JP3842107B2

JP3842107B2 - Roughened slide glass and method for analyzing biological material using the same

Info

Publication number: JP3842107B2
Application number: JP2001332778A
Authority: JP
Inventors: 浩岡村; 通文丹花; 光芳大場; 薫山川; 研一高木
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2000-11-07
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2006-11-08
Anticipated expiration: 2021-10-30
Also published as: JP2002211954A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子解析、診断、治療等に使用される遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質解析用等に用いられるスライドグラス及び該ガラスを用いて遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質等を解析する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、遺伝子解析用等に用いられる基板としては、ポリリシン等をコーティングしたスライドグラスが用いられ、表面に１万以上のＤＮＡ断片(ＤＮＡプローブ)等の遺伝子を載せうるように加工がされているものが広く用いられれている。
【０００３】
前記のようなチップを用いて例えば、あるＤＮＡサンプルの塩基配列を知りたい場合には、該スライドグラス上に、予め塩基配列が解明されており、互いに異なる塩基配列を有する数万本のＤＮＡ断片を、位置がわかるように結合させておいたものを用意し、これに蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮＡ断片は、該スライドグラス上につけたＤＮＡ断片（プローブ）のうちの相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズする。ハイブリダイズ部分は、スライドグラスを蛍光測定することによりスポットとして識別でき、ＤＮＡサンプル中のＤＮＡ断片の配列を解明することができる。
このように、遺伝子解析用スライドグラスは、あるＤＮＡの塩基配列を簡単に特定することができることから、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリング、ゲノムミスマッチング等の遺伝子解析等に利用されるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の開発等に応用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記遺伝子解析用スライドグラスを用いて解析を行う場合、蛍光標識ＤＮＡをハイブリダイズし、蛍光強度を観察することによって行われる。
しかし、従来の遺伝子解析用スライドグラスは、前記スポットの解析をするにあたり、ガラスの洗浄等の前処理を行うため、スポットしたＤＮＡ断片が洗い流されてしまい、スポットが明瞭に検出できない場合が多かった。また、固定化するＤＮＡ断片が少ないため、スポットが明瞭に検出できない場合も多かった。
本発明は、このような従来の遺伝子解析用スライドグラスの有する蛍光検出の不明瞭さという問題点を解決することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、ＤＮＡプローブあるいは蛋白質等の生体物質等を載せる粗面化したスライドグラス表面に炭素系物質層を形成することにより、スライドグラスを洗浄してもスポットしたＤＮＡ断片が洗い流されずに強固に多く固定化されており、蛍光照射した際に、蛍光スポットが明瞭となることに気が付いた。本発明は係る知見に基づくものである。
【０００６】
本発明のスライドグラスは、粗面化処理を施した表面粗さＲａ（中心線平均粗さ：ＪＩＳＢ０６０１）：１〜５１０ｎｍであるスライドグラスの表面に厚みが、１ｎｍ〜１０００ｎｍであるダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイトからなる炭素系物質層の表面処理層を形成し、当該スライドグラスの裏面に金属蒸着膜層を形成されたものであることを特徴とする。
ガラスの粗面化処理は、フッ酸あるいは、ケイフッ酸とシリカを含んだ水溶液中で処理するのが望ましい。また、機械的研磨でも良い。前記ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作製されたものであることが好ましい。さらに、前記ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイトからなる炭素系物質層の被膜上に、オリゴヌクレオチド断片を担持させたものであることが好ましい。また、このような本発明の粗面化スライドグラスは、その表面にＤＮＡプルーブ等の遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物質を担持させて遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物質を解析する方法に利用することができる。
【０００７】
【発明の実施の態様】
本発明のスライドガラスは、粗面化したガラス基板最表面に炭素質物質が形成されたものを用い、スライドグラスの上にＤＮＡ、蛋白質、ペプチド等のサンプルを載せて様々な解析に用いると、遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質との親和性等が強固になるので好ましい。
【０００８】
スライドグラスの基板となるガラスの粗面化方法として、フッ酸を含んだ水溶液、あるいはケイフッ化水素酸とシリカを含んだ水溶液で処理するのが好ましい。これらの水溶液にホウ酸などのｐＨ調整用薬品を添加しても良い。処理する方法は浸漬法、スプレー法が好ましい。また、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化ジルコニウム、べんがらあるいは酸化クロム等の研磨剤を用いて、機械的に研磨しても良い。特に、ケイフッ化水素酸とシリカを含んだ水溶液中に浸漬処理することにより、ガラス表面に微小な凹凸を形成すると効果的である。表面粗さＲａ（中心線平均粗さ：ＪＩＳＢ０６０１）は１〜５１０ｎｍが好ましい。１ｎｍ未満では、オリゴヌクレチドをスポッティングして蛍光検出装置で蛍光強度を測定しても、蛍光強度が小さすぎて検出が困難な場合がある。５１０ｎｍを超えると、蛍光強度が飽和した状態でこれ以上処理するのは不経済である。
また、この粗面化処理したガラスの表面に炭素系物質の表面処理層を形成させることが好ましい。炭素系物質は、ＤＮＡプローブ固着性の点からダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファイト等が好ましい。
【０００９】
基板たるガラス上に、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系物質からなる表面処理層を形成させたスライドグラスは、ＤＮＡプロ−ブを強固に固定化させることができる。
すなわち、炭素は化学的安定性に優れており、ＤＮＡプローブ等を載せる際の反応等に耐えることができるのである。その理由は、炭素上にＤＮＡなどのプローブを固定化させたときに炭素原子との共有結合の形態を示すので、ＤＮＡプローブをスライドグラス表面に強固に固定化させることができるためであると考えられる。
さらに、上記のダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他の物質との混合体、例えば金属やセラミックス等との混合体も表面処理層として用いることができる。
また、上記のダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他の物質との積層体も表面処理層として用いることができる。
【００１０】
また、固定化されたプローブは、図１に示すようにスライドグラス上にほぼ垂直に林立させられるので、スライドグラス表面の単位面積あたりの固定化密度を上げることができる。
上記表面処理層のダイヤモンドの素材としては、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いてダイヤモンド膜を形成させることが好ましい。
また、表面処理層としては、ダイヤモンドと同等の性能を有し経済的にも有利な点で、非晶質のダイヤモンドライクカーボン（ＤｉａｍｏｎｄＬｉｋｅＣａｒｂｏｎ）膜をガラス表面に形成することもできる。ダイヤモンドライクカーボン（ＤｉａｍｏｎｄＬｉｋｅＣａｒｂｏｎ）は、ダイヤモンドやグラファイトと同様に炭素原子から構成され、ダイヤモンドに類似した特性を有することからＤＬＣと呼ばれている。ＤＬＣの結晶構造は、アモルファス（非晶質）である。
上記表面処理層としては、グラファイト等の炭素系物質も好適に用いられる。ダイヤモンドは、中心及び四隅に炭素原子をもつ正四面体構造で、ｓｐ３混成軌道を形成するきわめて堅い立方晶系の結晶である。
【００１１】
本発明の炭素系物質としては、グラファイトや無定形炭素を挙げることができる。グラファイトは、ｓｐ２混成の六角形の網面がπ電子を介して層状に積み重なった構造の六方晶系結晶である。無定形炭素は明瞭な結晶構造を示さない。無定形炭素には結晶程度の低い徴晶質炭素も含まれる。
また、結晶の大小やその配列の度合いなどによって、無定形炭素からグラファイトに至る中間的な構造の炭素系物質が存在するが、これらの間には明瞭な変態点が存在しない。本発明の炭素系物質とは、グラファイト又は無定形炭素の単体、グラファイトと無定形炭素との混合物、これらに無定形炭素及びグラファイトの中間的構造を示すものが含まれる。
本発明の表面処理層は、上記ダイヤモンド、ＤＬＣ、グラファイト等の炭素系物質が混合されたものも用いることができる。
また本発明の表面処理層は、ＤＬＣ膜、ダイヤモンド膜、炭素系物質膜とが交互に積層されたものも用いることができる。
【００１２】
本発明の表面処理層の厚みは、特に限定するものではないが、１ｎｍ〜１０００ｎｍの厚みがあればよい。１ｎｍ未満では、あまりに薄すぎて表面処理層の厚みが均一にはならずに、下地のガラス基板を被覆できない部分が存在するので、好ましくない。一方、１０００ｎｍを超える被覆は表面処理層中の応力により、剥離が生じやすくなるので好ましくない。
工業上の生産性からすると、表面処理層の厚みは、１０ｎｍ〜５００ｎｍとすることが好ましい。さらに好ましくは、３０〜２００ｎｍである。
【００１３】
表面処理層のダイヤモンドの形成割合は、上記プラズマＣＶＤ法で形成する場合には、反応槽内の圧力、バイアス電圧や基板温度等の条件により適宜設定することができる。
表面処理層中のダイヤモンド濃度の調整は、例えばプラズマＣＶＤ法でＤＬＣ膜を形成する場合、置換ガスとしてのＮ_２ガスの供給量を調整することにより、供給原料としての炭化水素ガスにおけるＨ／Ｃ比を変更することに行うことができる。
【００１４】
Ｎ_２ガスの供給量を多くするとＤＬＣ膜中のＨ_２取り込み量が多くなるので、ＤＬＣにおけるダイヤモンド濃度を高くすることができ、一方Ｎ_２ガスの供給量を少なくするとＤＬＣ膜中へのＨ_２取り込み量が少なくなるので、ＤＬＣにおけるダイヤモンド濃度を低くすることができる。
ガラス基板上へのダイヤモンド、ＤＬＣ、グラファイト等の表面処理層形成は、高周波プラズマＣＶＤ法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、しーザ蒸着法等により形成することができる。
高周波プラズマＣＶＤ法では、１３．５６ＭＨｚの高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス(メタン)を分解し、基板上にＤＬＣ膜を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス(ベンゼン)を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上に成膜する。また、水素ガス０〜９９体積％と残りメタンガス１００〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ膜を形成しても良い。
【００１５】
ＤＬＣ膜は、通常黒色を呈しているが、本発明のスライドグラスにおいては、透明膜であることが好ましい。すなわち、本発明のスライドグラスは、遺伝子解析用等に用いられるものであって、スライドグラス表面に蛍光照射し、その強度を測定するものであることから、光透過性が要求されるのである。
本発明の表面処理層を形成したスライドグラスの光透過率は、光波長が４００ｎｍ〜５００ｎｍの領域(Ｂ１ｕｅ領域)における透過率が、５０％以上であることが好ましい。さらに好ましくは６０％以上である。
また光波長が６００ｎｍ〜７００ｎｍの領域（Ｒｅｄ領域）における透過率が、７０％以上であることが好ましい。さらに好ましくは７５％以上である。
上記のそれぞれの領域における光透過率を有することでスライドグラス上の蛍光標識の強度を効率よく測定できるのである。
【００１６】
このような光透過性を待ったダイヤモンドライクカーボンを製造するには、例えば、イオン化蒸着法において、炭化水素ガスと水素ガスとの混合ガス中の水素ガスの含有率を増すほど、光透過率を高くしたダイヤモンドライクカーボンを製造することができる。
上記のイオン化蒸着法とは、Weissmantelらにより考案された方法で、炭化水素ガスソースＤＬＣ成膜法のー種であり、イオン源は陰極である熱フィラメントと対向する陽極グリツドとそれらを取り囲む金属円筒からなる。
【００１７】
イオン化蒸着法を用いて、スライドグラス上に光透過率を高くしたダイヤモンドライクカーボンを製造する実施態様を述べる。
例えば、厚みｌｍｍのスライドグラス（マツナミガラス（株）製Ｓ−１１１２）を用いて、この上にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）膜を厚み１０ｎｍ形成した。そしてこのＤＬＣ膜を形成したスライドグラスの光透過率を調べた結果は次のようになった。すなわち、水素ガスを全く含まない雰囲気（０体積％）でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、４００ｎｍの波長の光では８８．７％の光透過率であった。水素ガスを１体積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、４００ｎｍの波長では８９．４％の光透過率であった。更に、水素ガスを８０体積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、４００ｎｍの波長では９０．８％の光透過率であった。このように、水素ガスの割合を増すほど光透過率が高くなることが分かった。
【００１８】
また、７００ｎｍの波長の光で光透過率を測定してみると、水素ガスを全く含まない雰囲気（０体積％）でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、９０．０％の光透過率であった。水素ガスを１体積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグヲスは、９０．８％の光透過率であった。更に、水素ガスを８０体積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、９２％の光透過率であった。このように、７００ｎｍの波長の光で測定した場合も４００ｎｍの波長を用いて測定した結果と同じように、水素ガスの割合を増すほど光透過率が高くなることが分かった。
【００１９】
なお、表面処理層を全く形成していないスライドグラス自体(ブランク)の光透過率は、４００ｎｍの波長では９１．０％を示し、７００ｎｍの波長では９２％の光透過率を示した。
ここで、光透過率は以下の式に基づき計算した。
光透過率Ｔ＝（Ｉ／Ｉ₀）×１００
Ｉ:ブランクでの透過光の強度
Ｉ_０:表面処理層を形成したときの透過光の強度
【００２０】
水素ガスを含有すると透明になりやすいのは、水素ガスを含有しないとｓｐ２混成軌道を多量に含み着色の原因となるが、水素ガスを含むと、透明なｓｐ３軌道を多く含むようになるためと考えられる。しかし、水素ガスを多く含むとダイヤモンドライクカーボンの成膜速度が遅くなり、水素ガスの含有率は、より好ましくは１〜５０体積％が良い。
【００２１】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト原料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速し成膜を行う。
また、しーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ(パルス発振)光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることにより形成することができる。
【００２２】
本発明のスライドグラスは、ＤＮＡプローブ等の遺伝子、蛋白質、ベプチド等の生体物質を多数載せることができるものである。従って、スライドグラスの表面上に複数の微小区分が設けられ、１つの区分に多数のオリゴヌクレオチド断片を担持可能となっているものも好ましく採用される。微小区分のそれぞれにおいて、ＤＮＡプローブ等の種類を変えることについては特に制限はなく、用途に応じて適宜変化させることができる。
【００２３】
スライドグラスの形状は特に限定されず、例えば、フィルムまたはシートのような平板状、円盤状、または粒状等のものであってもよい。また、スライドグラスの厚さ、大きさ等にも特に制限はなく、通常用いられるのと同様の範囲とすることができる。
スライドグラスの基板たるガラスの種類として、通常用いられているスライドグラス、結晶化ガラス、石英ガラス、強化ガラスなど特に限定されるものではない。また、組成の異なるガラスを２層以上に積層したガラスでも良い。
【００２４】
本発明の粗面化したスライドグラスに載せることができるオリゴヌクレオチド断片（プロ―ブ）については、１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ断片等、塩基数にも特に制限はない。オリゴヌクレオチド断片の固定は、スライドグラスの表面への化学結合等により行うことができる。例えば、ダイヤモンドライクカーボンによる炭素系物質層を形成させたスライドグラスを用いる場合、表面を活性化、すなわちＤＮＡと化学結合しやすくした後に、ＤＮＡの末端塩基のアミノ基を結合することができる。
【００２５】
この場合のスライドグラス表面活性化の一例を挙げると、該スライドグラスを塩素ガス中で固体支持体に紫外線照射してダイヤモンドライクカーボン膜表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。更に、カルボキシル化してないアミノ基を多価カルボン酸溶液に浸漬することによりマスキングする。末端のカルボキシル基をカルボジイミド或いはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより、アミド結合を介して炭化水素基の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基等の活性エステル基が結合した基を固定化することができ、活性化される。また、該スライドグラスをアンモニアガスまたはアミノ基を含む化合物を導入した反応容器に入れ、プラズマによりアミノ化しても良い。
【００２６】
こうして本発明のスライドグラス表面を活性化させておけば、例えば、塩基配列が既に解明されている数万本のＤＮＡ断片（プローブ）を担持させることができる。
また、該スライドグラス上にオリゴｄＴプライマーを結合させておき、逆転写反応等で目的のｃＤＮＡを伸張させると同時にスライドグラスに結合することもできる。
さらに、ＰＣＲ等を用いてガラス上で多数のＤＮＡ鎖を伸張させ、かつ結合させることもできる。
【００２７】
このようにして、ＤＮＡ断片を結合させた後、これに蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮＡサンプルは、該スライドグラス上に結合させたＤＮＡ断片（プローブ）のうちの相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズするので、蛍光スポットとしてＤＮＡサンプルの配列を解明することができる。
さらに、本発明のスライドグラスは、その裏面に例えば金属蒸着膜のような反射層が形成されていることが好ましい。
このような反射層をスライドグラスの裏面に形成させると、表面から蛍光照射をした場合の蛍光の反射効率を高める効果を有し、蛍光分析装置の感度を高めることができる。すなわち、蛍光スポットを明瞭に観察することができ、一度に多量の解析を行うことができる。
スライドグラスの裏面に形成させる反射層の種類としては、Ｔｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、ＷＣ、等の単層又はこれらの複合層が好ましい。反射層の厚みは、スライドグラス全体に均一に被覆されなければならないことから１００ｎｍ以上が好ましい。さらに好ましくは、１０００ｎｍ以上である。このような反射層を形成するにはー般に真空蒸着法を用いることができる。その他、スパッタリング法、イオンビーム蒸着法などの上記の反射層を形成させるのに適した従来技術を適宜選択して用いることができる。
【００２８】
このように、本発明のスライドグラスは、あるＤＮＡの塩基配列を従来と同様の方法をそのまま使いながら従来よりも格段に明瞭に解析、特定することができることから、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリング、ゲノムミスマッチング等の遺伝子解析等に利用されるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の開発等に有用である。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
実施例1
（１）以下のようにして、遺伝子解析用に用いるためのスライドグラスを用意した。まず、スライドグラスの基板として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のガラスを用いて、ガラスを粗面化した。ケイフッ化水素酸２０ｍｏｌ／Ｌ、シリカゲル３０ｇ／Ｌ及びホウ酸０．０４ｍｏｌ／Ｌを含んだ水溶液中に温度２５℃の条件で、ガラスを浸漬した。浸漬時間は適宜行い、表面粗さＲａを変化させた。更に、イオン交換水で洗浄後、乾燥して、粗面化したガラスを得た。
次に、この粗面化したガラス基体表面に、イオン化蒸着法により、メタンガス９５体積％と水素ガスを５体積％を混合したガスを原料として、ＤＬＣ膜２５ｎｍの厚みに形成したスライドグラスを作成した。
【００３０】
（２）次に、このスライドグラス表面を化学修飾し、活性化させた。
すなわち、ガラス基体表面を１分間塩素化した後、１０分間アミノ化し、さらに酸クロリドへ１０分間直接浸漬した。次に、超純水で洗浄後、活性化液へ浸漬して直接活性化を行った。活性化液の組成は、１，４−ジオキサン１ｍＬ、ハイドロゲンシアナミド２５ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１５０ｍｇであり、これらを溶解したものである。さらに超純水で洗浄後、６５℃で乾燥して活性化した。
【００３１】
前記のようにして作成したスライドグラス表面に、１０ｐｍｏｌ／ｍＬ濃度の蛍光標識オリゴヌクレチド（Ｃｙ３−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、Ｃｙ３、アマシャムファルマシアバイオテク社製、配列表の配列番号１参照）をスポッティングして、蛍光検出装置で蛍光強度を測定した。また、スポティング後洗浄し、同様に蛍光強度を測定した。なお、装置として、ＬＡＳ−１０００Ｐｌｕｓを用い、測定時間を１分とした。表１に示すように、こうして得られた蛍光強度は、表面粗さＲａが大きいほど強いことが判明した。
【００３２】
【表１】

表１において、粗面化しない比較例のガラスの表面粗さＲａは０．８ｎｍであり、粗面化した本発明のスライドグラスは、スポット後および洗浄後の蛍光強度は、粗面化しないガラス上のスポット後および洗浄後の蛍光強度よりも優れていた。
すなわち、祖面化した本発明のスライドグラスには、スポットしたＤＮＡ、蛋白質、ペプチド等の生体関連物質断片の密度が高く維持されており、スポットが明瞭に検出できた。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の粗面化したスライドグラスは、粗面化しないガラスに比べて、あるＤＮＡの塩基配列を従来と同様の方法をそのまま使いながら従来よりも格段に明瞭に解析、特定することができることから、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリング、ゲノムミスマッチング等の遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質の解析等に利用されるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の開発等に有用である。
【００３４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のスライドグラス上にプローブを固定化する場合の概略説明図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a slide glass used for analysis of biological materials such as genes or proteins used for gene analysis, diagnosis, treatment, etc., and a method for analyzing biological materials such as genes or proteins using the glass It is.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as a substrate used for gene analysis, a slide glass coated with polylysine or the like is used, and the surface is processed so that genes such as 10,000 or more DNA fragments (DNA probes) can be placed on the surface. Is widely used.
[0003]
For example, when it is desired to know the base sequence of a DNA sample using the chip as described above, the base sequence has been elucidated in advance on the slide glass, and tens of thousands of DNA fragments having different base sequences. Is prepared so that the position can be identified, and when a fluorescently labeled DNA sample is flowed, the DNA fragment is a complementary sequence of the DNA fragments (probes) attached on the slide glass. It hybridizes with a probe having The hybridized portion can be identified as a spot by measuring the fluorescence of the slide glass, and the sequence of the DNA fragment in the DNA sample can be elucidated.
Thus, since the slide glass for gene analysis can easily identify the base sequence of a certain DNA, in addition to being used for analysis of living genome, gene expression monitoring, gene analysis such as genome mismatching, etc. Furthermore, it is applied to genetic diagnosis such as detection of cancer gene mutation and development of pharmaceuticals.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
When the analysis is performed using the above-described slide glass for gene analysis, it is performed by hybridizing fluorescently labeled DNA and observing the fluorescence intensity.
However, since the conventional slide glass for gene analysis performs pretreatment such as glass washing in analyzing the spot, the spotted DNA fragments are often washed away, and the spot cannot be clearly detected in many cases. . In addition, since there are few DNA fragments to be immobilized, there are many cases where spots cannot be clearly detected.
An object of the present invention is to solve the problem of ambiguity in fluorescence detection of the conventional slide glass for gene analysis.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, as a result of diligent studies to achieve the above object, the present inventors formed a carbon-based material layer on the surface of a rough slide glass on which a biological material such as a DNA probe or a protein is placed. It was found that the spotted DNA fragments were firmly fixed without being washed away even after washing, and the fluorescent spots became clear when irradiated with fluorescence. The present invention is based on such knowledge.
[0006]
The slide glass of the present invention has a roughened surface roughness Ra (centerline average roughness: JIS B 0601): diamond having a thickness of 1 nm to 1000 nm on the surface of the slide glass having a thickness of 1 to 510 nm, A surface treatment layer of a carbon-based material layer made of diamond-like carbon or graphite is formed , and a metal vapor deposition film layer is formed on the back surface of the slide glass .
The glass roughening treatment is preferably carried out in an aqueous solution containing hydrofluoric acid or silicofluoric acid and silica. Further, mechanical polishing may be used. It is preferable that the diamond-like carbon is produced by an ionized vapor deposition method in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of methane gas. Furthermore, it is preferable that oligonucleotide fragments are supported on a film of a carbon-based material layer made of diamond, diamond-like carbon, or graphite . In addition, such a roughened slide glass of the present invention is used in a method for analyzing biological materials such as genes, proteins, peptides, etc., by carrying biological materials such as DNA probes, proteins, peptides, etc. on the surface thereof. can do.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The slide glass of the present invention uses a carbonaceous material formed on the outermost surface of a roughened glass substrate. When samples such as DNA, protein, and peptide are placed on the slide glass and used for various analyses, This is preferable because the affinity with a biological substance such as a gene or protein becomes strong.
[0008]
As a method for roughening the glass serving as the substrate of the slide glass, it is preferable to perform treatment with an aqueous solution containing hydrofluoric acid or an aqueous solution containing hydrofluoric acid and silica. You may add chemicals for pH adjustment, such as boric acid, to these aqueous solutions. The treatment method is preferably an immersion method or a spray method. Further, it may be mechanically polished by using an abrasive such as aluminum oxide, cerium oxide, zirconium oxide, red pepper or chromium oxide. In particular, it is effective to form minute irregularities on the glass surface by immersing in an aqueous solution containing hydrofluoric acid and silica. The surface roughness Ra (centerline average roughness: JIS B 0601) is preferably 1 to 510 nm. If it is less than 1 nm, even if the oligonucleotide is spotted and the fluorescence intensity is measured with a fluorescence detection device, the fluorescence intensity may be too small to be detected. If it exceeds 510 nm, it is uneconomical to process further in a state where the fluorescence intensity is saturated.
Moreover, it is preferable to form a surface treatment layer of a carbonaceous material on the surface of the roughened glass. The carbon-based material is preferably diamond-like carbon (DLC), diamond, graphite or the like from the viewpoint of DNA probe fixation.
[0009]
A slide glass in which a surface treatment layer made of a carbon-based material such as diamond, diamond-like carbon or graphite is formed on a glass as a substrate can firmly immobilize a DNA probe.
In other words, carbon is excellent in chemical stability and can withstand reactions and the like when a DNA probe is mounted. The reason is thought to be that when a probe such as DNA is immobilized on carbon, it shows a form of covalent bond with a carbon atom, so that the DNA probe can be firmly immobilized on the surface of the slide glass. It is done.
Further, a mixture of a carbon-based material such as diamond-like carbon (DLC), diamond, or graphite and another material, for example, a mixture of metal, ceramics, or the like can also be used as the surface treatment layer.
A laminate of a carbon-based material such as diamond-like carbon (DLC), diamond, or graphite and another material can also be used as the surface treatment layer.
[0010]
Further, since the immobilized probe is erected almost vertically on the slide glass as shown in FIG. 1, the immobilization density per unit area of the slide glass surface can be increased.
As the diamond material of the surface treatment layer, any of synthetic diamond, high pressure formed diamond, natural diamond, and the like can be used. Further, the structure may be either a single crystal or a polycrystal. From the viewpoint of productivity, it is preferable to form the diamond film by using a vapor phase synthesis method such as a microwave plasma CVD method.
In addition, as the surface treatment layer, an amorphous diamond-like carbon film can be formed on the glass surface because it has the same performance as diamond and is economically advantageous. Diamond Like Carbon is composed of carbon atoms like diamond and graphite, and is called DLC because it has similar characteristics to diamond. The crystal structure of DLC is amorphous.
A carbon-based material such as graphite is also preferably used as the surface treatment layer. Diamond is a very hard cubic crystal having a regular tetrahedral structure with carbon atoms in the center and four corners and forming sp3 hybrid orbitals.
[0011]
Examples of the carbonaceous material of the present invention include graphite and amorphous carbon. Graphite is a hexagonal crystal having a structure in which sp2 hybrid hexagonal network surfaces are stacked in layers via π electrons. Amorphous carbon does not show a clear crystal structure. Amorphous carbon includes crystalline carbon having a low crystallinity.
In addition, there are carbon-based substances having an intermediate structure from amorphous carbon to graphite depending on the size of the crystal and the degree of arrangement thereof, but there is no clear transformation point between them. The carbon-based material of the present invention includes graphite or amorphous carbon, a mixture of graphite and amorphous carbon, and those showing an intermediate structure between amorphous carbon and graphite.
As the surface treatment layer of the present invention, a layer in which a carbon-based material such as diamond, DLC, or graphite is mixed can be used.
In addition, the surface treatment layer of the present invention may be one in which a DLC film, a diamond film, and a carbon-based material film are alternately laminated.
[0012]
The thickness of the surface treatment layer of the present invention is not particularly limited, but it may be 1 nm to 1000 nm. If it is less than 1 nm, it is not preferable because the surface treatment layer does not have a uniform thickness, and there is a portion that cannot cover the underlying glass substrate. On the other hand, coating exceeding 1000 nm is not preferable because peeling easily occurs due to stress in the surface treatment layer.
From the viewpoint of industrial productivity, the thickness of the surface treatment layer is preferably 10 nm to 500 nm. More preferably, it is 30-200 nm.
[0013]
The diamond formation ratio of the surface treatment layer can be appropriately set depending on conditions such as the pressure in the reaction vessel, the bias voltage, and the substrate temperature when the diamond layer is formed by the plasma CVD method.
For adjusting the diamond concentration in the surface treatment layer, for example, when a DLC film is formed by the plasma CVD method, by adjusting the supply amount of N ₂ gas as a replacement gas, the H / C in the hydrocarbon gas as the feedstock is adjusted. This can be done by changing the ratio.
[0014]
Increasing the supply amount of N ₂ gas increases the amount of H ₂ incorporated into the DLC film, so that the diamond concentration in the DLC can be increased, while reducing the supply amount of N ₂ gas reduces the H ₂ into the DLC film. Since the amount of incorporation is reduced, the diamond concentration in DLC can be lowered.
Formation of a surface treatment layer of diamond, DLC, graphite or the like on a glass substrate can be formed by a high frequency plasma CVD method, an ionized vapor deposition method, an arc vapor deposition method, a scissor vapor deposition method, or the like.
In the high-frequency plasma CVD method, a source gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes by a high frequency of 13.56 MHz, and a DLC film is synthesized on the substrate. In the ionization vapor deposition method, the source gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a film is formed on a substrate by a bias voltage. Alternatively, the DLC film may be formed by ionized vapor deposition in a mixed gas composed of 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of the remaining methane gas.
[0015]
The DLC film is usually black, but is preferably a transparent film in the slide glass of the present invention. That is, the slide glass of the present invention is used for gene analysis and the like, and is designed to measure the intensity by irradiating the surface of the slide glass with fluorescence.
The light transmittance of the slide glass on which the surface treatment layer of the present invention is formed is preferably 50% or more in the light wavelength region of 400 nm to 500 nm (B1ue region). More preferably, it is 60% or more.
Moreover, it is preferable that the transmittance | permeability in the area | region (Red area | region) whose light wavelength is 600 nm-700 nm is 70% or more. More preferably, it is 75% or more.
By having the light transmittance in each of the above regions, the intensity of the fluorescent label on the slide glass can be measured efficiently.
[0016]
In order to produce diamond-like carbon that has waited for such light transmission, for example, in ionization deposition, the light transmittance increases as the content of hydrogen gas in the mixed gas of hydrocarbon gas and hydrogen gas increases. Diamond-like carbon can be produced.
The above ionized deposition method is a method devised by Weissmantel et al., Which is a kind of hydrocarbon gas source DLC film forming method. The ion source is an anode grid facing a hot filament as a cathode and a metal cylinder surrounding them. Consists of.
[0017]
An embodiment for producing diamond-like carbon having a high light transmittance on a slide glass by using an ionized vapor deposition method will be described.
For example, a diamond-like carbon (DLC) film having a thickness of 10 nm was formed on a slide glass having a thickness of 1 mm (S-1112 manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd.). And the result of having investigated the light transmittance of the slide glass in which this DLC film was formed was as follows. That is, the slide glass in which the DLC film was formed in an atmosphere containing no hydrogen gas (0% by volume) had a light transmittance of 88.7% for light having a wavelength of 400 nm. The slide glass on which the DLC film was formed in an atmosphere containing 1% by volume of hydrogen gas had a light transmittance of 89.4% at a wavelength of 400 nm. Furthermore, the slide glass in which the DLC film was formed in an atmosphere containing 80% by volume of hydrogen gas had a light transmittance of 90.8% at a wavelength of 400 nm. Thus, it has been found that the light transmittance increases as the proportion of hydrogen gas increases.
[0018]
When the light transmittance was measured with light having a wavelength of 700 nm, the slide glass in which the DLC film was formed in an atmosphere containing no hydrogen gas (0% by volume) had a light transmittance of 90.0%. It was. The slide glass in which the DLC film was formed in an atmosphere containing 1% by volume of hydrogen gas had a light transmittance of 90.8%. Further, the slide glass in which the DLC film was formed in an atmosphere containing 80% by volume of hydrogen gas had a light transmittance of 92%. As described above, it was found that the light transmittance increased as the proportion of hydrogen gas was increased as in the case of measurement using light having a wavelength of 700 nm as in the result of measurement using light having a wavelength of 400 nm.
[0019]
The light transmittance of the slide glass itself (blank) having no surface treatment layer formed was 91.0% at a wavelength of 400 nm and 92% at a wavelength of 700 nm.
Here, the light transmittance was calculated based on the following equation.
Light transmittance T = (I / I ₀ ) × 100
I: intensity of transmitted light in a blank I ₀ : intensity of transmitted light when a surface treatment layer is formed
If hydrogen gas is contained, it tends to be transparent because if it does not contain hydrogen gas, it will contain a large amount of sp2 hybrid orbitals and cause coloring, but if it contains hydrogen gas, it will contain many transparent sp3 orbitals. Conceivable. However, if a large amount of hydrogen gas is contained, the film formation rate of diamond-like carbon is reduced, and the hydrogen gas content is more preferably 1 to 50% by volume.
[0021]
In the arc evaporation method, an arc discharge is generated in a vacuum by applying a DC voltage between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode) to generate a plasma of carbon atoms from the cathode, and an evaporation source. Further, by applying a negative bias voltage to the substrate, the carbon ions in the plasma are accelerated toward the substrate to perform film formation.
Further, in the scissor vapor deposition method, for example, Nd: YAG laser (pulse oscillation) light is irradiated onto a graphite target plate and melted, and carbon atoms are deposited on a glass substrate.
[0022]
The slide glass of the present invention can be loaded with a large number of biological materials such as genes such as DNA probes, proteins and peptides. Therefore, it is also preferable to use a slide glass in which a plurality of minute sections are provided on the surface of the slide glass and a large number of oligonucleotide fragments can be carried in one section. There is no particular limitation on changing the type of DNA probe or the like in each of the fine sections, and it can be appropriately changed according to the application.
[0023]
The shape of the slide glass is not particularly limited, and may be, for example, a flat shape such as a film or a sheet, a disk shape, or a granular shape. Moreover, there is no restriction | limiting in particular also in the thickness of a slide glass, a magnitude | size, etc., It can be set as the same range as used normally.
The type of glass that is the substrate of the slide glass is not particularly limited, such as commonly used slide glass, crystallized glass, quartz glass, and tempered glass. Moreover, the glass which laminated | stacked the glass from which a composition differs in two or more layers may be sufficient.
[0024]
The oligonucleotide fragments (probes) that can be placed on the roughened slide glass of the present invention are not particularly limited in the number of bases such as single-stranded or double-stranded DNA and RNA fragments. The oligonucleotide fragment can be immobilized by chemical bonding to the surface of the slide glass. For example, when a slide glass having a carbon-based material layer formed of diamond-like carbon is used, the amino group of the terminal base of DNA can be bound after the surface is activated, that is, it is easy to chemically bond with DNA.
[0025]
As an example of the surface activation of the slide glass in this case, the surface of the diamond-like carbon film is chlorinated by irradiating the solid support with ultraviolet light in chlorine gas and then aminating by irradiating with ultraviolet light in ammonia gas. And then carboxylated with an appropriate acid chloride or acid anhydride. Furthermore, the amino group which is not carboxylated is masked by immersing it in a polyvalent carboxylic acid solution. By dehydrating and condensing terminal carboxyl groups with carbodiimide or dicyclohexylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide, a group in which an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide ester group is bonded to the end of a hydrocarbon group via an amide bond is immobilized. Can be activated. Alternatively, the slide glass may be put into a reaction vessel into which ammonia gas or a compound containing an amino group has been introduced and aminated by plasma.
[0026]
By thus activating the surface of the slide glass of the present invention, for example, tens of thousands of DNA fragments (probes) whose base sequences have already been elucidated can be carried.
Alternatively, an oligo dT primer can be bound on the slide glass, and the target cDNA can be extended simultaneously with the slide glass by a reverse transcription reaction or the like.
Furthermore, a large number of DNA strands can be extended and bonded on glass using PCR or the like.
[0027]
In this way, after the DNA fragment is bound, when a fluorescently labeled DNA sample is allowed to flow, the DNA sample has a complementary sequence of the DNA fragments (probes) bound on the slide glass. Since it hybridizes with the probe, the sequence of the DNA sample can be elucidated as a fluorescent spot.
Furthermore, the slide glass of the present invention preferably has a reflective layer such as a metal vapor deposition film formed on the back surface thereof.
When such a reflective layer is formed on the back surface of the slide glass, it has the effect of increasing the reflection efficiency of fluorescence when fluorescence is irradiated from the front surface, and the sensitivity of the fluorescence analyzer can be increased. That is, the fluorescent spot can be clearly observed, and a large amount of analysis can be performed at once.
As the kind of the reflective layer formed on the back surface of the slide glass, a single layer such as Ti, Au, Pt, Nb, WC, or a composite layer thereof is preferable. The thickness of the reflective layer is preferably 100 nm or more because the entire slide glass must be uniformly coated. More preferably, it is 1000 nm or more. In order to form such a reflective layer, a vacuum deposition method can be generally used. In addition, a conventional technique suitable for forming the reflective layer, such as a sputtering method or an ion beam evaporation method, can be appropriately selected and used.
[0028]
As described above, the slide glass of the present invention can analyze and specify the base sequence of a certain DNA much more clearly than before while using the same method as before. Besides being used for gene analysis such as monitoring and genome mismatching, it is also useful for gene diagnosis such as detection of cancer gene mutations and drug development.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described by examples.
Example 1
(1) A slide glass for use in gene analysis was prepared as follows. First, the glass was roughened using glass of 25 mm (width) × 75 mm (length) × 1 mm (thickness) as a substrate of the slide glass. The glass was immersed in an aqueous solution containing 20 mol / L of silicofluoric acid, 30 g / L of silica gel, and 0.04 mol / L of boric acid at a temperature of 25 ° C. Immersion time was appropriately set, and the surface roughness Ra was changed. Furthermore, after washing with ion exchange water, drying was performed to obtain a roughened glass.
Next, a slide glass having a DLC film thickness of 25 nm was formed on the roughened glass substrate surface by using an ionized vapor deposition method using a gas mixture of 95% by volume of methane gas and 5% by volume of hydrogen gas as a raw material. .
[0030]
(2) Next, this slide glass surface was chemically modified and activated.
That is, the glass substrate surface was chlorinated for 1 minute, then aminated for 10 minutes, and further directly immersed in acid chloride for 10 minutes. Next, after washing with ultrapure water, direct activation was performed by immersing in an activation solution. The composition of the activation liquid is 1,4-dioxane 1 mL, hydrogen cyanamide 25 mg, and N-hydroxysuccinimide 150 mg, which are dissolved. Further, after washing with ultrapure water, it was activated by drying at 65 ° C.
[0031]
A fluorescently labeled oligonucleotide (Cy3-AAAAAAAAAAAAAAAA, Cy3, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech, see SEQ ID No. 1 in the Sequence Listing) at a concentration of 10 pmol / mL was spotted on the surface of the slide glass prepared as described above. The fluorescence intensity was measured. In addition, the spot was washed after spotting, and the fluorescence intensity was measured in the same manner. Note that LAS-1000 Plus was used as the apparatus, and the measurement time was 1 minute. As shown in Table 1, it was found that the fluorescence intensity thus obtained was stronger as the surface roughness Ra was larger.
[0032]
[Table 1]

In Table 1, the surface roughness Ra of the glass of the comparative example that is not roughened is 0.8 nm, and the roughened slide glass of the present invention has a non-roughened glass after the spot and after washing. It was superior to the fluorescence intensity after the top spot and after washing.
That is, in the slide glass of the present invention, which was made to be an unbalanced surface, the density of biologically relevant substance fragments such as spotted DNA, protein, peptide, etc. was maintained high, and the spots could be detected clearly.
[0033]
【The invention's effect】
Since the roughened slide glass of the present invention can analyze and specify a DNA base sequence much more clearly than in the past while using the same method as in the past as compared with a non-roughened glass. In addition to analysis of biological genome, monitoring of gene expression, analysis of biological materials such as genes and proteins such as genomic mismatching, etc., it is also useful for gene diagnosis such as cancer gene mutation detection and drug development It is.
[0034]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic explanatory diagram when a probe is immobilized on a slide glass of the present invention.

Claims

粗面化処理を施した表面粗さＲａ（中心線平均粗さ：ＪＩＳＢ０６０１）：１〜５１０ｎｍであるスライドグラスの表面に厚みが、１ｎｍ〜１０００ｎｍであるダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイトからなる炭素系物質層の表面処理層を形成し、当該スライドグラスの裏面に金属蒸着膜層を形成した粗面化スライドグラス。Surface roughness Ra subjected to roughening treatment (centerline average roughness: JIS B 0601) : From diamond, diamond-like carbon or graphite having a thickness of 1 nm to 1000 nm on the surface of a slide glass having a thickness of 1 to 510 nm A roughened slide glass in which a surface treatment layer of a carbon-based material layer is formed and a metal vapor deposition film layer is formed on the back surface of the slide glass.

前記粗面化処理が、フッ酸を含んだ水溶液中で処理されることを特徴とする請求項１記載の粗面化スライドグラス。 The roughening slide glass according to claim 1, wherein the roughening treatment is performed in an aqueous solution containing hydrofluoric acid.

前記粗面化処理が、ケイフッ酸とシリカを含んだ水溶液中で処理されることを特徴とする請求項１記載の粗面化スライドグラス。 2. The roughened slide glass according to claim 1, wherein the roughening treatment is carried out in an aqueous solution containing silicic acid and silica.

前記粗面化処理が、機械的研磨であることを特徴とする請求項１記載の粗面化スライドグラス。 The roughened slide glass according to claim 1, wherein the roughening treatment is mechanical polishing.

前記ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作製した請求項１記載の粗面化スライドグラス。The roughened slide glass according to claim 1, wherein the diamond-like carbon is produced by an ionized vapor deposition method in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1 % by volume of the remaining methane gas.

前記ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイトからなる炭素系物質の被膜上に、オリゴヌクレオチド断片を担持させた請求項１〜５のいずれかに記載の粗面化スライドグラス。The roughened slide glass according to any one of claims 1 to 5 , wherein an oligonucleotide fragment is supported on a film of a carbon-based material comprising diamond, diamond-like carbon, or graphite .

請求項１〜６のいずれかに記載の粗面化スライドガラス表面にＤＮＡプルーブ等の遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物質を担持させて、遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物質を解析する方法。A method for analyzing a biological material such as a gene, protein or peptide by allowing a biological material such as a DNA probe or the like to be carried on the surface of the roughened glass slide according to any one of claims 1 to 6 .