中和、脱塩した後、必要に応じて、精製し目的物とすればよい。
【００２６】
以上のような方法で反応させて得られた液を、カラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにかけて、生成物を分画・分取した後、ＦＡＢ−ＭＳによる分子量測定および核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により構造解析を行った結果、前記の構造式１〜１２に代表される分岐ＣＤであることを確認した。
【００２７】
【実施例】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）縮合反応
Ｎ−アセチルグルコサミン１．１１ｇ，α−ＣＤ１．２２ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに、タチナタ豆由来のＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。
反応液の一部をアミド系カラム（東ソー（株）社製、Ａｍｉｄｅ−８０）および逆相カラム（ＹＭＣ（株）社製、ＯＤＳ−ＡＱ３０３）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を図１および２に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ａを１００ｍｇ、生成物Ｂを５ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ａは、図３に示すように、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１１７５であることがわかった。また、13Ｃ−ＮＭＲ解析により、この物質は図４に示すように、α−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎアセチルグルコサミニル−αＣＤ（前記構造式１の化合物；ｎ＝５）であることが確認された。
【００２８】
一方、生成物Ｂは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１１７５であることがわかった。また、少量の生成物Ｂを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解してＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った。
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンとα−ＣＤ等モルに分解された。このことから、転移生成物Ｂはα−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式５もしくは９の化合物；ｎ＝５）であることが判明した。
【００２９】
実施例２
（１）縮合反応
Ｎ−アセチルグルコサミン１．１１ｇとβ−ＣＤ０．５６７ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに、実施例１で用いたＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。反応液の一部をアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図５に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ｃを４０ｍｇと生成物Ｄを３ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ｃは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１３３７であることがわかった。したがって、実施例１の結果も踏まえて、この生成物Ｃはβ−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式１の化合物；ｎ＝６）であることが確認された。
【００３０】
一方、生成物Ｄは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１３３７であることがわかった。また、少量の生成物Ｄを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った。
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−ＣＤ等モルに分解された。このことから、実施例１の結果も踏まえて、生成物Ｄはβ−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（構造式５もしくは９の化合物；ｎ＝６）であること推察された。
【００３１】
実施例３
Ｎ−アセチルグルコサミン１．１１ｇとγ−ＣＤ１．６２ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに、実施例１で用いたＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。反応液の一部をアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図６に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ｅを２００ｍｇ、生成物Ｆを６ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ｅは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１４９９であることがわかった。したがって、実施例１の結果も踏まえて、この生成物Ｅはγ−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式１の化合物；ｎ＝７）であることが確認された。
【００３２】
一方、生成物Ｆは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１４９９であることがわかった。また、少量の生成物Ｆを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った。
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンとγ−ＣＤ等モルに分解された。このことから、実施例１の結果も踏まえて、生成物Ｆはγ−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式５もしくは９の化合物；ｎ＝７）であること推察された。
【００３３】
実施例４
（１）縮合反応
Ｎ−アセチルガラクトサミン１．１１ｇとα−ＣＤ１．２２ｇを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに実施例１で用いたＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを５０Ｕ加え、４５℃にて７２時間反応させた。反応液の一部をアミド系カラムおよび逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図７および８に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて主生成物Ｇを８３ｍｇ、生成物Ｈを５ｍｇ分取した。
（２）構造解析
上記（１）で単離された主生成物Ｇは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１１７５であることがわかった。また、この物質は、13Ｃ−ＮＭＲ解析により、図９に示すように、α−ＣＤの６位の１級水酸基にβ結合でＮ−アセチルガラクトサミニル基が結合した化合物６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−αＣＤ（前記構造式２の化合物；ｎ＝５）であることが確認された。
【００３４】
一方、生成物Ｈは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１１７５であることがわかった。また、少量の生成物Ｈを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った結果、Ｎ−アセチルガラクトサミンとα−ＣＤ等モルに分解された。このことから、生成物Ｈはα−ＣＤの２級水酸基にβ結合でＮ−アセチルガラクトサミニル基が結合した化合物（構造式６もしくは１０の化合物；ｎ＝５）であることがわかった。
【００３５】
実施例５
実施例１で得られたＮ−アセチルグルコサミニル−αＣＤ（前記構造式１の化合物；ｎ＝５）２５ｍｇを濃度１％となるように２０％水酸化ナトリウム溶液を調製し、８０℃で３時間反応を行った。
反応終了後、濃塩酸を滴下してｐＨを中性まで下げた。脱塩装置（旭化成株式会社製、マイクロアシライザーＧ１）を用いて反応液から塩を除き、脱アセチル化物、つまりα−ＣＤの６位の水酸基にβ結合でグルコサミニル基が結合した化合物（前記構造式３の化合物；ｎ＝５）を２０ｍｇ得た。
【００３６】
実施例６
実施例４で得られたＮ−アセチルガラクトサミニル−αＣＤ（前記構造式２の化合物；ｎ＝５）２５ｍｇを濃度１％となるように２０％水酸化ナトリウム溶液を調製し、８０℃で３時間反応させた。
反応終了後、濃塩酸を滴下してｐＨを中性まで下げた。脱塩装置（旭化成株式会社製、マイクロアシライザ−Ｇ１）を用いて反応液から塩を除き、脱アセチル化物、つまりα−ＣＤの６位の水酸基にβ結合でガラクトサミニル基が結合した化合物（前記構造式４の化合物；ｎ＝５）を２０ｍｇを得た。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素の縮合反応を利用して、ＣＤ分子中のＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基またはＮ−アセチルガラクトサミニル基が結合している新規分岐ＣＤを効率よく得ることができる。また、これらを脱アセチル化処理することによって、ＣＤ分子中のＣＤ環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でグルコサミニル基またはガラクトサミニル基が結合している新規分岐ＣＤを効率よく得ることができる。
本発明の新規分岐ＣＤは、医薬品分野の他に食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図２】 実施例１の反応液の逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図３】 実施例１の反応生成物ＡのＦＡＢ−ＭＳスペクトルである。
【図４】 実施例１の反応生成物Ａの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】 実施例２の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図６】 実施例３の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図７】 実施例４の反応液のアミド系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図８】 実施例４の反応液の逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフである。
【図９】 実施例４の反応生成物Ｇの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
Claims (2)
- シクロデキストリンとＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンを含有する溶液に、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させて縮合反応を行うことを特徴とする、シクロデキストリンのシクロデキストリン環を構成するグルコシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基，グルコサミニル基，Ｎ−アセチルガラクトサミニル基およびガラクトサミニル基のいずれかが結合している分岐シクロデキストリンおよびその塩の製造方法。
- シクロデキストリンがα−，β−およびγ−シクロデキストリンまたはこれらシクロデキストリンの水酸基にβ１，６結合で置換基が結合したもののいずれかである請求項１記載の分岐シクロデキストリンおよびその塩の製造方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19953496A JP3865436B2 (ja) | 1996-07-11 | 1996-07-11 | 分岐シクロデキストリンの製造方法 |
| US08/876,979 US5763598A (en) | 1996-07-11 | 1997-06-16 | Branched cyclodextrins and method for producing them |
| AU24977/97A AU686535B1 (en) | 1996-07-11 | 1997-06-18 | Branched cyclodextrins and method for producing them |
| KR1019970029294A KR100407043B1 (ko) | 1996-07-11 | 1997-06-30 | 분지 사이클로 덱스트린 및 그 제조방법 |
| EP97111747A EP0818469B1 (en) | 1996-07-11 | 1997-07-10 | Method for producing branched cyclodextrins |
| CA002210041A CA2210041C (en) | 1996-07-11 | 1997-07-10 | Branched cyclodextrins and method for producing them |
| DE69720604T DE69720604T2 (de) | 1996-07-11 | 1997-07-10 | Verfahren zur Herstellung von verzweigten Cyclodextrinen |
| HU9701186A HU223005B1 (hu) | 1996-07-11 | 1997-07-11 | Eljárás elágazó láncú ciklodextrinek előállítására |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19953496A JP3865436B2 (ja) | 1996-07-11 | 1996-07-11 | 分岐シクロデキストリンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1025305A JPH1025305A (ja) | 1998-01-27 |
| JP3865436B2 true JP3865436B2 (ja) | 2007-01-10 |
Family
ID=16409440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19953496A Expired - Fee Related JP3865436B2 (ja) | 1996-07-11 | 1996-07-11 | 分岐シクロデキストリンの製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5763598A (ja) |
| EP (1) | EP0818469B1 (ja) |
| JP (1) | JP3865436B2 (ja) |
| KR (1) | KR100407043B1 (ja) |
| AU (1) | AU686535B1 (ja) |
| CA (1) | CA2210041C (ja) |
| DE (1) | DE69720604T2 (ja) |
| HU (1) | HU223005B1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6683100B2 (en) | 1999-01-19 | 2004-01-27 | Novartis Ag | Organic compounds |
| US6194181B1 (en) | 1998-02-19 | 2001-02-27 | Novartis Ag | Fermentative preparation process for and crystal forms of cytostatics |
| JP4497592B2 (ja) * | 1999-09-10 | 2010-07-07 | 株式会社横浜国際バイオ研究所 | アミノ糖を分岐側鎖に有するシクロデキストリン、その製造法並びにその利用 |
| EP1380595A4 (en) | 2001-03-09 | 2007-08-29 | Hayashibara Biochem Lab | BRANCHED CYCLIC TETRASACCHARIDE, METHOD FOR ITS PREPARATION AND USE |
| DE10200405A1 (de) | 2002-01-08 | 2002-08-01 | Zimmer Ag | Spinnvorrichtung und -verfahren mit Kühlbeblasung |
| DE10204381A1 (de) | 2002-01-28 | 2003-08-07 | Zimmer Ag | Ergonomische Spinnanlage |
| FR2839313B1 (fr) * | 2002-05-03 | 2006-04-07 | Chelator | Nouveaux derives de cyclodextrines, leur procede de preparation et leurs applications |
| US6740509B2 (en) * | 2002-05-22 | 2004-05-25 | Ikuko Ishii Karakasa | Method for the production of mucin-type glycopeptide |
| EP1676923A4 (en) * | 2003-08-26 | 2007-02-28 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | SUGAR CHAINS CUTTING AGING |
| DE102004024030A1 (de) | 2004-05-13 | 2005-12-08 | Zimmer Ag | Lyocell-Verfahren mit polymerisationsgradabhängiger Einstellung der Verarbeitungsdauer |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS623795A (ja) * | 1985-06-28 | 1987-01-09 | Tokuyama Soda Co Ltd | 分枝状シクロデキストリンの製造方法 |
| DE3810737A1 (de) * | 1988-03-30 | 1989-10-12 | Macherey Nagel Gmbh & Co Kg | Substituierte cyclodextrine |
| AU7453191A (en) * | 1990-03-02 | 1991-09-18 | Australian Commercial Research & Development Limited | Cyclodextrin compositions and methods for pharmaceutical and industrial applications |
| DE4204315A1 (de) * | 1992-02-13 | 1993-08-19 | Consortium Elektrochem Ind | Cyclodextringlycoside und verfahren zu ihrer herstellung |
| JP3078923B2 (ja) * | 1992-04-08 | 2000-08-21 | 塩水港精糖株式会社 | 新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法 |
| FR2714067B1 (fr) * | 1993-12-22 | 1996-01-12 | Commissariat Energie Atomique | Nouveaux dérivés de cyclodextrines, utilisables en particulier pour solubiliser des composés chimiques hydrophobes tels que des médicaments, et leur procédé de préparation. |
| FR2715307B1 (fr) * | 1994-01-25 | 1996-04-05 | Commissariat Energie Atomique | Procédé de solubilisation dans un milieu aqueux d'agents antitumoraux de la famille du taxol, et cyclodextrines ramifiées utilisables pour cette solubilisation. |
| FR2716200B1 (fr) * | 1994-02-11 | 1996-04-26 | Commissariat Energie Atomique | Procédé de préparation de cyclomaltooligosaccharides ramifiés, en particulier de cyclodextrines ramifiées. |
| JPH07275698A (ja) * | 1994-04-06 | 1995-10-24 | Nakano Vinegar Co Ltd | クロマトグラフィー用または蛋白質固定化用担体 |
| JPH08173181A (ja) * | 1994-12-21 | 1996-07-09 | Ensuiko Sugar Refining Co Ltd | ヘテロ分岐シクロデキストリンの製造方法 |
| JP3816554B2 (ja) * | 1995-05-30 | 2006-08-30 | 塩水港精糖株式会社 | 新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法 |
-
1996
- 1996-07-11 JP JP19953496A patent/JP3865436B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-16 US US08/876,979 patent/US5763598A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-18 AU AU24977/97A patent/AU686535B1/en not_active Ceased
- 1997-06-30 KR KR1019970029294A patent/KR100407043B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-07-10 DE DE69720604T patent/DE69720604T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-10 EP EP97111747A patent/EP0818469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-10 CA CA002210041A patent/CA2210041C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-11 HU HU9701186A patent/HU223005B1/hu not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9701186A2 (hu) | 1998-03-02 |
| EP0818469B1 (en) | 2003-04-09 |
| AU686535B1 (en) | 1998-02-05 |
| HUP9701186A3 (en) | 1999-04-28 |
| HU9701186D0 (en) | 1997-09-29 |
| KR980009285A (ko) | 1998-04-30 |
| JPH1025305A (ja) | 1998-01-27 |
| DE69720604D1 (de) | 2003-05-15 |
| HU223005B1 (hu) | 2004-03-01 |
| EP0818469A2 (en) | 1998-01-14 |
| CA2210041A1 (en) | 1998-01-11 |
| EP0818469A3 (en) | 1998-08-05 |
| CA2210041C (en) | 2005-07-05 |
| US5763598A (en) | 1998-06-09 |
| KR100407043B1 (ko) | 2004-05-31 |
| DE69720604T2 (de) | 2003-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3865436B2 (ja) | 分岐シクロデキストリンの製造方法 | |
| JP3078923B2 (ja) | 新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法 | |
| WO2004087768A1 (fr) | Nouveaux derives de cyclodextrines, leur procede de preparation et leur utilisation notamment pour la solubilisation de substances pharmacologiquement actives | |
| JP3816554B2 (ja) | 新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法 | |
| CA2088116C (en) | Method of preparing branched cyclodextrin | |
| JP2863262B2 (ja) | 分岐シクロデキストリンの側鎖部分にα―結合でガラクトシル基を転移結合させた新規ヘテロ分岐シクロデキストリン及びその製造方法 | |
| JP3122203B2 (ja) | 新規ヘテロ分岐シクロデキストリンおよびその製造方法 | |
| JP3552732B2 (ja) | 新規な分岐シクロデキストリン | |
| JP3086076B2 (ja) | 新規ガラクトシル−分岐シクロデキストリン | |
| JP2863263B2 (ja) | 分岐シクロデキストリンの側鎖部分にβ―結合でガラクトシル基を転移結合させた新規ヘテロ分岐シクロデキストリン及びその製造方法 | |
| JP3637085B2 (ja) | マンノシル−シクロデキストリンの製造方法 | |
| JP3637086B2 (ja) | マンノシル−シクロデキストリンの製法 | |
| JP3655325B2 (ja) | マンノシル−シクロデキストリンの新規製造方法 | |
| JP4497592B2 (ja) | アミノ糖を分岐側鎖に有するシクロデキストリン、その製造法並びにその利用 | |
| JPH08173181A (ja) | ヘテロ分岐シクロデキストリンの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060412 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060608 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060912 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20061003 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091013 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101013 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111013 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111013 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121013 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |