JP3837480B2 - How to collect biomolecules from living cells - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生きている状態の細胞から種々の生体分子を採取する方法、及びその方法を利用した生細胞内で発現している遺伝子の同定方法に関する。本発明の方法により、一つの細胞における遺伝子発現等の変化を経時的に調べることが可能になる。
【０００２】
【従来の技術】
最近の生物学研究の大きな流れの一つは、個々の生物試料の個性を調べようというものである。タンパク質などの生体高分子にしても、たくさんの分子からなる溶液中の酵素活性などといった全体の性質を調べるだけでなく、一分子の活性を調べるというもので、これらの学問は一分子生化学と呼ばれている。
【０００３】
細胞生物学の分野においても一つ一つの細胞の個性を調べる研究が行われるようになってきた。例えば、脳のある領域の神経細胞では、従来は同じ種類の細胞の集まりとして扱われてきた。これら同じ種類の細胞集団の中の個々細胞のレセプターなどの微妙な発現の違いを調べることにより、より複雑な機能解析を行うことができるのではないかと考えられるようになってきた。一分子生化学に対して一細胞生物学と呼ぶことができよう。
【０００４】
一つの細胞での遺伝子発現変化などを観察するためには細胞を生きたまま、そこからわずかな量の生体分子を取り出し解析する技術が不可欠である。今までは同じ状態にあると思われる複数の細胞間での比較を行ってきたが、今後微妙な細胞間の変化などを調べる一細胞生物学を行うには十分な方法とはいえない。
【０００５】
最近、複数の鋤鼻神経細胞の一つ一つからcDNAライブラリーを作り、それらを比較することにより、微妙な遺伝子の発現を調べて、フェロモンレセプターのクローニングなどが行われた。この方法は大変画期的であるが、今までの方法と同じように細胞を殺してしまうため、経時的な変化を一つの細胞で調べることができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べたように、従来の生体分子の採取方法は、採取源とする細胞を殺すことを前提としており、細胞を生かした状態で生体分子を採取しようとする方法は知られていなかった。
【０００７】
本発明は、このような技術的な背景の下になされたものであり、その目的は、生きた細胞からRNAなどの生体分子を採取する手段を提供し、個々の細胞について経時的な変化を連続的に記録することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、一つの細胞での遺伝子発現変化などを観察するためには、生きた状態の細胞から生体分子を取り出すことが必要であるという着想を得、この着想を基に本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とする生体分子の採取方法である。
（１）採取しようとする生体分子と結合し得る針を、微細な位置制御が可能な装置を用いて、生細胞に刺し込む工程
（２）前記針を、前記装置を用いて、生細胞から引き抜く工程
また、本発明は、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺伝子の同定方法である。
（１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程
（２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応が起きるかどうかを調べる工程
更に、本発明は、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺伝子の同定方法である。
（１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程
（２）前記mRNAからcDNAを合成する工程
（３）前記cDNAを、発現が予想される複数の遺伝子断片が固定されているDNAチップに近づけ、前記cDNAと固定されている遺伝子断片間に生じる力を測定する工程
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の生体分子の採取方法は、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とするものである。
【００１１】
工程（１）では、採取しようとする生体分子と結合し得る針を、微細な位置制御が可能な装置を用いて、生細胞に刺し込む。
【００１２】
生体分子としては、mRNA、tRNA、rRNA、DNA、タンパク質、脂質、糖などを挙げることができる。
【００１３】
使用する針は、生体分子と結合し得るものであればどのようなものでもよく、例えば、金属酸化物のウィスカー（例えば、ZnOウィスカーなど）、カーボンナノチューブなどを使用することができる。ウィスカー等は、そのままの状態でも物理的吸着力によって生体分子と結合できるが、結合性を向上させるため、生体分子と特異的に結合し得る物質で修飾することが好ましい。生体分子と特異的に結合し得る物質としては、例えば、mRNAを採取する場合であればオリゴdTを例示することができ、タンパク質、脂質、糖を採取する場合であれば抗体を例示することができる。また、特定の配列を持つ核酸を採取しようとする場合には、その核酸と相補的な配列を持つ核酸で針を修飾してもよい。
【００１４】
針の修飾方法は、修飾する物質及び針の種類に応じて適宜決めることができる。例えば、オリゴdTでZnOウィスカーを修飾する場合は、表面にアミノ基を導入したウィスカーとオリゴdTを含み5'チオール化したオリゴDNAとを、適当な架橋剤と反応させることにより行うことができる。
【００１５】
微細な位置制御が可能な装置は、生細胞を殺すことなく、針の刺し込み操作及び後述する引き抜き操作が可能なものであればどのようなものでもよく、市販のマイクロマニピュレーターや原子間力顕微鏡を使用することができる。
【００１６】
針の生細胞への刺し込みは、例えば、原子間力顕微鏡のカンチレバーに針を固定し、カンチレバーを採取しようとする生細胞の上方に移動させた後、下方に移動させることにより行うことができる。針のカンチレバーへの固定は一般的な方法、例えば、エポキシなどを用いて行うことができる。このような針の刺し込み等の操作は顕微鏡観察下で行うのが好ましい。
【００１７】
採取源とする生細胞はどのようなものでもよく、例えば、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞などを例示できるが、これらに限定されるわけではない。
【００１８】
工程（２）では、前記針を、前記装置を用いて、生細胞から引き抜く。
【００１９】
針の刺し込みから引き抜きまでの時間は特に限定されないが、細胞へのダメージを考えれば短い方がよく、より多くの生体分子を取り出すには長い方がよい。刺し込みから引き抜きまでは、通常5〜10秒程度である。
【００２０】
以上の生体分子の採取方法を利用して、生細胞内で発現している遺伝子の同定を行うことができる。即ち、生細胞内からmRANを採取し、そのmRNAがどの遺伝子に由来するかを調べることにより、生細胞内でどのような遺伝子が発現していたかがわかる。具体的な方法としては、以下の第一の方法、及び第二の方法を例示できる。
【００２１】
第一の方法は、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とするものである。
（１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程
（２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応が起きるかどうかを調べる工程
mRNAが、予想した遺伝子由来のものであればポリメラーゼ連鎖反応による増幅断片が生じるが、予想した遺伝子由来のものでなければ増幅断片は生じない。従って、増幅断片の有無を電気泳動等により調べることにより、生細胞内で発現していた遺伝子がどのようなものであったかがわかる。
【００２２】
第二の方法は、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とするものである。
（１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程
（２）前記mRNAからcDNAを合成する工程
（３）前記cDNAを、発現が予想される複数の遺伝子断片が固定されているDNAチップに近づけ、前記cDNAと固定されている遺伝子断片間に生じる力を測定する工程
cDNAが予想した遺伝子断片に由来するものであれば、cDNAを遺伝子断片に近づけると、両者間の引力、斥力に変化が生じる。従って、この変化を調べることにより、生細胞内で発現していた遺伝子がどのようなものであったかがわかる。引力等の変化は、原子間力顕微鏡などにより測定することができる。
【００２３】
【実施例】
１．ZnOウィスカーの修飾
ZnOウィスカーを無水トルエンで洗浄後、50％アミノプロピルシランの入ったトルエン溶液中で一晩ローテーターで攪拌し、ZnOウィスカー表面にアミノ基を導入した。反応終了後、ZnOをメタノールで３回洗浄し、その後、メタノール中に保存した。次に、架橋剤（Sulfo-LC-SPDP）を使って5'チオール化したオリゴDNA (AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGC(T)₂₄)をZnOウィスカー表面に化学的に結合させた。
【００２４】
修飾が上手くいったかどうかは、赤い蛍光を発する色素を結合したポリAとの反応により調べた。図１ＢにポリAとの反応により赤く染まったZnOウィスカーを示す。
２．ZnOウィスカーのAFMカンチレバーへの固定
実体顕微鏡（SZX12、オリンパス）にヒーター（MP200DMSH、Kitazato）及びマイクロマニピュレータ（成茂科学）をセットした。ヒーターの温度は70℃に設定した。小さく切ったスライドガラス（約1.5cm角程度）を3個用意し、それぞれにエポキシ（グレード1001、油化シェル。融点64℃）、ZnOウィスカー、AFMチップを載せた。
【００２５】
エポキシが溶け、ZnOウィスカーが乾燥した時点で、以下の作業を開始した。実体顕微鏡で観察しつつ、マニピュレータのマイクロピペットをエポキシに少しだけ浸けた。これにより、ピペット先端にごく少量のエポキシが、球状になって付着した。そのピペット先端を、今度はAFMカンチレバー先端に軽く触れさせた。これにより、カンチレバー先端にもごく少量のエポキシが付いた。次に、もうひとつのマニピュレータピペットを使い、ZnOウィスカーをひとつだけ拾い上げた。ZnOウィスカーに針先を触れさせると、静電気力によってZnOウィスカーがピペット先端に付着した。そして拾い上げたZnOウィスカーを、先ほどエポキシを付けた場所の上に置き、室温に戻すと樹脂が固まって、ZnOウィスカーがAFMカンチレバー先端に固定された。
３．試料とする生細胞の調製
本実施例では、RNAの採取源として、BALB/cマウス由来の繊維芽細胞であるBALB 3T3細胞を用いた。培養環境は、5％ CO₂存在下で、37℃に温度を保つようにした。培地は、D-MEM/F-12培地（Gibco BRL）に100 U/mLペニシリン - 100 mg/mLストレプトマイシン（Gibco BRL ）を加えたものを作り、それと非働化処理したFBS（fetal bovine serum、JRH Biosciences）血清の比率が9：1になるよう混合した培地を用いた。継代後、約3日後に培地を交換した。継代は、約1週間毎に行った。継代方法であるが、コンフルエントになった細胞を0.25％トリプシン - 1mM EDTA（Gibco BRL）で処理し、遠心沈殿（700 rpm、10分）させた後、全体の1/10を継代した。通常は角ディッシュ（T-25）を用いて培養するが、本実施例では35mmペトリディッシュを用いた。
４．生細胞からのmRNAの採取
原子間力顕微鏡の試料台に、上述のBALB 3T3細胞を置き、カンチレバーに固定されたZnOウィスカーを細胞の刺したい部位に移動させた。この作業は、原子間力顕微鏡に付随する光学顕微鏡で観察しながら行った。ZnOウィスカーの位置調整が完了した後、ピエゾを動かして、ZnOウィスカーを細胞に刺した。ZnOウィスカーを細胞に刺した直後の写真を図２に示す。図中の丸印で示された細胞にZnOウィスカーを刺した。ZnOウィスカーは、この図ではみえないが、カンチレバー（三角の部分）の先端に付いている。
【００２６】
ZnOウィスカーを細胞に刺した後、すばやくカンチレバーを原子間力顕微鏡から取り外した。
５．mRNAの解析
ZnOウィスカーに付着したmRNAを鋳型とし、QIAGENのPCR用キットを用いて、RT-PCRとnested PCRを行った。プライマーは、β-アクチン遺伝子に特異的な二組のプライマーを用いた。これらのプライマーを用いた場合、ZnOウィスカーにβ-アクチン遺伝子由来のmRNAが付着していれば、約400bpの断片が増幅される（図３）。
【００２７】
PCRの条件及びプライマーの配列は下記の通りである。

上記二段階のPCRを行った後、その増幅産物を電気泳動した。ゲルの写真を図４に示す。この図に示すように、中央のレーンには約400bpのバンドが検出された。このバンドは、β-アクチンmRNA由来のものであると考えられる。なお、図中の左端のレーンはマーカー、右端のレーンはコントロールのレーンである。
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、生きている状態の細胞から生体分子を採取する方法を提供する。ある細胞における遺伝子発現の経時的変化を調べる場合、従来はクローン化された複数の細胞を用いていたが、本発明の方法により、一個の細胞についての経時的変化を調べることが可能になる。これにより、クローン細胞を用いる場合よりも、より正確な発現情報を得ることができるようになる。また、クローン化できない細胞についても、発現する遺伝子の経時的変化を調べることが可能になる。
【００２９】
更に、本発明の方法では、ウィスカーの刺す場所を変えることにより、細胞の場所による発現の違いも調べることができる。
【００３０】
【配列表】

【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、実施例で行ったRT-PCRのFoward Primerの塩基配列を示す。
【００３１】
【配列番号２】
配列番号２は、実施例で行ったRT-PCRのReverse Primerの塩基配列を示す。
【００３２】
【配列番号３】
配列番号３は、実施例で行ったnested PCRのFoward Primerの塩基配列を示す。
【００３３】
【配列番号４】
配列番号４は、実施例で行ったnested PCRのReverse Primerの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ZnOウィスカーの形状を示す顕微鏡写真（図１Ａ）、オリゴdTで修飾したZnOウィスカーと蛍光性ポリAのアニーリングの様子を示す蛍光顕微鏡写真（図１Ｂ）
【図２】 ZnOウィスカーを細胞に刺した直後の写真
【図３】実施例で使用したPCRプライマーと鋳型となるmRNAの位置を示す図
【図４】細胞から回収したmRNAを鋳型としたPCRによる増幅断片を示す写真[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for collecting various biomolecules from living cells, and a method for identifying genes expressed in living cells using the method. The method of the present invention makes it possible to examine changes in gene expression and the like in one cell over time.
[0002]
[Prior art]
One of the major trends in recent biological research is to examine the individuality of individual biological samples. Even in the case of biopolymers such as proteins, not only the overall properties such as enzyme activity in a solution consisting of many molecules, but also the activity of a single molecule is studied. being called.
[0003]
In the field of cell biology, research for examining the individuality of each cell has been conducted. For example, nerve cells in a certain area of the brain have conventionally been treated as a collection of the same type of cells. It has been considered that more complicated functional analysis can be performed by examining subtle differences in the expression of receptors of individual cells in the same type of cell population. It can be called single cell biology for single molecule biochemistry.
[0004]
In order to observe changes in gene expression in a single cell, it is indispensable to take out and analyze a small amount of biomolecules from a living cell. Until now, we have compared multiple cells that seem to be in the same state, but it is not a sufficient method for single cell biology to investigate subtle changes between cells.
[0005]
Recently, a cDNA library was created from each of a plurality of vomeronasal neurons, and by comparing them, the expression of subtle genes was examined, and pheromone receptors were cloned. Although this method is very epoch-making, the cells are killed in the same way as the conventional methods, so that changes over time cannot be examined with a single cell.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the conventional method for collecting biomolecules is based on the premise that a cell as a collection source is killed, and a method for collecting biomolecules in a state where the cells are kept alive has not been known.
[0007]
The present invention has been made under such a technical background, and the object thereof is to provide means for collecting biomolecules such as RNA from living cells, and to change individual cells over time. It is to record continuously.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor obtained the idea that it is necessary to extract a biomolecule from a living cell in order to observe a gene expression change in one cell, and completed the present invention based on this idea. did.
[0009]
That is, the present invention is a biomolecule collection method characterized by including at least the following steps (1) and (2).
(1) A step of inserting a needle capable of binding to a biomolecule to be collected into a living cell using a device capable of fine position control (2) The needle is removed from a living cell using the device. Extraction step The present invention also includes a method for identifying a gene expressed in a living cell, comprising at least the following steps (1) and (2).
(1) Step of collecting mRNA from living cells by the above method (2) Coexistence of the mRNA and an oligonucleotide containing a sequence specific to a gene expected to be expressed, using the former as a template and the latter as a primer The present invention is a method for identifying a gene expressed in a living cell, characterized by comprising at least the following steps (1) to (3): .
(1) The step of collecting mRNA from living cells by the above method (2) The step of synthesizing cDNA from the mRNA (3) The cDNA is brought close to a DNA chip on which a plurality of gene fragments expected to be expressed are fixed. , A step of measuring the force generated between the cDNA and the fixed gene fragment
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0010]
The biomolecule collection method of the present invention includes at least the following steps (1) and (2).
[0011]
In step (1), a needle that can bind to a biomolecule to be collected is inserted into a living cell using a device capable of fine position control.
[0012]
Examples of biomolecules include mRNA, tRNA, rRNA, DNA, protein, lipid, and sugar.
[0013]
Any needle may be used as long as it can bind to a biomolecule. For example, a metal oxide whisker (for example, ZnO whisker), a carbon nanotube, or the like can be used. Whisker or the like can be bound to a biomolecule by physical adsorption force as it is, but is preferably modified with a substance that can specifically bind to the biomolecule in order to improve the binding property. As a substance that can specifically bind to a biomolecule, for example, oligo dT can be exemplified when collecting mRNA, and antibody can be exemplified when collecting protein, lipid, and sugar. it can. When a nucleic acid having a specific sequence is to be collected, the needle may be modified with a nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid.
[0014]
The method for modifying the needle can be appropriately determined according to the substance to be modified and the type of the needle. For example, when a ZnO whisker is modified with oligo dT, it can be performed by reacting a whisker having an amino group introduced on the surface thereof and a 5′-thiolated oligo DNA containing oligo dT with an appropriate crosslinking agent.
[0015]
Any device capable of fine position control can be used as long as the needle can be inserted and pulled out without killing living cells. A commercially available micromanipulator or atomic force microscope can be used. Can be used.
[0016]
The needle can be inserted into the living cell by, for example, fixing the needle to the cantilever of an atomic force microscope, moving the cantilever above the living cell to be collected, and then moving it downward. . The needle can be fixed to the cantilever by using a general method such as epoxy. Such operations such as needle insertion are preferably performed under microscope observation.
[0017]
Any living cells may be used as a collection source, and examples thereof include fibroblasts, nerve cells, glial cells, and the like, but are not limited thereto.
[0018]
In step (2), the needle is withdrawn from the living cells using the device.
[0019]
The time from needle insertion to withdrawal is not particularly limited, but it is better if the damage to the cells is taken into account, and a longer time is better for taking out more biomolecules. It usually takes about 5 to 10 seconds from insertion to withdrawal.
[0020]
The gene expressed in the living cell can be identified using the above biomolecule collection method. That is, by collecting mRAN from a living cell and examining which gene the mRNA is derived from, it is possible to determine what gene was expressed in the living cell. Specific examples of the method include the following first method and second method.
[0021]
The first method includes at least the following steps (1) and (2).
(1) Step of collecting mRNA from living cells by the above method (2) Coexistence of the mRNA and an oligonucleotide containing a sequence specific to a gene expected to be expressed, using the former as a template and the latter as a primer To determine whether polymerase chain reaction occurs
If the mRNA is derived from the predicted gene, an amplified fragment is generated by the polymerase chain reaction. However, if the mRNA is not derived from the predicted gene, an amplified fragment is not generated. Therefore, by examining the presence or absence of the amplified fragment by electrophoresis or the like, it is possible to determine what kind of gene was expressed in the living cell.
[0022]
The second method includes at least the following steps (1) to (3).
(1) The step of collecting mRNA from living cells by the above method (2) The step of synthesizing cDNA from the mRNA (3) The cDNA is brought close to a DNA chip on which a plurality of gene fragments expected to be expressed are fixed. , Measuring the force generated between the cDNA and the fixed gene fragment
If the cDNA is derived from the expected gene fragment, when the cDNA is brought close to the gene fragment, the attractive force and repulsive force between them change. Therefore, by examining this change, it can be seen what kind of gene was expressed in the living cells. Changes such as attractive force can be measured with an atomic force microscope or the like.
[0023]
【Example】
1. Modification of ZnO whiskers
The ZnO whisker was washed with anhydrous toluene and then stirred in a toluene solution containing 50% aminopropylsilane with a rotator overnight to introduce amino groups on the surface of the ZnO whisker. After completion of the reaction, ZnO was washed with methanol three times and then stored in methanol. Next, 5′-thiolated oligo DNA (AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGC (T) ₂₄ ) was chemically bound to the ZnO whisker surface using a crosslinking agent (Sulfo-LC-SPDP).
[0024]
Whether the modification was successful or not was examined by reaction with poly A conjugated with a red fluorescent dye. FIG. 1B shows ZnO whiskers stained red by reaction with polyA.
2. A heater (MP200DMSH, Kitazato) and a micromanipulator (Narimo Kagaku) were set on a stationary stereomicroscope (SZX12, Olympus) on an AFM cantilever of ZnO whiskers. The heater temperature was set to 70 ° C. Three small cut glass slides (about 1.5 cm square) were prepared, and epoxy (grade 1001, oiled shell, melting point 64 ° C), ZnO whiskers, and AFM chips were placed on each.
[0025]
When the epoxy melted and the ZnO whiskers dried, the following work was started. While observing with a stereomicroscope, the manipulator micropipette was slightly immersed in epoxy. As a result, a very small amount of epoxy adhered in a spherical shape to the pipette tip. The pipette tip was then lightly touched by the AFM cantilever tip. As a result, a very small amount of epoxy was also attached to the tip of the cantilever. Next, I picked up only one ZnO whisker using another manipulator pipette. When the tip of the ZnO whisker was touched, the ZnO whisker adhered to the pipette tip due to electrostatic force. The ZnO whisker that we picked up was placed on the place where the epoxy was attached, and when it was returned to room temperature, the resin hardened and the ZnO whisker was fixed to the tip of the AFM cantilever.
3. Preparation of Live Cells as Samples In this example, BALB 3T3 cells, which are fibroblasts derived from BALB / c mice, were used as the RNA collection source. The culture environment was maintained at 37 ° C. in the presence of 5% CO ₂ . The medium was made by adding 100 U / mL penicillin-100 mg / mL streptomycin (Gibco BRL) to D-MEM / F-12 medium (Gibco BRL), and inactivated FBS (fetal bovine serum, JRH) Biosciences) Medium mixed so that the serum ratio was 9: 1 was used. After the passage, the medium was changed about 3 days later. Passaging was performed approximately every week. As a subculture method, confluent cells were treated with 0.25% trypsin-1 mM EDTA (Gibco BRL), centrifuged (700 rpm, 10 minutes), and then 1/10 of the whole cells were subcultured. Usually, culturing is performed using a square dish (T-25), but a 35 mm Petri dish was used in this example.
4). Collection of mRNA from living cells The BALB 3T3 cells described above were placed on a sample stage of an atomic force microscope, and the ZnO whiskers fixed to the cantilever were moved to the site where the cells were to be inserted. This operation was performed while observing with an optical microscope attached to the atomic force microscope. After the position adjustment of the ZnO whisker was completed, the piezo was moved to pierce the cell with the ZnO whisker. FIG. 2 shows a photograph immediately after the ZnO whisker is inserted into the cell. ZnO whiskers were stabbed into the cells indicated by the circles in the figure. The ZnO whisker is not visible in this figure, but is attached to the tip of the cantilever (triangle).
[0026]
After inserting the ZnO whisker into the cell, the cantilever was quickly removed from the atomic force microscope.
5). Analysis of mRNA
RT-PCR and nested PCR were performed using mRNA attached to ZnO whiskers as a template and QIAGEN PCR kit. As the primer, two sets of primers specific for the β-actin gene were used. When these primers are used, if a β-actin gene-derived mRNA is attached to the ZnO whisker, a fragment of about 400 bp is amplified (FIG. 3).
[0027]
PCR conditions and primer sequences are as follows.

After performing the above two-stage PCR, the amplified product was electrophoresed. A photograph of the gel is shown in FIG. As shown in this figure, a band of about 400 bp was detected in the center lane. This band is considered to be derived from β-actin mRNA. In the figure, the leftmost lane is a marker, and the rightmost lane is a control lane.
[0028]
【The invention's effect】
The present invention provides a method for collecting biomolecules from living cells. When investigating changes over time in gene expression in a certain cell, conventionally, a plurality of cloned cells have been used, but the method of the present invention makes it possible to examine changes over time in a single cell. This makes it possible to obtain more accurate expression information than when using clonal cells. It is also possible to examine changes over time in genes that can be expressed in cells that cannot be cloned.
[0029]
Furthermore, in the method of the present invention, the difference in expression depending on the location of the cell can be examined by changing the location where the whisker is inserted.
[0030]
[Sequence Listing]

[Sequence Listing Free Text]
[SEQ ID NO: 1]
Sequence number 1 shows the base sequence of Forward Primer of RT-PCR performed in the Example.
[0031]
[SEQ ID NO: 2]
SEQ ID NO: 2 shows the base sequence of the Reverse Primer of RT-PCR performed in the Example.
[0032]
[SEQ ID NO: 3]
SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of the forward primer of nested PCR performed in the Example.
[0033]
[SEQ ID NO: 4]
SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of the reverse primer of nested PCR performed in the Example.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photomicrograph showing the shape of a ZnO whisker (FIG. 1A), and a fluorescent photomicrograph showing the annealing of a ZnO whisker modified with oligo dT and fluorescent poly A (FIG. 1B).
[Fig. 2] Photo immediately after inserting a ZnO whisker into a cell [Fig. 3] Fig. 4 shows the position of mRNA used as a template and PCR primers used in the examples [Fig. 4] By PCR using mRNA recovered from the cell as a template Photo showing the amplified fragment

Claims (5)

少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とする生体分子の採取方法。
（１）採取しようとする生体分子と結合し得る針を、原子間力顕微鏡を用いて、生細胞に刺し込む工程
（２）前記針を、前記原子間力顕微鏡を用いて、生細胞から引き抜く工程A biomolecule collection method comprising at least the following steps (1) and (2):
(1) A step of inserting a needle capable of binding to a biomolecule to be collected into a living cell using an atomic force microscope (2) Pulling out the needle from a living cell using the atomic force microscope Process 針が、生体分子と特異的に結合し得る物質で修飾されたウィスカーであることを特徴とする請求項１記載の生体分子の採取方法。The method for collecting biomolecules according to claim 1 , wherein the needle is a whisker modified with a substance capable of specifically binding to the biomolecule. ウィスカーが、ZnOウィスカーであることを特徴とする請求項２記載の生体分子の採取方法。The method for collecting biomolecules according to claim 2 , wherein the whiskers are ZnO whiskers. 生体分子が、mRNAである請求項１乃至３のいずれか一項に記載の生体分子の採取方法。The biomolecule collection method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the biomolecule is mRNA. 少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺伝子の同定方法。
（１）請求項４記載の方法によって生細胞からmRNAを採取する工程
（２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応が起きるかどうかを調べる工程A method for identifying a gene expressed in a living cell, comprising at least the following steps (1) and (2):
(1) Step of collecting mRNA from living cells by the method according to claim 4 (2) Coexistence of said mRNA and an oligonucleotide containing a sequence specific to a gene expected to be expressed, using the former as a template, A process to check whether the polymerase chain reaction occurs using the latter as a primer

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